Wykorzystanie zautomatyzowanego systemu śledzenia 3D do rejestrowania osobników i ławic dorosłych ryb pręgowanego

Podsumowanie

Opisano użycie automatycznego systemu wideo 3D, który może śledzić pojedyncze osoby i grupy danio pręgowanych. Jako przykład zastosowania badamy wpływ antagonisty receptora NMDA MK-801 na ławice danio pręgowanego.

Streszczenie

Podobnie jak wiele zwierząt wodnych, danio pręgowany (Danio rerio) porusza się w przestrzeni 3D. Dlatego lepiej jest użyć systemu nagrywania 3D do badania jego zachowania. Prezentowany system automatycznego śledzenia wideo osiąga to dzięki zastosowaniu systemu luster i procedury kalibracji, która koryguje znaczny błąd wprowadzony przez przejście światła z wody do powietrza. Dzięki temu systemowi możliwe jest nagrywanie zarówno pojedynczych, jak i grup dorosłych ryb danio pręgowanego. Przed użyciem system musi zostać skalibrowany. System składa się z trzech modułów: Nagrywanie, Rekonstrukcja Ścieżki oraz Przetwarzanie Danych. Przedstawiono instrukcje krok po kroku dotyczące kalibracji i korzystania z trzech modułów. W zależności od konfiguracji eksperymentalnej, system może być używany do testowania neofobii, awersji do białych, spójności społecznej, upośledzenia motorycznego, eksploracji nowych obiektów itp. Jest szczególnie obiecujący jako pierwsze narzędzie do badania wpływu leków lub mutacji na podstawowe wzorce zachowań. System dostarcza informacji o pionowym i poziomym rozmieszczeniu danio pręgowanego, o składowych xyz parametrów kinematycznych (takich jak lokomocja, prędkość, przyspieszenie i kąt skrętu) oraz dostarcza danych niezbędnych do obliczenia parametrów spójności społecznej podczas badania ławic.

Wprowadzenie

Danio pręgowany stał się ważnym modelem dla badań biologicznych i farmakologicznych^1-3. Nieocenione jest śledzenie wzorców ruchu i rozmieszczenia przestrzennego poszczególnych danio pręgowanego i ławic danio pręgowanego. W starszych badaniach stosuje się ręczną kwantyfikację na podstawie zarejestrowanych obrazów⁴. Obecnie powszechnie stosowane są automatyczne systemy śledzenia wideo 2D⁵. Ponieważ jednak danio pręgowany i wiele innych zwierząt wodnych i niewodnych porusza się w przestrzeni trójwymiarowej, zainteresowanie systemami 3D rośnie⁶. Opisany system 3D został po raz pierwszy opublikowany w 2007 roku⁷. Szczegóły techniczne i porównania z innymi systemami znajdują się w^{punkcie 8}. Podstawową zaletą tego systemu w porównaniu z innymi systemami jest to, że uzyskuje on dwa (opcjonalnie trzy) synchroniczne i niezależne widoki za pomocą systemu lustrzanego oraz wykorzystuje dwustopniowy protokół kalibracji. W pierwszym kroku kalibrowana jest geometria 3D systemu stereo (utworzona przez kamerę i lustra). W drugim kroku korygowane są błędy nieliniowe wprowadzone przez załamanie światła. Podczas badania zwierząt wodnych wpływ załamania światła może być znaczny, gdy nie zostanie skorygowany. Inne dotychczas opublikowane systemy (nawet nowsze opracowania⁹) pomijają dwuetapową procedurę kalibracji. Aby uzyskać szczegółowe informacje techniczne na temat identyfikacji obiektów, okluzji ze śledzeniem wielu obiektów, szumu jigowania itp. Czytelnika odsyłamy do oryginalnych publikacji^8,9. System został zwalidowany do badania reakcji behawioralnych podobnych do lęku^10,11, ławic^8,11,12 oraz, w badaniu wstępnym, pod kątem zachowań antagonistycznych u danio pręgowanego¹³. Został również przetestowany na innych gatunkach ryb (złota rybka⁸, mieczyk, brzanka tygrysia) oraz na myszy⁹.

Poniżej opisano protokoły kalibracji i korzystania z systemu, a wyniki eksperymentu testującego wpływ niekonkurencyjnego antagonisty receptora NMDA, MK-801, na ławicę danio pręgowanego, przedstawiono jako reprezentatywny przykład demonstrujący rodzaj danych, które można uzyskać za pomocą systemu.

Zarówno w naturalnym środowisku, jak i w akwariach, danio pręgowany zazwyczaj pływa w ławicach¹⁴. Preferencje dotyczące płycizny wydają się zależeć od kilku czynników, takich jak hodowla, płeć i dostępność pożywienia^14,15. Co ciekawe, odległość między poszczególnymi danio pręgowanymi w ławicy zmniejsza się, gdy pojawiają się sygnały o potencjalnym zagrożeniu, takie jak feromony alarmowe¹⁶ lub nowość¹¹. Paradygmat płycizny jest zatem również wykorzystywany do testowania leków przeciwlękowych¹⁷. Hierarchie dominacji¹⁸ i społeczne uczenie się¹⁹ są fascynującym aspektem zachowania danio pręgowanego. Ze względu na wysoko rozwinięty charakter zachowań społecznych, danio pręgowany stał się również przedmiotem zainteresowania w badaniach nad autyzmem^20,21.

MK-801 zmienia zachowania społeczne u danio pręgowanego^5,22,23, co przypomina jego wpływ na ssaki²⁴. Jednak MK-801 ma również wiele innych skutków dla innych zachowań (takich jak pływanie, unikanie hamowania i preferencja miejsca^25-27). Dlatego tak ważne jest, aby we wstępnych eksperymentach uzyskać jak najwięcej informacji z podstawowych obserwacji. Będzie to stanowić podstawę do projektowania bardziej ukierunkowanych eksperymentów.

Przegląd aparatury rejestrującej i oprogramowania

W obecnej konfiguracji, pojemnik obserwacyjny (25 cm x 25 cm x 18 cm, dł. x szer. x wys.), w którym znajduje się danio pręgowany, jest umieszczony w komorze obserwacyjnej (91 cm x 46 cm x 56 cm, dł. x szer. x wys.). W komorze znajduje się również kamera, lustro zawieszone pod kątem około >45° nad pojemnikiem oraz listwy świetlne LED. Rysunek 1 przedstawia uproszczony schemat. Kamera rejestruje zarówno widok z przodu, jak i widok z góry (lustro), aby skonstruować trajektorie 3D danio pręgowanego, określając jego współrzędne x, y i z. Dla celów orientacyjnych wektory współrzędnych są prezentowane w lewym przednim rogu kontenera obserwacyjnego (położenie względem kamery), co odpowiada wektorom przedstawionym na widokach 3D (np. Rysunek 15) wygenerowanych przez Moduł Rekonstrukcji Ścieżki (patrz dalej poniżej). Częstotliwość próbkowania zależy od aparatu i komputera. W naszych eksperymentach jest to około 40 klatek/s (fps). Rozdzielczość przestrzenna rejestrowanych klatek wynosi 640 x 480 pikseli (taka konfiguracja została wybrana jako optymalna równowaga między rozdzielczością przestrzenną i czasową). Wymagany jest system Windows XP lub nowszy.

