Jednoczesne wielobarwne obrazowanie struktur biologicznych z fluorescencyjną mikroskopią lokalizacji fotoaktywacji

Summary

Pokazujemy użycie mikroskopii lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji (FPALM) do jednoczesnego obrazowania wielu typów fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek w komórkach. Opisane techniki pozwalają na lokalizację od tysięcy do setek tysięcy pojedynczych białek znakowanych fluorescencyjnie, z precyzją do dziesiątek nanometrów w pojedynczych komórkach.

Abstract

Mikroskopia superrozdzielcza oparta na lokalizacji może być zastosowana do uzyskania przestrzennej mapy (obrazu) rozkładu pojedynczych fluorescencyjnie znakowanych pojedynczych cząsteczek w próbce o rozdzielczości przestrzennej dziesiątek nanometrów. Wykorzystując fotoaktywowane (PAFP) lub fotoprzełączalne (PSFP) białka fluorescencyjne połączone z białkami będącymi przedmiotem zainteresowania lub barwniki organiczne sprzężone z przeciwciałami lub innymi interesującymi cząsteczkami, mikroskopia lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji (FPALM) może jednocześnie obrazować wiele gatunków cząsteczek w pojedynczych komórkach. Stosując następujące podejście, populacje dużej liczby (od tysięcy do setek tysięcy) pojedynczych cząsteczek są obrazowane w pojedynczych komórkach i lokalizowane z precyzją ~10-30 nm. Uzyskane dane można zastosować do zrozumienia rozkładów przestrzennych w nanoskali wielu typów białek w komórce. Jedną z głównych zalet tej techniki jest dramatyczny wzrost rozdzielczości przestrzennej: podczas gdy dyfrakcja ogranicza rozdzielczość do ~200-250 nm w konwencjonalnej mikroskopii świetlnej, FPALM może skalować długość obrazu o ponad rząd wielkości mniejszą. Ponieważ wiele hipotez biologicznych dotyczy relacji przestrzennych między różnymi biomolekułami, ulepszona rozdzielczość FPALM może dostarczyć informacji na temat organizacji komórek, które wcześniej były niedostępne dla konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Oprócz szczegółowego omówienia metod przygotowania próbek i pozyskiwania danych, opisujemy tutaj konfigurację optyczną dla FPALM. Dodatkową kwestią dla badaczy, którzy chcą przeprowadzić mikroskopię superrozdzielczą, jest koszt: własne konfiguracje są znacznie tańsze niż większość dostępnych na rynku urządzeń do obrazowania. Ograniczenia tej techniki obejmują konieczność optymalizacji znakowania cząsteczek będących przedmiotem zainteresowania w próbkach komórkowych oraz potrzebę oprogramowania do przetwarzania końcowego w celu wizualizacji wyników. Opisujemy tutaj zastosowanie ekspresji PAFP i PSFP do obrazowania dwóch gatunków białek w utrwalonych komórkach. Opisano również rozszerzenie tej techniki na żywe komórki.

Introduction

Chociaż struktury komórkowe istnieją w szerokim zakresie skal przestrzennych, obrazowanie fluorescencyjne organizacji komórkowej na skalach długości mniejszych niż ~250 nm jest ograniczone w konwencjonalnej mikroskopii ze względu na fizyczne ograniczenie limitu dyfrakcji. Ograniczenie to zostało przezwyciężone wraz z pojawieniem się fluorescencyjnej mikroskopii lokalizacji fotoaktywacji (FPALM¹) i podobnych technik^2,3, które mogą lokalizować dużą liczbę pojedynczych cząsteczek z precyzją ~10 nm, w celu generowania obrazów o rozdzielczości kilkudziesięciu nanometrów. FPALM opiera się na wykorzystaniu kontroli optycznej do aktywacji i dezaktywacji podzbiorów cząsteczek (pełny opis FPALM i instrukcje dotyczące implementacji tego systemu obrazowania można znaleźć w Gould i wsp.⁴). Technika ta pozwala na mapowanie rozkładów przestrzennych całych populacji pojedynczych cząsteczek, wyjaśniając w ten sposób struktury biologiczne w skalach długości od kilkudziesięciu nanometrów do dziesiątek mikronów. Mikroskopia superrozdzielcza oparta na lokalizacji (zwana dalej mikroskopią lokalizacyjną) została obecnie zaadaptowana do rozwiązywania szeregu problemów biologicznych, a rozwój technologiczny pozwolił na przykład na obrazowanie poszczególnych orientacji molekularnych za pomocą polaryzacji FPALM lub P-FPALM⁵, obrazowanie fluorescencyjne pojedynczych cząsteczek w trzech wymiarach za pomocą Biplane FPALM⁶ lub innych technik^7-9oraz superrozdzielcze obrazowanie fluorescencyjne pojedynczych cząsteczek w żywych komórkach^10-12. Mikroskopia lokalizacyjna została również zastosowana do obrazowania wielu gatunków w stałych komórkach^13-16. Ostatnio trzy gatunki białek zostały jednocześnie zobrazowane za pomocą FPALM zarówno w komórkach stałych, jak i żywych¹⁷. Mikroskopia lokalizacyjna może obrazować próbki znakowane na różne sposoby: Przykłady obejmują białka wyrażane za pomocą znaczników fuzyjnych PAFP lub PSFP, przeciwciała lub cząsteczki znakowane barwnikami organicznymi w klatkach lub konwencjonalnymi barwnikami organicznymi. Podczas gdy stosowanie konwencjonalnych barwników fluorescencyjnych pozwala na znakowanie białek przy braku znacznika białka fuzyjnego, warunki ogólnie wymagane do stosowania barwników organicznych bez klatkowania w obrazowaniu superrozdzielczym wymagają, aby próbki były zanurzone w redukcyjnych². Dodatkowo, wewnątrzkomórkowe dostarczanie koniugatów przeciwciało-barwnik zazwyczaj wymaga utrwalenia komórek i przepuszczalności ich błon, lub wymaga, aby żywe komórki były przepuszczalne poprzez elektroporację lub w inny sposób. Wymagania dotyczące zmniejszenia warunków buforowych i przepuszczalności błony ograniczają przydatność barwników organicznych do obrazowania żywych komórek, chociaż ostatnie osiągnięcia pozwoliły na skuteczne wykorzystanie HaloTags i FPALM do obrazowania struktur błonowych¹⁸.

