Podejście do badań przesiewowych materiałów z przewodnikiem w celu opracowania ilościowych mikromacierzy białkowych pochodzących zol-żel

Summary

Opisano podejście do badań przesiewowych materiałów w celu opracowania mikromacierzy domieszkowanych białkiem pochodzącym zol-żel przy użyciu nowej metody produkcji druku pinów. Metodologia ta została zademonstrowana poprzez opracowanie mikromacierzy acetylocholinoesterazy i multikinaz, które są wykorzystywane do opłacalnych badań przesiewowych małych cząsteczek.

Abstract

Mikromacierze znalazły zastosowanie w rozwoju wysokoprzepustowych testów dla nowych materiałów i odkrywaniu małocząsteczkowych leków prowadzących. W niniejszym artykule opisano podejście do badań przesiewowych materiałów z przewodnikiem w celu identyfikacji materiałów na bazie zol-żel, które są odpowiednie do produkcji trójwymiarowych mikromacierzy białkowych. Podejście to najpierw identyfikuje materiały, które można wydrukować jako mikromacierze, zawęża liczbę materiałów, identyfikując te, które są kompatybilne z danym testem enzymatycznym, a następnie koncentruje się na optymalnych materiałach w oparciu o zachowanie maksymalnej aktywności enzymatycznej. Podejście to stosuje się do opracowania mikromacierzy odpowiednich do dwóch różnych testów enzymatycznych, jednego przy użyciu acetylocholinoesterazy, a drugiego przy użyciu zestawu czterech kluczowych kinaz zaangażowanych w raka. W każdym przypadku udało się wyprodukować mikromacierze, które można było wykorzystać do ilościowych testów przesiewowych małych cząsteczek i produkcji zależnych od dawki krzywych odpowiedzi inhibitora. Co ważne, możliwość badania przesiewowego wielu materiałów dostarczyła informacji na temat rodzajów materiałów, które najlepiej nadają się zarówno do produkcji mikromacierzy, jak i do utrzymania aktywności enzymów. Dane materiałowe zapewniają wgląd w podstawowe wymagania materiałowe niezbędne do dostosowania optymalnych mikromacierzy pochodzących z zol-żelu o dużej gęstości.

Introduction

Mikromacierze zyskały popularność w środowisku naukowym jako metoda zwiększania przepustowości testów. Od czasu opracowania technologii mikromacierzy do oceny ekspresji genów¹ w połowie lat dziewięćdziesiątych XX wieku, mikromacierze znalazły zastosowanie w opracowywaniu wysokoprzepustowych testów do identyfikacji interakcji białko-białko i białko-małe cząsteczki, a także do znajdowania nowych materiałów o unikalnych właściwościach. ^2-5 Niedawno opracowano mikromacierze, w których określone materiały są używane do unieruchamiania funkcjonalnych białek, wytwarzając trójwymiarowy element mikromacierzy, w którym białka są uwięzione, co pozwala na łatwy pomiar aktywności enzymatycznej i inhibicji samej mikromacierzy przy użyciu odpowiedniego testu fluorescencyjnego, który jest sprzężony z wymianą substratu. ^5-10 Co ważne, takie mikromacierze mogą być zaprojektowane tak, aby zawierały wszystkie niezbędne komponenty do przesiewania próbek i kontroli razem w wysoce równoległy sposób. ^5,8

pkt.

Wczesne przykłady mikromacierzy białkowych były zazwyczaj przygotowywane przy użyciu standardowych metod immobilizacji białek na stałych podłożach, takich jak kowalencyjne przyłączanie,11 przechwytywanie powinowactwa³ i adsorpcja fizyczna. ¹² Chociaż te metody bioimmobilizacji pozwalają na zwiększenie stężenia próbki i przyspieszoną kinetykę reakcji wymaganą do miniaturyzacji testu, każda z nich ma wady. Ogólnie rzecz biorąc, wszystkie powodują zmniejszenie natywnej funkcjonalności biomolekuły z powodu chemicznej modyfikacji powierzchni, utrudnionego dostępu do miejsc aktywnych lub niewłaściwej orientacji z powodu niespecyficznego unieruchomienia. W związku z tym wszystkie metody skutkują niższą czułością testu pomimo wzrostu osadzania się biomolekuł, odpowiedzi, która prawdopodobnie wynika z potrzeby sztucznego wiązania biomolekuł z powierzchnią.

Pojawiającym się podejściem do produkcji funkcjonalnych mikromacierzy biomolekuł jest drukowanie pinami domieszkowanych białkiem zoli krzemionkowych na stałych podłożach, które zazwyczaj są albo funkcjonalizowanymi szkiełkami podstawowymi, albo pojedynczymi dołkami płytek mikrodołkowych. Sam proces zol-żel odbywa się w środowisku wodnym w temperaturze pokojowej i to właśnie ciekły prekursor jest drukowany, a następnie żeluje w celu uwięzienia biomolekuł w matrycy 3D, co pozwala na wysokie obciążenie białkami¹³, a także uwięzienie wielu składników w tym samym elemencie mikromacierzy. ^13,14 Dostosowanie materiału pochodzącego zol-żel można przeprowadzić poprzez staranny dobór różnych prekursorów krzemionki, jak również poprzez zmianę składnika wodnego poprzez zastosowanie różnych (pH, siła jonowa) i włączenie różnych dodatków (polimerów, małych cząsteczek) w celu uzyskania optymalnego materiału, którego specyficzny charakter zależy od uwięzionej biocząsteczki. ¹⁰

Potencjalnym ograniczeniem związanym z tworzeniem mikromacierzy białkowych pochodzących zol-żel za pomocą drukowania pinów jest potrzeba identyfikacji materiałów kompozytowych na bazie zol-żel, które mogą być drukowane bez żelowania w szpilce lub wykazywania niepożądanych właściwości (niepowtarzalne rozmiary plamek, pękanie, słaba adhezja, niekompatybilność ze składnikami testu, słaba aktywność białka) po wydrukowaniu na powierzchni. ⁵ Jednoczesna optymalizacja wszystkich tych parametrów wyklucza podejście, w którym materiały mogą być projektowane de novo lub badane powoli w sposób seryjny. Z drugiej strony, wyrywkowe przesiewanie wielu tysięcy lub dziesiątek tysięcy materiałów nie jest ani czasochłonne, ani opłacalne.

W tym artykule opisujemy podejście do ukierunkowanego badania, które pozwala na szybką identyfikację odpowiednich materiałów do produkcji mikromacierzy białkowych bez potrzeby losowego przesiewania dużej liczby materiałów. Stosując podejście kierowane, najpierw identyfikowane są materiały nadające się do drukowania mikromacierzy, a następnie przeprowadza się serię małych ekranów w celu zidentyfikowania optymalnych kombinacji materiałów pochodzących zol i żel, które można drukować w sposób powtarzalny, bez pęknięć i są kompatybilne z danym testem. Na koniec identyfikowane są optymalne materiały na podstawie zachowania aktywności enzymu i wydajności w końcowym teście przesiewowym małych cząsteczek. W ten sposób optymalne materiały można zidentyfikować spośród wielu tysięcy kandydatów przy użyciu zaledwie kilkuset kroków testu. Demonstrujemy to podejście do wytwarzania zarówno acetylocholinoesterazy o dużej gęstości, jak i mikromacierzy multikinazy oraz zastosowania takich mikromacierzy do badań przesiewowych małych cząsteczek.

