Protokół wyświetlania fagów i selekcji powinowactwa przy użyciu rekombinowanych przynęt białkowych

Summary

Wyświetlanie fagów to potężna technika do wychwytywania białek lub ugrupowań białkowych, które oddziałują z unieruchomioną cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania. Po podjęciu decyzji o rodzaju biblioteki cDNA fagów, którą należy utworzyć i przebadać, opisany tutaj protokół pozwala na skuteczną selekcję powinowactwa prowadzącą do identyfikacji interaktorów.

Abstract

Wykorzystanie rekombinowanego faga jako rusztowania do prezentacji różnych porcji białek kodowanych przez kierunkowo sklonowaną bibliotekę cDNA do unieruchomionych cząsteczek przynęty jest skutecznym sposobem na odkrywanie interakcji. Technika ta została w dużej mierze wykorzystana do odkrycia interakcji białko-białko, ale cząsteczka przynęty, która ma zostać poddana próbie, nie musi ograniczać się do białek. Przedstawiony tutaj protokół został zoptymalizowany, aby umożliwić badanie przesiewowe niewielkiej liczby przynęt w powtórzeniach, aby zmaksymalizować identyfikację niezależnych klonów prezentujących to samo białko. Pozwala to na uzyskanie większej pewności, że zidentyfikowane oddziałujące białka są legalnymi interaktorami cząsteczki przynęty. Monitorowanie miana faga po każdej rundzie selekcji powinowactwa dostarcza informacji o postępie selekcji powinowactwa, a także o skuteczności kontroli ujemnych. Przedstawiono jeden ze sposobów mianowania faga oraz to, jak i co przygotować z wyprzedzeniem, aby proces ten przebiegał jak najefektywniej. Podkreślono atrybuty amplikonów pobranych po wyizolowaniu niezależnej płytki, które można wykorzystać do ustalenia, jak dobrze postępuje selekcja powinowactwa. Wyjaśniono techniki rozwiązywania problemów w celu zminimalizowania wyników fałszywie dodatnich lub ominięcia trwale odzyskiwanych fagów. Omówiono sposoby ograniczania zaostrzeń zakażeń wirusowych.

Introduction

Dlaczego używać wyświetlania fagów i selekcji powinowactwa zamiast niezliczonych innych dostępnych technik do odkrywania i badania interakcji białek z innymi cząsteczkami? Wyświetlanie fagów może mieć pewne unikalne zalety w porównaniu z innymi metodami wykrywania interakcji białko-ligand^1-3, w tym:

Bardzo szeroki repertuar cząsteczek przynęty

Głównym powodem jest różnorodność molekuł zdolnych do działania jako przynęta w selekcji powinowactwa ⁴. Wyświetlanie fagów jest bardzo skutecznym sposobem izolowania fragmentów białek, które oddziałują z innymi białkami, nukleotydami, węglowodanami itp.5 Zasadniczo, jeśli polimer/cząsteczka może być przyłączona do odzyskiwalnego nośnika, można ją przebadać pod kątem powinowactwa do białek wyświetlanych w fagach. Dodatkowo można uzyskać dostęp do cząsteczki przynęty w celu określenia, czy zachowuje ona aktywność biologiczną po unieruchomieniu⁶, czy warunki stosowane w celu zmniejszenia/wyeliminowania jej aktywności są skuteczne⁶ lub w celu wprowadzenia modyfikacji potranslacyjnych do przynęty przed selekcją powinowactwa.

Odporność fagów na czynniki zewnętrzne

Drugim powodem korzystania z wyświetlania fagów jest to, że możliwe jest, że niektóre przynęty mogą wymagać stresu środowiskowego (ciepło, wysokie stężenia osmolitów, specyficzne kofaktory, itp.), aby uchwycić ich oddziałujące białka, lub białka wyświetlane na fagach mogą wymagać jakoś zmiany przed selekcją powinowactwa. Podstawowym badanym czynnikiem jest interakcja między przynętą a białkiem, a nie stan, który pozwala na wystąpienie interakcji lub czy jest ona śmiertelna dla badanego organizmu. T7 szczególnie dobrze nadaje się do takich badań, ponieważ może wytrzymać trudne warunki eksperymentalne, zarówno nienaruszony, jak i żywotny (np. opublikowane maksimum termiczne dla żywotności T7 wynosi ~60 °C ⁷). Jako przykład zmiany białek wyświetlanych przez fagi, podczas badania proteomu nasion Arabidopsis thaliana pod kątem substratów białkowych enzymu naprawczego, Protein Isoaspartyl Methyl Transferease (PIMT), wirus użyty w tych badaniach był "leżakowany" przez tydzień, przed każdą rundą selekcji powinowactwa, aby zachęcić do wprowadzenia reszt izoasparaginianu (isoAsp) do podatnych białek⁶ co nie jest możliwe w organizmach, które potrafią rozpoznawać i naprawiać/metabolizować takie nieprawidłowości.