FPALM był pierwszą techniką mikroskopii lokalizacyjnej zastosowaną do żywych komórek¹⁰. W żywych komórkach, oprócz dostarczania zależnej od czasu mapy przestrzennej lokalizacji znakowanych cząsteczek, FPALM może śledzić pojedyncze cząsteczki w wielu klatkach i trajektorie molekularne wyznaczane w skalach czasowych^{milisekund 19}. Tak więc, FPALM zapewnia dostęp do dość krótkich skal czasowych i rozdzielczości w nanoskali.

Multicolor FPALM może być używany do wielu różnych sond, w tym białek fotoaktywowalnych i organicznych barwników w klatkach lub bez nich. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe informacje na temat protokołu i konfiguracji do jednoczesnego obrazowania dwóch fluorescencyjnych gatunków białek, Dendra2 i PAmCherry. Przedstawiamy wyniki obrazowania PAmCherry sprzężonego z beta aktyną (PAmCherry-aktyna) i Dendra2 sprzężonego z hemaglutyniną grypy (Dendra2-HA) w fibroblastach NIH-3T3. Komponenty opisane w konfiguracji mogą być wymieniane na inny sprzęt, bardziej przystosowany do obrazowania innych sond. Tam, gdzie tak jest, staraliśmy się być jednoznaczni w tekście.

Multicolor FPALM jest idealny do raportowania przestrzennego rozkładu wielu gatunków białek w żywych lub stałych komórkach. Technika ta jest szczególnie przydatna do badania relacji przestrzennych i/lub dynamicznych w skalach przestrzennych o długości nanometrów, chociaż obrazy będą raportować lokalizację w różnych skalach długości, od dziesiątek nanometrów do dziesiątek mikronów. Jedną z głównych zalet wielokolorowego FPALM jest to, że konfiguracja jest stosunkowo niedroga w budowie i bardzo elastyczna w użyciu z różnymi kombinacjami sond. Proces budowy i kalibracji systemu na podstawie komponentów zapewnia również znaczne zrozumienie czynników, które mogą mieć negatywny wpływ na jakość i interpretowalność danych, a tym samym na wynik badań. Szczegółowo opisujemy tutaj metody konfiguracji optycznej, przygotowania próbek i pozyskiwania danych z wielu gatunków białek, z konstruktami fuzyjnymi PSFP i PAFP, przy użyciu FPALM. Chociaż protokół ten opisuje analizę komórek stałych, procedury te można łatwo zastosować do obrazowania żywych komórek.

Opisany tutaj układ optyczny jest idealny do jednoczesnego obrazowania PSFP Dendra2 i PAFP PAmCherry. Wiele innych sond może być używanych do obrazowania wielokolorowego; Jednak dokładne wymagane komponenty mogą się różnić w zależności od widm wzbudzenia i emisji wybranych sond. Wybór zwierciadeł dichroicznych, filtrów i długości fal laserowych powinien być dokonywany na podstawie tych rozważań.

Protocol

Proszę zauważyć: Schematyczne przedstawienie komponentów optycznych, do których odwołuje się ten protokół, można znaleźć na rysunku 1.