Przed pierwszym zapisem system musi zostać skalibrowany, aby określić położenie ścianek pojemnika i powierzchni wody, określić współczynnik skalowania zarejestrowanych klatek i dostosować się do znacznego błędu generowanego przez załamanie światła podczas przechodzenia z wody do powietrza. Zasadniczo kalibrację należy przeprowadzić tylko podczas początkowej instalacji i po przeniesieniu lub wymianie części zestawu, takich jak kamera lub lustro. Niemniej jednak dobrą praktyką jest od czasu do czasu sprawdzanie, czy kalibracja jest nadal prawidłowa i w razie potrzeby ponowna kalibracja.

Oprogramowanie składa się z trzech modułów. Moduł Nagrania rejestruje klatki (dwie przykładowe klatki pokazano na rysunku 2). Moduł trajektorii rekonstruuje ścieżki dla każdego danio pręgowanego. Moduł Przetwarzania Danych oblicza szereg standardowych parametrów kinematycznych i przestrzennych. W celu dalszej analizy dane można zaimportować do arkusza kalkulacyjnego lub oprogramowania statystycznego.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem Narodowego Instytutu Zdrowia dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.

1. Kalibracja

1. Umieść pusty pojemnik obserwacyjny w komorze tak, aby nóżki pojemnika zostały włożone w otwory przewidziane do prawidłowego ustawienia. Ustaw pojemnik w taki sposób, aby półprzezroczyste ścianki (celem ich konstrukcji jest redukcja odbić) były skierowane na dalszą stronę i na prawo od aparatu.
2. Otwórz moduł nagrywania, wybierz "Sterowanie kamerą" i dostosuj "wzmocnienie" i "migawkę" (po ich odznaczeniu, pola po prawej stronie), aby obraz był wyraźny. Umieść lusterko boczne pod kątem około 45° po lewej stronie pojemnika obserwacyjnego, tak aby bok view pojemnika na monitorze komputera był w pełni widoczny. Ponadto lusterko musi być ustawione w taki sposób, aby przednia ściana zbiornika była widoczna jako jedna linia (jak wskazuje strzałka na rysunku 3).
3. Podłącz panel kalibracyjny do portu równoległego (karty aparatu) i naciśnij przycisk "LED panel on/off" w module nagrywania, aby włączyć diody LED.
4. Umieść panel kalibracyjny w pustym pojemniku obserwacyjnym tak, aby 5 diod LED było widocznych z przodu, z góry i z boku na monitorze komputera, jak na rysunku 3 (czasami zasłania view, w takim przypadku przesuń go). Upewnij się również, że diody LED znajdują się poniżej oznaczeń poziomu wody (oznaczenia te są wygrawerowane w pojemnikach obserwacyjnych w odległości 135 mm od wewnętrznego dna zbiornika) oraz że pozycja panelu jest stabilna (tak, aby nie poruszał się podczas napełniania pojemnika wodą w kroku 1.9).
5. Wyłącz światła w komorze obserwacyjnej i zasuń kurtynę (należy uważać, aby nie dotknąć panelu kalibracyjnego lub lusterka bocznego).
6. Naciśnij przycisk "Lokalizacja danych" i utwórz lub wybierz folder dla kalibracji files. Pliki te będą używane do wszystkich kolejnych nagrań (lub eksperymentów) do momentu, gdy konieczna będzie ponowna kalibracja. Dlatego najlepiej byłoby, gdyby dane kalibracyjne były częścią nazwy folderu kalibracji.
7. Dostosuj trzy czerwone pola na ekranie komputera tak, aby każde z nich obejmowało tylko 5 diod LED w dowolnym z trzech widoków (Rysunek 4, lewy panel). Ponownie użyj "wzmocnienia" i "migawki" w sekcji "Sterowanie kamerą", aby uzyskać wyraźne obrazy diod LED, bez obrazów innych punktów świetlnych (które są spowodowane szumem, odbiciami lub kropelkami wody na ściance pojemnika), jak na rysunku 4, prawy panel.
8. Wyłącz diody LED i naciśnij przycisk "Zbierz kalibrację bez wody". Na ekranie komputera pojawia się 5 tagów ("x") ponumerowanych od 0-4. Włącz panel. Lokalizacje tagów powinny pokrywać się z diodami LED. Jeśli nie, powtórz krok 1.7 (patrz Rysunek 4, aby zilustrować nieprawidłowe przypisanie tagów na lewym panelu i prawidłowe przypisanie tagów na prawym panelu).
9. Napełnij komorę obserwacyjną wodą do kreski. Diody LED powinny znajdować się poniżej poziomu wody (jak wyjaśniono w kroku 1.4). Jeśli znajdują się powyżej poziomu wody, opróżnij pojemnik i wróć do kroku 1.4. Podczas wlewania wody do pojemnika należy uważać, aby panel LED się nie poruszał. Jeśli jednak tak się stanie, opróżnij pojemnik i wróć do kroku 1.4. Jest to o tyle istotne, że kalibracja opiera się na określeniu różnic pomiędzy zarejestrowanymi pozycjami diod LED bez wody i z wodą.
10. Naciśnij przycisk "Zbieraj kalibrację z wodą". Ponownie, podobnie jak w kroku 1.8, na ekranie pojawi się pięć tagów, które w większości przypadków będą nieco przesunięte w stosunku do tych uzyskanych podczas kalibracji bez użycia wody. Na tym etapie może być konieczne ponowne dostosowanie wzmocnienia i migawki. Powtarzaj, aż tagi zostaną prawidłowo umieszczone na górze diod LED (jak na rysunku 4, prawy panel).
11. Włącz światła w komorze obserwacyjnej, wyreguluj wzmocnienie i migawkę (w sekcji "Sterowanie kamerą"), aby obraz nie był zbyt jasny.
12. Rysunek 5 przedstawia sześć punktów, które należy wybrać sekwencyjnie, klikając prawym przyciskiem myszy. Upewnij się, że punkty znajdują się na wyznaczonych liniach: 1. Widok z przodu poziom wody, 2. Lewy górny grzbiet kontenera w widoku z góry, 3. Pionowa linia obrysowująca ścianę przednią w widoku z boku. Długość linii nie jest istotna. Pomiędzy pozycjami kliknięcia 1 i 2, 3 i 4 oraz 5 i 6 pojawią się linie proste (liczby w rzeczywistości nie pojawią się na ekranie). Naciśnij "Zbierz informacje o kontenerze", aby zapisać te informacje.
13. Zdejmij lusterko boczne i panel LED i napełnij wodę dokładnie do kreski. Wybierz opcję "Rozpocznij nagrywanie". W nowym oknie pojawi się pytanie o czas trwania w minutach. Do obecnego celu wystarczy 1 minuta. Naciśnij przycisk OK.
14. Po nagraniu wyjdź z modułu nagrywania, otwórz moduł trajektorii, wybierz folder kalibracji (wykonany w kroku 1.6) za pomocą opcji "Lokalizacja danych" (ładowanie pliku może zająć trochę czasu). Ten folder zawiera pliki kalibracyjne i pliki z właśnie zarejestrowanymi danymi (krok 1.13).
15. Naciśnij przycisk "Uzyskaj tło". Otworzy się nowe okno, nie zmieniając niczego, naciśnij OK. Poczekaj, aż na monitorze pojawi się (odwrócony) obraz zbiornika obserwacyjnego. Następnie naciśnij "Załaduj tło". Obraz tła zostanie poprawiony. Otworzy się nowe okno z prośbą o dostosowanie pól. Wystarczy nacisnąć przycisk OK.
16. Naciśnij kolejno przyciski od trzeciego do siódmego: "Załaduj korespondencję bez wody", "Kalibruj wirtualną kamerę", "Załaduj załamaną korespondencję", "Zbierz geometrie pojemnika", "Pobierz informacje o pojemniku na zwierzęta". Ten ostatni krok może potrwać kilka minut. Jest on zakończony, gdy na ekranie pojawią się trzy białe linie (są to linie, które zostały narysowane w kroku 1.12). Naciśnij przycisk "Zapisz informacje o kontenerze".
17. Naciśnij przycisk "Zbierz głośność". Teraz, jak pokazano na rysunku 6, zaznacz kolejno 8 rogów zbiornika wodnego, który jest prostopadłościanem. Dla każdego punktu najpierw kliknij go w widoku z przodu, a następnie w widoku z góry.
18. Wybierz "3D" w lewym rogu okna. Teraz otworzy się nowe okno pokazujące kontur pudełka z białym dnem (jak na rysunku 15, ale bez trajektorii). Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać obroty i przesunięcia widoku pola. Jeśli nie pojawia się żaden obraz lub jeśli obraz nie przedstawia prostopadłościanu (np. w kroku 1.17 rogi zostały kliknięte prawym przyciskiem myszy w złej kolejności), wykonaj następujące czynności: wychodząc, ale nie zamykając modułu trajektorii, za pomocą systemu Windows przejdź do folderu kalibracji (wykonanego w kroku 1.6), wybierz podfolder "Dane kontenera zwierząt" i usuń plik o nazwie TankVertices i powtórz krok 1.17.
19. Gratulacje, kalibracja została zakończona. Idealnie byłoby, gdyby przeprowadzono próbny bieg z atrapą ryby, aby sprawdzić, czy wszystko działa dobrze. Dobrą wiadomością jest to, że ponowna kalibracja musi być przeprowadzona tylko wtedy, gdy pozycje lustra lub kamery zostały (nawet nieznacznie) zmienione lub jeśli występują problemy ze śledzeniem (patrz sekcja 3).