Metabolicznie obojętny

Ponadto, fagi są zazwyczaj odporne na trucizny metaboliczne i zakłócające małe cząsteczki, które co najmniej skutkowałyby plejotropowymi efektami na metabolicznie aktywnych organizmach testowych. Po rygorystycznym myciu trucizna jest usuwana przed wprowadzeniem dużej ilości bakterii do infekcji, więc trucizna jest rozcieńczana do zakresu nieszkodliwego dla bakterii lub późniejszej replikacji fagów. Podczas badania celów białkowych enzymu naprawczego PIMT, S-adenozylometionina (AdoMet) została użyta do aktywacji enzymu unieruchomionego mikro-mianowo-płytkowego, aby umożliwić wychwytywanie docelowego białka, polegając jednocześnie na S-adenozylohomocysteinie (AdoHcy) w celu inaktywacji enzymu i zapewnienia użytecznej kontroli ujemnej, mając pewność, że wirus nie będzie miał negatywnego wpływu ani AdoMet, ani AdoHcy⁶. Ponadto wiadomo, że członkowie niektórych rodzin białek Late Embryogenesis Abundant (LEA), badanych w tym laboratorium, zmieniają swój kształt w obecności dodatków, takich jak sacharoza⁸, która może osiągnąć stężenie nawet 200 mM w nasionach soi w momencie dojrzałości fizjologicznej⁹. Nie przewiduje się, aby dodanie 200 mM sacharozy w każdej rundzie selekcji powinowactwa miało wpływ na wirusa, co może być konieczne w przypadku niektórych interakcji białkowych LEA-klient, co nie ma miejsca w przypadku autonomicznie zdolnych do życia organizmów testowych¹⁰.

To laboratorium skupiło się na odkrywaniu interakcji białko-białko w dojrzałych, odwodnionych lub kiełkujących nasionach, które leżą u podstaw mechanizmu ochrony przechowywanego proteomu podczas odwodnienia¹¹ lub naprawy składników przechowywanego proteomu, które są podatne na tworzenie isoAsp po wchłonięciu^{nasion 6}. W związku z tym produkcja i oczyszczanie rekombinowanych białek wymaganych jako przynęta w stanie aktywnym oraz zapewnienie, że pozostaną one takie przed i po unieruchomieniu, choć często trudne, jest kamieniem węgielnym naszej pracy. Ponieważ jednak każdy scenariusz produkcji białek rekombinowanych jest inny, optymalizacja warunków produkcji białek rekombinowanych nie będzie tutaj omawiana. Zachęca się użytkowników, aby w miarę możliwości podjęli próbę ustalenia, czy unieruchomione białko jest nadal funkcjonalne (np. jeśli jest to enzym, należy przeprowadzić test enzymatyczny w dołkach płytki do mikromiareczkowania). Da to pewną pewność, że przynęta jest biologicznie aktywna, a zatem, że wszelkie odkryte interakcje z większym prawdopodobieństwem będą miały znaczenie biologiczne.

Protocol

Graficzne przedstawienie procedury opisanej poniżej (Rysunek 1) podkreśla dwa główne składniki selekcji powinowactwa za pomocą biblioteki wyświetlania fagów: A) biblioteka cDNA wyświetlająca fagi, która prawdopodobnie koduje białka o powinowactwie do przynęty oraz; B) oczyszczone rekombinowane białko przynęty. Produkcja przynęty (białka rekombinowanego) została szeroko zbadana, a literatura przedstawia najlepsze praktyki w zakresie zabezpieczania rozpuszczalnego, aktywnego białka rekombinowanego z E. coli^12-13, drożdży eukariotycznych¹⁴, owadów^15-16, roślin^17-18 lub komórek ssaków^19-20.

W poniższym protokole, jako przynęta użyto rekombinowanego białka oznaczonego heksahistydylem. Pozwala to na sprawdzenie, czy białka przynęty pozostają w studzienkach po całonocnej inkubacji i etapach mycia.

1. Test ELISA dla retencji białka rekombinowanego w dołkach płytki mikromiareczkowej

1. Oznaczyć płytkę do mikromiareczkowania trwałym tuszem i wyznaczyć, które studzienki będą zawierały jakie stężenia białka. Wykonaj to w 3 replikacjach studni. Obejmują 3 powtórzenia serii stężeń kontroli ujemnej (białko nieznakowane heksahistydylem; BSA działa dobrze jako to sprawdzenie przeszłości).
2. Dokładnie umyj talerz wodą i usuń wodę, uderzając talerzem do góry nogami o 4-warstwowy ręcznik papierowy między praniami.
3. Unieruchomić w pierwszych 3 dołkach w 100 μl Tris, pH 7,5 (lub bufor do wyboru) najwyższe stężenie rekombinowanego białka (10 μg/ml). Dodać do następnych trzech dołków rekombinowane białko o stężeniu (1,0 μg/ml) itd., aż do 1,0 ng/ml. To samo należy zrobić z serią stężeń BSA.
4. Przykryj naczynia folią spożywczą i pozostaw na noc w temperaturze 4 °C.
5. Następnego ranka usuń białko, uderzając talerzem do góry nogami o 4-5 warstw ręcznika papierowego.
6. Myj studzienki 5x 200 μl 1x TBS za każdym razem, pozostawiając bufor w studzienkach na ~1 min za każdym razem i usuwając płukanie buforem, uderzając płytką do góry nogami o ręczniki papierowe po każdym myciu.
7. Zablokować płytkę ELISA na wytrząsarce obrotowej za pomocą 200 μl 5% (m/v) BSA lub 200 μl 5% (w/v) odczynnika blokującego w TBS w temperaturze pokojowej przez 2 godziny (lub siedząc nieruchomo przez noc w temperaturze 4 °C, jeśli jest to wygodne) owinięte w folię spożywczą.
8. Usuń nadmiar roztworu blokującego, uderzając talerzem do góry nogami o ręczniki papierowe. Myć 4x 1 min za każdym razem 200 μl 1x TBS, usuwając roztwór myjący, uderzając płytką do góry nogami.
9. Rozcieńczyć przeciwciało pierwotne penta-HIS 1/2,000 w buforze blokującym i dostarczyć 100 μl do każdej studzienki. Inkubować 1-2 godziny w temperaturze pokojowej z nieruchomą płytką.
10. Usuń przeciwciało pierwotne, uderzając płytką do góry nogami o ręczniki papierowe. Myć 4x 1 min za każdym razem 200 μl 1x TBST. Usuń każde pranie, uderzając talerzem do góry nogami.
11. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe (koniugat fosfatazy alkalicznej przeciwko myszy) w buforze blokującym i inkubować 100 μl w każdym dołku przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z nieruchomą płytką.
12. Usuń przeciwciało wtórne, uderzając płytką do góry nogami o ręczniki papierowe. Myć 4x 1 min za każdym razem 200 μl 1x TBST. Usuń każde pranie, uderzając talerzem do góry nogami.
13. Umieścić 200 μl roztworu substratu para-nitrofenylofosforanu (pNPP) w każdej studzience. W temperaturze -20 °C podłoże jest ciałem stałym, dlatego należy przygotować porcje i pobrać z zamrażarki wymaganą liczbę porcji niezbędnych do wykrycia z dużym wyprzedzeniem, tak aby na tym etapie zostało całkowicie rozmrożone.
14. Po 30 minutach zatrzymać reakcję, dodając 50 μl 3 M NaOH do każdego dołka.
15. Natychmiast odczytać absorbancję przy długości fali 405 nm na płytce czytnika ELISA.