1. Przygotowanie próbki komórki

1. Płytki o zoptymalizowanej gęstości (dla komórek NIH-3T3 jest to około 2-5 x 10⁴ komórek/cm²) w studzienkach komory 8-dołkowej. Komórki powinny być posiane w kompletnych pożywkach odpowiednich do typu komórek, chociaż pożywki powinny być wykonane bez antybiotyków i bez czerwieni fenolowej, która przyczynia się do fluorescencji tła. Należy pamiętać, że warunki eksperymentowania z komórkami, takie jak optymalny zakres liczby pasaży, mogą się różnić dla poszczególnych linii komórkowych.
2. Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ (lub w warunkach odpowiednich dla typu komórek), aby umożliwić komórkom przyleganie do szkiełka nakrywkowego. Komórki transfekcyjne z DNA wolnym od endotoksyn dla każdego z dwóch konstruktów białkowych (w tym przypadku DNA dla PAmCherry-aktyny i Dendra2-HA). Przykryj próbkę materiałem nieprzepuszczalnym dla światła, takim jak folia aluminiowa. Transfekcja powinna obejmować studzienki z obydwoma konstruktami DNA oraz studzienki zawierające tylko jeden z tych konstruktów.
3. Inkubować przez 4-6 godzin, w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ (lub w warunkach odpowiednich dla typu komórki), przed zmianą w kompletne podłoże (z antybiotykami, bez czerwieni fenolowej) i dalej inkubować przez 16-48 godzin, aby umożliwić komórkom ekspresję pożądanych białek.
   1. Komórki można utrwalić poprzez trzykrotne przemycie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), a następnie inkubację z 4% paraformaldehydem (PFA) (UWAGA: Toksyczny) w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemywanie kolejne 3x PBS. Jednak w zależności od interesujących białek, to utrwalenie może spowodować powstanie sporej puli znakowanych cząsteczek, które są nadal ruchliwe. Aby jeszcze bardziej zmniejszyć mobilność, alternatywne metody utrwalania obejmują użycie schłodzonego 100% metanolu lub 0,2% aldehydu gluterowego i 4% PFA w PBS przez >30 min w temperaturze 25 °C²⁰. W obu metodach komórki należy przemywać PBS jak powyżej. Należy zauważyć, że stosowanie aldehydu gluterowego może zwiększyć fluorescencję tła lub autofluorescencję w niektórych warunkach obrazowania i może wymagać leczenia po utrwaleniu borowodorkiem sodu²¹.
4. Próbka może być przechowywana w temperaturze 4 °C, zanurzona w PBS, szczelnie zamknięta w folii samouszczelniającej, przez okres do 7 dni przed pobraniem obrazu.

2. Wyrównanie mikroskopu

1. Umieść skalę kalibracyjną (siatkę) na stoliku mikroskopu. Używając obiektywu 10X i lampy do światła przechodzącego, wyśrodkuj siatkę celowniczą w środku pola widzenia (FOV).
2. Oświetlenie Köhlera. Dostosuj mikroskop do oświetlenia Köhlera²². Aby rozpocząć, zamknij przysłonę pola i patrząc przez okulary, skup się na siatce. Jeśli krawędzie przysłony pola widzenia są nieostre, wyreguluj wysokość kondensora, aż zarówno przysłona pola, jak i siatka celownicza będą ostre.
3. Dostosuj boczne położenie otworu pola, aż zostanie wyśrodkowany w stosunku do pola widzenia. Zamknij otwór pola, aż zaświeci się tylko środkowa siatka na siatce.
4. Aby uzyskać zgrubne wyrównanie pozycji kamery (tj. przy pierwszym wyrównaniu ustawienia), użyj lampy o dużej intensywności przy ZAMKNIĘTEJ migawki aparatu i nie umieszczaj żadnych elementów w pudełku B (Rysunek 1) w torze optycznym, dopóki nie zostanie osiągnięty krok 2.5. Nie umieszczaj L2 i L3 na ścieżce wykrywania podczas pierwszego ustawiania kamery. Z grubsza wyśrodkuj obraz siatki celowniczej na migawki aparatu, regulując pionową i poziomą pozycję aparatu (Rysunek 2B). Wyłącz wzmocnienie EM, wyłącz oświetlenie w pomieszczeniu i otwórz migawkę aparatu.
5. Po zmniejszeniu intensywności lampy do poziomu, który nie uszkodzi matrycy kamery, rzuć światło z obrazu siatki celowniczej bezpośrednio na czujnik kamery (Rysunek 2A). Ustaw ostrość siatki, regulując pokrętło ostrości mikroskopu podczas view obraz w trybie wideo na żywo w oprogramowaniu do akwizycji. Wyśrodkuj obraz siatki celowniczej na czujniku kamery, regulując pionową i poziomą pozycję kamery (Rysunek 2B).
6. Umieść L2 i L3 w ścieżce wykrywania między przysłoną a aparatem (Rysunek 2C). Ustaw L2 i L3 w taki sposób, aby L2 znajdowała się o jedną ogniskową od punktu ogniskowego portu wyjściowego mikroskopu, a L3 była o jedną ogniskową od czujnika aparatu. Odległość między L2 i L3 powinna być idealnie równa sumie ogniskowych L2 i L3, ale można ją nieco dostosować, aby dostosować się do ograniczeń przestrzennych. Kamera i obiektywy powinny znajdować się na tej samej wysokości co port wyjściowy.
7. Należy pamiętać, że światło emitowane przez mikroskop powinno być wyśrodkowane na L2 i L3. Dostosuj odległość między L2 a mikroskopem, aby upewnić się, że obraz siatki celowniczej jest ostry zarówno w aparacie, jak i przez okulary.
8. W razie potrzeby można użyć małych translacji (np. <1 mm) L2 i L3, aby wyśrodkować obraz siatki celowniczej na matrycy aparatu.
9. Moduł dwukolorowy. Po zoptymalizowaniu pozycji kamery przymocuj elementy pokazane w ramce B (Rysunek 1) do ścieżki wykrywania. Elementy te można przymocować do zdejmowanego uchwytu, dzięki czemu cały moduł można włożyć w przypadku wielokolorowego FPALM lub wyjąć w przypadku innych zastosowań FPALM, które tego nie wymagają.
10. Przy pierwszym montażu tych komponentów dostosuj długości ścieżek każdego kanału tak, aby były równe. Wyświetl siatkę celowniczą na chipie kamery, wyreguluj M7 i M9 i/lub zamknij przysłonę detekcji (AP), aby zapobiec przestrzennemu nakładaniu się dwóch kanałów. Ustaw ostrość obrazu siatki celowniczej w odbitym kanale światła.
11. Jeśli obraz w kanale światła przechodzącego nie jest ostry, przesuń M9 (i obróć w razie potrzeby), aż obraz siatki celowniczej będzie ostry jednocześnie w obu kanałach. Należy pamiętać, że oba kanały powinny być przesunięte poprzecznie względem siebie (rysunek 2D). To przemieszczenie, zarówno w poziomie, jak i w pionie, może wpływać na szybkość naprowadzania. Aby uzyskać więcej informacji, zapoznaj się z instrukcją obsługi aparatu.
12. Zapisz migawkę skali siatki celowniczej (do późniejszego wykorzystania przy obliczaniu ogólnego powiększenia). Korzystając z oprogramowania aparatu, wybierz żądany obszar zainteresowania. Wyższa liczba klatek na sekundę będzie zazwyczaj możliwa w przypadku mniejszego obszaru zainteresowania.

