Artykuł metodologiczny

Podejście do badań przesiewowych materiałów z przewodnikiem w celu opracowania ilościowych mikromacierzy białkowych pochodzących zol-żel

15.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50689

⸱

26 sierpnia 2013

 , 
1Department of Chemistry and Chemical Biology, McMaster University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano podejście do badań przesiewowych materiałów w celu opracowania mikromacierzy domieszkowanych białkiem pochodzącym zol-żel przy użyciu nowej metody produkcji druku pinów. Metodologia ta została zademonstrowana poprzez opracowanie mikromacierzy acetylocholinoesterazy i multikinaz, które są wykorzystywane do opłacalnych badań przesiewowych małych cząsteczek.

Streszczenie

Mikromacierze znalazły zastosowanie w rozwoju wysokoprzepustowych testów dla nowych materiałów i odkrywaniu małocząsteczkowych leków prowadzących. W niniejszym artykule opisano podejście do badań przesiewowych materiałów z przewodnikiem w celu identyfikacji materiałów na bazie zol-żel, które są odpowiednie do produkcji trójwymiarowych mikromacierzy białkowych. Podejście to najpierw identyfikuje materiały, które można wydrukować jako mikromacierze, zawęża liczbę materiałów, identyfikując te, które są kompatybilne z danym testem enzymatycznym, a następnie koncentruje się na optymalnych materiałach w oparciu o zachowanie maksymalnej aktywności enzymatycznej. Podejście to stosuje się do opracowania mikromacierzy odpowiednich do dwóch różnych testów enzymatycznych, jednego przy użyciu acetylocholinoesterazy, a drugiego przy użyciu zestawu czterech kluczowych kinaz zaangażowanych w raka. W każdym przypadku udało się wyprodukować mikromacierze, które można było wykorzystać do ilościowych testów przesiewowych małych cząsteczek i produkcji zależnych od dawki krzywych odpowiedzi inhibitora. Co ważne, możliwość badania przesiewowego wielu materiałów dostarczyła informacji na temat rodzajów materiałów, które najlepiej nadają się zarówno do produkcji mikromacierzy, jak i do utrzymania aktywności enzymów. Dane materiałowe zapewniają wgląd w podstawowe wymagania materiałowe niezbędne do dostosowania optymalnych mikromacierzy pochodzących z zol-żelu o dużej gęstości.

Wprowadzenie

Mikromacierze zyskały popularność w środowisku naukowym jako metoda zwiększania przepustowości testów. Od czasu opracowania technologii mikromacierzy do oceny ekspresji genów1 w połowie lat dziewięćdziesiątych XX wieku, mikromacierze znalazły zastosowanie w opracowywaniu wysokoprzepustowych testów do identyfikacji interakcji białko-białko i białko-małe cząsteczki, a także do znajdowania nowych materiałów o unikalnych właściwościach. 2-5 Niedawno opracowano mikromacierze, w których określone materiały są używane do unieruchamiania funkcjonalnych białek, wytwarzając trójwymiarowy element mikromacierzy, w którym białka są uwięzione, co pozwala na łatwy pomiar aktywności enzymatycznej i inhibicji samej mikromacierzy przy użyciu odpowiedniego testu fluorescencyjnego, który jest sprzężony z wymianą substratu. 5-10 Co ważne, takie mikromacierze mogą być zaprojektowane tak, aby zawierały wszystkie niezbędne komponenty do przesiewania próbek i kontroli razem w wysoce równoległy sposób. 5,8

pkt.

Wczesne przykłady mikromacierzy białkowych były zazwyczaj przygotowywane przy użyciu standardowych metod immobilizacji białek na stałych podłożach, takich jak kowalencyjne przyłączanie,11 przechwytywanie powinowactwa3 i adsorpcja fizyczna. 12 Chociaż te metody bioimmobilizacji pozwalają na zwiększenie stężenia próbki i przyspieszoną kinetykę reakcji wymaganą do miniaturyzacji testu, każda z nich ma wady. Ogólnie rzecz biorąc, wszystkie powodują zmniejszenie natywnej funkcjonalności biomolekuły z powodu chemicznej modyfikacji powierzchni, utrudnionego dostępu do miejsc aktywnych lub niewłaściwej orientacji z powodu niespecyficznego unieruchomienia. W związku z tym wszystkie metody skutkują niższą czułością testu pomimo wzrostu osadzania się biomolekuł, odpowiedzi, która prawdopodobnie wynika z potrzeby sztucznego wiązania biomolekuł z powierzchnią.

Pojawiającym się podejściem do produkcji funkcjonalnych mikromacierzy biomolekuł jest drukowanie pinami domieszkowanych białkiem zoli krzemionkowych na stałych podłożach, które zazwyczaj są albo funkcjonalizowanymi szkiełkami podstawowymi, albo pojedynczymi dołkami płytek mikrodołkowych. Sam proces zol-żel odbywa się w środowisku wodnym w temperaturze pokojowej i to właśnie ciekły prekursor jest drukowany, a następnie żeluje w celu uwięzienia biomolekuł w matrycy 3D, co pozwala na wysokie obciążenie białkami13, a także uwięzienie wielu składników w tym samym elemencie mikromacierzy. 13,14 Dostosowanie materiału pochodzącego zol-żel można przeprowadzić poprzez staranny dobór różnych prekursorów krzemionki, jak również poprzez zmianę składnika wodnego poprzez zastosowanie różnych (pH, siła jonowa) i włączenie różnych dodatków (polimerów, małych cząsteczek) w celu uzyskania optymalnego materiału, którego specyficzny charakter zależy od uwięzionej biocząsteczki. 10

Potencjalnym ograniczeniem związanym z tworzeniem mikromacierzy białkowych pochodzących zol-żel za pomocą drukowania pinów jest potrzeba identyfikacji materiałów kompozytowych na bazie zol-żel, które mogą być drukowane bez żelowania w szpilce lub wykazywania niepożądanych właściwości (niepowtarzalne rozmiary plamek, pękanie, słaba adhezja, niekompatybilność ze składnikami testu, słaba aktywność białka) po wydrukowaniu na powierzchni. 5 Jednoczesna optymalizacja wszystkich tych parametrów wyklucza podejście, w którym materiały mogą być projektowane de novo lub badane powoli w sposób seryjny. Z drugiej strony, wyrywkowe przesiewanie wielu tysięcy lub dziesiątek tysięcy materiałów nie jest ani czasochłonne, ani opłacalne.

W tym artykule opisujemy podejście do ukierunkowanego badania, które pozwala na szybką identyfikację odpowiednich materiałów do produkcji mikromacierzy białkowych bez potrzeby losowego przesiewania dużej liczby materiałów. Stosując podejście kierowane, najpierw identyfikowane są materiały nadające się do drukowania mikromacierzy, a następnie przeprowadza się serię małych ekranów w celu zidentyfikowania optymalnych kombinacji materiałów pochodzących zol i żel, które można drukować w sposób powtarzalny, bez pęknięć i są kompatybilne z danym testem. Na koniec identyfikowane są optymalne materiały na podstawie zachowania aktywności enzymu i wydajności w końcowym teście przesiewowym małych cząsteczek. W ten sposób optymalne materiały można zidentyfikować spośród wielu tysięcy kandydatów przy użyciu zaledwie kilkuset kroków testu. Demonstrujemy to podejście do wytwarzania zarówno acetylocholinoesterazy o dużej gęstości, jak i mikromacierzy multikinazy oraz zastosowania takich mikromacierzy do badań przesiewowych małych cząsteczek.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów dodatków