Uwaga: Jeśli interesujące nas białko rekombinowane nie przyczepi się do studzienek, można znacznie zmienić skład/pH buforu (bufor węglanowy pH 10,0) lub dodać chaotropy (mocznik), aby spróbować wspomóc przyłączanie białka do dołków na płytce mikromiareczkowej. Jednakże ponowne ustalenie, że rekombinowane białko: 1) pozostaje związane z płytką mikromiareczkową w warunkach selekcji powinowactwa oraz; 2) zachowuje swoją aktywność biologiczną po usunięciu wysokiego pH/chaotropu.

2. Hodowla bakteryjnego gospodarza (BLT5403) do miareczkowania

1. Autoklaw (ryc. 2A): dziesięć kolb Erlenmeyera o pojemności 250 ml i 3 probówki hodowlane. Przygotuj płyn LB i agar LB do nalewania płytek z mediami stałymi. Schłodzić agar LB do temperatury 50 °C i dodać ampicylinę do 100 μg/ml przed przelaniem do szalek Petriego w okapie przepływowym (ryc. 2B).
2. Również w okapie przepływowym (Rysunek 2B) nałóż płytkę agarową LB, 100 μg/ml ampicyliny (LB^AMP100) dla pojedynczych kolonii BLT5403 z zapasu trzymanego w 15% (v/v) glicerolu w temperaturze -80 °C (Rysunek 2C). Umieścić płytkę do góry nogami w temperaturze 37 °C na noc w inkubatorze do wzrostu (ryc. 2D).
3. Rano zaszczepić 50 ml LB^AMP100 w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml z pojedynczą kolonią pobraną z płytki. Inkubować w temperaturze 37 °C, 200 obr./min w wytrząsarce poziomej (rysunki 2E i 2F) i użyć spektrofotometru do monitorowania gęstości komórek przy OD₆₀₀ = 0,5 do 0,6 (rysunek 2H).
4. Wlać komórki do probówki Falcon o pojemności 50 ml lub podobnej i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia (Rysunek 2G). Komórki zwykle zachowują żywotność przez ~1 tydzień.
5. Przygotuj 500 ml LB, umieść go w przegrodzie Fernbacha i przeklawuj w autoklawie. Po sterylnym umieszczeniu kolby w temperaturze 4 °C (Rysunek 2G) lub temperaturze pokojowej do nocy "DZIEŃ PIERWSZY" poniżej.

Uwaga: Komórki bakteryjne gospodarza BLT5403, wyrażające plazmidowe źródło natywnego białka kapsydu T7, bez którego wektory T7 o średniej i niskiej kopii nie mogą się pomyślnie replikować, są niezwykle podatne na wirusa. Konieczne jest unikanie zanieczyszczenia. W końcu dojdzie do zanieczyszczenia, w którym to momencie wszystkie powierzchnie mające kontakt z wirusem/zakażonymi bakteriami muszą zostać przetarte 70% (v/v) etanolem lub wyszorowane przy użyciu detergentu (Rysunek 2I). Jeśli jest to nieskuteczne, wymagana jest dokładna dekontaminacja wszystkich powierzchni, które są odporne na działanie Envirocide (rysunek 2J). Rozpocznij BLT5403 komórek z materiału zamrażarskiego w każdej nowej rundzie selekcji powinowactwa, aby pomóc złagodzić zanieczyszczenie materiału wyjściowego w temperaturze 4 °C i upewnić się, że w protokole używane są energiczne komórki. Końcówki do pipet z barierą filtracyjną są niezbędne.