2. Nagrywanie

1. Umieść pojemnik obserwacyjny wypełniony wodą po brzegi wodą w komorze obserwacyjnej w taki sposób, aby nóżki pojemnika były włożone w otwory przewidziane do prawidłowego ustawienia. Ustaw pojemnik tak, aby półprzezroczyste ściany (lub białe ściany w naszym przykładzie - patrz Dyskusja) były skierowane na drugą stronę i w prawo, jak widać z kamery.
2. Włącz światła w komorze, włóż (eksperymentalną lub atrapę) rybę do pojemnika i zasłoń zasłony. Uwaga: system może rejestrować wiele ryb (patrz sekcja Reprezentatywne wyniki); Wskazane jest jednak zdobycie pewnego doświadczenia z systemem, rejestrując najpierw pojedyncze ryby.
3. Otwórz moduł Rekordy. Na ekranie pojawia się obraz widoku z przodu i z góry (lustrzanego) kontenera. Obraz może nie być idealny (np. prześwietlony, np. Rysunek 7) i może wymagać dostosowania (kolejne trzy kroki), aby uzyskać dobry kontrast między rybami a tłem (np. Rysunek 8).
4. Wybierz "Sterowanie kamerą" i w otwartym oknie "Ustawienia ogólne" dostosuj "Migawka" i "Wzmocnienie" (po odznaczeniu odpowiednich pól po prawej stronie, patrz rysunek 9) w taki sposób, aby obraz nie był prześwietlony i aby istniał dobry kontrast między rybami a tłem.
5. Po lewej stronie okna "Sterowanie kamerą" wybierz "Balans bieli/Kolor", a w nowym oknie odznacz pole "Auto" i dostosuj wartości czerwonego i niebieskiego (patrz rysunek 10), aby uzyskać najlepszy kontrast kolorów zarówno w widoku z przodu, jak i z góry.
6. Może być konieczne kilkakrotne przełączenie między regulacją koloru (w sekcji "Balans bieli/kolor") a regulacją wzmocnienia i migawki (w sekcji "Ustawienia ogólne"), aby uzyskać najlepsze ustawienia aparatu. Należy pamiętać, że nawet jeśli miałbyś być zadowolony bez żadnej regulacji, ważne jest, aby odznaczyć pola "Migawka", "Wzmocnienie" i "Auto" (jak wyjaśniono w krokach 2.4 i 2.5), w przeciwnym razie tło będzie się wahać w trakcie nagrywania, co uniemożliwi wyodrębnienie trajektorii. Nie zmieniaj żadnych innych ustawień. Po zakończeniu zamknij okno "Sterowanie kamerą".
7. Z menu głównego modułu rekordów wybierz "Lokalizacja danych", aby utworzyć lub otworzyć wcześniej utworzony folder. Zauważ, że każde nagranie (np. ryba lub ławica) otrzymuje swój własny folder, który najlepiej byłoby, gdyby był podfolderem folderu eksperymentu.
8. Naciśnij "Rozpocznij nagrywanie". Otworzy się okno z pytaniem o czas trwania nagrania w minutach (wprowadź tylko liczby całkowite). Naciśnij "OK", co rozpocznie właściwą sesję nagrywania.
9. Jeśli nagrywanie zostało zakończone, wyjdź z programu. Przed nagraniem kolejnej ryby zaleca się ponowne uruchomienie komputera. Użyj opcji Uruchom ponownie w systemie Windows, aby zachować ustawienia aparatu (z kroków 2.4 i 2.5). Konieczność ponownego uruchomienia komputera między nagraniami wynika z pewnych problemów z kartą aparatu.
10. Przed przejściem do modułu trajektorii w celu rekonstrukcji ścieżki, skopiuj i wklej podfoldery "Dane kontenera zwierzęcego" i "Dane korespondencji" z folderu kalibracji (utworzonego w sekcji pierwszej niniejszego protokołu) do każdego folderu, który został utworzony podczas nagrywania. W tych ostatnich folderach znajdują się dwa inne podfoldery, a mianowicie "Surowe dane" i "Znaczniki czasu". Pierwsza z nich zawiera wszystkie nagrane klatki w formacie JPEG; Ten ostatni zawiera informacje o całkowitej liczbie ramek i odstępach między ramkami (w ms).