  1. Przygotować 25 i 50 mM tris(hydroksymetylo)aminometanu (zasada Tris, Mr 121,14 g/mol) i HEPES (Mr 238,3 g/mol) o pH 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0 i 8,2 w probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml. Dostosuj pH za pomocą odpowiednio 1 N HCl i NaOH. Przechowywać w temperaturze pokojowej i wymienić po 3 miesiącach.
  2. Przygotować 24% (w/v) poli(alkohol winylowy) (PVA): odważyć 2,4 g PVA (Mw 9 000 - 10 000, 80% hydrolizy) i dodać do 10 ml wody dejonizowanej destylowanej (ddH2O), rozpuść granulki polimeru przez wirowanie. Użyj roztworu 24% (w/v), aby przygotować równe objętości 16% (w/v), 12% (w/v) i 8% (w/v) roztworów PVA. Roztwory odgazowujące przez sonikację przed użyciem. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.
  3. Przygotować 24% (m/v) iminę polietylenu (PEI): dodać 4,8 ml PEI (Mw 1,300, 50% (w/w) wH2O) do 5,2 ml ddH2O. Użyć 24% (w/v) roztworu do przygotowania równych objętości 16% (w/v), 12% (w/v) i 8% (w/v) roztworów PEI. Roztwory odgazowujące przez sonikację przed użyciem. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.
  4. Przygotować 60% (w/v) glikolu polietylenowego (PEG): odważyć 6 g PEG (Mw 600) i dodać do 10 ml ddH2O, rozpuścić granulki polimeru przez wirowanie. Użyj seryjnego rozcieńczenia, aby przygotować równą objętość 30% (w/v) roztworu PEG. Roztwory odgazowujące przez sonikację przed użyciem. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.
  5. Przygotować 24% (v/v) N-(3-trietoksysililopropylo)glukonamid (GLS): dodać 480 μl GLS (50% w etanolu - zapas GLS może wymagać użycia łaźni wodnej w celu ogrzania i rozpuszczenia roztworu, jeśli jest krystaliczny) do 520 μl 95% (v/v) etanolu i mieszać przez 20 minut metodą sonikacji. Użyj roztworu 24% (v/v), aby uzyskać równą objętość 16% (v/v) roztworu GLS. Przygotuj świeże roztwory do użytku dziennie.
  6. Przygotować 24% (v/v) metylotrimetoksysilan (MTMS): dodać 240 μl MTMS do 760 μl istniejącego zakwaszonego ddH2O (pH 2,0, 1 N HCl) i mieszać przez 20 minut przez sonifikację. Użyj roztworu 24% (v/v), aby uzyskać równą objętość 16% (v/v) roztworu MTMS. Przygotuj świeże roztwory do użytku dziennie.
  7. Przygotować 24% (v/v) tlenek bis[(3-metylodimetoksylosililo)propylo]polipropylenu (MDSPPO): dodać 240 μl MDSPPO do 760 μl istniejącego zakwaszonego ddH2O (pH 2,0, 1 N HCl) i mieszać przez 20 minut przez sonifikację. Użyj 24% (v/v) roztworu, aby uzyskać równą objętość 16% (v/v) roztworu MDSPPO. Przygotuj świeże roztwory do użytku dziennie.
  8. Przygotować 24% (v/v) 3-(aminopropylo)-trietoksysilan (APTES): dodać 240 μl APTES do 760 μl istniejącego zakwaszonego ddH2O (pH 2,0, 1 N HCl) i mieszać przez 20 minut przez sonifikację. Użyj 24% (v/v) roztworu, aby uzyskać równą objętość 16% (v/v) roztworu APTES. Przygotuj świeże roztwory do użytku dziennie.
  9. Przygotować 24% (v/v) bis(trietoksysililo)etan (bis-TEOS): dodać 240 μl bis-TEOS do 760 μl istniejącego zakwaszonego ddH2O (pH 2,0, 1 N HCl) i mieszać przez 20 minut przez sonifikację. Użyj roztworu 24% (v/v), aby uzyskać równą objętość 16% (v/v) roztworu bis-TEOS. Przygotuj świeże roztwory do użytku dziennie.
  10. Przygotować 24% (v/v) karboksyetylosilanetriol (Si-COOH): dodać 960 μl Si-COOH (25% w ddH2O) do 40 μl istniejącego zakwaszonego ddH2O (pH 2,0, 1 N HCl) i mieszać przez 20 minut przez sonifikację. Użyj 24% (v/v) roztworu, aby uzyskać równą objętość 16% (v/v) roztworu Si-COOH. Przygotuj świeże roztwory do użytku dziennie.
  11. Oddzielnie przygotuj 3 mM N ε-acetylo-L-lizyny, D-sorbitol, α-α-trehalozę (Mr 188,22 g/mol, 182,17 g/mol i 378,33 g/mol, odpowiednio) i 1,5 mM Triton X-100 (średnio Mw 625 g/mol) w ddH2O. Objętości mogą się różnić w zależności od tego, ile jest wymagane; przygotuj świeże roztwory do użycia dziennie.
  12. Przygotować 60% (w/w) glicerolu: dodać 2,4 g bezwodnego glicerolu do 1,6 g ddH2O, wymieszać wirowo. Odgazowanie roztworu przez sonikację przed użyciem. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.
  13. Przygotować 30% (w/w) glicerolu: dodać 1,6 g bezwodnego glicerolu do 2,4 g ddH2O, wymieszać wirowo. Odgazowanie roztworu przez sonikację przed użyciem. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.

2. Przygotowanie soli krzemionkowych

Zgodnie z poniższymi procedurami, odpowiednie sole, gdy są trzymane na lodzie, mogą być używane do 1 godziny po dodaniu wody. Sole używane dłużej niż 1 godzina powodują skrócenie/niespójny czas żelowania materiału.

  1. Przygotowanie zolu na bazie krzemianu sodu (SS)
    1. Odważyć 120 g żywicy jonowymiennej do plastikowej zlewki o pojemności 500 ml.
    2. Dodać 150 ml 0,1 N HCl i mieszać przez 1 godzinę za pomocą 2-calowego mieszadła magnetycznego.
    3. Przefiltrować roztwór za pomocą lejka Büchnera podłączonego do próżni.
    4. Powoli dodawać ddH2O, aby przepłukać przefiltrowaną żywicę, aż otrzymany filtrat będzie klarowny. Potrzeba około 100 ml ddH2O.
    5. Zbierz i przechowuj przygotowaną żywicę w plastikowym pojemniku w temperaturze pokojowej do 1 miesiąca.
    6. Odważyć 2,59 g krzemianu sodu (SS, 27% (m/m) SiO2, 10% (w/w) NaOH) do zlewki plastikowej o pojemności 50 ml.
    7. Dodać 10 ml ddH2O do SS. Delikatnie zamieszać ręcznie, aby wymieszać roztwór.
    8. Odważyć 5,60 g przygotowanej żywicy do osobnej zlewki plastikowej o pojemności 50 ml. Dodaj do roztworu krzemianu sodu i mieszaj przez 2 minuty za pomocą jednocalowego mieszadła magnetycznego.
    9. Przefiltrować roztwór mieszaniny za pomocą lejka Büchnera podłączonego do aspiratora podłączonego do kranu z wodą.
    10. Użyj plastikowej strzykawki o pojemności 10 ml wyposażonej w filtr membranowy 0,2 μm, aby przefiltrować roztwór zolu. Daje to zol z 5,6% (w/w) krzemionki, określany w dalszej części tekstu jako SS. Trzymaj sol na lodzie, gdy nie jest używany.
    11. 1/2SS: dodać 1 ml przygotowanego zolu SS do 1 ml ddH2O, wymieszać wirowo. Trzymaj sol na lodzie, gdy nie jest używany.
  2. Przygotowanie zol na bazie diglicerylosilanu (DGS)
    1. Zsyntetyzuj DGS zgodnie z opisem w innym miejscu. 15,16 Krystaliczny DGS należy przechowywać w eksykatorze w temperaturze pokojowej przez okres do 6 miesięcy.
    2. Odważyć około 1 g krystalicznego DGS.
    3. Użyj moździerza i tłuczka, aby zmielić DGS na drobny proszek. Wykonaj ten krok tak szybko, jak to możliwe, aby zapobiec wchłanianiu wilgoci z powietrza.
    4. Ostrożnie przenieść drobno zmielony DGS do pustej 20-mililitrowej fiolki scyntylacyjnej, zanotować masę (z dokładnością do tysięcznej części grama).
    5. Dodać ddH2O, aby uzyskać 0,5 g/ml DGS.
    6. Sonikować zhydrolizowany DGS na lodzie przez 20 minut, mieszać wirowo przez 5 sekund co 5 minut. W wilgotne dni całkowite rozpuszczenie DGS może wymagać dodania 10 μl 1 N HCl. Należy go dodać do roztworu przed sonikacją.
    7. Użyj plastikowej strzykawki o pojemności 3 ml wyposażonej w filtr membranowy 0,2 μm, aby przefiltrować roztwór zolu, usuwając drobne cząstki. Daje to zol z 5,0% (w/w) krzemionki, określany w dalszej części tekstu jako DGS. Trzymaj sol na lodzie, gdy nie jest używany.
    8. 1/2DGS: dodać 1 ml przygotowanego zolu DGS do 1 ml ddH2O, wymieszać wirowo. Trzymaj sol na lodzie, gdy nie jest używany.