Protocol

1. Przygotowanie roztworów dodatków

1. Przygotować 25 i 50 mM tris(hydroksymetylo)aminometanu (zasada Tris, M_r 121,14 g/mol) i HEPES (M_r 238,3 g/mol) o pH 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0 i 8,2 w probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml. Dostosuj pH za pomocą odpowiednio 1 N HCl i NaOH. Przechowywać w temperaturze pokojowej i wymienić po 3 miesiącach.
2. Przygotować 24% (w/v) poli(alkohol winylowy) (PVA): odważyć 2,4 g PVA (M_w 9 000 - 10 000, 80% hydrolizy) i dodać do 10 ml wody dejonizowanej destylowanej (ddH₂O), rozpuść granulki polimeru przez wirowanie. Użyj roztworu 24% (w/v), aby przygotować równe objętości 16% (w/v), 12% (w/v) i 8% (w/v) roztworów PVA. Roztwory odgazowujące przez sonikację przed użyciem. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.
3. Przygotować 24% (m/v) iminę polietylenu (PEI): dodać 4,8 ml PEI (M_w 1,300, 50% (w/w) w_H2O) do 5,2 ml ddH₂O. Użyć 24% (w/v) roztworu do przygotowania równych objętości 16% (w/v), 12% (w/v) i 8% (w/v) roztworów PEI. Roztwory odgazowujące przez sonikację przed użyciem. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.
4. Przygotować 60% (w/v) glikolu polietylenowego (PEG): odważyć 6 g PEG (M_w 600) i dodać do 10 ml ddH₂O, rozpuścić granulki polimeru przez wirowanie. Użyj seryjnego rozcieńczenia, aby przygotować równą objętość 30% (w/v) roztworu PEG. Roztwory odgazowujące przez sonikację przed użyciem. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.
5. Przygotować 24% (v/v) N-(3-trietoksysililopropylo)glukonamid (GLS): dodać 480 μl GLS (50% w etanolu - zapas GLS może wymagać użycia łaźni wodnej w celu ogrzania i rozpuszczenia roztworu, jeśli jest krystaliczny) do 520 μl 95% (v/v) etanolu i mieszać przez 20 minut metodą sonikacji. Użyj roztworu 24% (v/v), aby uzyskać równą objętość 16% (v/v) roztworu GLS. Przygotuj świeże roztwory do użytku dziennie.
6. Przygotować 24% (v/v) metylotrimetoksysilan (MTMS): dodać 240 μl MTMS do 760 μl istniejącego zakwaszonego ddH₂O (pH 2,0, 1 N HCl) i mieszać przez 20 minut przez sonifikację. Użyj roztworu 24% (v/v), aby uzyskać równą objętość 16% (v/v) roztworu MTMS. Przygotuj świeże roztwory do użytku dziennie.
7. Przygotować 24% (v/v) tlenek bis[(3-metylodimetoksylosililo)propylo]polipropylenu (MDSPPO): dodać 240 μl MDSPPO do 760 μl istniejącego zakwaszonego ddH₂O (pH 2,0, 1 N HCl) i mieszać przez 20 minut przez sonifikację. Użyj 24% (v/v) roztworu, aby uzyskać równą objętość 16% (v/v) roztworu MDSPPO. Przygotuj świeże roztwory do użytku dziennie.
8. Przygotować 24% (v/v) 3-(aminopropylo)-trietoksysilan (APTES): dodać 240 μl APTES do 760 μl istniejącego zakwaszonego ddH₂O (pH 2,0, 1 N HCl) i mieszać przez 20 minut przez sonifikację. Użyj 24% (v/v) roztworu, aby uzyskać równą objętość 16% (v/v) roztworu APTES. Przygotuj świeże roztwory do użytku dziennie.
9. Przygotować 24% (v/v) bis(trietoksysililo)etan (bis-TEOS): dodać 240 μl bis-TEOS do 760 μl istniejącego zakwaszonego ddH₂O (pH 2,0, 1 N HCl) i mieszać przez 20 minut przez sonifikację. Użyj roztworu 24% (v/v), aby uzyskać równą objętość 16% (v/v) roztworu bis-TEOS. Przygotuj świeże roztwory do użytku dziennie.
10. Przygotować 24% (v/v) karboksyetylosilanetriol (Si-COOH): dodać 960 μl Si-COOH (25% w ddH₂O) do 40 μl istniejącego zakwaszonego ddH₂O (pH 2,0, 1 N HCl) i mieszać przez 20 minut przez sonifikację. Użyj 24% (v/v) roztworu, aby uzyskać równą objętość 16% (v/v) roztworu Si-COOH. Przygotuj świeże roztwory do użytku dziennie.
11. Oddzielnie przygotuj 3 mM N ε-acetylo-L-lizyny, D-sorbitol, α-α-trehalozę (M_r 188,22 g/mol, 182,17 g/mol i 378,33 g/mol, odpowiednio) i 1,5 mM Triton X-100 (średnio M_w 625 g/mol) w ddH₂O. Objętości mogą się różnić w zależności od tego, ile jest wymagane; przygotuj świeże roztwory do użycia dziennie.
12. Przygotować 60% (w/w) glicerolu: dodać 2,4 g bezwodnego glicerolu do 1,6 g ddH₂O, wymieszać wirowo. Odgazowanie roztworu przez sonikację przed użyciem. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.
13. Przygotować 30% (w/w) glicerolu: dodać 1,6 g bezwodnego glicerolu do 2,4 g ddH₂O, wymieszać wirowo. Odgazowanie roztworu przez sonikację przed użyciem. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.

2. Przygotowanie soli krzemionkowych

Zgodnie z poniższymi procedurami, odpowiednie sole, gdy są trzymane na lodzie, mogą być używane do 1 godziny po dodaniu wody. Sole używane dłużej niż 1 godzina powodują skrócenie/niespójny czas żelowania materiału.