3. Rekonstrukcja ścieżki

1. Otwórz moduł trajektorii, naciśnij "Lokalizacja danych", aby wybrać folder, który został utworzony za pomocą modułu rekordów, a następnie naciśnij przycisk "Ustawienia systemu", aby otworzyć "Parametry" (patrz Rysunek 11).
2. Wybierz progi kolorów widoku z góry i z dołu. Dobra wartość początkowa to 1,000. Jeśli ta wartość jest niska, oprogramowanie z większym prawdopodobieństwem zarejestruje szum. Jeśli jednak wartość jest zbyt wysoka, ryba może znajdować się poniżej zakresu wykrywania. Później (kroki 3.11 i 3.12) może okazać się konieczne ponowne dostosowanie progów kolorów. Należy również pamiętać, że górne i dolne progi kolorów nie muszą być takie same.
3. Wybierz Górne i Dolne progi rozmiaru widoku. Dobra wartość początkowa dla średniej wielkości danio pręgowanego to 10, dla bardzo dużego 20, a dla bardzo małego 5. Im wyższy próg rozmiaru, tym mniejsze prawdopodobieństwo, że będzie odbierał hałas. Jeśli jednak jest zbyt wysoki, oprogramowanie może również nie być w stanie wykryć ryby. Również w krokach 3.11 i 3.12 może okazać się konieczne ponowne dostosowanie progów rozmiaru. Należy również pamiętać, że górne i dolne progi rozmiaru nie muszą być takie same.
4. Dla "Górnego progu rozmiaru" wartość 3,000 jest zwykle dobra, a dla "Określonej długości" pozostaw ją na poziomie 220 (już ustawioną). "Liczba ryb" odnosi się do liczby ryb w zbiorniku obserwacyjnym. "Maksymalna liczba punktów" odnosi się do całkowitej liczby klatek. Zapamiętaj (lub zapisz) tę liczbę lub nieco niższą (np. 45 703 może być zapamiętane jako 45 000). Naciśnij przycisk OK.
5. Kolejno naciskaj przyciski "Załaduj korespondencję bez wody", "Kalibruj wirtualną kamerę" i "Załaduj informacje o pojemniku na zwierzęta". Komunikat o błędzie zostanie wygenerowany, jeśli podfoldery kalibracji "Dane pojemnika na zwierzęta" i "Odpowiednie dane" nie zostały skopiowane do bieżącego folderu eksperymentalnego (patrz krok 2.10). Jeśli tak, skopiuj i wklej teraz te podfoldery i ponownie naciśnij przyciski.
6. Naciśnij przycisk "Uzyskaj tło". W nowym oknie pojawi się prośba o wypełnienie "od" i "do" wartościami domyślnymi odpowiednio 0 i 100. Zamień 100 na maksymalną liczbę klatek (w przykładzie podanym w kroku 3.4 można to uprościć do 45 000). Naciśnij przycisk OK.
7. Poczekaj, aż pojawi się (zniekształcony) obraz. Następnie naciśnij "Załaduj tło", co spowoduje ustalenie prawidłowego obrazu tła. Ryba nie powinna być widoczna na tym obrazie tła. Jeśli ryba jest widoczna, spróbuj uzyskać lepsze tło z innych segmentów nagrania (np. spróbuj 0-1 000, 1 000-2 000 itd. w kroku 3.6).
8. Jeśli ryba w ogóle się nie poruszyła podczas sesji nagraniowej, jedynym sposobem na uzyskanie tła jest usunięcie ryby i zrobienie nowego krótkiego nagrania bez ryby, ale z tymi samymi ustawieniami "Sterowania kamerą" (jest to ważne). Uzyskaj tło i skopiuj podfolder "Dane w tle" do bieżącego folderu eksperymentalnego. Teraz naciśnij "Załaduj tło", nie naciskaj "Uzyskaj tło". Należy pamiętać, że otwieranie i zamykanie kurtyny często powoduje nieznaczne zmiany tła, dlatego może być konieczne dostosowanie progów w krokach 3.2 i 3.3 w celu zmniejszenia hałasu. Krok 3.11 pokazuje, jak sprawdzić szumy.
9. Po załadowaniu tła dostosuj trzy czerwone pola (za pomocą myszy), jak pokazano na rysunku 12. Pola oznaczają obszary, w których oprogramowanie szuka ryby. Zamknij pole po lewej stronie (tj. zmniejsz je do linii lub punktu), ponieważ widok z boku jest używany tylko do kalibracji (jak wyjaśniono w kroku 1.7).
10. Naciśnij przycisk "Rozpocznij generowanie trajektorii". Otworzy się okno z prośbą o podanie początkowego numeru klatki. Idź z domyślnym "0". Po naciśnięciu przycisku "OK" otworzy się okno "Przypisania tagów" (patrz Rysunek 13). Naciskaj "Krok do przodu", aż tag ("X0") pojawi się na ekranie. Jeśli przywieszka nie jest umieszczona na obrazie ryby, naciśnij przycisk "Nie", aż zostanie prawidłowo umieszczona. Następnie naciśnij "Go" (Idź). Jeśli nigdy nie zostanie przypisany poprawnie (lub wcale), mimo to naciśnij "Go" i poszukaj problemu (następny krok).
11. Rozpoczyna się rekonstrukcja ścieżki. Idealnie byłoby, gdyby znacznik zawsze (lub przynajmniej przez większość czasu) był umieszczony na obrazie ryby. Jeśli często jest umieszczany nieprawidłowo, otwórz okno "Informacje" (drugi wybór nad ekranem wideo). Rysunek 14A przedstawia idealny przypadek, w którym widoczne są tylko kontury ryb. Rysunek 14B przedstawia przypadek nadmiernego szumu, który uniemożliwia prawidłowe przypisanie znacznika. Jeśli widzisz wyraźny obraz ryby bez szumów (jak na rysunku 14A), ale znacznik nigdy lub rzadko zostanie przypisany poprawnie, to najbardziej prawdopodobnym powodem jest to, że kalibracja jest wyłączona. Ponownie skalibruj i ponownie wykonaj rekonstrukcję ścieżki. Jeśli podczas kalibracji lustro i kamery nie zostaną przesunięte, nowe dane kalibracyjne można wykorzystać do poprzednio wykonanych nagrań.
12. W przypadku nadmiernego hałasu (jak na rysunku 14B) naciśnij "Stop" w menu głównym i wybierz nowe progi koloru i rozmiaru (kroki 3.2 i 3.3). Sprawdź również, czy czerwone pola (krok 3.9) można nieco zmniejszyć (na przykład, aby wykluczyć hałas generowany przez ruchy wody na górze). Zauważ, że czasami program jest "zablokowany" (jeśli w ogóle nie można przydzielić żadnego tagu): w takim przypadku uruchom ponownie program.
13. Obserwuj trajektorię na ekranie 3D (trzeci wybór nad ekranem). Rysunek 15. stanowi przykład trajektorii. Klikając prawym przyciskiem myszy, wybierz między obrotem a translacją konfiguracji 3D.
14. Po zakończeniu trajektorii kolejno naciskaj przyciski "Zapisz" (nie "Stop", który usuwa trajektorię!), "Czyszczenie trajektorii" i "Wygładzanie trajektorii". Otworzy się nowe okno z parametrami filtra do wygładzania (Rysunek 16). Nie zmieniaj wartości domyślnych przed zdobyciem większego doświadczenia z systemem. Naciśnij "OK".
15. Do tej pory powinno być jasne, dlaczego wybór dobrych ustawień kamery (z dobrym kontrastem między rybami a tłem) przed nagrywaniem (patrz kroki 2.4-2.6) był tak ważny. Przejdź do przetwarzania danych.