3. Wstępna selekcja w celu identyfikacji materiałów do druku

Na rysunku 1 pokazany jest uogólniony schemat pokazujący różne etapy kierowanej analizy czynnikowej używanej do identyfikacji materiałów drukowalnych. Zalecana jest minimalna całkowita objętość materiału wynosząca 100 μl. Stosowanie mniejszych objętości utrudnia wizualizację żelowania materiału.

  1. Etap 1: bufor i silan
    1. Dodać 50 μl buforu (25 i 50 mM Tris lub HEPES o pH 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0, 8,2) do 2 ml szklanej fiolki scyntylacyjnej.
    2. Dodać 50 μl odpowiedniego zolu (DGS, 1/2DGS, SS, 1/2SS) i mieszać wiry w sposób włączany i wyłączany przez 10 sekund, włączając i wyłączając fiolkę z mieszalnika wirowego.
    3. Ustaw materiały tak, aby odpoczywały w temperaturze pokojowej, monitorując czas żelowania materiału. Czas żelowania definiuje się jako punkt, w którym materiał przestaje swobodnie płynąć po obróceniu fiolki pod kątem 45°.
    4. Z kolejnych etapów przesiewania materiału należy wykluczyć kombinacje materiałów o czasie żelowania krótszym niż 2,5 godziny.
  2. Etap 2: bufor, silan i polimer
    1. Do szklanej fiolki scyntylacyjnej o pojemności 2 ml dodać 3,13 μl 16% (m/v) lub 8% (w/v) roztworu PVA/PEI lub 6,3 μl 30% (m/v) lub 60% (w/v) roztworu PEG.
    2. Dodać 50 mM HEPES (pH 8,0), aby doprowadzić łączną objętość do 50 μl, wymieszać roztwór przez wirowanie.
    3. Dodać 50 μl odpowiedniego solu (DGS, 1/2DGS, SS, 1/2SS), wymieszać w sposób opisany w kroku 3.1.2.
    4. Z kolejnych etapów przesiewania materiału należy wykluczyć kombinacje materiałów, których czas żelowania (jak określono w kroku 3.1.3) krótszy niż 2,5 godziny.
  3. Etap 3: bufor, silan, polimer i organosilan
    1. Do 2-mililitrowej szklanej fiolki scyntylacyjnej dodać 3,13 μl 16% (m/v) lub 8% (w/v) roztworu PVA lub 6,3 μl 30% (m/v) lub 60% (w/v) roztworu PEG.
    2. Dodać 3,13 μl 16% (w/v) organozylanu (GLS, MTMS, MDSPPO, bis-TEOS, Si-COOH lub APTES).
    3. Dodać 50 mM HEPES (pH 8,0), aby doprowadzić łączną objętość do 50 μl, wymieszać roztwór przez wirowanie.
    4. Dodać 50 μl odpowiedniego solu (DGS, 1/2DGS, SS, 1/2SS) i wymieszać w sposób opisany w kroku 3.1.2. Z kolejnych etapów przesiewania materiału należy wykluczyć kombinacje materiałów, których czas żelowania (jak określono w kroku 3.1.3) krótszy niż 2,5 godziny.
  4. Etap 4: bufor, silan, polimer, organozylana i dodatek małocząsteczkowy
    1. Do szklanej fiolki scyntylacyjnej o pojemności 2 ml dodać 2,08 μl 24% (m/v) lub 12% (w/v) roztworu PVA lub 6,3 μl 30% (m/v) lub 60% (w/v) roztworu PEG.
    2. Dodać 2,08 μl 24% (w/v) organosilanu (GLS, Si-COOH).
    3. Dodać 2,08 μl 3 mM roztworu drobnocząsteczkowego (N ε-acetylo-L-lizyna, D-sorbitol, α-α-trehaloza) lub 1,5 mM (Triton X-100).
    4. Dodać 50 mM HEPES (pH 8,0), aby doprowadzić łączną objętość do 50 μl, wymieszać roztwór przez wirowanie.
    5. Dodać 50 μl odpowiedniego solu (DGS, 1/2DGS, SS, 1/2SS) i wymieszać w sposób opisany w kroku 3.1.2.
    6. Z kolejnych etapów drukowania materiału należy wykluczyć kombinacje materiałów o czasach żelowania (jak określono w kroku 3.1.3) krótszych niż 2,5 godziny.

4. Przygotowanie materiałów do druku domieszkowanego białkiem

Materiały zidentyfikowane na końcu kroku 3.4.6 są kontynuowane w badaniach nad drukownością, a odpowiedni enzym jest teraz włączony do zolu. We wszystkich przypadkach opisanych poniżej, roztwór wodny zawierający wszystkie składniki z wyjątkiem silanu przygotowuje się w mikrostudzience, a następnie dodaje się zol tuż przed drukowaniem. Aby dostosować się do użycia płytki o długości 384 mikromiareczkowania, zamiast 100 μl stosuje się całkowitą objętość roztworu wynoszącą 50 μl.

  1. Mikromacierz acetylocholinoesterazy (AChE)
    1. Przygotować roztwór AChE o stężeniu 2 kU/ml w 50 mM HEPES (pH 8,0) zgodnie z informacjami o aktywności enzymu specyficznymi dla partii (jednostki aktywności na mg) dostarczonymi przez producenta.
    2. Roztwór podstawowy enzymu o stężeniu 2 kU/ml rozdzielić na 5 μl frakcji za pomocą probówek mikrowirówek o objętości 500 μl i przechowywać w temperaturze -20 °C. Roztwory podstawowe AChE o stężeniu 2 kU/ml pozostają stabilne przez okres do 4 miesięcy przy przechowywaniu w temperaturze -20 °C.
    3. Przygotować materiały bazowe, łącząc połowę objętości odpowiednich polimerów, organozylanów i dodatków małocząsteczkowych zidentyfikowanych w kroku 3.4.6 na 384-dołkowej płytce do mikromiareczkowania.
    4. Dodać 5 μl 2 kU/ml AChE do 50 mM HEPES (pH 8,0).
    5. Używając 50 mM HEPES (pH 8,0), doprowadzić połączoną objętość studzienki do 25 μl, kilkakrotnie pipetując roztwór w górę i w dół.
  2. Mikromacierz wielokinazowa
    1. Przygotować 100 roztworów kinaz ng/μl (p38α, MAPK2, EGFR, GSK-3β) wddH2O zgodnie z informacjami o aktywności (U/ml lub U/mg) i ilości dostarczonymi przez producenta. Roztwory kinaz należy przechowywać w porcjach po 2 μl w temperaturze -80 °C.
    2. Przygotować substraty kinazy (MBP, p(E4Y), GSM) w stężeniu 5 mg/ml, 50 mg/ml lub 300 μM w ddH2O, postępując zgodnie z informacją o ilości podaną przez producenta. Przechowywać podłoża w porcjach 2,5 μl w temperaturze -80 °C.
    3. Przygotować materiały bazowe, łącząc połowę objętości odpowiednich polimerów, organozylanów i dodatków małocząsteczkowych zidentyfikowanych w kroku 3.4.6 na 384-dołkowej płytce do mikromiareczkowania.
    4. Do każdej studzienki zawierającej materiały podstawowe dodać 2,5 μl kinazy i 2 μl odpowiedniego substratu (p38α i MBP, MAPK2 i MBP, EGFR i p(E4Y), GSK-3β i GSM), jak przygotowano odpowiednio w krokach 4.2.1 i 4.2.2.
    5. Używając 50 mM HEPES (pH 7,4), doprowadzić połączoną objętość studzienki do 25 μl. Wymieszać pipetując.