1. Przygotowanie zolu na bazie krzemianu sodu (SS)
   1. Odważyć 120 g żywicy jonowymiennej do plastikowej zlewki o pojemności 500 ml.
   2. Dodać 150 ml 0,1 N HCl i mieszać przez 1 godzinę za pomocą 2-calowego mieszadła magnetycznego.
   3. Przefiltrować roztwór za pomocą lejka Büchnera podłączonego do próżni.
   4. Powoli dodawać ddH₂O, aby przepłukać przefiltrowaną żywicę, aż otrzymany filtrat będzie klarowny. Potrzeba około 100 ml ddH₂O.
   5. Zbierz i przechowuj przygotowaną żywicę w plastikowym pojemniku w temperaturze pokojowej do 1 miesiąca.
   6. Odważyć 2,59 g krzemianu sodu (SS, 27% (m/m) SiO₂, 10% (w/w) NaOH) do zlewki plastikowej o pojemności 50 ml.
   7. Dodać 10 ml ddH₂O do SS. Delikatnie zamieszać ręcznie, aby wymieszać roztwór.
   8. Odważyć 5,60 g przygotowanej żywicy do osobnej zlewki plastikowej o pojemności 50 ml. Dodaj do roztworu krzemianu sodu i mieszaj przez 2 minuty za pomocą jednocalowego mieszadła magnetycznego.
   9. Przefiltrować roztwór mieszaniny za pomocą lejka Büchnera podłączonego do aspiratora podłączonego do kranu z wodą.
   10. Użyj plastikowej strzykawki o pojemności 10 ml wyposażonej w filtr membranowy 0,2 μm, aby przefiltrować roztwór zolu. Daje to zol z 5,6% (w/w) krzemionki, określany w dalszej części tekstu jako SS. Trzymaj sol na lodzie, gdy nie jest używany.
   11. 1/2SS: dodać 1 ml przygotowanego zolu SS do 1 ml ddH₂O, wymieszać wirowo. Trzymaj sol na lodzie, gdy nie jest używany.
2. Przygotowanie zol na bazie diglicerylosilanu (DGS)
   1. Zsyntetyzuj DGS zgodnie z opisem w innym miejscu. ^15,16 Krystaliczny DGS należy przechowywać w eksykatorze w temperaturze pokojowej przez okres do 6 miesięcy.
   2. Odważyć około 1 g krystalicznego DGS.
   3. Użyj moździerza i tłuczka, aby zmielić DGS na drobny proszek. Wykonaj ten krok tak szybko, jak to możliwe, aby zapobiec wchłanianiu wilgoci z powietrza.
   4. Ostrożnie przenieść drobno zmielony DGS do pustej 20-mililitrowej fiolki scyntylacyjnej, zanotować masę (z dokładnością do tysięcznej części grama).
   5. Dodać ddH₂O, aby uzyskać 0,5 g/ml DGS.
   6. Sonikować zhydrolizowany DGS na lodzie przez 20 minut, mieszać wirowo przez 5 sekund co 5 minut. W wilgotne dni całkowite rozpuszczenie DGS może wymagać dodania 10 μl 1 N HCl. Należy go dodać do roztworu przed sonikacją.
   7. Użyj plastikowej strzykawki o pojemności 3 ml wyposażonej w filtr membranowy 0,2 μm, aby przefiltrować roztwór zolu, usuwając drobne cząstki. Daje to zol z 5,0% (w/w) krzemionki, określany w dalszej części tekstu jako DGS. Trzymaj sol na lodzie, gdy nie jest używany.
   8. 1/2DGS: dodać 1 ml przygotowanego zolu DGS do 1 ml ddH₂O, wymieszać wirowo. Trzymaj sol na lodzie, gdy nie jest używany.

3. Wstępna selekcja w celu identyfikacji materiałów do druku

Na rysunku 1 pokazany jest uogólniony schemat pokazujący różne etapy kierowanej analizy czynnikowej używanej do identyfikacji materiałów drukowalnych. Zalecana jest minimalna całkowita objętość materiału wynosząca 100 μl. Stosowanie mniejszych objętości utrudnia wizualizację żelowania materiału.

1. Etap 1: bufor i silan
   1. Dodać 50 μl buforu (25 i 50 mM Tris lub HEPES o pH 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0, 8,2) do 2 ml szklanej fiolki scyntylacyjnej.
   2. Dodać 50 μl odpowiedniego zolu (DGS, 1/2DGS, SS, 1/2SS) i mieszać wiry w sposób włączany i wyłączany przez 10 sekund, włączając i wyłączając fiolkę z mieszalnika wirowego.
   3. Ustaw materiały tak, aby odpoczywały w temperaturze pokojowej, monitorując czas żelowania materiału. Czas żelowania definiuje się jako punkt, w którym materiał przestaje swobodnie płynąć po obróceniu fiolki pod kątem 45°.
   4. Z kolejnych etapów przesiewania materiału należy wykluczyć kombinacje materiałów o czasie żelowania krótszym niż 2,5 godziny.
2. Etap 2: bufor, silan i polimer
   1. Do szklanej fiolki scyntylacyjnej o pojemności 2 ml dodać 3,13 μl 16% (m/v) lub 8% (w/v) roztworu PVA/PEI lub 6,3 μl 30% (m/v) lub 60% (w/v) roztworu PEG.
   2. Dodać 50 mM HEPES (pH 8,0), aby doprowadzić łączną objętość do 50 μl, wymieszać roztwór przez wirowanie.
   3. Dodać 50 μl odpowiedniego solu (DGS, 1/2DGS, SS, 1/2SS), wymieszać w sposób opisany w kroku 3.1.2.
   4. Z kolejnych etapów przesiewania materiału należy wykluczyć kombinacje materiałów, których czas żelowania (jak określono w kroku 3.1.3) krótszy niż 2,5 godziny.
3. Etap 3: bufor, silan, polimer i organosilan
   1. Do 2-mililitrowej szklanej fiolki scyntylacyjnej dodać 3,13 μl 16% (m/v) lub 8% (w/v) roztworu PVA lub 6,3 μl 30% (m/v) lub 60% (w/v) roztworu PEG.
   2. Dodać 3,13 μl 16% (w/v) organozylanu (GLS, MTMS, MDSPPO, bis-TEOS, Si-COOH lub APTES).
   3. Dodać 50 mM HEPES (pH 8,0), aby doprowadzić łączną objętość do 50 μl, wymieszać roztwór przez wirowanie.
   4. Dodać 50 μl odpowiedniego solu (DGS, 1/2DGS, SS, 1/2SS) i wymieszać w sposób opisany w kroku 3.1.2. Z kolejnych etapów przesiewania materiału należy wykluczyć kombinacje materiałów, których czas żelowania (jak określono w kroku 3.1.3) krótszy niż 2,5 godziny.
4. Etap 4: bufor, silan, polimer, organozylana i dodatek małocząsteczkowy
   1. Do szklanej fiolki scyntylacyjnej o pojemności 2 ml dodać 2,08 μl 24% (m/v) lub 12% (w/v) roztworu PVA lub 6,3 μl 30% (m/v) lub 60% (w/v) roztworu PEG.
   2. Dodać 2,08 μl 24% (w/v) organosilanu (GLS, Si-COOH).
   3. Dodać 2,08 μl 3 mM roztworu drobnocząsteczkowego (N ε-acetylo-L-lizyna, D-sorbitol, α-α-trehaloza) lub 1,5 mM (Triton X-100).
   4. Dodać 50 mM HEPES (pH 8,0), aby doprowadzić łączną objętość do 50 μl, wymieszać roztwór przez wirowanie.
   5. Dodać 50 μl odpowiedniego solu (DGS, 1/2DGS, SS, 1/2SS) i wymieszać w sposób opisany w kroku 3.1.2.
   6. Z kolejnych etapów drukowania materiału należy wykluczyć kombinacje materiałów o czasach żelowania (jak określono w kroku 3.1.3) krótszych niż 2,5 godziny.