3. Wyrównanie laserowe

1. Włącz lasery odczytu i aktywacji. (UWAGA: Lasery powinny być używane tylko po przeszkoleniu operatorów w zakresie bezpieczeństwa lasera.) Wszystkie drzwi do laboratorium powinny pozostać zamknięte, a podczas ustawiania laserów w laboratorium powinien znajdować się tylko przeszkolony personel. Użyj przesłon SH1 i SH2, aby zablokować odpowiednio wiązki odczytu i aktywacji, gdy nie są używane, oraz filtrów ND, aby osłabić moc lasera do bezpiecznego poziomu (<1 mW). Pomocne jest zminimalizowanie całego oświetlenia pomieszczenia podczas wyrównywania, z wyjątkiem oświetlenia potrzebnego dla bezpieczeństwa.
2. Zablokuj wiązki aktywacji i odczytu. Usuń L1 ze ścieżki lasera.
3. Umieść białą kartę równo z M4. Większość dostępnych na rynku mikroskopów złożonych ma wbudowaną migawkę, która blokuje wpadające oświetlenie. Jeśli to możliwe, otwórz migawkę mikroskopu i ustaw ostrość, aż obraz siatki celowniczej zostanie wyświetlony na M4. Jeśli wewnętrzna migawka mikroskopu nie jest dostępna, użyj zewnętrznej migawki w dogodnym miejscu, które blokuje przedostawanie się wszystkich wiązek laserowych do mikroskopu.
4. Laser centrujący odczyt w polu widzenia. Odblokuj wiązkę odczytu. Wyśrodkuj wiązkę odczytu na krzyżu nitkowym obrazu siatki celowniczej na M4, dostosowując M1.
5. Rzutuj obraz siatki celowniczej na M5 i dostosuj lustro M4, aż wiązka zostanie wyśrodkowana na krzyżu nitkowym obrazu na M5, tak aby wiązka odczytu była wyśrodkowana z krzyżykiem celownika zarówno na M4, jak i M5. Zablokuj wiązkę odczytu.
6. Laser aktywacyjny centrujący w polu widzenia. Wyświetl obraz siatki celowniczej na M3 i usuń ekspander wiązki (BE) ze ścieżki lasera. Odblokuj wiązkę aktywacyjną.
7. Dostosuj M2, aby wyśrodkować wiązkę aktywacji na krzyżu nitkowym obrazu siatki celowniczej na M3. Po wyśrodkowaniu zamień BE między M2 i M3 i dostosuj położenie BE, aż wiązka zostanie wyśrodkowana na krzyżu nitkowym obrazu siatki celowniczej na M3.
8. Używając obiektywu 10X, wyświetl obraz siatki celowniczej na M5, w razie potrzeby regulując pokrętło ostrości mikroskopu, aby uzyskać ostrość. Dostosuj kąt DM1, aż wiązka aktywacyjna zostanie wyśrodkowana na obrazie siatki celowniczej. Zablokuj obie belki.
9. Gdy nie ma założonego obiektywu i otwarta migawka mikroskopu, wyświetl laser odczytu przez tylny otwór mikroskopu. (UWAGA: Ten krok stwarza zagrożenie bezpieczeństwa lasera poprzez skierowanie równoległej wiązki laserowej po niezablokowanej ścieżce pionowej.) Reguluj M5 tak, aż wiązka wyjdzie prosto z mikroskopu i wyląduje na suficie bezpośrednio nad nim lub zostanie wyśrodkowana na karcie umieszczonej na uchwycie obiektywu w wieżyczce.
10. OPCJONALNIE: Określenie prawidłowego wyrównania może być ułatwione przez użycie próbki barwnika w roztworze (w tym przypadku rodaminy B o stężeniu ~100 μM w wodzie lub metanolu o głębokości >0,5 cm do celów wizualnych), umieszczonej na stoliku próbki z założoną soczewką obiektywu 60X. Jeśli wiązka jest prawidłowo ustawiona, obiektyw będzie emitował stożek fluorescencji wyrównany z osią obiektywu i mikroskopu. Niewielkie odchylenia w rozmieszczeniu wiązki laserowej w tylnej aperturze obiektywu spowodują, że stożek odchyli się od czysto pionowego ustawienia.
11. Zablokuj obie belki. Zamontuj L1 na ścieżce lasera w odpowiedniej odległości (tj. jednej ogniskowej) od tylnej apertury soczewki obiektywu. Po umieszczeniu obiektywu 60X pozwól, aby wiązka odczytu wyświetlała się na suficie. Dostosuj położenie poziome i pionowe L1 (prostopadłe do kierunku propagacji lasera), aż wiązka zostanie wyśrodkowana nad mikroskopem. Uwaga: w tym kroku belka utworzy większą plamkę niż w poprzednim kroku.