4. Przetwarzanie danych

1. Najpierw spójrz na folder, który był używany do nagrywania ryb (Rysunek 17). Zawiera on podfoldery "Dane z pojemnika na zwierzęta" i "Dane korespondencji", które zostały skopiowane z folderu kalibracji (krok 2.10), podfoldery "Znaczniki czasu" i "Dane surowe", które zostały utworzone podczas rejestrowania ryb, oraz podfoldery "Dane tła" i "Trajektorie", które zostały utworzone podczas rekonstrukcji ścieżki.
2. Rysunek 17 pokazuje również, że podfolder "Trajektorie" zawiera trzy pliki. Plik point.smoothed-file to plik, który będzie używany do dalszego przetwarzania danych. W przypadku rejestracji wielu ryb (np. eksperyment z ławicą), dla każdej ryby zostanie wygenerowany osobny plik point.smoothed-file.
3. Rysunek 18 przedstawia górną część przykładowego pliku point.smoothed. Pierwsza linia podaje całkowitą liczbę próbek lub klatek, druga linia czas trwania nagrania (w minutach), a trzecia linia współrzędne (sekwencja: x, z, y) środka zbiornika wodnego względem kamery. Po niej następuje jedna linia dla każdej ramki, podając współrzędne x, y, z (w mm) dla ryby oraz czas trwania tej próbki (w sekundach).
4. Istnieją dwa sposoby przetwarzania danych zawartych w plikach point.smoothed: użycie Modułu Przetwarzania Danych lub użycie innego oprogramowania, takiego jak Excel lub MATLAB, do wykonania obliczeń, które nie są (jeszcze) włączone do Modułu Przetwarzania Danych.
5. Otwórz moduł przetwarzania danych, wybierz "Projekt" na pasku narzędzi, a następnie z menu rozwijanego wybierz "Nowy", a następnie wpisz nazwę eksperymentu. Wybierz "Edytuj projekt" na pasku narzędzi, wybierz "Dodaj do projektu" z menu rozwijanego, a następnie "Nowa grupa" i wpisz nazwę grupy (np. "Kontrole"). Zauważ, że w tej chwili nazwy projektów i grup nie są tak naprawdę używane, ale nazwy muszą być wypełnione. Utworzone foldery mogą być używane do przechowywania plików wyjściowych (patrz krok 4.10).
6. Wybierz grupę (np. "Sterowanie") w prawym oknie (patrz Rysunek 19). Pasek narzędzi zmieni się. Z menu rozwijanego wybierz "Edytuj grupę", następnie "Dodaj do grupy", a następnie "Nowe pomiary". Spowoduje to otwarcie przeglądarki. Otwórz folder utworzony podczas nagrywania (krok 2.7), wybierz podfolder "trajektorie", a następnie plik point.smoothed. W przykładzie przedstawionym na rysunku 19 dla Grupy A załadowano sześć plików, a dla Grupy B cztery pliki. (Odnotuj, że w zilustrowanym przykładzie wygładzone pliki mają rozszerzenia 0 i 1, ponieważ w owym eksperymencie dwie złote rybki były testowane równocześnie).
7. Do analizy wybierz plik wygładzony punktowo w prawym oknie, wybierz "Przetwarzanie danych", wybierz "Pojedyncze punkty końcowe" z menu rozwijanego i na przykład wybierz "Zamrażanie czasu trwania" (Rysunek 20). Otworzy się okno, w którym można określić zamrożenie pod względem progu prędkości i progu czasu trwania. W tym przykładzie ryba spędza 25,86 % czasu obserwacji na zamrażaniu.
8. Aby zapoznać się z programem, wypróbuj inne przykłady, takie jak odległość podróży, rozkład głębokości (który pozwala określić liczbę poziomów głębokości) i częstotliwość serii.
9. Istnieją bardziej zaawansowane obliczenia, takie jak analiza spektralna na przykład składowej z przyspieszenia. W takim przypadku wybierz "Cechy szeregów czasowych", a następnie "Analiza domeny częstotliwości TD", "Analiza spektralna" i "Widmo akceleriału Z". Analiza Fouriera zostanie przeprowadzona na wskazanym parametrze (dla wyjaśnienia⁷). Nie wszystkie opcje wyświetlane w menu są jeszcze w pełni zaimplementowane. Na przykład "Krętość ścieżki" została dodana tylko eksperymentalnie.
10. Po wybraniu opcji "Przetwarzanie wsadowe przy użyciu progu domyślnego" zostanie obliczonych około 200 punktów końcowych. W tym kontekście wartość "default" oznacza, że ograniczniki zostały ustawione. Na przykład obecnie rozkład głębokości jest obliczany dla trzech poziomów głębokości, rozkład kątowy jest obliczany dla czterech przekrojów (tj. kwadrantów) itd. Po wygenerowaniu parametrów otwiera się nowe okno z prośbą o podanie lokalizacji i nazwy pliku, który ma zostać utworzony. Zostaną one zapisane w formacie CSV i można je zaimportować do innego oprogramowania, takiego jak Excel, w celu dalszego przetwarzania.
11. W przeciwieństwie do Modułu Rejestrującego i Modułu Trajektorii, Moduł Przetwarzania Danych jest modułem ewoluującym, który będzie dalej dostosowywany do wymagań badaczy.

Wyniki

Sześciomiesięczne samice danio pręgowanego (Danio rerio) nieokreślonego szczepu typu dzikiego („short-fin”) zakupiono w firmie Aquatica Tropicals, Inc. W badaniach wykorzystano łącznie 120 ryb. Przed rozpoczęciem eksperymentów ryby aklimatyzowano do warunków laboratoryjnych przez około 8 tygodni w akwariach o pojemności 38 L. Temperatura wody odpowiadała temperaturze pokojowej (~23° C). Reżim oświetleniowy: 14 h światła (6:00-20:00), 10 h ciemności. Ryby karmiono trzy razy dziennie: o 8:00 płatkami Tetra tropical, o 12:00 żywymi larwami solankowców, o 15:00 płatkami Tetra tropical. W dniach przeprowadzania eksperymentów ryby karmiono płatkami wyłącznie o 8:00. Bezpośrednio po drugim pomiarze ryby poddano eutanazji przy użyciu 300 mg/L metansulfonianu tricainy (MS-222).

W grupie kontrolnej wykorzystano 14 czwórek (i.e. grup po cztery danio przebrzne) (n =14), a w grupie MK-801 16 czwórek (n = 16). Po 1 h ekspozycji na 10 µM MK-801 (rozpoczętej o 9:30) w pojemnikach o pojemności 1 L, czwórki przeniesiono do pojemników obserwacyjnych. Nagrywanie rozpoczęto natychmiast (o 10:30), a trwało ono 20 min. Następnie ryby pozostawiono w pojemnikach na 3,5 h. W tym czasie zapewniono napowietrzanie za pomocą rurki podłączonej do pompy powietrznej. O 14:00 wykonano drugie 20 min nagrywanie. Celem dwóch nagrań było zbadanie efektów habituacji i/lub słabnącego działania leków (okres półtrwania MK-801 u szczurów wynosi około 2 h²⁸). Analizowano (1) średnie dystanse społeczne (nazywane również dystansami międzyindywidualnymi^11,29) jako miarę spójności społecznej, (2) rozkład pionowy w obrębie dziesięciu poziomów głębokości, (3) rozkład poziomy w obrębie czterech stref radialnych (patrz Rycina 24A, wstawka w celu zlokalizowania stref) oraz w obrębie kwadrantów (patrz Rycina 24B, wstawka w celu zlokalizowania kwadrantów) oraz (4) trzy składowe (x,y,z) przebytej odległości. Dane uśredniono dla każdego ławicy. Po tym, jak testy Shapiro-Wilkinsa wykazały, że nie wszystkie zmienne mają rozkład normalny, zastosowano testy U Manna-Whitneya dla wszystkich zmiennych w celu porównania średnich w grupach kontrolnej i MK-801. Porównania te przeprowadzono oddzielnie dla sesji porannej i popołudniowej. Przyjęto α = 0,05/4 = 0,0125, ponieważ wykorzystano cztery (grupy) zmiennych (patrz wyżej).

Rysunek 2A przedstawia typową klatkę obrazu dla grupy kontrolnej danio pręgowanych, a Rysunek 2B typową klatkę obrazu dla ryb traktowanych MK-801, obie zarejestrowane podczas porannej sesji. Należy zauważyć, że ryby kontrolne znajdowały się blisko dna, blisko przedniej ścianki (t.j. strony najbliższej kamerze) i trzymały się blisko siebie (t.j. spójność społeczna była wysoka). W przeciwieństwie do nich, ryby traktowane MK-801 znajdowały się blisko powierzchni, nie wykazywały żadnych preferencji w płaszczyźnie poziomej i pływały w znacznej odległości od siebie (t.j. spójność społeczna była niska). Rysunek 21 przedstawia reprezentatywne trajektorie. Ryby kontrolne wykazywały wyraźną tendencję do pozostawania przy przedniej ściance pojemnika obserwacyjnego. Ponadto przez większość czasu przebywały blisko dna. Z kolei ryby traktowane MK801 pływały w dowolnych miejscach w płaszczyźnie poziomej. Wykazywały one jednak wyraźną preferencję dla górnych poziomów głębokości o godzinie 10:30. O godzinie 14:00 ich rozkład pionowy stał się bardziej jednorodny.