4. Przygotowanie materiałów do druku domieszkowanego białkiem

Materiały zidentyfikowane na końcu kroku 3.4.6 są kontynuowane w badaniach nad drukownością, a odpowiedni enzym jest teraz włączony do zolu. We wszystkich przypadkach opisanych poniżej, roztwór wodny zawierający wszystkie składniki z wyjątkiem silanu przygotowuje się w mikrostudzience, a następnie dodaje się zol tuż przed drukowaniem. Aby dostosować się do użycia płytki o długości 384 mikromiareczkowania, zamiast 100 μl stosuje się całkowitą objętość roztworu wynoszącą 50 μl.

1. Mikromacierz acetylocholinoesterazy (AChE)
   1. Przygotować roztwór AChE o stężeniu 2 kU/ml w 50 mM HEPES (pH 8,0) zgodnie z informacjami o aktywności enzymu specyficznymi dla partii (jednostki aktywności na mg) dostarczonymi przez producenta.
   2. Roztwór podstawowy enzymu o stężeniu 2 kU/ml rozdzielić na 5 μl frakcji za pomocą probówek mikrowirówek o objętości 500 μl i przechowywać w temperaturze -20 °C. Roztwory podstawowe AChE o stężeniu 2 kU/ml pozostają stabilne przez okres do 4 miesięcy przy przechowywaniu w temperaturze -20 °C.
   3. Przygotować materiały bazowe, łącząc połowę objętości odpowiednich polimerów, organozylanów i dodatków małocząsteczkowych zidentyfikowanych w kroku 3.4.6 na 384-dołkowej płytce do mikromiareczkowania.
   4. Dodać 5 μl 2 kU/ml AChE do 50 mM HEPES (pH 8,0).
   5. Używając 50 mM HEPES (pH 8,0), doprowadzić połączoną objętość studzienki do 25 μl, kilkakrotnie pipetując roztwór w górę i w dół.
2. Mikromacierz wielokinazowa
   1. Przygotować 100 roztworów kinaz ng/μl (p38α, MAPK2, EGFR, GSK-3β) w_ddH2O zgodnie z informacjami o aktywności (U/ml lub U/mg) i ilości dostarczonymi przez producenta. Roztwory kinaz należy przechowywać w porcjach po 2 μl w temperaturze -80 °C.
   2. Przygotować substraty kinazy (MBP, p(E₄Y), GSM) w stężeniu 5 mg/ml, 50 mg/ml lub 300 μM w ddH₂O, postępując zgodnie z informacją o ilości podaną przez producenta. Przechowywać podłoża w porcjach 2,5 μl w temperaturze -80 °C.
   3. Przygotować materiały bazowe, łącząc połowę objętości odpowiednich polimerów, organozylanów i dodatków małocząsteczkowych zidentyfikowanych w kroku 3.4.6 na 384-dołkowej płytce do mikromiareczkowania.
   4. Do każdej studzienki zawierającej materiały podstawowe dodać 2,5 μl kinazy i 2 μl odpowiedniego substratu (p38α i MBP, MAPK2 i MBP, EGFR i p(E₄Y), GSK-3β i GSM), jak przygotowano odpowiednio w krokach 4.2.1 i 4.2.2.
   5. Używając 50 mM HEPES (pH 7,4), doprowadzić połączoną objętość studzienki do 25 μl. Wymieszać pipetując.

5. Tworzenie mikromacierzy

Ta sekcja wyjaśnia szczegółową procedurę drukowania materiałów na pojedynczej powierzchni slajdu. Aby drukować na wielu zmodyfikowanych powierzchniach szkiełka (amina, żywica epoksydowa, aldehyd i PMMA), procedurę tę powtarza się 4 razy.

1. Formuj mikrotablice za pomocą robota drukującego styki wyposażone w stolik XYZ. Użyj szczelinowych kołków osłonowych o średnicy 100 μM, aby zdeponować zole domieszkowane białkiem.
2. Ustaw wilgotność w komorze drukującej na 80-90%. Wilgotność <80% może powodować parowanie próbki i niespójności w drukowaniu ze względu na małe objętości osadzania.
3. Sonikować szpilki w ddH₂O przez 15 minut przed drukowaniem i suszyć pod strumieniem azotu. Użyj środka do czyszczenia rur, aby usunąć resztki wilgoci z uchwytu szpilki i ostrożnie umieść szpilkę w głowicy drukującej. Brak usunięcia wilgoci resztkowej może utrudnić swobodne przesuwanie się sworznia wraz z uchwytem, powodując pominięcie miejsc.
4. Kontroluj wzorce macierzy za pomocą programu Chip Writer Pro (CWP). Dla każdej studzienki na próbkę w 384-dołkowej płytce źródłowej, 200 plamek (maksymalna liczba plamek na wychwyt przy użyciu kołka osłony SMP3) jest drukowanych na szkiełku podstawowym o zmodyfikowanej powierzchni.
5. Rozpocznij proces drukowania za pomocą oprogramowania. Ustaw ruch w kierunku XY na 10 mm/s, a prędkość zbliżania się próbki (kierunek Z) na 2 mm/s z czasem ładowania próbki wynoszącym 2,5 sekundy.
6. Wstrzymaj przebieg przez CWP. Zanurzyć szpilkę w próbce i dodać pipetą 25 μl odpowiedniego zolu (DGS, 1/2DGS, SS, 1/2SS) do studzienki. Wymieszać roztwór, wykonując ruchy pipetowania góra-dół powtórzone 50 razy. W przypadku mieszania przez pipetowanie należy zminimalizować ilość powietrza wprowadzanego do roztworu. Pęcherzyki powietrza zapobiegają całkowitemu załadowaniu próbki do trzpienia.
7. Rozpocznij proces drukowania za pomocą CWP i wydrukuj próbkę na jednej powierzchni szkiełka. Wstrzymaj proces drukowania przed załadowaniem próbki z kolejnej płytki źródłowej.
8. Wyjmij kołek drukujący za pomocą magnesu i umieść czyścik do rur w głowicy drukującej, aby zapobiec gromadzeniu się wilgoci w głowicy drukującej.
9. Opłucz pin drukujący za pomocą ddH₂O i sonikuj w czystym ddH₂O przez 30 sekund.
10. Wysusz kołek drukarski pod strumieniem azotu i wyjmij środek do czyszczenia rur, umieszczając kołek z powrotem w głowicy drukującej.
11. Rozpocznij drukowanie, wykonując kroki 5.6 - 5.10 dla wszystkich próbek pozostałych na płycie źródłowej. Na jednym szkiełku można umieścić do 12 000 plamek o średnicy 100 μm.
12. Metodę tę można również zastosować do drukowania materiałów na dnie studzienek w 96-dołkowej mikropłytce. Po pliku kalibracyjnym CWP ponownie skalibruj kołek drukujący, aby upewnić się, że odległość przebyta między osadzaniem punktowym jest wyższa niż wysokość płytki mikrodołkowej. Dzięki temu pin może drukować konsekwentnie od studni do studni w sposób liniowy bez uszkadzania pinu.
13. Po zakończeniu całego eksperymentu drukowania należy postarzać matrycę przez co najmniej 30 minut i do 24 godzin w komorze drukującej w temperaturze 80-90%.