12. Położenie osiowe L1 i jego ogniskowa będą miały wpływ na wielkość oświetlanego obszaru na próbce. Ściśle mówiąc, obliczenia profilu oświetlenia na próbce muszą uwzględniać dyfrakcję²³. Z grubsza rzecz biorąc, umieszczenie L1 w odległości osiowej innej niż jedna ogniskowa od tylnej płaszczyzny ogniskowej obiektywu w wielu przypadkach spowoduje mniejszy, bardziej intensywny profil oświetlenia laserowego niż wtedy, gdy L1 znajduje się dokładnie na jednej ogniskowej od tylnej płaszczyzny ogniskowej. Mniejszy oświetlony obszar może być wykorzystany do wytworzenia większej intensywności lasera w niektórych zastosowaniach, takich jak na przykład obrazowanie z dużą prędkością.
13. Pomiar profilu belki odczytowej. Po założeniu L1 umieścić próbkę odpowiedniego stężonego roztworu barwnika (w tym przypadku rodaminy B o stężeniu ~100 μM w wodzie) na stoliku.
14. Gdy laser aktywacyjny jest zablokowany, wyświetl laser odczytujący (wyreguluj ND1, aby uzyskać moc <<1 mW dla wszystkich naświetlonych wiązek) przez obiektyw 60X i do barwnika, a następnie (przy wyłączonym wzmocnieniu EM) wyślij ten obraz do kamery.
15. Skoncentruj obiektyw na próbce. Na tym etapie potrzebna jest wystarczająco duża apertura, aby umożliwić obrazowanie pełnego profilu wiązki.
16. Przesuń AP na boki tak, aby środek profilu belki i AP były koncentryczne. Korzystając z oprogramowania kamery, wybierz obszar zainteresowania, aby umożliwić najmniejszy obszar odczytu z kamery obejmujący oba kanały. Zapisz te współrzędne. Zapisz pojedynczą migawkę (jest to profil wiązki odczytu).
17. Obrazy, które dokładniej odzwierciedlają profil lasera w płaszczyźnie ogniskowej, zostaną uzyskane, gdy próbka roztworu barwnika będzie jak najcieńsza. Taką cienką próbkę można uzyskać, umieszczając kroplę ~5 ul roztworu barwnika między szkiełkiem mikroskopowym a szkiełkiem nakrywkowym.
18. Pomiar profilu wiązki aktywacyjnej. Zablokuj laser odczytu. Rzutować laser aktywacyjny na próbkę; i wyświetl ten obraz w aparacie.
19. W razie potrzeby użyj wzmocnienia EM <100 i dostosuj DM1, aż wiązka zostanie wyśrodkowana w każdym polu widzenia. Zapisz migawkę profilu wiązki aktywacyjnej.
20. Zmierz moc każdej wiązki. Usuń roztwór barwnika i umieść czujnik miernika mocy nad obiektywem 60X (bez mediów zanurzeniowych). Zmierz moc każdej wiązki (aktywacja i odczyt) osobno. Należy pamiętać, że położenie miernika mocy należy dokładnie wyregulować, aby upewnić się, że cała emitowana moc lasera uderza w czujnik miernika mocy.
21. Dla każdego lasera należy użyć filtrów o neutralnej gęstości (ND1 i ND2), aby dostosować moc do intensywności uzyskiwania w próbce odpowiedniej dla eksperymentu.
22. Intensywność lasera odczytującego do akwizycji obrazu. Intensywność lasera odczytowego powinna być wystarczająco wysoka, aby wzbudzić i fotowybielać pojedyncze cząsteczki w ciągu kilku klatek. Typowe wartości to 10^{3-10 4} W/^cm2 (patrz także Gould i wsp.⁴). Intensywność próbki zależy od wielkości obszaru obrazu, więc moc wymagana do osiągnięcia pożądanej intensywności będzie się różnić w zależności od systemu.
23. Intensywność aktywacji lasera. Intensywność lasera aktywacyjnego powinna być tak dobrana, aby liczba aktywnych cząsteczek była mała (np. 1-100) w dowolnym układzie akwizycji. Z grubsza rzecz biorąc, pożądana gęstość jest osiągana, gdy najbliższa odległość między cząsteczkami aktywnymi jest nieco większa niż rozdzielczość ograniczona dyfrakcją (patrz również Sekcja 6, Obrazowanie). Wraz ze zmniejszaniem się populacji nieaktywnych pojedynczych cząsteczek wymagane są większe intensywności lasera aktywacyjnego. Typowe intensywności to ^{10-1-10 2} W/cm².
24. Zoptymalizuj płytę ćwierćfalową. Płytka ćwierćfalowa (QWP) jest opcjonalna, ale zwiększenie stopnia polaryzacji kołowej laserów odczytowych i aktywacyjnych za pomocą QWP może zwiększyć gęstość cząsteczek na końcowych obrazach. Aby zoptymalizować QWP, umieść polaryzator między QWP a M5. Zablokuj laser aktywacyjny. Wyświetl laser odczytu na mierniku mocy nad suchym obiektywem 60X.
25. Zapisz kąt QWP. Wyreguluj polaryzator do maksimum, a następnie osiągnięte zostaną minimalne moce. Zapisz każdą z tych wartości i oblicz stosunek wartości minimalnej/maksymalnej. Dostosuj kąt QWP i powtórz te pomiary. Chociaż pożądane jest uzyskanie wartości bliskich 1,0, do obrazowania wystarczy stosunek >0,8.

