Method Article

Protokół wyświetlania fagów i selekcji powinowactwa przy użyciu rekombinowanych przynęt białkowych

DOI:

10.3791/50685

⸱

February 16th, 2014

 ,  , 
1Department of Horticulture, University of Kentucky

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyświetlanie fagów to potężna technika do wychwytywania białek lub ugrupowań białkowych, które oddziałują z unieruchomioną cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania. Po podjęciu decyzji o rodzaju biblioteki cDNA fagów, którą należy utworzyć i przebadać, opisany tutaj protokół pozwala na skuteczną selekcję powinowactwa prowadzącą do identyfikacji interaktorów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie rekombinowanego faga jako rusztowania do prezentacji różnych porcji białek kodowanych przez kierunkowo sklonowaną bibliotekę cDNA do unieruchomionych cząsteczek przynęty jest skutecznym sposobem na odkrywanie interakcji. Technika ta została w dużej mierze wykorzystana do odkrycia interakcji białko-białko, ale cząsteczka przynęty, która ma zostać poddana próbie, nie musi ograniczać się do białek. Przedstawiony tutaj protokół został zoptymalizowany, aby umożliwić badanie przesiewowe niewielkiej liczby przynęt w powtórzeniach, aby zmaksymalizować identyfikację niezależnych klonów prezentujących to samo białko. Pozwala to na uzyskanie większej pewności, że zidentyfikowane oddziałujące białka są legalnymi interaktorami cząsteczki przynęty. Monitorowanie miana faga po każdej rundzie selekcji powinowactwa dostarcza informacji o postępie selekcji powinowactwa, a także o skuteczności kontroli ujemnych. Przedstawiono jeden ze sposobów mianowania faga oraz to, jak i co przygotować z wyprzedzeniem, aby proces ten przebiegał jak najefektywniej. Podkreślono atrybuty amplikonów pobranych po wyizolowaniu niezależnej płytki, które można wykorzystać do ustalenia, jak dobrze postępuje selekcja powinowactwa. Wyjaśniono techniki rozwiązywania problemów w celu zminimalizowania wyników fałszywie dodatnich lub ominięcia trwale odzyskiwanych fagów. Omówiono sposoby ograniczania zaostrzeń zakażeń wirusowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dlaczego używać wyświetlania fagów i selekcji powinowactwa zamiast niezliczonych innych dostępnych technik do odkrywania i badania interakcji białek z innymi cząsteczkami? Wyświetlanie fagów może mieć pewne unikalne zalety w porównaniu z innymi metodami wykrywania interakcji białko-ligand1-3, w tym:

Bardzo szeroki repertuar cząsteczek przynęty

Głównym powodem jest różnorodność molekuł zdolnych do działania jako przynęta w selekcji powinowactwa 4. Wyświetlanie fagów jest bardzo skutecznym sposobem izolowania fragmentów białek, które oddziałują z innymi białkami, nukleotydami, węglowodanami i....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Graficzne przedstawienie procedury opisanej poniżej (Rysunek 1) podkreśla dwa główne składniki selekcji powinowactwa za pomocą biblioteki wyświetlania fagów: A) biblioteka cDNA wyświetlająca fagi, która prawdopodobnie koduje białka o powinowactwie do przynęty oraz; B) oczyszczone rekombinowane białko przynęty. Produkcja przynęty (białka rekombinowanego) została szeroko zbadana, a literatura przedstawia najlepsze praktyki w zakresie zabezpieczania rozpuszczalnego, aktywnego białka rekombinowanego z E. coli12-13, drożdży eukariotycznych14, owadów15-16, roślin17-18 lub komórek ssaków19-20.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Możliwość osłabienia zdolności przynęty do interakcji z białkami wyświetlanymi przez fagi (metabolicznie zatruwając przynętę) zapewnia silną kontrolę negatywną dla tej techniki. Wskazane jest również określenie, czy przynęta po dokładnym związaniu z płytką mikromiareczkową zachowuje swoją funkcję. Obie te kontrole zwiększą pewność, że oddziałujące ze sobą, wyświetlane na fagach białka odzyskane przez niezatrutą przynętę są legalne.