5. Tworzenie mikromacierzy

Ta sekcja wyjaśnia szczegółową procedurę drukowania materiałów na pojedynczej powierzchni slajdu. Aby drukować na wielu zmodyfikowanych powierzchniach szkiełka (amina, żywica epoksydowa, aldehyd i PMMA), procedurę tę powtarza się 4 razy.

  1. Formuj mikrotablice za pomocą robota drukującego styki wyposażone w stolik XYZ. Użyj szczelinowych kołków osłonowych o średnicy 100 μM, aby zdeponować zole domieszkowane białkiem.
  2. Ustaw wilgotność w komorze drukującej na 80-90%. Wilgotność <80% może powodować parowanie próbki i niespójności w drukowaniu ze względu na małe objętości osadzania.
  3. Sonikować szpilki w ddH2O przez 15 minut przed drukowaniem i suszyć pod strumieniem azotu. Użyj środka do czyszczenia rur, aby usunąć resztki wilgoci z uchwytu szpilki i ostrożnie umieść szpilkę w głowicy drukującej. Brak usunięcia wilgoci resztkowej może utrudnić swobodne przesuwanie się sworznia wraz z uchwytem, powodując pominięcie miejsc.
  4. Kontroluj wzorce macierzy za pomocą programu Chip Writer Pro (CWP). Dla każdej studzienki na próbkę w 384-dołkowej płytce źródłowej, 200 plamek (maksymalna liczba plamek na wychwyt przy użyciu kołka osłony SMP3) jest drukowanych na szkiełku podstawowym o zmodyfikowanej powierzchni.
  5. Rozpocznij proces drukowania za pomocą oprogramowania. Ustaw ruch w kierunku XY na 10 mm/s, a prędkość zbliżania się próbki (kierunek Z) na 2 mm/s z czasem ładowania próbki wynoszącym 2,5 sekundy.
  6. Wstrzymaj przebieg przez CWP. Zanurzyć szpilkę w próbce i dodać pipetą 25 μl odpowiedniego zolu (DGS, 1/2DGS, SS, 1/2SS) do studzienki. Wymieszać roztwór, wykonując ruchy pipetowania góra-dół powtórzone 50 razy. W przypadku mieszania przez pipetowanie należy zminimalizować ilość powietrza wprowadzanego do roztworu. Pęcherzyki powietrza zapobiegają całkowitemu załadowaniu próbki do trzpienia.
  7. Rozpocznij proces drukowania za pomocą CWP i wydrukuj próbkę na jednej powierzchni szkiełka. Wstrzymaj proces drukowania przed załadowaniem próbki z kolejnej płytki źródłowej.
  8. Wyjmij kołek drukujący za pomocą magnesu i umieść czyścik do rur w głowicy drukującej, aby zapobiec gromadzeniu się wilgoci w głowicy drukującej.
  9. Opłucz pin drukujący za pomocą ddH2O i sonikuj w czystym ddH2O przez 30 sekund.
  10. Wysusz kołek drukarski pod strumieniem azotu i wyjmij środek do czyszczenia rur, umieszczając kołek z powrotem w głowicy drukującej.
  11. Rozpocznij drukowanie, wykonując kroki 5.6 - 5.10 dla wszystkich próbek pozostałych na płycie źródłowej. Na jednym szkiełku można umieścić do 12 000 plamek o średnicy 100 μm.
  12. Metodę tę można również zastosować do drukowania materiałów na dnie studzienek w 96-dołkowej mikropłytce. Po pliku kalibracyjnym CWP ponownie skalibruj kołek drukujący, aby upewnić się, że odległość przebyta między osadzaniem punktowym jest wyższa niż wysokość płytki mikrodołkowej. Dzięki temu pin może drukować konsekwentnie od studni do studni w sposób liniowy bez uszkadzania pinu.
  13. Po zakończeniu całego eksperymentu drukowania należy postarzać matrycę przez co najmniej 30 minut i do 24 godzin w komorze drukującej w temperaturze 80-90%.

6. Test aktywności acetylocholinoesterazy

  1. Przygotowanie próbek kontroli pozytywnej (PC)
    1. Przygotować 1 mM jodku acetylotiocholiny (ATCh: Mr 289,18 g/mol) w 4% glicerolu, 25 mM Tris (pH 7,0) w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. ATCh musi być przygotowany na świeżo przed każdym użyciem i przy użyciu buforu o pH 7,0, ponieważ o wyższym pH powodują szybką autohydrolizę, powodując wyniki fałszywie dodatnie. Ostateczna objętość może być zmieniana w zależności od liczby próbek (25 μl na próbkę).
    2. Dodać 0,14 μl 5 mM bodipy-Fl-L-cystyny do 25 μl 1 mM ATCh w studzience płytki o 384 mikromiareczkowaniu.
    3. Dodać 24,86 μl 4% glicerolu, 25 mM Tris (pH 7,0); wymieszać ostrożnie, pipetując, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków w roztworze. Potencjalne inhibitory enzymów można włączyć do roztworu PC przed doprowadzeniem objętości do 50 μl za pomocą buforu.
  2. Przygotowanie próbek kontroli ujemnej (NC)
    1. Dodać 0,14 μl 5 mM bodipy-Fl-L-cystyny do 49,86 μl 4% glicerolu, 25 mM Tris (pH 6,5) do dołka płytki o 384 mikromiareczkach. Wymieszać pipetując.
  3. Rozwiązania do nadruku na PC i NC
    1. Wydrukuj przestarzałe mikromacierze zgodnie z krokami 5.1 - 5.10 (ignorując krok 5.6) protokołu. Użyj kołków z rowkiem o średnicy 235 μM, aby nanieść roztwory do nadruku na PC i NC. Dzięki temu roztwór całkowicie pokrywa wcześniej zdeponowane miejsce.
    2. Starzenie matryc przy wilgotności 80-90% przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Ze względu na autohydrolizę ATCh dłuższy czas inkubacji może skutkować fałszywie dodatnimi wynikami lub zwiększoną aktywnością enzymów.