3. Wybór powinowactwa

DZIEŃ PIERWSZY

1. Zaznaczyć płytkę do mikromiareczkowania trwałym tuszem i wskazać, które studzienki będą zawierały jakie białka/poprawki. (Ze względu na problemy z zanieczyszczeniem płyty nigdy nie są ponownie używane). Wykonaj to w 3 powtórzeniach dołków dla każdego białka i zabiegu.
2. Dokładnie umyj talerz wodą i usuń wodę, uderzając talerzem do góry nogami o 4-warstwowy ręcznik papierowy między praniami. Unieruchomić w 100 μl Tris o pH 7,5 (lub buforze z wyboru) rekombinowane białko (10 μg/ml) w sześciu studzienkach lub BSA (10 μg/ml) w trzech studzienkach, co daje w sumie 9 dołków do pierwszej rundy selekcji powinowactwa. Przykryj naczynie folią spożywczą i pozostaw na noc w temperaturze 4 °C (Rysunek 2G).
3. Upewnij się, że 9 kolb Erlenmeyera o pojemności 250 ml (patrz 2.1 powyżej) zostało oczyszczonych, autoklawowanych i odpowiednio oznakowanych (kodowanie kolorową taśmą działa dobrze, Rysunek 2F).
4. Obliczyć objętość lizatu fagowego do użycia dla każdej studzienki w oparciu o miano używanej biblioteki i liczbę fagów, które mają być przebadane.
5. Upewnij się, że świeże komórki BLT5403 są gotowe do użycia do określenia mianowania w tej rundzie selekcji powinowactwa jutro (Rysunek 3A).
6. Upewnij się, że dostępna jest wystarczająca ilość 1 TBS (150 mM NaCl, 50 mM Tris Base, pH 7,6) i 1x TTBS (1x TBS + 0,05% (v/v) Tween 20) do wykonania 10 x 200 μl płukania dla liczby używanych studzienek. Dodatkowo należy wstępnie inkubować TTBS w temperaturze wyboru powinowactwa. Upewnij się, że zapasowa, szczelnie zamknięta probówka Falcon o pojemności 50 ml z 1x TTBS istnieje w temperaturze wyboru powinowactwa z wystarczającą ilością 1x TTBS.
7. Przygotować 3 zabiegi x 3 powtórzenia x 3 potrójne dawki 1,5 ml probówek Eppendorfa (łącznie 27) z 990 μl LB^{100 AMP} każda i odpowiednio oznaczyć (np. ^10-2). Są one przeznaczone dla zakażonych bakterii, które jutro zostaną pobrane z dołków na płytkach mikromiareczkowych. Zaznaczyć rozcieńczenie po jednej stronie probówki (^10-2) i rosnącą liczbę po drugiej stronie ("1"). Dla każdej rurki Eppendorf należy również oznaczyć jedną rurkę borokrzemianową i jedną płytkę LB^{100 AMP}. W ten sposób płytki i probówki borokrzemianowe są ponumerowane 1, 2, 3, 4, 5 itd. , aby miareczkowanie przebiegało szybciej. Następnie liczbę prostą można dopasować do rozcieńczenia i obróbki na probówce Eppendorfa (np. probówka #12 była trzecią trójką pierwszej replikacji kontroli BSA dla rozcieńczenia ^10-5). Probówki Eppendorfa i płytki LB^{100 AMP} należy przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C (rysunki 2G i 3B).

Na przykład: Rozpocznij etykietowanie probówek Eppendorfa o pojemności 1,5 ml na trzy ^10-2 rozcieńczenia faga z replikacji BSA jeden dołek oraz 1, 2 i 3 (trzy trzykrotne odczyty miana faga dla replikacji pierwszej), a następnie zaznacz probówki borokrzemianowe 1, 2 i 3, w których zakażone bakterie zostaną zmieszane z niezakażonymi bakteriami i górną agarozą przed wylaniem na płytki agarowe LB^{100 AMP} (Rysunek 3C).

8. W przypadku rozcieńczeń seryjnych oznacz probówki Eppendorfa i do każdej z nich dodaj 900 μl LB^{100 AMP.} Po wykonaniu początkowych rozcieńczeń (^10-2) zakażonych bakterii dla każdego białka/zabiegu, replikacji i trzykrotności, jutro zostaną one dobrze wymieszane i pobrane z nich 100 μl i dodane do odpowiedniej probówki Eppendorfa zawierającej 900 μl LB^{100 AMP} do rozcieńczenia 10-3 (probówki 4, 5 i 6 do replikacji jednej kontroli BSA). Te z kolei zostaną dobrze wymieszane, a rozcieńczenia ^10-3 zostaną użyte do rozcieńczenia ^10-4 (7, 8, 9). Użyj rozcieńczeń ^10-4 dla rozcieńczeń ^10-5 (10, 11, 12) itd. w celu uzyskania miana dla pierwszej z trzech replikacji BSA (studzienek).
9. To samo zostanie zrobione dla drugiej replikacji BSA (studnia 2), trzeciej replikacji BSA (studnia 3), trzech replikacji zatrutej przynęty i wreszcie trzech replikacji studni przynęty. Na końcu powinny znajdować się rurki oznaczone w skali od 1 do 135 (135 to ostatnia trójka ostatniego powtórzenia przynęty przy maksymalnym rozcieńczeniu ^10-6). Probówki Eppendorfa należy przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C (rysunek 3C przedstawia probówki Eppendorfa i probówki borokrzemianowe dla wszystkich rozcieńczeń trzech replikacji (trzech studzienek) BSA.
10. Rozpocznij 2 lub 3 probówki hodowlane BLT5403 komórek (pobranych z pojedynczych kolonii ze świeżo prążkowanej przez noc płytki LB^AMP100; z kroku 2.2 powyżej) rosnących w wytrząsarce inkubacyjnej (ryc. 2E i 2F) jako kulturę nocną. Do 500 ml LB (ppkt 2.5 powyżej) dodać ampicylinę do 100 μg/ml i umieścić kolbę Fernbacha w zacisku w inkubatorze do wytrząsania, tak aby osiągnęła temperaturę 37 °C i została napowietrzona następnego ranka (rysunek 2F).