4. Tworzenie trwałej próbki koralików do wyrównania kanałów

1. Rozcieńczyć próbkę kulek fluorescencyjnych (o średnicy od 40 do 100 nm) w stosunku 1:70 w wodzie klasy HPLC. Roztwór podstawowy należy następnie rozcieńczyć w stosunku 1:15 w wodzie HPLC, aby uzyskać końcową objętość 200 μl zawiesiny kulek w wodzie.
2. Pokryj szkiełko nakrywkowe płynną poli-L-lizyną. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Odessać, aby usunąć roztwór, i umyć szkiełko nakrywkowe trzykrotnie wodą klasy HPLC. Odessać wszelkie ślady wody z szkiełka nakrywkowego i pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.
3. Odpipetować 200 μl zawiesiny kulki na szkiełko nakrywkowe. Pozostaw to szkiełko nakrywkowe na 20 minut w temperaturze pokojowej przed trzykrotnym umyciem wodą z HPLC. Alternatywnie, pozostawić szkiełko nakrywkowe O/N w temperaturze RT, aby zawiesina wyschła.
4. Używając ~20 μl wody HPLC lub podłoża montażowego, zamontuj szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym. Uszczelnij obwód szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci. Po wyschnięciu lakieru umieść szkiełko nakrywkowe (i odpowiednie medium do zanurzania obiektywu; wodę lub olej) na obiektywie 60X.

5. Akwizycja obrazu: próbka koralików obrazowania w celu wyrównania kanałów detekcji

1. Oświetl próbkę koralików wiązką laserową odczytu o intensywności około 10 razy mniejszej niż zostanie użyta do obrazowania. Po ustawieniu wzmocnienia EM na 100 wyświetl obraz do kamery i dostosuj ostrość, aż koraliki będą widoczne w obu kanałach.
2. Jeśli koraliki są przyciemnione, zwiększ moc lasera lub wzmocnienie EM. Minimalizacja szumów w obrazach perełkowych (poprzez wykrywanie dużej liczby fotonów, tj. w sumie co najmniej 5 000 z każdego koralika) ma kluczowe znaczenie dla dokładnej rejestracji kanałów. Skonfiguruj kamerę tak, aby rejestrowała 100 klatek, z takim samym czasem ekspozycji, jaki będzie używany do późniejszego obrazowania FPALM.
3. Wyszukaj regiony, w których koraliki są rozmieszczone zarówno w środku, jak i na obrzeżach kanałów i gdzie gęstość ściegów jest na tyle niska, że poszczególne koraliki są dobrze oddzielone i można je indywidualnie zidentyfikować.
4. Uzyskaj od 10 do 20 zestawów obrazów różnych regionów przy tych gęstościach koralików. Zapoznaj się z sekcją wyników, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat używania obrazów koralików do kalibracji kanałów.