6. Test aktywności acetylocholinoesterazy

1. Przygotowanie próbek kontroli pozytywnej (PC)
   1. Przygotować 1 mM jodku acetylotiocholiny (ATCh: M_r 289,18 g/mol) w 4% glicerolu, 25 mM Tris (pH 7,0) w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. ATCh musi być przygotowany na świeżo przed każdym użyciem i przy użyciu buforu o pH 7,0, ponieważ o wyższym pH powodują szybką autohydrolizę, powodując wyniki fałszywie dodatnie. Ostateczna objętość może być zmieniana w zależności od liczby próbek (25 μl na próbkę).
   2. Dodać 0,14 μl 5 mM bodipy-Fl-L-cystyny do 25 μl 1 mM ATCh w studzience płytki o 384 mikromiareczkowaniu.
   3. Dodać 24,86 μl 4% glicerolu, 25 mM Tris (pH 7,0); wymieszać ostrożnie, pipetując, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków w roztworze. Potencjalne inhibitory enzymów można włączyć do roztworu PC przed doprowadzeniem objętości do 50 μl za pomocą buforu.
2. Przygotowanie próbek kontroli ujemnej (NC)
   1. Dodać 0,14 μl 5 mM bodipy-Fl-L-cystyny do 49,86 μl 4% glicerolu, 25 mM Tris (pH 6,5) do dołka płytki o 384 mikromiareczkach. Wymieszać pipetując.
3. Rozwiązania do nadruku na PC i NC
   1. Wydrukuj przestarzałe mikromacierze zgodnie z krokami 5.1 - 5.10 (ignorując krok 5.6) protokołu. Użyj kołków z rowkiem o średnicy 235 μM, aby nanieść roztwory do nadruku na PC i NC. Dzięki temu roztwór całkowicie pokrywa wcześniej zdeponowane miejsce.
   2. Starzenie matryc przy wilgotności 80-90% przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Ze względu na autohydrolizę ATCh dłuższy czas inkubacji może skutkować fałszywie dodatnimi wynikami lub zwiększoną aktywnością enzymów.

7. Test aktywności kinazy

1. Przygotować 500 μM roztworu adenozyno-5'-trifosforanu (ATP) przy użyciu podstawowego ATP (100 mM) przechowywanego w temperaturze -20 °C. Przygotuj świeży roztwór do każdego eksperymentu i dostosuj objętość do potrzeb eksperymentalnych: każdy roztwór do drukowania wymaga 5 μl.
2. Przygotować 100 mM roztwór podstawowy chlorku magnezu (MgCl₂: M_r 95,21 g/mol) w ddH₂O.
3. Kontrola pozytywna (PC)
   1. Dodać 2,5 μl 100 mM MgCl₂ i 5 μl 500 μM ATP do dołka płytki o wielkości 384 mikromiareczkowania.
   2. Doprowadzić całkowitą objętość studzienki do 50 μl za pomocą 50 mM HEPES (pH 7,4); wymieszać pipetując. Potencjalne inhibitory enzymów można włączyć do roztworu PC przed doprowadzeniem objętości do 50 μl za pomocą buforu.
4. Kontrola ujemna (NC)
   1. Dodać 2,5 μl 100 mM MgCl₂ i 5 μl ddH₂O do dołka płytki o wielkości 384 mikromiareczkowania.
   2. Doprowadzić całkowitą objętość studzienki do 50 μl za pomocą 50 mM HEPES (pH 7,4) i wymieszać pipetując.
5. Nadruk kofaktorów testowych PC i NC
   1. Postępuj zgodnie z krokiem 6.3.1 protokołu.
   2. Starzeje się przy wilgotności 80-90% przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
6. Barwienie szkiełek
   1. Umieść wydrukowane szkiełka z mikromatrycą pojedynczo na szalce Petriego z wystarczającą ilością barwnika (z zestawu), aby pokryć całe szkiełko. Wstrząsać umiarkowanie (~200 obr./min) przez 45 minut za pomocą wytrząsarki płytkowej.
   2. Wyjmij szkiełko za pomocą kleszczy i umieść na czystej szalce Petriego z buforem do mycia (z zestawu). Wstrząsać umiarkowanie (~200 obr./min) przez 45 minut za pomocą wytrząsarki płytkowej.
   3. Wyjmij szkiełko za pomocą kleszczy i odwiruj do sucha za pomocą konwencjonalnej wirówki do mikromacierzy biurkowej wyposażonej w uchwyt na szkiełko.

8. Obrazowanie i analiza mikromacierzy

1. Obrazowania
   
   Proszę zauważyć, że metoda obrazowania będzie specyficzna dla dostępnego typu czytnika matryc. Do badań wykorzystano kamerę Alpha Innotech NovaRay ze źródłem światła białego i systemem detekcji CCD wyposażoną w filtr wzbudzenia 478±17 nm i emisji 538±21 nm dla mikromacierzy AChE oraz filtr wzbudzenia 530±40 nm i filtr emisyjny 614±62 nm dla mikromacierzy kinaz. Konfokalne systemy skanowania laserowego mogą być również używane do odczytu matryc, chociaż ustawienia będą specyficzne dla instrumentu.
   
   1. Umieść szkiełko w uchwycie szkiełka miejscami skierowanymi do góry.
   2. Ustaw liczbę sekcji podglądu (zalecane są co najmniej 2, po jednej na każdym końcu szkiełka mikroskopu), rozdzielczość (zalecane jest minimum 4 μm) i ekspozycję (zalecana jest automatyczna) w oprogramowaniu do obrazowania.
   3. Uzyskaj obraz slajdu i zapisz jako plik ".tiff".
2. analiza
   1. Otwórz uzyskany obraz slajdu w ImageJ64.
   2. Kliknij narzędzie do zaznaczania owalu i zmierz intensywność sygnału każdego punktu za pomocą opcji pomiaru na karcie analizy. Wybierając obszar do pomiaru, wybierz obszar nieco większy niż obserwowana plamka i o stałej wielkości wśród plam, aby zmniejszyć subiektywność ImageJ.
   3. Uśrednić intensywność z 25 podobnych plamek PC, podzieloną przez średnią intensywność 25 podobnych plamek NC, aby uzyskać proporcje PC/NC dla poszczególnych kompozycji materiałowych.

Results

Przeprowadzając prowadzoną analizę czynnikową dla ekranu materiałowego, byliśmy w stanie zminimalizować liczbę testowanych materiałów z ~20 000 do kilkuset, które miały czasy żelowania odpowiednie do druku. Stosując ścisłe wytyczne wymagające czasu żelowania materiału wynoszącego 2,5 godziny lub więcej, materiały, które mogą zatkać kołki drukujące lub wytworzyć niepowtarzalne matryce, nigdy nie zostały wydrukowane. Materiały do druku, w których stwierdzono, że mają wystarczający czas żelowania (>2,5 godziny), zostały wydrukowane na 4 różnych funkcjonalnych powierzchniach szkiełek szkiełkowych. Aby można było uznać go za "nadający się do zadruku", musiała zostać wydrukowana maksymalna liczba plamek na objętość wychwytu pinu (SMP3 = 200). Plamki oceniano również pod kątem morfologii plamki, aby upewnić się, że nie doszło do pęknięć ani niepożądanej separacji faz przy użyciu prostej mikroskopii jasnego pola, jak pokazano na rysunku 2.