7. Test aktywności kinazy

  1. Przygotować 500 μM roztworu adenozyno-5'-trifosforanu (ATP) przy użyciu podstawowego ATP (100 mM) przechowywanego w temperaturze -20 °C. Przygotuj świeży roztwór do każdego eksperymentu i dostosuj objętość do potrzeb eksperymentalnych: każdy roztwór do drukowania wymaga 5 μl.
  2. Przygotować 100 mM roztwór podstawowy chlorku magnezu (MgCl2: Mr 95,21 g/mol) w ddH2O.
  3. Kontrola pozytywna (PC)
    1. Dodać 2,5 μl 100 mM MgCl2 i 5 μl 500 μM ATP do dołka płytki o wielkości 384 mikromiareczkowania.
    2. Doprowadzić całkowitą objętość studzienki do 50 μl za pomocą 50 mM HEPES (pH 7,4); wymieszać pipetując. Potencjalne inhibitory enzymów można włączyć do roztworu PC przed doprowadzeniem objętości do 50 μl za pomocą buforu.
  4. Kontrola ujemna (NC)
    1. Dodać 2,5 μl 100 mM MgCl2 i 5 μl ddH2O do dołka płytki o wielkości 384 mikromiareczkowania.
    2. Doprowadzić całkowitą objętość studzienki do 50 μl za pomocą 50 mM HEPES (pH 7,4) i wymieszać pipetując.
  5. Nadruk kofaktorów testowych PC i NC
    1. Postępuj zgodnie z krokiem 6.3.1 protokołu.
    2. Starzeje się przy wilgotności 80-90% przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  6. Barwienie szkiełek
    1. Umieść wydrukowane szkiełka z mikromatrycą pojedynczo na szalce Petriego z wystarczającą ilością barwnika (z zestawu), aby pokryć całe szkiełko. Wstrząsać umiarkowanie (~200 obr./min) przez 45 minut za pomocą wytrząsarki płytkowej.
    2. Wyjmij szkiełko za pomocą kleszczy i umieść na czystej szalce Petriego z buforem do mycia (z zestawu). Wstrząsać umiarkowanie (~200 obr./min) przez 45 minut za pomocą wytrząsarki płytkowej.
    3. Wyjmij szkiełko za pomocą kleszczy i odwiruj do sucha za pomocą konwencjonalnej wirówki do mikromacierzy biurkowej wyposażonej w uchwyt na szkiełko.

8. Obrazowanie i analiza mikromacierzy

  1. Obrazowania

    Proszę zauważyć, że metoda obrazowania będzie specyficzna dla dostępnego typu czytnika matryc. Do badań wykorzystano kamerę Alpha Innotech NovaRay ze źródłem światła białego i systemem detekcji CCD wyposażoną w filtr wzbudzenia 478±17 nm i emisji 538±21 nm dla mikromacierzy AChE oraz filtr wzbudzenia 530±40 nm i filtr emisyjny 614±62 nm dla mikromacierzy kinaz. Konfokalne systemy skanowania laserowego mogą być również używane do odczytu matryc, chociaż ustawienia będą specyficzne dla instrumentu.
    1. Umieść szkiełko w uchwycie szkiełka miejscami skierowanymi do góry.
    2. Ustaw liczbę sekcji podglądu (zalecane są co najmniej 2, po jednej na każdym końcu szkiełka mikroskopu), rozdzielczość (zalecane jest minimum 4 μm) i ekspozycję (zalecana jest automatyczna) w oprogramowaniu do obrazowania.
    3. Uzyskaj obraz slajdu i zapisz jako plik ".tiff".
  2. analiza
    1. Otwórz uzyskany obraz slajdu w ImageJ64.
    2. Kliknij narzędzie do zaznaczania owalu i zmierz intensywność sygnału każdego punktu za pomocą opcji pomiaru na karcie analizy. Wybierając obszar do pomiaru, wybierz obszar nieco większy niż obserwowana plamka i o stałej wielkości wśród plam, aby zmniejszyć subiektywność ImageJ.
    3. Uśrednić intensywność z 25 podobnych plamek PC, podzieloną przez średnią intensywność 25 podobnych plamek NC, aby uzyskać proporcje PC/NC dla poszczególnych kompozycji materiałowych.

Wyniki

Dzięki przeprowadzeniu ukierunkowanej analizy czynników podczas przesiewu materiałów udało nam się zminimalizować liczbę testowanych materiałów z ~20 000 do kilkuset, które charakteryzowały się czasami żelowania odpowiednimi do drukowania. Poprzez zastosowanie rygorystycznego wytycznego wymagającej czasu żelowania materiału wynoszącego 2,5 hr lub więcej, materiały mogące zapchać piny drukujące lub spowodować powstanie nieodtwarzalnych matryc nie były drukowane. Materiały nadające się do druku, które zidentyfikowano jako posiadające wystarczające (>2,5 hr) czasy żelowania, zostały naniesione na 4 różne funkcjonalizowane powierzchnie szkiełek przedmiotowych. Aby materiał został uznany za „nadający się do druku”, należało wydrukować maksymalną liczbę plamek na objętość pobrania pinu (SMP3 = 200). Oceniano również morfologię plamek za pomocą prostej mikroskopii w jasnym polu, jak pokazano na Rysunku 2, aby upewnić się, że nie wystąpiły pęknięcia ani niepożądana separacja faz.

Na tym etapie zidentyfikowanych materiałów nadających się do druku przygotowano macierze z AChE i kinazami wbudowanymi w buforowy składnik wodny. Materiały kompatybilne z procedurą analizy (w tym z potencjalnym nadrukiem oraz etapami przemywania lub barwienia) zidentyfikowano poprzez obserwację trwałości plamek macierzy (brak pęknięć, ubytków plamek lub nietypowych wzorów fluorescencji) oraz stosunku kontroli pozytywnej (PC) do kontroli negatywnej (NC) większego niż 1, ocenianego na podstawie obrazów. Ponieważ kryteria te spełniło około 50% materiałów, do zdefiniowania materiałów optymalnych z zachowaną aktywnością białek zastosowano wyższy stosunek PC/NC wynoszący 3. Metodą tą wyłoniono 26 materiałów pochodzenia sol-gel zawierających AChE oraz 2 materiały zawierające kinazy, które spełniły kryterium PC/NC >3. Rysunek 3 oraz Rysunek 4 przedstawiają graficzny schemat 5 etapów ukierunkowanego przesiewu materiałów w celu identyfikacji optymalnych macierzy AChE odpowiednio dla AChE i kinaz.

Testy można było również zwalidować poprzez wyznaczenie współczynnika Z'.17 Zostało to wykonane przy użyciu materiału, który dał najwyższy stosunek PC/NC. Rycina 5 przedstawia wykres Z' otrzymany poprzez porównanie sygnału generowanego z 200 punktów, 100 PC i 100 NC, po naniesieniu barwnika wskaźnikowego i substratu na matrycę AChE. Matryce AChE i kinazy dały odpowiednio współczynniki Z' na poziomie 0,60 i 0,67, co świadczy o doskonałej jakości testu. Należy jednak zauważyć, że przed walidacją testu konieczna była optymalizacja stężeń enzymu, barwnika, substratu i kofaktora na matrycy poprzez naniesienie zakresu stężeń każdego z komponentów i wybranie stężenia dającego najwyższy sygnał, co zostało szczegółowo opisane w innym opracowaniu.5

Aby zwalidować testy, uzyskano ilościowe dane dotyczące inhibicji przy użyciu znanych i nieznanych inhibitorów AChE; pomiary wykonano w dubletach, które posłużyły do sporządzenia podwójnych wykresów (Rycina 6A) oraz krzywych inhibicji (Ryciny 6B i 6C). Na plamki naniesiono najpierw mieszaniny znanych, biologicznie czynnych inhibitorów małocząsteczkowych, a następnie barwnik i substrat, uwzględniając mieszaniny kontrolne zawierające znane inhibitory lub brak inhibitora. Wygenerowano podwójne wykresy w celu oceny aktywności enzymu; wszystkie mieszaniny, w których aktywność enzymu spadła poniżej 25%, uznano za pozytywne pod kątem inhibicji. Następnie poszczególne związki z takich mieszanin przetestowano w dubletach, aby zidentyfikować konkretne małe cząsteczki odpowiedzialne za inhibicję. Po ich zidentyfikowaniu małe cząsteczki te wykorzystano do wygenerowania ilościowych krzywych inhibicji w celu wyznaczenia wartości IC50 oraz stałych inhibicji.