Ilościowa analiza danych potwierdziła nasz opis. Rycina 22A pokazuje, że średni dystans społeczny (t.j. średnie odległości międzyosobnicze pomiędzy czterema danio pręgowanymi w czwórkach) był dla ryb poddanych działaniu MK-801 ponad trzykrotnie większy niż dla ryb kontrolnych w godzinach porannych (o 10:30), przy U = 0 i p<0.00001. Po 3,5 h habituacji (o 14:00) dystans społeczny u ryb kontrolnych wzrósł, podczas gdy u ryb poddanych działaniu MK-801 pozostał mniej więcej bez zmian. Niemniej jednak, pozostał on istotnie różny dla obu grup (U = 19, p<0.0005). Rycina 22B przedstawia przebieg czasowy dystansu społecznego dla obu grup eksperymentalnych zarówno o 10:30, jak i o 14:00.

Rozkład pionowy był również bardzo różny dla obu grup. Rycina 23 pokazuje, że zarówno rano (10:30), jak i po południu (14:00), kontrolne rybki danio spędzały większość czasu na dwóch lub trzech najniższych poziomach głębokości (i.e. na poziomach najbliższych dnu pojemnika obserwacyjnego). Z kolei rybki danio z MK-801 o godzinie 10:30 pływały przez większość czasu blisko powierzchni wody (Rycina 23A). Po 3,5 hr habituacji, o godzinie 14:00, były one rozłożone mniej więcej równomiernie na wszystkich poziomach głębokości.

Rozkład poziomy był również bardzo odmienny dla obu grup eksperymentalnych. Na Rysunku 24A widać, że danio pręgowane poddane działaniu MK-801 spędzały mniej czasu w strefie zewnętrznej oraz więcej czasu w strefie środkowej i centralnej niż ryby z grupy kontrolnej. Różnice między grupami w odniesieniu do kwadrantów były jeszcze bardziej wyraźne (Rysunek 24B). Ryby kontrolne wykazywały bardzo silną preferencję do dwóch przednich kwadrantów (1 i 4), t.j.. strony pojemnika znajdującej się najbliżej kamery. Z kolei ryby poddane działaniu MK-801 były rozłożone mniej więcej równomiernie we wszystkich czterech kwadrantach.

Jeśli chodzi o parametry kinematyczne, ograniczamy tutaj dyskusję do przebytej odległości (Rysunek 25). Zebrafish poddane działaniu MK-801 poruszały się bardziej niż zebrafish z grupy kontrolnej. Co ciekawe, różnica ta była szczególnie istotna dla komponentu y przebytej odległości. Jest to kierunek skierowany w stronę kamery (patrz Rysunek 1). Rzeczywiście, zebrafish z grupy kontrolnej przez większość czasu pozostawały blisko przedniej ścianki w kwadrantach 1 i 4 (co widać na Rysunkach 24A i 24B). Z kolei zebrafish poddane działaniu MK-801 poruszały się tam i z powrotem między przednią a tylną połową pojemnika.

W niniejszej pracy przedstawiliśmy jedynie przykładowe sposoby analizy danych uzyskanych w eksperymencie. Na tym etapie powstrzymujemy się od przypisywania wynikom jakiejkolwiek konkretnej interpretacji biologicznej. Warto jednak wspomnieć, że wykazano, iż MK-801 wywołuje wycofanie społeczne³⁰ i zmniejsza zachowania badawcze o charakterze społecznym u szczurów³¹, a także był on badany jako model negatywnych objawów schizofrenii³⁰. U ssaków powodował on również nadaktywność³¹, zachowania krążenia³², upośledzenie sensoryczne³³ oraz zmniejszenie hamowania prepulsyjnego³⁴. Chociaż nie badaliśmy tych konkretnych upośledzeń, nasze wyniki wydają się być z nimi spójne. Wymagane są bardziej specyficzne układy eksperymentalne, aby ustalić, czy opisane efekty działania MK-801 u danio pręgowanego są porównywalne do tych opisanych u ssaków. Dalsze analizy i eksperymenty byłyby również niezbędne, aby rozstrzygnąć, czy lęk, problemy z oddychaniem, dezorientacja przestrzenna, deficyt uwagi, stereotypia itp. odgrywały istotną rolę w zmienionych zachowaniach wywołanych przez MK-801 u danio pręgowanego.