Uwaga: Runda trzecia i czwarta mogą wymagać przybliżonego rozcieńczenia aż ^10-10 objętości faga do objętości LB^AMP100.

DZIEŃ DRUGI

11. Następnego ranka umieścić w autoklawie, puste kolby Erlenmeyera o pojemności 9 x 250 ml (po jednej na każdą studzienkę na każdą płytkę do mikromiareczkowania) w zaciskach wytrząsarki inkubacyjnej. Zaszczepić 500 ml LB^{100 AMP} 500 μl z jednej z nocnych hodowli komórek BLT5403 rozpoczętych wczoraj wieczorem (patrz krok 3.8 powyżej), ponownie zamknąć i rozpocząć wzrost (37 °C, 220 obr./min). Włącz spektrofotometr (rysunek 2H) i ustaw go tak, aby odczytywał absorbancję przy 600 nm.
12. Wyjąć płytkę do mikromiareczkowania z 4 °C, usunąć folię z tworzywa sztucznego i usunąć wszelkie niezwiązane białko z płytki, przemywając 10x 200 μl za każdym razem 1x TBS pH 7,5 i uderzając płytką do góry nogami o ręcznik papierowy między praniami. Blokować 200 μl 5% (w/v) BSA lub 200 μl 5% (w/v) odczynnika blokującego w TBS przez 1 godzinę (lub przez noc, jeśli jest to wygodne) z płytką owiniętą folią.
13. Zmyj roztwór blokujący 10x 200 μl za każdym razem 1x TBST, uderzając talerzem do góry nogami o 4 warstwy ręcznika papierowego między praniami. Na tym etapie można napełnić studzienki 200 μl wody, przykryć je folią spożywczą i umieścić w temperaturze 4 °C do przechowywania przez maksymalnie 1 tydzień.

Uwaga: Rozpocznij hodowlę na tyle szybko, że zanim zainfekowane fagi BLT5403 po zakończeniu selekcji powinowactwa będą gotowe do dodania, komórki w 500 ml mają od 0,6 do 1,0 OD₆₀₀. Jeśli rosną znacznie powyżej 1,0, liza może nie wystąpić z powodu ograniczeń zasobów, gdy komórki zbliżają się do fazy stacjonarnej. Jeśli komórki nie osiągną OD₆₀₀ wynoszącego 0,6 przynajmniej przed wprowadzeniem faga, mnogość infekcji może być zbyt duża, szybko zabijając komórki, co może wpłynąć na reprezentację lizatu. Jeśli komórki nie zbliżają się jeszcze do OD₆₀₀ wynoszącego 0,6 przed zakończeniem selekcji powinowactwa, zaszczepić kolbę większą ilością BLT5403 z drugiej (lub nawet z obu i trzecich) probówek wytrząsających w temperaturze 37 °C (ryc. 2F). Jeśli OD₆₀₀ 1.0 zbliża się zbyt szybko, wyłącz grzałkę i shaker, a następnie otwórz pokrywę, aby schłodzić kulturę i pozbawić bakterie tlenu. Wznowić ogrzewanie/wstrząsanie po dodaniu faga.

Stąd użyj końcówek bariery filtrującej, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego fagów.