6. Akwizycja obrazu: Wielokolorowy FPALM

1. Ważne jest, aby obrazować komórki, które zostały transfekowane tylko jednym z każdego z konstruktów, a także rejestrować obrazy komórek wszystkimi konstruktami. Dane te pomogą w ustaleniu histogramów alfa każdej z użytych sond i są wymagane do interpretacji danych wielokolorowych.
2. Znajdź komórki wyrażające sondy fotoprzełączalne, jeśli są używane. Wyeliminuj całe oświetlenie w pomieszczeniu. Rzutować lampę rtęciową za pomocą uchwytu typu flip mount (FM) na próbkę (zawierającą transfekowane komórki). Zmień kostkę filtra wieżyczkowego na taką, która zawiera odpowiednią kombinację zwierciadła dichroicznego/filtra, aby umożliwić wzbudzenie stanu sprzed fotoprzełącznika etykiety. Na przykład do obrazowania prephotoswitched Dendra2 lub sond z zieloną wstępnie przełączoną emisją, jednym z wyborów dla DM4 jest dichroik, który odbija niebieskie światło (<488 nm), a dla F5 jest filtr, który przepuszcza światło z zakresu ~500-570 nm, jednocześnie blokując światło poza tym zakresem.
3. Za pomocą okularu poszukaj komórek, które wyrażają sondę przed zdjęciem. Na przykład komórki wyrażające Dendra2 będą wyświetlane na zielono. Należy pamiętać, że nie wszystkie sondy są fotoprzełączalne, a te, które są wstępnie przełączane, mogą wymagać kombinacji DM4/F5 innych niż wymienione tutaj.
4. Po wybraniu komórki przesuń FM w dół, aby umożliwić laserom przejście do mikroskopu (zablokuj światło rtęci ze ścieżki). Zmień wieżyczkę filtra na taką, która zawiera odpowiedni dichroik do obrazowania (w tym przypadku DM2 powinien odbijać zarówno odczyt, jak i laser aktywacyjny, transmitując dłuższe fale, a F1 powinien przesyłać fale na czerwono lasera i najlepiej charakteryzować się wysokim tłumieniem na długości fali lasera).
5. Jeśli komórki nie wyrażają sondy fotoprzełączalnej, należy poszukać komórek, wyświetlając obraz do kamery i używając lasera odczytującego do oświetlenia próbki. Pojedyncze cząsteczki będą prawdopodobnie widoczne (patrz ryc. 3) w wielu komórkach.
6. Aby odróżnić transfekowane komórki od fluorescencji tła (która nadal może wyglądać jak pojedynczo cząsteczki) i potwierdzić, że cząsteczki są fotoaktywowane, należy krótko oświetlić próbkę niską mocą lasera aktywacyjnego (zwykle rzędu mikrowatów). Liczba fotoaktywowanych cząsteczek widocznych pod wiązką odczytową powinna dramatycznie wzrosnąć i utrzymywać się na wysokim poziomie przez krótki czas, nawet po ponownym zablokowaniu oświetlenia aktywacyjnego. Należy pamiętać, że różne sondy mogą się znacznie różnić pod względem jasności, wydajności fotokonwersji i mocy lasera wymaganej do aktywacji^24-27.
7. Przygotuj oprogramowanie aparatu do akwizycji serii kinetycznej, ustawiając wzmocnienie EM na 200 i wybierając żądaną liczbę klatek (zwykle 5 000-10 000) oraz czas naświetlania (zwykle 10-30 ms jest odpowiednie). Podczas gdy wzmocnienie EM można ustawić na poziomie wyższym niż 200, powyżej pewnego punktu zwiększenie wzmocnienia EM może zwiększyć szum.
8. Zablokuj wiązkę aktywacyjną. Odblokuj wiązkę odczytu i wyświetl obraz oświetlonej komórki do kamery.
9. Upewnij się, że komórka jest transfekowana (krok 6.6). Podczas oglądania komórki dostosuj ostrość, aż żądana płaszczyzna ogniskowej znajdzie się w polu widzenia, a cząsteczki będą ostre
.
10. Aby wybrać płaszczyznę ogniskowej, która obrazuje w pobliżu dolnej błony komórkowej, przesuń ostrość w dół, aż poszczególne cząsteczki przestaną być widoczne. Następnie stopniowo przesuwaj ostrość w górę, aż cząsteczki staną się po raz pierwszy widoczne.
11. Aby obrazować w pobliżu górnej błony komórkowej, kontynuuj przesuwanie ostrości w górę o żądaną wartość, zwracając uwagę na odległość za pomocą pokrętła ostrości mikroskopu lub automatycznego ustawiania ostrości. Wybranie obszaru ostrości między tymi dwoma limitami spowoduje, że obszar w środku komórki będzie obrazowany.
12. Odblokuj wiązkę aktywacyjną i oświetl próbkę o niskiej intensywności (użyj filtrów ND2, aby stłumić wiązkę do bardzo niskiej intensywności, około <1 W/^cm2 na próbce).
13. Rozpocznij pobieranie danych. Pożądana jest wysoka gęstość aktywnych cząsteczek; Jednak dla etapów analizy kluczowe znaczenie ma to, aby cząsteczki te nie nakładały się na siebie przestrzennie.
14. Spróbuj utrzymać gęstość widocznych fotoaktywowanych cząsteczek na poziomie ~0,1-1 ^μm-2 poprzez dostosowanie ND2. Zazwyczaj dla obszaru obrazu o średnicy ~10-20 μm będzie widocznych jednocześnie ~10-100 cząsteczek (patrz rysunki 3 i 4 w celach informacyjnych). Ponieważ liczba pozostałych nieaktywnych cząsteczek zmniejsza się w trakcie akwizycji, moc lasera aktywacyjnego może wymagać stopniowego zwiększania, aby utrzymać gęstość.
15. Jeśli pożądane jest obrazowanie TIRF*, M5 i L1 powinny być zamontowane na jednym stoliku translacyjnym (TS, rysunek 1), który należy przesuwać na boki (tj. w kierunku prostopadłym do lasera tuż za wejściem do mikroskopu). W miarę translacji M5 i L1 lasery wychodzące z obiektywu w górę przez próbkę będą stopniowo przechylać się na jedną stronę (UWAGA: zagrożenie bezpieczeństwa lasera).
16. Gdy kąt laserów osiągnie 90 ° od pionu, wyłaniający się laser sam zniknie, przychodzący laser odczytowy zostanie odbity wstecznie, pojawiając się jako wiązka wychodząca z tylnej apertury obiektywu, antyrównoległa do przychodzącej wiązki i przemieszczona na bok.
17. Jednocześnie fluorescencja tła zostanie prawie całkowicie osłabiona, a grubość obszaru próbki zawierającego dostrzegalne, skupione pojedyncze cząsteczki zostanie znacznie zmniejszona.
    *TIRF pozwoli na obrazowanie cienkiego przekroju próbki, który znajduje się ~100-500 nm powyżej szkiełka nakrywkowego. Obrazowanie płaszczyzn ogniskowych, które znajdują się dalej w próbce, można łatwo uzyskać przy użyciu oświetlenia szerokokątnego (sekcja 3), ale nie jest odpowiednie dla TIRF.
    