Z tego etapu identyfikowanych materiałów do druku, wyprodukowano mikromacierze z AChE i kinazami włączonymi do buforowanego składnika wodnego. Materiały, które były zgodne z procedurą testową (w tym potencjalne etapy nadruku i mycia lub barwienia) zidentyfikowano, obserwując zachowanie plamek mikromacierzy (brak pęknięć, utraty plam lub nietypowych wzorów fluorescencji) oraz stosunek kontroli pozytywnej (PC) do kontroli ujemnej (NC) większy niż 1, jak zaobserwowano za pomocą obrazu. Ponieważ było to około 50% materiałów, do zdefiniowania optymalnych materiałów z zachowaniem aktywności białkowej zastosowano większy stosunek PC/NC wynoszący 3. Dzięki tej metodzie 26 materiałów pochodnych zol-żel zawierających AChE i 2 materiały zawierające kinazy spełniało kryteria >3 PC/NC. Rysunek 3 i rysunek 4 przedstawiają graficzny podział 5 etapów badania przesiewowego materiału prowadzonego w celu identyfikacji optymalnych mikromacierzy AChE i kinaz

.

Testy mogą być również weryfikowane poprzez generowanie wyniku Z'. ¹⁷ W tym celu wykorzystano materiał, który uzyskał najwyższy współczynnik PC/NC. Rysunek 5 przedstawia wykres Z' uzyskany przez porównanie sygnału wygenerowanego z 200 plamek, 100 PC i 100 NC po nadruku barwnika wskaźnikowego i podłoża na tablicy AChE. Układy AChE i kinazy dały odpowiednie wyniki Z' wynoszące 0,60 i 0,67, co wskazuje na doskonały test. Należy jednak zauważyć, że przed walidacją testu, stężenia enzymów, barwników, substratów i kofaktorów na matrycy musiały zostać zoptymalizowane poprzez nadruk zakresu stężeń każdego składnika i wybranie stężenia, które dało najwyższy sygnał, jak opisano szczegółowo w innym miejscu. ⁵

Aby potwierdzić testy, uzyskano ilościowe dane dotyczące hamowania przy użyciu znanych i nieznanych inhibitorów AChE, z wynikami wykonanymi w dwóch egzemplarzach i wykorzystanymi do wytworzenia zduplikowanych wykresów (Rysunek 6A) i krzywych inhibicji (Rysunki 6B i 6C). Plamki najpierw nadrukowano mieszaninami znanych biologicznie aktywnych inhibitorów małocząsteczkowych, a następnie barwnikiem i substratem, a mieszaniny kontrolne zawierające znane inhibitory lub brak inhibitora zostały włączone. Wygenerowano zduplikowane wykresy w celu oceny aktywności enzymu, a wszelkie mieszaniny, które spowodowały mniej niż 25% aktywność enzymu, uznano za pozytywne pod względem hamowania. Poszczególne związki z takich mieszanin zostały następnie przetestowane w dwóch egzemplarzach w celu zidentyfikowania konkretnych małych cząsteczek odpowiedzialnych za inhibicję. Po zidentyfikowaniu te małe cząsteczki wykorzystano do wygenerowania ilościowych krzywych inhibicji w celu określenia wartości IC₅₀ i stałych inhibicji.

Podobne wyniki jakościowe uzyskano przy użyciu zestawu multikinaz z powszechnym inhibitorem kinazy, staurosporyną. Ryciny 7A i 7B pokazują obraz mikromacierzy i wskazują, że intensywność sygnału po nadrukowaniu i barwieniu macierzy multikinazy jest zgodna z oczekiwaniami dla kontroli ujemnej (- ATP), kontroli pozytywnej (+ ATP) i znanego inhibitora (+ ATP + inh). Aby zademonstrować możliwość uzyskania ilościowych danych dotyczących inhibicji z mikromacierzy, przeprowadzono test inhibicji zależny od stężenia dla pojedynczej kinazy. Jak pokazano na rysunkach 8A i 8B, intensywność sygnału zmniejsza się wraz ze wzrostem stężenia inhibitora, a odpowiedź jest zgodna z oczekiwaną krzywą hamowania zależną od stężenia dla układu kinazy/substratu p38α / MBP.

Rysunek 1. Ogólny schemat podejścia opartego na kontroli przesiewowej materiałów z przewodnikiem. Każdy blok reprezentuje krok ekranu w kolejności sekwencyjnej. Liczby po lewej stronie reprezentują łączną liczbę materiałów przygotowanych do analizy. Używając czasu żelowania większego niż 2,5 godziny (materiały o czasach żelowania krótszym niż 2,5 godziny są oznaczone przekreśleniem), liczba materiałów, które przeszły każdy etap i zostały przeniesione do przodu podczas przesiewania materiału, jest oznaczona liczbą po prawej stronie. *Reprezentuje materiały o separacji faz mniejszej niż optymalna.

Rysunek 2. Obrazy optyczne przedstawiające różne tryby uszkodzenia materiałów na etapie drukowania ekranu. Dla porównania pokazany jest również obraz "dobrego" materiału (drugi rząd, trzecia kolumna). Przedruk za zgodą z odnośnika ⁸, copyright 2013 American Chemical Society.

Rysunek 3. Ukierunkowane podejście do badań przesiewowych materiałów w celu identyfikacji optymalnych materiałów do wytwarzania mikromacierzy AChE pochodzących z zol-żelu. Przedruk za zgodą z odnośnika ⁵, copyright 2013 American Chemical Society.

Rysunek 4. Podejście do badań przesiewowych materiałów ukierunkowanych w celu identyfikacji optymalnych materiałów do wytwarzania mikromacierzy kinaz pochodzących z żelu. Przedruk za zgodą z odnośnika ⁸, copyright 2013 American Chemical Society.

Rysunek 5. (A) Fragment mikromacierzy AChE przedstawiający plamki HC (jasnozielone) i LC (jasnozielone) (czarno-zielona paleta została zastosowana jako pseudokolor dla jasności prezentacji); (B) powiększony widok obszaru obramowanego ramką w celu podkreślenia morfologii i wyrównania plamki; oraz (C) działkę Z'. Linie ciągłe wskazują średnią powtórzeń, natomiast linie przerywane odpowiadają 3SD. Przedruk za zgodą z odnośnika ⁵, copyright 2013 American Chemical Society.