Rycina 1. Schemat aparatury. Kamera rejestruje klatki (t.j. nieruchome obrazy) przedstawiające widok z przodu oraz z góry zbiornika obserwacyjnego. Klatki są zapisywane w komputerze do dalszej obróbki. Należy zwrócić uwagę na położenie wymiarów xyz, które są istotne dla opisu trójwymiarowej charakterystyki ruchów i lokalizacji danio pręgowanych. Dwie zacieniowane ścianki na rysunku (oraz dno zbiornika) zostały w naszym eksperymencie (patrz wyniki reprezentatywne) pomalowane na biało, natomiast dwie pozostałe ścianki były przezroczyste. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Rysunek 2. Przykładowe klatki. Należy zauważyć, że same widoki z przodu lub z góry charakteryzują się utratą informacji. Jest to szczególnie widoczne na panelu B, gdzie trzy danio przebrzuchane po lewej stronie wydają się znajdować w bliskim sąsiedztwie w widoku z przodu, podczas gdy widok z góry pokazuje, że nie jest to prawdą. Z drugiej strony, widok z góry nie daje żadnej informacji o odległości od dna. A) Kontrolne danio przebrzuchane. B) Danio przebrzuchane traktowane 10 µM MK-801. Należy zauważyć, że kolor (niebieski) tła został wygenerowany przez oprogramowanie do rejestracji i wybrano go w celu uzyskania dobrego kontrastu. Rzeczywisty kolor ścian z tyłu i po prawej stronie oraz dna był biały. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 3. Ustawienie lustra bocznego. Biała strzałka po lewej stronie wskazuje przednią ściankę (najbliższą kamery) w lustrze bocznym. Jeśli widoczne są dwie linie, należy skorygować położenie lustra bocznego, aż pojawi się tylko jedna linia (krok 1.2). 5 diod LED panelu kalibracyjnego jest wyraźnie widocznych we wszystkich trzech widokach. Należy zauważyć, że ze względu na włączone oświetlenie w komorze, na panelu LED widocznych jest wiele innych odbić (krok 1.4). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Rysunek 4. Tagowanie diod LED. Lewy panel pokazuje, że pięć tagów (numerowanych od 0-4) zidentyfikowanych przez procedurę kalibracyjną nie pokrywa się z rzeczywistymi diodami LED. Oprócz diod LED widoczne są inne punkty świetlne (w rzeczywistości odbicia). Na prawym panelu zredukowano wzmocnienie i czas otwarcia migawki tak, aby widoczne były tylko diody LED. Teraz pięć tagów zostało przypisanych prawidłowo (zgodnie z opisem w krokach 1.7-1.10). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Rycina 5. Gromadzenie informacji o pojemniku. Przedstawiono sekwencję sześciu punktów do zaznaczenia (poprzez kliknięcie prawym przyciskiem myszy). Linie zostaną narysowane automatycznie. Należy pamiętać, że wskazane tutaj numery nie pojawiają się na ekranie. Po zakończeniu należy nacisnąć „Collect container info” (zgodnie z opisem w kroku 1.12). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rycina 6. Pobieranie objętości. Kliknij prawym przyciskiem myszy w zaznaczonych miejscach wyznaczających narożniki masy wody: najpierw zaznacz narożnik w widoku z przodu, a następnie w widoku z góry. Następnie przejdź do kolejnego narożnika (od 1 do 8). Należy pamiętać, że osiem punktów wyznacza obrys masy wody, a nie zbiornika. Zauważ również, że podczas klikania prawym przyciskiem myszy pojawia się tylko „x0”, który znika po kliknięciu w następne miejsce (zatem liczby 1-8 nie pojawiają się w rzeczywistości na ekranie). Procedura została opisana w kroku 1.17. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 7. Niepoprawiony kontrast. Obraz jest prześwietlony, a kontrast między rybą a tłem (szczególnie w widoku z przodu) jest niski. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Rycina 8. Skorygowany kontrast. Kontrast został poprawiony w porównaniu do Ryciny 7. Należy pamiętać, że kolory na ekranie są kolorami sztucznymi. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Rycina 9. Ustawienia ogólne. Po wybraniu opcji „Camera control” w menu głównym otwiera się okno „General Settings”. Odznacz pola „Shutter” i „Gain”, a następnie użyj suwaków, aby uzyskać optymalny kontrast między rybą a tłem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Rysunek 10. Ustawienia kolorów. W oknie „White Balance/Color” odznacz pole „Auto” i użyj suwaków „Red” oraz „Blue”, aby dobrać najlepszą kombinację zapewniającą odpowiedni kontrast między rybami a tłem. Parametry. Po otwarciu Trajectory Module wybierz plik eksperymentalny za pomocą opcji „Data location”, a następnie otwórz okno „Parameters” poprzez „System Setup”. Tutaj przypisano odpowiednie wartości początkowe dla parametrów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Rycina 11. Parametry. Po otwarciu modułu Trajectory Module należy wybrać plik eksperymentalny za pomocą opcji „Data location”, a następnie otworzyć okno „Parameters” poprzez „System Setup”. Tutaj przypisano odpowiednie wartości początkowe parametrów. .Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Rysunek 12. Dopasowanie ramek. Zauważ, że czerwone ramki w widoku z góry oraz z przodu definiują obszary, w których mogą znajdować się ryby. Ramka po lewej stronie została zredukowana do linii, aby wykluczyć ten obszar z wyszukiwania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Rycina 13. Przypisywanie znaczników. Po naciśnięciu przycisku „Start generating trajectories” i wybraniu klatki początkowej (zazwyczaj klatka nr 0) otwiera się okno „Tag assignments”. Należy naciskać „Step forward”, aż na ekranie pojawi się znacznik („X0”). Jeśli znacznik nie znajduje się na obrazie ryby, należy naciskać „No”, dopóki nie zostanie umieszczony prawidłowo. Następnie należy nacisnąć „Go”. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Rycina 14. Ekran informacji. Panel (A) przedstawia prawidłowe przypisanie znacznika. Znacznik ('X0') jest umieszczony na obrazie ryby w obu widokach. Zazwyczaj przez znacznik przechodzi linia. Panel (B) pokazuje nadmierny szum i brak przypisania znacznika. Klatki zostały pobrane z tego samego nagrania poprzez zmianę progów koloru i rozmiaru (w kroku 2.2) odpowiednio z 1,000-50 na 10-5. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Rysunek 15. Trójwymiarowa reprezentacja zrekonstruowanej ścieżki. Początek strzałek znajduje się w lewym przednim rogu zbiornika w celu orientacji (patrz również Rysunek 1). Zatem w tym przykładzie ryba pozostaje blisko lewej ściany (względem kamery). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Rycina 16. Wygładzanie trajektorii. Okno to otwiera się po naciśnięciu przycisku „Trajectory smoothing”. Na ten moment zaakceptuj wartości domyślne, klikając „OK”. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Rysunek 17. Podfoldery. Powyżej przedstawiono folder wygenerowany podczas rejestracji. Po rekonstrukcji ścieżki zawiera on sześć wskazanych podfolderów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Rysunek 18. Wygładzony plik. Przedstawiono górną część przykładowego pliku point.smoothed-file, wskazując liczbę klatek, czas trwania nagrania (w min), współrzędne centrum zbiornika wodnego względem kamery oraz współrzędne i czas trwania dla każdej klatki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rycina 19. Przetwarzanie danych. Wybór plików do analizy (prawe okno). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 20. Przykład analizy. Interesujące punkty końcowe można obliczyć, wybierając je z menu. W tym przykładzie wybrano „Duration Freezing” (czas trwania zamarcia). Program prosi o podanie progów prędkości i czasu trwania, które definiują zamarcie. Wynik jest wyrażony jako procent całkowitego czasu trwania nagrania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Rysunek 21. Reprezentatywne trajektorie. Przedstawiono dwie reprezentatywne trajektorie dla kontrolnych rybek zebrafish oraz dwie reprezentatywne trajektorie dla rybek zebrafish traktowanych 10 µM MK-801 dla sesji porannej rozpoczynającej się o 10:30 (górny rząd) oraz dla sesji popołudniowej rozpoczynającej się o 14:00 (dolny rząd). Trajektorie poszczególnych rybek zebrafish w każdym kwartecie są przedstawione za pomocą różnych kolorów. Należy jednak zauważyć, że mogło dojść do zamiany znaczników. W przypadku, gdy kluczowe jest śledzenie poszczególnych linii, wymagana jest korekta ręczna. Lewy przód (miejsce rozpoczęcia strzałek wstawki) przedstawionego pojemnika to strona znajdująca się najbliżej kamery (pozycjonowanie zbiornika patrz Rysunek 1). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Rycina 22. Średni dystans społeczny między rybami. A) Przedstawiono średnie dystanse społeczne dla kontrolnych rybek zebrafish oraz rybek zebrafish traktowanych 10 µM MK-801 w sesjach porannych i popołudniowych. Przedstawiono średnią oraz S.E.M. ***, p<0.001. B) Przedstawiono osie czasu średniego dystansu międzyosobniczego dla obu grup. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Rycina 23. Rozkład głębokości. A) Rozkład danio pręgowanego w dziesięciu równych poziomach głębokości (gdzie poziom 1 jest poziomem najbliższym dna) podczas sesji porannej. B) Rozkład danio pręgowanego podczas sesji popołudniowej. Przedstawiono średnią oraz S.E.M. *, p<0.0125; **, p<0.005; ***, p<0.001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Rycina 24. Rozkłady poziome. (A) Przedstawiono rozkład czasowy w czterech strefach radialnych dla grup eksperymentalnych. Wstawka pokazuje położenie stref od centrum do peryferii: strefa centralna, środkowa, zewnętrzna i strefy narożne łączone. (B) Przedstawiono rozkład czasowy w czterech kwadrantach dla grup eksperymentalnych. Wstawka pokazuje położenie kwadrantów. Ściany oznaczone podwójnymi liniami reprezentują ściany białe, a te przedstawione pojedynczymi liniami reprezentują ściany przezroczyste. Kamera znajduje się po lewej stronie wstawki, i.e. najbliżej kwadrantów 1 i 4 (patrz również Rycina 1). Przedstawiono średnią oraz S.E.M. Czarne gwiazdki oznaczają porównania między grupami dla sesji porannej, a szare gwiazdki dla sesji popołudniowych: *, p<0.0125; **, p<0.005; ***, p<0.001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 25. Dystans przebyty. Przedstawiono składowe xyz dystansu przebytego przez danio pręgowanego podczas sesji porannych i popołudniowych. Przedstawiono średnią oraz S.E.M. Czarne gwiazdki oznaczają porównania między grupami w sesji porannej, a szare gwiazdki porównania w sesjach popołudniowych: *, p<0.0125; ***, p<0.001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj procedura doświadczalna pozwala na rejestrację pojedynczych danio pręgowanego, par danio pręgowanego (np. w celu zbadania krycia lub agresji) oraz ławic danio pręgowanego (jak pokazano na reprezentatywnym przykładzie). System jest szczególnie przydatny do jednoczesnego uzyskiwania informacji o rozkładzie 3D (pionowym i poziomym), charakterystyce kinematycznej (np. prędkość, przyspieszenie, kąt skrętu) i parametrach społecznych (np. spójność społeczna). Poniżej przedstawiamy kilka ważnych kwestii, które należy wziąć pod uwagę podczas planowania eksperymentów.