Podobne wyniki jakościowe uzyskano, stosując macierz multikinazową z powszechnie znanym inhibitorem kinaz, staurosporyną. Rycina 7A oraz 7B przedstawiają obraz mikromacierzy i wskazują, że intensywności sygnału po naniesieniu próbek i barwieniu macierzy multikinazowej są zgodne z oczekiwaniami dla kontroli negatywnej (- ATP), kontroli pozytywnej (+ ATP) oraz znanego inhibitora (+ ATP + inh). Aby zademonstrować możliwość uzyskania ilościowych danych o inhibicji z mikromacierzy, przeprowadzono test inhibicji zależnej od stężenia dla pojedynczej kinazy. Jak pokazano na Ryciniach 8A i 8B, intensywność sygnału maleje wraz ze wzrostem stężenia inhibitora, a odpowiedź podąża za oczekiwaną krzywą inhibicji zależnej od stężenia dla układu kinaza/substrat p38α/MBP.

Schemat reakcji prekursor-krzemionka z wariantami polimeru, organosilanu i dodatków do syntezy.
Rycina 1. Ogólny schemat ukierunkowanego podejścia do przesiewania materiałów. Każdy blok reprezentuje krok przesiewania w kolejności sekwencyjnej. Liczby po lewej stronie oznaczają całkowitą liczbę materiałów przygotowanych do analizy. Przy założeniu czasu żelowania przekraczającego 2,5 hr (materiały z czasem żelowania krótszym niż 2,5 hr są przekreślone), liczba materiałów, które przeszły każdy etap i zostały przekazane do dalszego przesiewania, jest wskazana liczbą po prawej stronie. *Oznacza materiały z nieoptymalnym rozdzieleniem faz.

Wyniki nanoszenia plamek na mikromacierzy; wariacje chemiczne; efekty epoksydowe, aminowe i aldehydowe; mikroskopia.
Rycina 2. Obrazy optyczne przedstawiające różne tryby uszkodzeń materiałów na etapie sprawdzania drukowalności sita. Dla porównania przedstawiono również obraz materiału „dobrego” (drugi wiersz, trzecia kolumna). Przedrukowano za zgodą źródła 8, copyright 2013 American Chemical Society.

Schemat optymalizacji materiałów dla aktywności enzymatycznej: czas żelowania, drukowalność, etapy integralności plamek.
Rycina 3. Podejście do ukierunkowanego przesiewania materiałów w celu identyfikacji optymalnych materiałów do wytwarzania mikrotablic AChE pochodnych z sol-gelu. Przedrukowano za zgodą z odniesienia 5, copyright 2013 American Chemical Society.

Schemat wyboru materiałów z danymi dotyczącymi żelowania, drukowalności, barwienia i aktywności kinazy.
Rysunek 4. Ukierunkowane podejście do przesiewania materiałów w celu identyfikacji optymalnych materiałów do wytwarzania mikromacierzy kinaz pochodnych sol-gel. Przedrukowano za zgodą z referencji 8, copyright 2013 American Chemical Society.

Analiza danych z mikromacierzy; wysoka/niska fluorescencja kontrolna; schemat z siatką i wykresem RFU do analizy.
Rysunek 5. (A) Fragment mikromacierzy AChE przedstawiający plamki HC (jasnozielone) i LC (bladozielone) (zastosowano paletę czarno-zieloną jako pseudokolor w celu przejrzystości prezentacji); (B) powiększony widok obszaru w ramce w celu uwidocznienia morfologii i wyrównania plamek; oraz (C) wykres Z'. Linie ciągłe oznaczają średnią z powtórzeń, natomiast linie przerywane odpowiadają 3SD. Przedruk za zgodą z referencji 5, copyright 2013 American Chemical Society.

Analiza korelacji aktywności z wartościami IC₅₀; diagram, wykres punktowy, wyniki testu fluorescencyjnego.
Rycina 6. (A) Wykres duplikatów dla przesiewania na macierzy syntetycznych analogów alkaloidów Amaryllidaceae; (B) wykresy IC50 zidentyfikowanych potencjalnych inhibitorów oznaczonych jako związek 1 oraz (C) związek 2, z słupkami błędów reprezentującymi jedno odchylenie standardowe średniej z 25 powtórzeń. Reprezentatywne plamki pokazano w celu zilustrowania różnic w sygnale proporcjonalnych do stężeń inhibitora. Przedruk za zgodą z odniesienia 5, copyright 2013 American Chemical Society. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinię.

Schemat testu aktywności kinazy białkowej, wyniki intensywności fluorescencji z ATP i inhibicją staurosporyną.
Rycina 7. Test na macierzy czterech kinaz z wykorzystaniem 1.4SS/1.0PVA do unieruchomienia, nadrukowany na slajdzie pochodnej aminy. (A) Obraz fragmentu macierzy, w której plamki z kinazami współunieruchomionymi z ich odpowiednimi substratami zostały nadrukowane buforem (NC, górny rząd), roztworami zawierającymi ATP (PC, środkowy rząd) lub ATP + staurosporynę (dolny rząd). (B) Wykresy słupkowe porównujące intensywności sygnałów między reakcjami inhibowanymi a nieinhibowanymi, po odjęciu sygnałów tła; słupki błędów reprezentują jedno odchylenie standardowe średniej z 25 powtórzeń. Przedrukowano za zgodą z referencji 8, copyright 2013 American Chemical Society.

Analiza staurosporyny: wzór fluorescencji mikromacierzy i krzywa zależność dawka-odpowiedź wykazująca IC50=1μM.
Rycina 8. Analiza inhibicji na mikromacierzy p38a/MBP. (A) Fragmenty mikromacierzy pokazujące reprezentatywne plamki naniesione z różnymi stężeniami staurosporyny, zgodnie z oznaczeniami (obrazy uzyskano podczas pojedynczego skanowania tej samej płytki; dla przejrzystości przedstawiono obraz kompozytowy). (B) Krzywa IC50 wygenerowana na podstawie analizy obrazów macierzy. Intensywność uzyskaną przy 100 mM odjęto od wszystkich obrazów; pozostałe intensywności znormalizowano, przyjmując intensywność uzyskaną przy 10 nM za wartość 100% aktywności. Przedrukowano za zgodą z odniesienia 8, copyright 2013 American Chemical Society.

Porównanie końcówek mikropipety pod mikroskopem; analiza mikroskopowa w badaniu precyzji.
Rycina 9. Obrazy mikroskopowej igły stealth używanej do drukowania kontaktowego, wykazujące różne niedoskonałości: (A) zapchana, (B) wygięta.