Rysunek 6. (A) Zduplikowany wykres do badań przesiewowych syntetycznych analogów alkaloidów z rodziny amarylkowatych (Amaryllidaceae); (B) Wykresy IC₅₀ zidentyfikowanych potencjalnych inhibitorów oznaczonych jako związki 1 i (C) związek 2, ze słupkami błędu reprezentującymi jedno odchylenie standardowe średniej z 25 kontrprób. Pokazano reprezentatywne plamki w celu zilustrowania różnic w sygnale proporcjonalnych do stężeń inhibitorów. Przedruk za zgodą z odnośnika ⁵, copyright 2013 American Chemical Society. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 7. Test na matrycy czterech kinaz przy użyciu 1.4SS/1.0PVA do uwięzienia i wydrukowany na szkiełku derywatyzowanym aminami. (A) Obraz fragmentu mikromacierzy, w którym plamki z kinazami współuwięzionymi z odpowiednimi substratami zostały nadrukowane buforem (NC, górny rząd) lub roztworami zawierającymi ATP (PC, środkowy rząd) lub ATP + staurosporynę (dolny rząd). (B) Wykresy słupkowe porównujące natężenia sygnału między reakcjami hamowanymi i niehamowanymi, po odjęciu sygnałów tła i słupki błędów reprezentujące jedno odchylenie standardowe średniej z 25 powtórzeń. Przedruk za zgodą z odnośnika ⁸, copyright 2013 American Chemical Society.

Rysunek 8. Test inhibicji na mikromacierzy p38a/MBP. (A) Sekcje mikromacierzy przedstawiające reprezentatywne plamki przesiąknięte różnymi stężeniami staurosporyny, jak wskazano (obrazy uzyskano przez pojedynczy skan tego samego szkiełka; dla jasności pokazano obraz złożony). (B) Krzywa IC₅₀ wygenerowana na podstawie analizowanych obrazów matrycy. Intensywność uzyskana przy 100 mM została odjęta od wszystkich obrazów; wszystkie inne intensywności znormalizowano poprzez ustawienie intensywności uzyskanej na poziomie 10 nM na wartość 100% aktywności. Przedruk za zgodą z odnośnika ⁸, copyright 2013 American Chemical Society.

Rysunek 9. Obrazy mikroskopijnego pin stealth używanego do drukowania styków pokazujących różne niedoskonałości: (A) zatkany, (B) wygięty.

Discussion

Opisana tutaj metodologia została wybrana jako najbardziej odpowiednia do identyfikacji materiałów pochodzących z zol-żelu nadających się do druku za pomocą drukarki kontaktowej, co pozwoliło na szybką i kosztową identyfikację optymalnych materiałów bez konieczności przesiewania dużej liczby materiałów. Z łącznej liczby ~20 000 potencjalnych materiałów udało się zidentyfikować ~200 materiałów, które nadawały się do druku na podstawie samego czasu żelowania. To znacznie ograniczyło ilość materiałów potrzebnych do przygotowania do kolejnych prób drukarskich. Te materiały do druku zostały następnie wydrukowane na 4 powierzchniach szkiełek, co daje łącznie 768 kombinacji materiał-szkiełko. Średnio można wydrukować 50 plamek/powtórzeń jednego materiału w ciągu ~3 minut, wliczając w to ładowanie próbki, osadzanie punktowe i czyszczenie pinów. Spośród nich 155 materiałów, czyli około 20%, pozwoliło na wydrukowanie maksymalnej liczby plamek na pobranie roztworu i uzyskało powtarzalne rozmiary plamek. Należy zauważyć, że spośród 4 badanych powierzchni szkiełka materiały drukowane są lepiej w kolejności: amina > żywica epoksydowa > aldehyd > PMMA; Szkiełka PMMA nie wytwarzały użytecznych matryc dla żadnych materiałów. Zostało to prawdopodobnie przypisane polarności powłoki powierzchniowej. Porównując wyżej wymienione powierzchnie szkiełkowe, bardziej polarne aminy i żywice epoksydowe lepiej nadawały się do zol wodnych w porównaniu ze szkiełkami z PMMA. Ponadto, spośród badanych powierzchni, szkiełka pokryte aminami zapewniają potencjalną dodatnio naładowaną powierzchnię do wiązania osadzonego zolu anionowego. Podejrzewamy, że nanocząstki krzemionki na granicy faz między szkiełkiem a zolem oddziałują wzdłuż powierzchni. Zarówno powierzchnie szkiełka epoksydowego, jak i aldehydowego nie mają tej samej początkowej interakcji opartej na ładunku. Aby zapewnić optymalne osadzanie punktowe, zdecydowanie zaleca się stosowanie wstępnie powlekanych szkiełek od dostawcy takiego jak Arrayit. Powlekanie we własnym zakresie powoduje powstawanie niespójnych powierzchni, co prowadzi do słabej odtwarzalności plamki¹³ , a w niektórych przypadkach może prowadzić do problemów z kwantyfikacją. ¹⁸ Równie ważne jest to, że temperatura i wilgotność mają wpływ na "drukowność" materiałów. Chociaż nie przeprowadzono szczegółowych badań nad wpływem temperatury, drukowanie zawsze odbywało się w temperaturze pokojowej (23±3 °C). Wilgotność (ponad 80%) była również kontrolowana w komorze druku, aby zapobiec osadzaniu się nieregularnych kształtów z powodu małych objętości osadzania (0,7-2,3 nl) i parowania.

Podczas gdy badanie przesiewowe materiału było ukierunkowane na identyfikację optymalnych materiałów pochodzących z zol-żel, przeznaczonych specjalnie do drukowania AChE i kinaz, zidentyfikowano niewielki zestaw materiałów, które sprawdzały się w przypadku obu typów białek. Rzeczywiście, oba materiały, które zostały zidentyfikowane do produkcji mikromacierzy kinaz, były oparte na SS + PVA + glicerolu, a oba materiały zostały również zidentyfikowane wśród 26 materiałów wybranych do mikromacierzy AChE. Te "optymalne" materiały mogą stanowić ogólny punkt wyjścia do opracowania dalszych mikromacierzy na bazie żelu domieszkowanego białkami, a małe ekrany skupione wokół tych kompozycji mogą zidentyfikować jeszcze lepsze materiały do produkcji mikromacierzy. Drugą kwestią, na którą należy zwrócić uwagę, jest znaczenie zastosowanego enzymu. W przypadku AChE (dość wytrzymałego enzymu) 26 (lub około 40%) z pierwotnych 66 materiałów zidentyfikowanych jako kompatybilne z testem zachowało aktywność uwięzionego AChE. Jednak w przypadku delikatniejszych kinaz tylko 2 z 69 kompozycji kompatybilnych z testami, czyli około 3% materiałów, były w stanie zachować aktywność wszystkich kinaz. Chociaż nie zbadano wystarczającej liczby różnych enzymów, aby sformułować rozstrzygające stwierdzenia, wydaje się, że optymalizacja wytwarzania macierzy za pomocą stosunkowo niestabilnych enzymów może prowadzić do identyfikacji materiałów, które mogą uwięzić szeroki zakres białek, aby umożliwić wytwarzanie mutliplexed microray.