W zależności od procedury eksperymentalnej można badać różne systemy behawioralne. Na przykład, aby zbadać neofobię (tj. strach przed nowym środowiskiem), nagrywanie powinno rozpocząć się natychmiast po wprowadzeniu danio pręgowanego do zbiornika obserwacyjnego (po odczekaniu zaledwie kilku sekund, aż woda się uspokoi, aby zmniejszyć hałas), bez wcześniejszego przyzwyczajenia^11,17,37. Z drugiej strony, niektóre tematy badawcze mogą wymagać dobrego przyzwyczajenia danio pręgowanego, na przykład podczas badania wpływu feromonów alarmowych¹⁶. Badając grupy danio pręgowanego, eksperymentator powinien mieć świadomość, że chociaż oprogramowanie minimalizuje przełączanie znaczników, w tej chwili nie jest możliwe śledzenie poszczególnych danio pręgowanego przez cały czas. Nie jest to również ważne w przypadku badań nad ławicami, w których nacisk kładziony jest na spójność społeczną, ale byłoby kluczowe przy badaniu agresji lub kojarzenia się. Ręczne ponowne przypisywanie tagów jest opcją, ale może być bardzo czasochłonne.

Kolor ścianek pojemnika obserwacyjnego i komory obserwacyjnej może mieć duży wpływ na zachowanie danio pręgowanego. Na przykład, białe ściany zostały opisane jako wywołujące reakcje awersyjne^{36, 37}. Wypróbowując różne kolory, pamiętaj o dwóch rzeczach: 1) ważne jest, aby przednia ściana (tj. ściana najbliżej aparatu) pozostała przezroczysta i aby pokrywa (jeśli jest używana) również musiała być przezroczysta; 2) Wybierając kolor, który nigdy wcześniej nie był używany, najpierw określ, czy kontrast między danio pręgowanym a tłem jest odpowiedni do nagrywania. Wykonaj uruchomienie testowe. Zmiana ustawień aparatu do nagrywania (Wzmocnienie, Migawka, Czerwony i Niebieski, jak wyjaśniono w krokach 2.5 i 2.6) oraz ustawień rekonstrukcji trajektorii (np. progi koloru i rozmiaru, jak wyjaśniono w krokach 3.3, 3.5, 3.11 i 3.12) może mieć duże znaczenie. Ponownie, doświadczenie z systemem przejdzie długą drogę, aby zdecydować, co jest możliwe.

W zależności od celu eksperymentu pożądane może być źródło światła o różnych charakterystykach (np. widmie, natężeniu). Listwy LED można łatwo wymienić. Upewnij się, że światło dociera do każdej części pojemnika.

Jeśli eksperyment wymaga, aby danio pręgowany pozostał w pojemniku obserwacyjnym przez kilka godzin, należy zapewnić napowietrzenie. Rurkę powietrzną można przymocować do tylnego prawego rogu za pomocą klipsa. Sprawdź na ekranie komputera, czy klip nie przeszkadza w nagraniu, tj. że danio pręgowany w żadnym momencie nie jest ukryty przed wzrokiem. Na rysunkach 2A i 2B klips można zobaczyć w widoku z góry. Idealnie byłoby, gdyby napowietrzanie było zapewnione przed nagraniami lub między nimi, ale nie w trakcie nagrywania, aby zapobiec hałasowi. Należy również pamiętać, że włączanie lub wyłączanie silnego napowietrzania może przestraszyć danio pręgowanego.

Jeśli eksperyment wymaga trzymania danio pręgowanego w pojemniku przez noc, warto przykryć komorę obserwacyjną przezroczystą pokrywą, aby zapobiec wyskakiwaniu danio pręgowanego (co jest bardzo częstym zjawiskiem). Jeśli osłona nie zostanie zdjęta przed nagrywaniem (aby nie przeszkadzać danio pręgowanemu), należy wziąć pod uwagę następujące dwa punkty: 1) upewnij się, że lustrzane odbicia źródeł światła nie przeszkadzają w nagrywaniu (np. poprzez przesunięcie źródeł światła lub wybór pokrywy, która odbija światło tylko w minimalnym stopniu); 2) wziąć pod uwagę, że pokrywka może stać się zaparowana podczas używania przez noc, zwłaszcza że w tym przypadku należy również zapewnić napowietrzenie; Jednym ze sposobów na zmniejszenie tego jest wybór pokrywki z małymi otworami.

W przypadku niektórych eksperymentów może być konieczne określenie wyjściowego zachowania danio pręgowanego przed podaniem leku. W takim przypadku lek można dodawać między sesjami za pomocą rurki (podobnej do rurki napowietrzającej omówionej powyżej).

Chociaż skupiono się tutaj na rejestrowaniu danio pręgowanego (Danio rerio), inne gatunki ryb mogą oczywiście również być rejestrowane za pomocą systemu. Był używany do badania zachowań u (młodocianych) złotych rybek (Carassius auratus), brzanki tygrysiej (Barbus tetrazona) i mieczyka zielonego (Xiphophorus helleri).

Na koniec należy zauważyć, że zasadniczo możliwe są inne wymiary zbiorników obserwacyjnych. Wymagałoby to jednak rekonfiguracji systemu i znalezienia dobrej równowagi między rozdzielczością przestrzenną i czasową przy użyciu znacznie większych kontenerów obserwacyjnych. Ponadto pojemnik musi mieć kształt prostopadłościanu. Liczba danio pręgowanego lub innych obiektów eksperymentalnych jest teoretycznie nieograniczona; Jednak zamiana tagów zwiększa się wraz z liczbą tematów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
AABT-3D Sprzęt śledzący	xyZfish	AABT II	Zawiera kamerę, kartę graficzną, komorę obserwacyjną z lustrem i oświetleniem
AABT-3D Sprzęt do kalibracji	kalibru xyZfish	calib	Zawiera panel kalibracyjny i lusterko boczne
AABT-3D Pojemniki obserwacyjne	kostki xyZfish
AABT-3D Oprogramowanie śledzące	xyZfish	v.1.0
Komputer	opcjonalny	N/A	Windows XP lub nowszy
(+)-MK-801 wodoromaleinian	Sigma	M107
Pompa powietrza	Fusion	500
Przewód powietrzny 3/16"	Lee' powiedział: s Produkty akwarystyczne i dla zwierząt	14508
Medium Spiner Clips	OfficeDepot	561339	Do mocowania linii lotniczej do kontenera obserwacyjnego