18. Po zakończeniu akwizycji natychmiast zamknij migawkę mikroskopu i zablokuj obie wiązki. Wyłącz wzmocnienie EM, ustaw kamerę tak, aby nagrywała jedną klatkę i ustaw maksymalny rozmiar obszaru odczytu kamery.
19. Zablokuj jeden kanał, umieszczając kartę nad F3 lub F4. Za pomocą filtra długoprzepustowego (>580 nm) zamontowanego na lampie mikroskopu oświetlić próbkę i wyświetlić ten obraz do kamery. Nagraj migawkę komórki.
20. OPCJONALNIE: Przy nadal zablokowanym jednym kanale otwórz otwór tak, aby duży obszar próbki był widoczny przez oświetlenie światłem przechodzącym. Nagraj migawkę. Te obrazy w świetle przechodzącym są bardzo pomocne w przeglądaniu kontekstu odpowiadających im obrazów FPALM.
21. Obrazowanie żywych komórek. Aby zobrazować żywe komórki, należy wykonać transfekcję komórek zgodnie z krokami 1.1-1.3, ale nie utrwalaj tych próbek. Zamiast tego należy w pełni wyrównać konfigurację zgodnie z powyższym opisem, ale przed próbkowaniem należy usunąć je z temperatury 37 °C i 5% CO_{2 ,} przemyć 3 razy w PBS i zanurzyć próbkę w mediach obrazowych (np. PBS z 20 mM glukozy). Usunięcie pożywek hodowlanych i mycie zmniejszy tło związane z większością pożywek komórkowych.
22. W razie potrzeby próbki mogą być obrazowane w temperaturze pokojowej, tak jak w przypadku komórek stałych, lub w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ za pomocą stolika inkubacyjnego zamontowanego na stoliku mikroskopu. Pojedyncza próbka komórek NIH 3T3 powinna być zanurzona w pożywkach obrazowych na nie dłużej niż około 1 godzinę. Pomocne może być monitorowanie, jak komórki reagują na zanurzenie w pożywkach obrazowych przed przygotowaniem się do tego rodzaju eksperymentów, aby zoptymalizować czas zanurzenia i potencjalnie skład pożywki obrazowej w celu zmniejszenia zaburzeń komórek.

Results

Hemaglutynina grypy (HA) tworzy klastry rzędu dziesiątek nanometrów do mikrometrów, a klastry te zmiennie kolokalizują się z aktyną (Rysunek 5). Te rozkłady przestrzenne potwierdzają obrazowanie tych dwóch białek w grubej skali²⁸ oraz zależność rozkładów przestrzennych HA od aktyny¹⁹. Wielokolorowe obrazy FPALM mogą być dalej wykorzystywane do opisania gęstości, obszaru i obwodu tych klastrów oraz stopnia kolokalizacji między tymi dwoma gatunkami zarówno w nano-, jak i mikroskali. R...

Discussion

Obrazowanie w superrozdzielczości oparte na lokalizacji zapewnia wiele potężnych możliwości obrazowania biologicznego. Droga od pojedynczych elementów optycznych umieszczonych na stole do funkcjonalnego mikroskopu superrozdzielczego, zdolnego do jednoczesnego obrazowania wielu gatunków fluorescencyjnych w próbce biologicznej, wiąże się z wieloma wyzwaniami. Niektóre aspekty wyrównania są bardziej krytyczne niż inne; Poniżej staramy się udzielić wskazówek potencjalnym użytkownikom zajmującym się najtrudniejszymi aspektami...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Komory LabTek II	Nunc
Koraliki fluorescencyjne	Invitrogen	F-8801	Koraliki do kalibracji Koraliki
Tetraspeck	Invitrogen	T-7279	Czterokolorowe koraliki do kalibracji
Obiektywowy olejek immersyjny	Zeiss	518F	Olejek immersyjny do obiektywu o wysokim NA (w zależności od wyboru obiektywu)
HPLC woda	Fisher Scientific	W5-4
Media	ATCC	30-2003	Lub Cellgro 10-090
Antybiotyki	GIBCO	15070-063
surowica	Thermo Scientific	SH30087.03
Lipofectamine	Invitrogen	52887
Optimem I	GIBCO	11058-021
Trypsyna	MPBiomedicals
paraformaldehyd	Fisher Scientific	AA433689M	UWAGA: Toksyczny