14. Po zaszczepieniu kolby umieścić bibliotekę fagów (100 μl) z białkami, ponownie zamknąć płytkę folią spożywczą i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
15. Po 55 minutach zapisz OD₆₀₀ komórek. Czas podwajania wynosi mniej więcej co 20 minut. Postępuj zgodnie z tym (patrz "Uwaga" powyżej).
16. Po upływie jednej godziny zdjąć folię z płytki i natychmiast przemyć, wytrząsając do przekształconych odpadów, a następnie szybko dodając 200 μl 1x TBST. (W tym celu należy użyć multipipetora z głowicą 1 = 100 μl, a pipetor jest ustawiony na 2 [tj. zapewnia obniżenie ciśnienia 200 μl/tłok] i wszystko idzie szybko). Ustaw minutnik na 1 minutę. Po 1 minutach wytrząsnąć bufor do przetworzonych odpadów, uderzyć talerzem do góry nogami w ręcznik papierowy i położyć z powrotem na stole (talerz o temperaturze 25 °C). Powtórz kroki prania 10 razy.
17. Po dziesiątym przemyciu pobrać 200 μl komórek BLT5403 z probówki Falcon o pojemności 50 ml w temperaturze 4 °C i umieścić je na dnie studzienki, z której usunięto ostatnie płukanie TTBS. Zawiń płytki w folię spożywczą i umieść w temperaturze 37 °C na 20 minut, aby nadal przykleił się do przynęty w celu zakażenia bakterii (patrz uwaga w dyskusji na temat uporczywie pobieranego faga i/lub wysokiego tła z masowo wiążącego faga).
18. Po upływie 20 minut rozwiń płytki i weź 10 μl bakterii z BSA w temperaturze 25 °C, powielaj jedną studzienkę i umieść ją w 990 μl LB^{100 AMP} oznaczonym "1". Powtórz jeszcze dwa razy dla tej studzienki (probówki 2 i 3), co daje 3 triplikaty 1/100 rozcieńczeń faga z tej studzienki. Jest to replikacja BSA, w której próbkowano trzy razy. Rozcieńczenia te zostaną wykorzystane do oszacowania średniego miana SEM ± dla tej replikacji BSA.
19. To samo należy zrobić dla replikacji 2 i 3 BSA (trzy potrójne próbki po 10 μl każda), dla trzech powtórzonych studzienek zatrutego białka przynęty oraz dla białka przynęty. Odłóż te 27 probówek Eppendorfa na bok i pobierz pozostałe 170 μl zainfekowanych bakterii w studzienkach, które rosną w kierunku lizy.
20. Jeżeli bakterie w kolbie mają OD₆₀₀ = 0,6-1,0, zdekantować 50 ml komórek z kolby Fernbacha do każdej z dziewięciu kolb Erlenmeyera o pojemności 250 ml. Pobrać pozostałe 170 μl bakterii BLT5403 zakażonych fagami do dołka replikacji BSA 1 i dodać je do 50 ml komórek oznaczonych "BSA Rep 1" (żółta taśma). Zrób to dla wszystkich dziewięciu studzienek i umieść je potrząsając w inkubatorze (Rysunek 2F).
21. Od czasu do czasu monitorować komórki w wytrząsarce inkubacyjnej w temperaturze 37 °C pod kątem lizy (około 3 godziny od momentu inokulacji). W tym czasie należy rozcieńczyć z 27 początkowych rozcieńczeń (^10-2) w odpowiednich, oznakowanych probówkach Eppendorfa.
22. Aby przeprowadzić te rozcieńczenia z początkowych 27 rozcieńczeń z ppkt 3.12 powyżej, należy pobrać 100 μl LB z bakteriami z probówki Eppendorfa 1 (pierwsza replikacja BSA, pierwsza z trzech próbek z tego rozcieńczenia 1:100 z tej studzienki) i dodać ją do 900 μl LB w probówce Eppendorfa 4 (1 x ^10-4 rozcieńczenie replikacji BSA, pierwszej z trzech próbek z tej studni).
23. Wyrzuć końcówkę bariery filtra na nową przed uzyskaniem 100 μl LB z bakteriami z probówki Eppendorfa 4, aby dodać do 900 μl LB w probówce Eppendorfa 7 (1 x ^10-5 rozcieńczenie replikacji BSA jeden, najpierw z trzech próbek z tej studzienki). Kontynuować rozcieńczenia (do 1 x ^10-6) dla wszystkich trzykrotności wszystkich replikacji wszystkich białek i traktowania (łącznie 135 probówek).
24. Po lizie komórek doprowadzić hodowlę do 0,5 M NaCl, dodając 5 ml z 5 M NaCl i przenieść do oznakowanej butelki wirówkowej.
25. Wirować przy 8 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant (wirusa) do czystej, sterylnej probówki Falcon o pojemności 50 ml.
26. Dodać kilka kropli chloroformu do zdekantowanego supernatantu w probówce Falcona.
27. Przechowywać w temperaturze 4 °C do następnej rundy selekcji powinowactwa.

4. Dzień trzeci

1. Autoklaw lub wybielanie wszystkich przyborów laboratoryjnych, które zostały użyte do wygenerowania tej rundy wyboru powinowactwa, aby przygotować się do następnej rundy.