Niezależnie od wybranego białka, głównym czynnikiem odcięcia dla identyfikacji materiałów do druku była potrzeba długiego czasu żelowania materiału (>2,5 godziny). Podczas opracowywania materiałów zol-żel na bazie SS bardzo ważne jest, aby upewnić się, że po wymianie jonowej i filtracji zol ma pH około 4. Sole o niższym początkowym pH mogą skutkować materiałami o pH niższym niż neutralne, co może wpływać na aktywność enzymów. ¹⁹ Dostosowanie ilości Dowex (żywicy jonowymiennej) do SS może zmienić końcowe pH zolu. Gdy przygotowuje się nową partię żywicy, stosunek żywicy do SS należy dostosować tak, aby uzyskać zol o pH około 4, zgodnie z procedurą opisaną w sekcji 2 protokołu.

Podobnie, przygotowanie krystalicznego DGS jest często źródłem błędów związanych z uszkodzeniem materiału przy użyciu zoli na bazie DGS do uwięzienia biomolekuł. Chociaż nie zostało to tutaj szczegółowo przedstawione, należy zachować szczególną ostrożność podczas syntezy krystalicznego DGS, w szczególności potrzebę unikania obecności wody podczas syntezy, która może wytwarzać poligliceryniany krzemiany, a nie monomeryczne DGS. Ponadto, ze względu na higroskopijny charakter DGS, krystaliczna próbka musi być przechowywana w stanie wysuszonym i zużyta w ciągu 6 miesięcy po syntezie. Krystaliczne DGS starsze niż 6 miesięcy mogą nie rozpuścić się całkowicie (ze względu na częściowo skondensowany materiał poliglicerolowo-krzemianowy) nawet przy sonikacji w środowisku kwaśnym. Niepełne rozpuszczenie DGS powoduje powstanie zoli o nieznanej i niekontrolowanej zawartości krzemionki, a tym samym mniej wytrzymałych materiałów.

Ważną kwestią, na którą należy zwrócić uwagę w przypadku drukowania kontaktowego, jest jakość szpilek. Uszkodzone lub niewłaściwie obsługiwane piny (ilustracja 9) nigdy nie stworzą powtarzalnych tablic niezależnie od drukowanego materiału. Zaleca się sprawdzenie jakości szpilek za pomocą mikroskopu preparacyjnego, aby upewnić się, że nie są używane złamane lub zatkane szpilki. Ostrożne obchodzenie się z kołkami zapewnia długą żywotność kołków. Ważny jest również swobodny ruch szpilki. W przypadkach, gdy wilgoć zostanie uwięziona w głowicy drukującej między głowicą a kołkiem, kołek nie zostanie prawidłowo osadzony, a tym samym nie będzie miał prawidłowego kontaktu z powierzchnią, co spowoduje brak osadzania się materiału.

Podsumowując, przedstawiliśmy szczegółowe, wieloetapowe podejście do badań przesiewowych w celu opracowania mikromacierzy o dużej gęstości z domieszką białek. Przesiewanie obejmuje optymalizację właściwości materiału (czas żelowania i drukowność), aby umożliwić drukowanie materiałów, a następnie bardziej ukierunkowane badanie przesiewowe w celu zidentyfikowania materiałów, które są kompatybilne z danym testem i są w stanie zachować aktywność enzymów. To podejście do przesiewania materiałów z przewodnikiem można zastosować do dodatkowych formatów mikromacierzy w celu skrócenia czasu i obniżenia kosztów związanych z produkcją wydajnych mikromacierzy o dużej gęstości.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Odczynnik/Materiał
Poli(alkohol winylowy) (PVA)	Sigma-Alderich	360627	80% hydrolozyzowany, Mw 600
Glikol polietylenowy 600 (PEG)	Sigma-Alderich	87333&	nbsp;
Polietyleniminę (PEI)	Sigma-Alderich	482595	50% wag. roztwór w wodzie
Karboksyetylosilanetriol (Si-COOH)	Gelest, Inc.	SIC2263,0	25% w wodzie
N-(3-trietoksysililopropylo)glukonamid (GLS)	Gelest, Inc.	SIT8189,0	50% w etanolu
tlenek bis[(3-metylodimetoksysililo)propylo]polipropylenu (MDSPPO)	Gelest, Inc.	SIB1660.0
Metylotrimetoksysilan (MTMS)	Gelest, Inc.	SIM6560.1
Bis(trietoksysylili)etan (Bis-TEOS)	Gelest, Inc.	SIB1817.0
3-aminopropylotrietoksysilan (APTES)	Gelest, Inc.	SIA0610.0
Glicerol	Sigma-Alderich	49767
D-Sorbitol	Sigma-Alderich	240850
D-(+)-trehaloza dwuwodna	Sigma-Alderich	T9531
Triton X-100	Sigma-Alderich	X-100
Nε -Acetylo-L-lizyna	Sigma-Alderich	A4021
Tris(hydroksymetylo)aminometan	Sigma-Alderich	154563
HEPES	Sigma-Alderich	H3375
Wodorotlenek sodu, 1,0 N	LabChem Inc.	LC24350-2
Kwas solny, 1,0 N/0,1 N	LabChem Inc.	LC15300-2/LC152220-2
Chlorek magnezu	Sigma-Alderich	M8266
Diglicerolsilan (DGS)			Przygotowany w laboratorium
Roztwór krzemianu sodu	Fisher Scientific	SS338-1
Żywica jonowa Dowex 50WX8-100	Sigma-Alderich	217492
Jodek acetylotiocholiny	Sigma-Alderich	1480
Acetylocholinoesterazy z Electrophorus electricus (węgorz elektryczny)	Sigma-Alderich	C2888
BODIPY FL L-Cystyna	Invitrogen	B-20340
Pro-Q Zestaw barwników do mikromacierzy z fosfoproteiną diamentową/fosfopeptydem	Invitrogen	P33706
Roztwór soli disodowej adenozyno-5'trifosforanu (ATP)	Sigma-Alderich	A6559
Kinaza MAP 2 (MAPK2)	EMD Milipor	454850
p38α/SAPK2a (T106M), aktywny	EMD Millipore	14-687M
Naskórkowy czynnik wzrostu (EGFR)	EMD Millipore		Dawany przez Millipore
Kinaza syntazy glikogenu 3 i beta; (GSK-3β)	EMD Milipory	14-306
Podstawowe białko mielinowe (MBP)	EMD Milipore		Substrat dla MAPK2 i p38α, Przekazane przez Millipore
GSM	EMD Millipore	12-533	Substrat dla GSK-3β
Polipeptyd poli-glu-tyr p(E4Y)	EMD Milipor	12-440	Podłoże do EGFR
Stealth	pin ArrayIt	SMP3
Pin ukryty	ArrayIt	SMP7
Prowadnice z powłoką aminową	ArrayIt	SMM2
Prowadnice powlekane aldehydem	ArrayIt	SMA2
Szkiełka z powłoką Exposy	ArrayIt	SME2
Prowadnice powlekane poli(metakrylanem metylu) (PMMA) Exakt	Technologies Inc.	41500
0,2-μ m filtr strzykawkowy	PALL Nauki Przyrodnicze	4612
			Equipment
Virtek Drukarka kontaktowa	BioRad
Imager do slajdów fluorescencyjnych Novaray	Alpha Innotech Corporation
Wirówka do mikromatryc biurkowych	ArrayIt	MHC110V
MilliQ Synthesis A10	Millipore		Służy do filtrowania całej wody potrzebnej do eksperymentów