Dyskusja

Opisana tutaj metodologia została wybrana jako najbardziej odpowiednia do identyfikacji materiałów pochodzących z zol-żelu nadających się do druku za pomocą drukarki kontaktowej, co pozwoliło na szybką i kosztową identyfikację optymalnych materiałów bez konieczności przesiewania dużej liczby materiałów. Z łącznej liczby ~20 000 potencjalnych materiałów udało się zidentyfikować ~200 materiałów, które nadawały się do druku na podstawie samego czasu żelowania. To znacznie ograniczyło ilość materiałów potrzebnych do przygotowania do kolejnych prób drukarskich. Te materiały do druku zostały następnie wydrukowane na 4 powierzchniach szkiełek, co daje łącznie 768 kombinacji materiał-szkiełko. Średnio można wydrukować 50 plamek/powtórzeń jednego materiału w ciągu ~3 minut, wliczając w to ładowanie próbki, osadzanie punktowe i czyszczenie pinów. Spośród nich 155 materiałów, czyli około 20%, pozwoliło na wydrukowanie maksymalnej liczby plamek na pobranie roztworu i uzyskało powtarzalne rozmiary plamek. Należy zauważyć, że spośród 4 badanych powierzchni szkiełka materiały drukowane są lepiej w kolejności: amina > żywica epoksydowa > aldehyd > PMMA; Szkiełka PMMA nie wytwarzały użytecznych matryc dla żadnych materiałów. Zostało to prawdopodobnie przypisane polarności powłoki powierzchniowej. Porównując wyżej wymienione powierzchnie szkiełkowe, bardziej polarne aminy i żywice epoksydowe lepiej nadawały się do zol wodnych w porównaniu ze szkiełkami z PMMA. Ponadto, spośród badanych powierzchni, szkiełka pokryte aminami zapewniają potencjalną dodatnio naładowaną powierzchnię do wiązania osadzonego zolu anionowego. Podejrzewamy, że nanocząstki krzemionki na granicy faz między szkiełkiem a zolem oddziałują wzdłuż powierzchni. Zarówno powierzchnie szkiełka epoksydowego, jak i aldehydowego nie mają tej samej początkowej interakcji opartej na ładunku. Aby zapewnić optymalne osadzanie punktowe, zdecydowanie zaleca się stosowanie wstępnie powlekanych szkiełek od dostawcy takiego jak Arrayit. Powlekanie we własnym zakresie powoduje powstawanie niespójnych powierzchni, co prowadzi do słabej odtwarzalności plamki13 , a w niektórych przypadkach może prowadzić do problemów z kwantyfikacją. 18 Równie ważne jest to, że temperatura i wilgotność mają wpływ na "drukowność" materiałów. Chociaż nie przeprowadzono szczegółowych badań nad wpływem temperatury, drukowanie zawsze odbywało się w temperaturze pokojowej (23±3 °C). Wilgotność (ponad 80%) była również kontrolowana w komorze druku, aby zapobiec osadzaniu się nieregularnych kształtów z powodu małych objętości osadzania (0,7-2,3 nl) i parowania.

Podczas gdy badanie przesiewowe materiału było ukierunkowane na identyfikację optymalnych materiałów pochodzących z zol-żel, przeznaczonych specjalnie do drukowania AChE i kinaz, zidentyfikowano niewielki zestaw materiałów, które sprawdzały się w przypadku obu typów białek. Rzeczywiście, oba materiały, które zostały zidentyfikowane do produkcji mikromacierzy kinaz, były oparte na SS + PVA + glicerolu, a oba materiały zostały również zidentyfikowane wśród 26 materiałów wybranych do mikromacierzy AChE. Te "optymalne" materiały mogą stanowić ogólny punkt wyjścia do opracowania dalszych mikromacierzy na bazie żelu domieszkowanego białkami, a małe ekrany skupione wokół tych kompozycji mogą zidentyfikować jeszcze lepsze materiały do produkcji mikromacierzy. Drugą kwestią, na którą należy zwrócić uwagę, jest znaczenie zastosowanego enzymu. W przypadku AChE (dość wytrzymałego enzymu) 26 (lub około 40%) z pierwotnych 66 materiałów zidentyfikowanych jako kompatybilne z testem zachowało aktywność uwięzionego AChE. Jednak w przypadku delikatniejszych kinaz tylko 2 z 69 kompozycji kompatybilnych z testami, czyli około 3% materiałów, były w stanie zachować aktywność wszystkich kinaz. Chociaż nie zbadano wystarczającej liczby różnych enzymów, aby sformułować rozstrzygające stwierdzenia, wydaje się, że optymalizacja wytwarzania macierzy za pomocą stosunkowo niestabilnych enzymów może prowadzić do identyfikacji materiałów, które mogą uwięzić szeroki zakres białek, aby umożliwić wytwarzanie mutliplexed microray.

Niezależnie od wybranego białka, głównym czynnikiem odcięcia dla identyfikacji materiałów do druku była potrzeba długiego czasu żelowania materiału (>2,5 godziny). Podczas opracowywania materiałów zol-żel na bazie SS bardzo ważne jest, aby upewnić się, że po wymianie jonowej i filtracji zol ma pH około 4. Sole o niższym początkowym pH mogą skutkować materiałami o pH niższym niż neutralne, co może wpływać na aktywność enzymów. 19 Dostosowanie ilości Dowex (żywicy jonowymiennej) do SS może zmienić końcowe pH zolu. Gdy przygotowuje się nową partię żywicy, stosunek żywicy do SS należy dostosować tak, aby uzyskać zol o pH około 4, zgodnie z procedurą opisaną w sekcji 2 protokołu.

Podobnie, przygotowanie krystalicznego DGS jest często źródłem błędów związanych z uszkodzeniem materiału przy użyciu zoli na bazie DGS do uwięzienia biomolekuł. Chociaż nie zostało to tutaj szczegółowo przedstawione, należy zachować szczególną ostrożność podczas syntezy krystalicznego DGS, w szczególności potrzebę unikania obecności wody podczas syntezy, która może wytwarzać poligliceryniany krzemiany, a nie monomeryczne DGS. Ponadto, ze względu na higroskopijny charakter DGS, krystaliczna próbka musi być przechowywana w stanie wysuszonym i zużyta w ciągu 6 miesięcy po syntezie. Krystaliczne DGS starsze niż 6 miesięcy mogą nie rozpuścić się całkowicie (ze względu na częściowo skondensowany materiał poliglicerolowo-krzemianowy) nawet przy sonikacji w środowisku kwaśnym. Niepełne rozpuszczenie DGS powoduje powstanie zoli o nieznanej i niekontrolowanej zawartości krzemionki, a tym samym mniej wytrzymałych materiałów.

Ważną kwestią, na którą należy zwrócić uwagę w przypadku drukowania kontaktowego, jest jakość szpilek. Uszkodzone lub niewłaściwie obsługiwane piny (ilustracja 9) nigdy nie stworzą powtarzalnych tablic niezależnie od drukowanego materiału. Zaleca się sprawdzenie jakości szpilek za pomocą mikroskopu preparacyjnego, aby upewnić się, że nie są używane złamane lub zatkane szpilki. Ostrożne obchodzenie się z kołkami zapewnia długą żywotność kołków. Ważny jest również swobodny ruch szpilki. W przypadkach, gdy wilgoć zostanie uwięziona w głowicy drukującej między głowicą a kołkiem, kołek nie zostanie prawidłowo osadzony, a tym samym nie będzie miał prawidłowego kontaktu z powierzchnią, co spowoduje brak osadzania się materiału.