5. Mianowanie

1. Ponumeruj tyle stałych płytek LB^{100 AMP}, ile jest rozcieńczeń w kolejności rosnącej (teraz powinna być 1 płytka na każdą probówkę borokrzemianową i probówkę Eppendorfa, każda o TYM SAMYM numerze). Umieścić płytki w inkubatorze o temperaturze 37 °C (Rysunek 3D).
2. Rozpuść górną agarozę (1,0 g tryptonu Bacto, 0,5 g ekstraktu drożdżowego, 0,5 g NaCl, 0,6 g agarozy, dorobić do 100 ml, autoklaw), poluzowując górną nakrętkę butelki z agarozą i naprzemiennie podgrzewając butelkę w kuchence mikrofalowej i obracając ją, aby wymieszać, aż górna agaroza całkowicie się rozpuści. Umieść butelkę w łaźni wodnej, aby ostygła do 50 °C (Rysunek 3E).
3. Weź pipetę borokrzemianową o pojemności 10 ml z dołączoną pompką do pipet. Zapal palnik Bunsena. Odwróć styropianowy uchwyt rurki Falcon lub pokrywę chłodnicy do góry nogami na stole i umieść na nim płytki LB100 AMP od 1 do 6 (świeżo po wyjęciu z inkubatora w temperaturze 37 °C), płyta 1 u góry (Rysunek 4A). Styropian utrzymuje ciepło płyt.
4. Umieścić 250 μl komórek BLT5403 w temperaturze 4 °C do każdej z ponumerowanych probówek borokrzemianowych przygotowanych pierwszego dnia powyżej (sekcja 3.7 i rysunki 4B i 4C). Ułóż ponumerowane probówki borokrzemianowe w tym samym rosnącym szeregu, co rozcieńczenia w probówkach Eppendorfa o pojemności 1,5 ml (Rysunek 4A).
5. Umieścić 100 μl z rozcieńczenia w probówce Eppendorfa 1 w 250 μl komórek w probówce borokrzemianowej 1 (ryc. 4D i 4E). Podgrzej nieco pierwsze 5 cali pipety nad płomieniem (nie za dużo! ~ 3 przeciągnięcia, Rysunek 4F) i zanurz się w stopionej górnej agarozie. Wyciągnij 3 ml i dostarcz SZYBKO do probówki na wierzchu komórek/faga (Rysunek 4G).
6. Wymieszaj, przesuwając palcem, trzymając probówkę drugą ręką (Rysunek 4H) i wylej zawartość na talerz (Rysunek 4I). Przechyl płytkę i użyj probówki, aby gonić bąbelki i suche miejsca, aż cała płytka zostanie pokryta górną agarozą. Odłóż go na bok, pionowo na ławce, aby ostygł
.
7. Wyrzuć rurkę borokrzemianową, wysuń końcówkę bariery filtra, weź nową i kontynuuj, aż wszystkie rozcieńczenia zostaną platerowane. Wyjmij płytki LB^{100 AMP} z inkubatora, ponieważ są wyczerpane, ale nie więcej niż 6 na raz lub ostygną, a górna agaroza zastyga zbyt szybko.
8. Gdy górna agaroza stwardnieje, odwróć płytki do góry nogami (WAŻNE JEST, ABY TO ZROBIĆ). W przeciwnym razie agar/agaroza "płacze", zagęszcza się na pokrywce, opada na wierzch agarozy i spływa po niej, zabierając ze sobą faga, uniemożliwiając dokładne mianowanie) i ALBO: 1) umieścić płytki w inkubatorze o temperaturze 37 °C [wróć 4 godziny później, aby policzyć miano, ponieważ T7 jest agresywne] LUB: 2) Zostaw je do góry nogami na ławce, a następnego ranka będą gotowe do liczenia miana.
9. Podejmując wszelkie niezbędne środki ostrożności w celu ochrony przed stłuczeniem szkła lub obrażeniami, jeśli tak się stanie, załóż luźno górną nakrętkę butelki z agarozą i podgrzewaj górną agarozę w kuchence mikrofalowej, aż się zagotuje. Zrób to dwa razy. Pozwól mu ostygnąć, dokręć nakrętkę i odłóż. Zmniejsz temperaturę łaźni wodnej do zwykłej temperatury lub wyłącz ją. Umieść rozcieńczone roztwory w lodówce o temperaturze 4 °C. Będą one potrzebne do interpretacji mian i/lub ponownego wykonania niektórych mian.

6. Określanie i obliczanie miana

1. Zbadaj płytkę nazębną utworzoną na płytkach i wyrzuć te z konfluencyjną lizą (Rysunek 5A, np. rozcieńczenie ^10-2). Określ, które z pozostałych rozcieńczeń seryjnych wytworzyły wystarczająco mało płytki nazębnej, aby umożliwić dokładne zestawienie (rysunki 5A ai 5B). Zapisać liczbę płytki nazębnej z tych tabliczek ( Tabela 1; Rysunek 5B).
2. Pomnóż liczbę płytki nazębnej przez rozcieńczenie, a następnie pomnóż tę liczbę przez 100, aby uzyskać liczbę jednostek tworzących płytkę miażdżycową na ml zakażonych bakterii pobranych ze studzienek (tj. dla każdego z trzech razy pobrano tylko 10 μl zakażonych bakterii, a więc należy to pomnożyć przez 100, aby uzyskać liczbę na ml). Uśrednić liczbę jednostek tworzących płytkę nazębną (PFU) na mililitr (PFU/ml nierozcieńczonych zakażonych bakterii wyjętych z płytki mikromiareczkowej) w trzech triplikatach pobranych z tego dołka.
3. Proszę sporządzić średnią końcową z wyników dla trzech powtórzonych studzienek i obliczyć błąd standardowy tej średniej (tabela 1). To jest to, co zostanie zarejestrowane na rysunku wzrostu miana faga dla każdej rundy selekcji powinowactwa i leczenia (Figura 5C).