Pobieranie próbek trzech trójek z każdego dołka znacznie zwięk.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeprowadzając eksperyment w trzech zreplikowanych studzienkach, można odróżnić niezależnie nabyte fagi tego samego białka wiążące się z przynętą, nawet jeśli są to te same klony (tj. nie ma różnicy w sekwencji nukleotydów regionu CDS, który został nabyty, ale zostały one pobrane z niezależnych studzienek). W przeciwnym razie jedynym sposobem na odróżnienie fagów kodujących to samo białko wiążące się z przynętą jest to, że są to niezależnie odwrócone regiony transkrybowane, które różnią się w jakiejś części sek.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten projekt został częściowo sfinansowany przez NSF IOS (0849230); Hatch, McIntire-Stennis (AD421 CRIS), Grant Nasion USDA (2011-04375) oraz stypendium badawcze Sir Fredericka McMastera dla ABD.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Trypton, Becton, Dickinson Co.
Ekstrakt z drożdżyBecton Dickinson212750
AgarBecton Dickinson214010
Chlorek soduFisher ScientificBP358-10
AgarozaProducts InternationalA20090
Odczynnik blokującyEMD Chemicals Inc.69064
Tween 20Fisher ScientificBP337-100
Wodorotlenek soduFisher ScientificBP359-212
Dodecylosiarczan soduFisher ScientificBP166-500
Tris BaseFisher ScientificBP152-5
ChloroformFisher ScientificBP1145-1
Escherichia coli BLT5403EMD Chemicals Inc.BLT5403Genotyp: F- ompT hsdSB (rB - mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR)
Ampicylina, Sól sodowaResearch Products InternationalA40040
Bromek etydynyFisher ScientificBP102-1
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-Aldrich Corp.A-9647
Przeciwciało pierwotne Penta-HISQiagen Inc.34660
Kozia koniugat fosfatyzacji alkalicznej przeciwko myszomSigma-Aldrich Corp.A-5153
para-NitrofenylofosforanSigma-Aldrich Corp.N-7653
Podkład T7-UPEMD Chemicals Inc.5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'T7-DOWN
podkładEMD Chemicals Inc.5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'Qiaquick
Zestaw do oczyszczania PCRQiagen Inc.28104
Zestaw do ekstrakcji żelu Qiaquick Qiagen Inc.28706
Zestaw do sekwencjonowania cykli Big Dye Terminator v3.1Invitrogen Life Technologies4336917
Blok grzewczyPierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.)18780
96-dołkowe płytki do hodowli komórkowychCorningCostar 3590
Piec do inkubatora izotempowegoFisher Scientific516D
Pipety Pasteura, 5 i #190; wFisher Scientific13-678-20A
Transformiluminator ChromaViewUVP Inc.TS-15
UV ShieldOberon071AF
Rękawice, nitrylFisher Scientific19-170-010C
Sterylne probówki 1,5 mlUSA Scientific Inc1615-5500
10 ml pipety borokrzemianoweFisher Scientific13-678-25E
Probówki do hodowli borokrzemianówFisher Scientific14-961-27
Uniskan I, czytnik płytek ELISALabsystem i Flow Laboratories, Helsinki, FinlandiaTyp 362
211705 Research

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Georgieva, Y., Konthur, Z. Design and screening of M13 phage display cDNA libraries. Molecules. 16, 1667-1681 (2011).
  2. Beghetto, E., Gargano, N. Lambda-display: a powerful tool for antigen discovery. Molecules. 16, 3089-3105 (2011).
  3. Li, W.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Phage DisplayAffinity SelectionRecombinant Protein BaitsProtein Protein InteractionsPhage Titer MonitoringPlaque IsolationPhage Library ScreeningStringent WashingPhage AmplificationBait Immobilization

Related Articles