Podsumowując, przedstawiliśmy szczegółowe, wieloetapowe podejście do badań przesiewowych w celu opracowania mikromacierzy o dużej gęstości z domieszką białek. Przesiewanie obejmuje optymalizację właściwości materiału (czas żelowania i drukowność), aby umożliwić drukowanie materiałów, a następnie bardziej ukierunkowane badanie przesiewowe w celu zidentyfikowania materiałów, które są kompatybilne z danym testem i są w stanie zachować aktywność enzymów. To podejście do przesiewania materiałów z przewodnikiem można zastosować do dodatkowych formatów mikromacierzy w celu skrócenia czasu i obniżenia kosztów związanych z produkcją wydajnych mikromacierzy o dużej gęstości.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Marii Monton, Julie Lebert, Jessamyn Little, Xin Ge i Laurze Lautens za pomoc w rozwoju mikromacierzy białkowych. Autorzy dziękują również Kanadyjskiej Radzie ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych (NSERC) za sfinansowanie tych prac. Autorzy dziękują również Canada Foundation for Innovation i Ontario Innovation Trust za wsparcie tych prac. J.D.B jest kierownikiem Kanadyjskiej Katedry Badawczej w dziedzinie chemii bioanalitycznej i biointerfejsów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
 Odczynnik/Materiał
Poli(alkohol winylowy) (PVA)Sigma-Alderich36062780% hydrolozyzowany, Mw 600
Glikol polietylenowy 600 (PEG)Sigma-Alderich87333&nbsp;
Polietyleniminę (PEI)Sigma-Alderich48259550% wag. roztwór w wodzie
Karboksyetylosilanetriol (Si-COOH)Gelest, Inc.SIC2263,025% w wodzie
N-(3-trietoksysililopropylo)glukonamid (GLS)Gelest, Inc.SIT8189,050% w etanolu
tlenek bis[(3-metylodimetoksysililo)propylo]polipropylenu (MDSPPO)Gelest, Inc.SIB1660.0 
Metylotrimetoksysilan (MTMS)Gelest, Inc.SIM6560.1 
Bis(trietoksysylili)etan (Bis-TEOS)Gelest, Inc.SIB1817.0 
3-aminopropylotrietoksysilan (APTES)Gelest, Inc.SIA0610.0 
GlicerolSigma-Alderich49767 
D-SorbitolSigma-Alderich240850 
D-(+)-trehaloza dwuwodnaSigma-AlderichT9531 
Triton X-100Sigma-AlderichX-100 
Nε -Acetylo-L-lizynaSigma-AlderichA4021 
Tris(hydroksymetylo)aminometanSigma-Alderich154563 
HEPESSigma-AlderichH3375 
Wodorotlenek sodu, 1,0 NLabChem Inc.LC24350-2 
Kwas solny, 1,0 N/0,1 NLabChem Inc.LC15300-2/LC152220-2 
Chlorek magnezuSigma-AlderichM8266 
Diglicerolsilan (DGS)Przygotowany w laboratorium
Roztwór krzemianu soduFisher ScientificSS338-1 
Żywica jonowa Dowex 50WX8-100Sigma-Alderich217492 
Jodek acetylotiocholinySigma-Alderich1480 
Acetylocholinoesterazy z Electrophorus electricus (węgorz elektryczny)Sigma-AlderichC2888 
BODIPY FL L-CystynaInvitrogenB-20340 
Pro-Q Zestaw barwników do mikromacierzy z fosfoproteiną diamentową/fosfopeptydemInvitrogenP33706 
Roztwór soli disodowej adenozyno-5'trifosforanu (ATP)Sigma-AlderichA6559 
Kinaza MAP 2 (MAPK2)EMD Milipor454850 
p38α/SAPK2a (T106M), aktywnyEMD Millipore14-687M 
Naskórkowy czynnik wzrostu (EGFR)EMD MilliporeDawany przez Millipore
Kinaza syntazy glikogenu 3 i beta; (GSK-3β)EMD Milipory14-306 
Podstawowe białko mielinowe (MBP)EMD MiliporeSubstrat dla MAPK2 i p38α, Przekazane przez Millipore
GSMEMD Millipore12-533Substrat dla GSK-3β
Polipeptyd poli-glu-tyr p(E4Y)EMD Milipor12-440Podłoże do EGFR
Stealthpin ArrayItSMP3 
Pin ukrytyArrayItSMP7 
Prowadnice z powłoką aminowąArrayItSMM2 
Prowadnice powlekane aldehydemArrayItSMA2 
Szkiełka z powłoką ExposyArrayItSME2 
Prowadnice powlekane poli(metakrylanem metylu) (PMMA) ExaktTechnologies Inc.41500 
0,2-μ m filtr strzykawkowyPALL Nauki Przyrodnicze4612 
 Equipment
Virtek Drukarka kontaktowaBioRad 
Imager do slajdów fluorescencyjnych NovarayAlpha Innotech Corporation 
Wirówka do mikromatryc biurkowychArrayItMHC110V 
MilliQ Synthesis A10MilliporeSłuży do filtrowania całej wody potrzebnej do eksperymentów

Bibliografia

  1. Schena, M. M., Shalon, D. D., Davis, R. W. R., Brown, P. O. P. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science (New York, N.Y.). 270 (5235), 467-470 (1995).
  2. MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science (New York, N.Y.). 289 (5485), 1760-1763 (2000).
  3. Zhu, H. H., Bilgin, M. M., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science (New York, N.Y.). 293 (5537), 2101-2105 (2001).
  4. Hook, A. L., Chang, C. -Y., et al. Combinatorial discovery of polymers resistant to bacterial attachment. Nature Biotechnology. , (2012).
  5. Monton, M. R. N., Lebert, J. M., Little, J. R. L., Nair, J. J., McNulty, J., Brennan, J. D. A Sol-Gel-Derived Acetylcholinesterase Microarray for Nanovolume Small-Molecule Screening. Analytical Chemistry. 82 (22), 9365-9373 (2010).
  6. Cho, E. J., Tao, Z., Tehan, E. C., Bright, F. V. Multianalyte pin-printed biosensor arrays based on protein-doped xerogels. Analytical Chemistry. 74 (24), 6177-6184 (2002).
  7. Cho, E. J., Tao, Z., et al. Tools to Rapidly Produce and Screen Biodegradable Polymer and Sol-Gel-Derived Xerogel Formulations. Applied Spectroscopy. Society for Applied Spectroscopy. 56 (11), 1385-1389 (2002).
  8. Ge, X., Lebert, J. M., Monton, M. R. N., Lautens, L. L., Brennan, J. D. Materials Screening for Sol-Gel-Derived High-Density Multi-Kinase Microarrays. Chemistry of Materials. 23 (16), 3685-3691 (2011).
  9. Rupcich, N., Green, J. R. A., Brennan, J. D. Nanovolume Kinase Inhibition Assay Using a Sol-Gel-Derived Multicomponent Microarray. Analytical Chemistry. 77 (24), 8013-8019 (2005).
  10. Rupcich, N. Coupled enzyme reaction microarrays based on pin-printing of sol-gel derived biomaterials. Analytica Chimica Acta. 500 (1-2), 3-12 (2003).
  11. MacBeath, G. G., Schreiber, S. L. S. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science (New York, N.Y.). 289 (5485), 1760-1763 (2000).
  12. Stillman, B. A. B., Tonkinson, J. L. J. FAST slides: a novel surface for microarrays. BioTechniques. 29 (3), 630-635 (2000).
  13. Rupcich, N., Goldstein, A., Brennan, J. D. Optimization of sol-gel formulations and surface treatments for the development of pin-printed protein microarrays. Chemistry of Materials. 15 (9), 1803-1811 (2003).
  14. Gill, I., Ballesteros, A. Encapsulation of biologicals within silicate, siloxane, and hybrid sol-gel polymers: An efficient and generic approach. Journal of the American Chemical Society. 120 (34), 8587-8598 (1998).
  15. Brook, M. A., Chen, Y., et al. Proteins entrapped in silica monoliths prepared from glyceroxysilanes. Journal of Sol-gel Science and Technology. 31 (1), 343-348 (2004).
  16. Brook, M. A., Chen, Y., Guo, K., Zhang, Z., Brennan, J. D. Sugar-modified silanes: precursors for silica monoliths. Journal of Materials Chemistry. 14 (9), 1469(2004).
  17. Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  18. Next generation of protein microarray support materials: Evaluation for protein and antibody microarray applications. Journal of Chromatography A. , 1-8 (2013).
  19. Bhatia, R. B., Brinker, C. J., Gupta, A. K., Singh, A. K. Aqueous Sol-Gel Process for Protein Encapsulation. Chemistry of Materials. 12 (8), 2434-2441 (2000).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

mikromacierze sol-gelprzesiewanie za pomocą mikromacierzy białkowychzachowanie aktywności enzymatycznejanaliza acetylcholinesterazyprzesiewanie inhibitorów kinazyproces drukowania mikromacierzydrukowanie w kontrolowanej wilgotnościpomiar intensywności fluorescencjiwyznaczanie IC50przesiewanie małych cząsteczek
Podejście do badań przesiewowych materiałów z przewodnikiem w celu opracowania ilościowych mikromacierzy białkowych pochodzących zol-żel
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.