7. Izolacja płytki nazębnej, PCR i sekwencjonowanie

1. Pod koniec 4. rundy selekcji powinowactwa wybrać 18 pojedynczych, dobrze zdefiniowanych kolonii blaszek miażdżycowych i za pomocą sterylnej pipety Pasteura, wykałaczki, żółtej końcówki do pipety lub podobnego urządzenia, wydrążyć tę płytkę z płytek miareczkowych. Jeśli używasz probówek lub końcówek, najpierw zwilż wnętrze Tris-HCl, pH 8,5 w probówce Eppendorfa (rysunek 5D).
2. Jeśli używasz probówek, upewnij się, że probówka borokrzemianowa nie zawiera nadmiaru kropli Tris, wciśnij bańkę i, nadal będąc ściśniętą, przepchnij końcówkę pipety borokrzemianowej przez dobrze odizolowaną płytkę dokładnie do plastikowej szalki Petriego poniżej (Rysunek 5E). Zwolnij bańkę z końcówką pipety nadal w agarozie agarowej/górnej i zassaj rdzeń (Rysunek 5F, patrz strzałka).
3. Wyrzuć rdzeń do 100 μl Tris-HCl, pH 8,5 do odpowiedniej probówki (ryc. 5G) i krótko zwiruj.
4. Podgrzewać 20 μl z tej objętości w temperaturze 65 °C przez 10 minut.
5. Odwirować podgrzaną objętość przy stężeniu 13 000 x g w wirówce stołowej w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Pobrać 3 μl z supernatantu tej podwielokrotności do użycia w reakcjach PCR ze starterami T7-UP i T7-Down.
6. Dla każdej z 18 wyizolowanych płytek miażdżycowych, podgrzanych roztworów, przeprowadzić reakcję PCR o objętości 50 μl, stosując temperaturę wyżarzania 58 °C i 35 cykli.
7. Przeprowadzić 20 μl każdej reakcji na 1% (w/v) żelu agarozowym zawierającym 0,015% (v/v) bromku etydyny. Wizualizacja za pomocą transiluminatora przy użyciu odpowiedniej ochrony oczu i nitrylowych rękawic laboratoryjnych. (UWAGA: bromek etydyny jest silnym mutagenem.) Sfotografuj żel i odpowiednio zutylizuj zanieczyszczone materiały (rysunki 6A i 6B).
8. Jeśli amplikony są pojedynczymi produktami, a nie z pustego wektora (produkt przebiega w pobliżu 100 pz na 1% (w/v) żelu agarozowym TAE; Rysunki 6A i 6B strzałki), wyczyść pozostałe 30 μl do użycia jako szablon sekwencjonowania. Jeśli na żelu nie ma ani jednego produktu (ryc. 6B, płytka 15), wytnij najbardziej widoczne prążki (pasma) z żelu i wyekstrahuj DNA z żelu za pomocą zestawu.
9. Sekwencjonuj amplikony, które nie są pustymi wektorami, za pomocą startera T7-UP.
10. Zbadaj każdą sekwencję ramion łącznika i na podstawie tych informacji określ, gdzie znajduje się początek wkładki. Użyj narzędzia Basic Local Alignment Search Tool (BLAST; National Library of Medicine) w celu określenia tożsamości zakodowanego cDNA, czy wstawka znajduje się w ramce, a jeśli tak, to jaka część sekwencji kodującej białko (CDS) została wyświetlona i przechwycona przez przynętę.

Results

Możliwość osłabienia zdolności przynęty do interakcji z białkami wyświetlanymi przez fagi (metabolicznie zatruwając przynętę) zapewnia silną kontrolę negatywną dla tej techniki. Wskazane jest również określenie, czy przynęta po dokładnym związaniu z płytką mikromiareczkową zachowuje swoją funkcję. Obie te kontrole zwiększą pewność, że oddziałujące ze sobą, wyświetlane na fagach białka odzyskane przez niezatrutą przynętę są legalne.

Pobieranie próbek trzech trójek z każdego dołka znacznie zwięk...

Discussion

Przeprowadzając eksperyment w trzech zreplikowanych studzienkach, można odróżnić niezależnie nabyte fagi tego samego białka wiążące się z przynętą, nawet jeśli są to te same klony (tj. nie ma różnicy w sekwencji nukleotydów regionu CDS, który został nabyty, ale zostały one pobrane z niezależnych studzienek). W przeciwnym razie jedynym sposobem na odróżnienie fagów kodujących to samo białko wiążące się z przynętą jest to, że są to niezależnie odwrócone regiony transkrybowane, które różnią się w jakiejś części sek...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trypton	, Becton, Dickinson Co.
Ekstrakt z drożdży	Becton Dickinson	212750
Agar	Becton Dickinson	214010
Chlorek sodu	Fisher Scientific	BP358-10
Agaroza	Products International	A20090
Odczynnik blokujący	EMD Chemicals Inc.	69064
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100
Wodorotlenek sodu	Fisher Scientific	BP359-212
Dodecylosiarczan sodu	Fisher Scientific	BP166-500
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-5
Chloroform	Fisher Scientific	BP1145-1
Escherichia coli BLT5403	EMD Chemicals Inc.	BLT5403	Genotyp: F- ompT hsdSB (rB - mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR)
Ampicylina, Sól sodowa	Research Products International	A40040
Bromek etydyny	Fisher Scientific	BP102-1
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich Corp.	A-9647
Przeciwciało pierwotne Penta-HIS	Qiagen Inc.	34660
Kozia koniugat fosfatyzacji alkalicznej przeciwko myszom	Sigma-Aldrich Corp.	A-5153
para-Nitrofenylofosforan	Sigma-Aldrich Corp.	N-7653
Podkład T7-UP	EMD Chemicals Inc.		5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'T7-DOWN
podkład	EMD Chemicals Inc.		5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'Qiaquick
Zestaw do oczyszczania PCR	Qiagen Inc.	28104
Zestaw do ekstrakcji żelu Qiaquick	Qiagen Inc.	28706
Zestaw do sekwencjonowania cykli Big Dye Terminator v3.1	Invitrogen Life Technologies	4336917
Blok grzewczy	Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.)	18780
96-dołkowe płytki do hodowli komórkowych	Corning	Costar 3590
Piec do inkubatora izotempowego	Fisher Scientific	516D
Pipety Pasteura, 5 i #190; w	Fisher Scientific	13-678-20A
Transformiluminator ChromaView	UVP Inc.	TS-15
UV Shield	Oberon	071AF
Rękawice, nitryl	Fisher Scientific	19-170-010C
Sterylne probówki 1,5 ml	USA Scientific Inc	1615-5500
10 ml pipety borokrzemianowe	Fisher Scientific	13-678-25E
Probówki do hodowli borokrzemianów	Fisher Scientific	14-961-27
Uniskan I, czytnik płytek ELISA	Labsystem i Flow Laboratories, Helsinki, Finlandia	Typ 362