Coraz częstsze wykorzystanie danio pręgowanego jako modelu zwierzęcego wymaga opracowania skutecznych metod dostarczania znanych ilości związków i roztworów. Opisana poniżej procedura zgłębnika pozwala na doustne podawanie precyzyjnych objętości roztworu dorosłym rybom danio pręgowanym.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Dorastający dorosły danio pręgowany
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Danio pręgowany stał się ważnym modelem in vivo w badaniach biomedycznych. Należy opracować i wykorzystać skuteczne metody dostarczania związków lub środków w roztworach do badań naukowych. Obecne metody doustnego podawania związków dorosłym rybom danio pręgowanym są niedokładne ze względu na zmienność dobrowolnego spożycia przez ryby. Opracowano procedurę zgłębnika, aby dostarczyć precyzyjne ilości czynników zakaźnych do danio pręgowanego w celu przeprowadzenia badań biomedycznych. Dorosłe rybki danio pręgowanego w wieku powyżej 6 miesięcy znieczulono 150 mg/l buforowanego MS-222 i znieczulono 5 μl roztworu za pomocą elastycznej rurki do implantacji cewnika przymocowanej do przeciętej końcówki igły 22-G. Elastyczny rurkę zanurzono w jamie ustnej danio pręgowanego, aż końcówka rurki wystawała poza skrzela (około 1 cm). Roztwór był następnie powoli wstrzykiwany do przewodu pokarmowego. Ta metoda była skuteczna w 88% przypadków, a ryby regenerowały się bez zakłóceń. Ta procedura jest również skuteczna, ponieważ jedna osoba może złowić 20-30 ryb w ciągu jednej godziny. Metoda ta może być stosowana do precyzyjnego podawania środków do badań chorób zakaźnych lub badań innych związków u dorosłych danio pręgowanego.
Wprowadzenie
Obecne metody doustnego podawania związków danio pręgowanej obejmują podawanie związków powlekanych na paszę, mieszanych z dietami żelatynowymi1, biokapsułkowanych z krewetkami solankowymi2, mieszanych z dietami kapsułkowanymi lipidami3, kulek woskowych w sprayu4 oraz poprzez diety oparte na glutenie. 5 Do ograniczeń tych metod podawania doustnego zalicza się wysokie tempo wymywania oraz niepełne lub nieprzewidywalne spożycie związków przez poszczególne ryby. Zmienne te są problematyczne, ponieważ w badaniach nad chorobami zakaźnymi znajomość dawki infekcyjnej podawanej rybom może mieć kluczowe znaczenie dla powodzenia badania. Wcześniejsze prace wykazały również, że niektóre związki podawane w kąpielach wodnych powodują toksyczne uszkodzenia skrzeli danio pręgowanego, zanim wystąpią skutki jelitowe, które mogą być przedmiotem badań. 6
Gavage to standardowa metoda stosowana u innych gatunków zwierząt laboratoryjnych do podawania precyzyjnych ilości produktu o znanym stężeniu do badań biomedycznych i farmaceutycznych. Dopiero niedawno w literaturze opisano metody oddawania danio pręgowanego. Jedną z opisanych technik jest metoda dwuosobowa wykorzystująca osłonkę cewnika 24 G przymocowaną do pipety o pojemności 2-20 μl w celu dostarczenia 5 μl roztworu. 7 Opisana metoda wykazała śmiertelność wynoszącą odpowiednio 8,7% i 39% w pierwszym i drugim badaniu; Większość śmiertelności przypisywano ciężarnym samicom. Druga opisana technika zgłębnika wykorzystywała strzykawki z końcówkami do podawania 5 μl roztworu medakas (Oryzias latipes). 8 Nie podano informacji na temat śmiertelności i nie opisano dokładnego procesu wykonywania zgłębnika. Według Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami i Laboratorium Danio pręgowanego, do 1% masy ciała ryby można podawać przez zgłębnik. 9,10 Naszym celem było opracowanie powtarzalnej, bezpiecznej i wydajnej metody doustnego dostarczania precyzyjnych objętości związków dorosłym danio pręgowanym obu płci i na wszystkich etapach rozrodu. Procedura ta miałaby zastosowanie do każdego badania, w którym wymagane jest dokładne doustne dawkowanie związku.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie roztworu znieczulającego
- Przygotować roztwór 150 mg/l MS-222 w wodzie systemowej z roztworu podstawowego lub w postaci sproszkowanej.
- Sprawdź pH za pomocą pH-metru.
- W razie potrzeby buforować wodorowęglanem sodu, aż pH będzie się mieścić w przedziale 7-7,5.
- Przygotuj zbiornik z wodą systemową wolną od MS-222, aby ryby mogły się w nim zregenerować. Czas rekonwalescencji wynosi zwykle mniej niż 1 minutę.
2. Przygotowanie aparatu do gaszenia
- Przyciąć przezroczystą rurkę implantacyjną 22-G na nieco więcej niż przybliżoną długość od ust do opuszki jelitowej ryby. Początkowo sugerujemy znieczulenie jednej ryby dla każdej nowej grupy, aby uzyskać jak najlepsze oszacowanie potrzebnej długości.
- Wsunąć przezroczystą rurkę implantacyjną na igłę 1/2 cala 22-G, aż będzie bezpieczna i nie będzie ryzyka odłączenia. Jeśli igła 1/2 22-C nie jest dostępna, przytnij dłuższą igłę do mniej więcej tej długości.
- Po zakończeniu rurka implantacji cewnika powinna wystawać około 1 cm od czubka igły lub krótsza, jeśli ryby są mniejsze.
- Przymocować piastę igły 22-G do strzykawki luerlok o pojemności 1 cm3.
3. Przygotowanie do Gavage
- Wytnij rowek w gąbce za pomocą ostrza skalpela.
- Namocz gąbkę w wodzie systemowej wolnej od MS-222.
- Umieść zwilżoną gąbkę na płaskiej powierzchni.
- Pobrać odpowiedni roztwór 5 μl do głębka do rurki cewnika 22-G i strzykawki o pojemności 1 cm3.
4. Znieczulenie i zgłębnik
- Rybę należy pościć przez co najmniej 24 godziny przed zabiegiem.
- Umieść rybę w roztworze MS-222, aż straci odruch prostowania i nie zareaguje na uszczypnięcie płetwy ogonowej, ale utrzyma ruch wieczkowy. Zwykle zajmuje to około 2-3 minut.
- Wyjmij rybę z roztworu znieczulającego i umieść ją w rowku w gąbce z głową lekko wystającą z gąbki, ale skrzelami zakrytymi gąbką.
- Przesuń gąbkę do pozycji pionowej.
- Otwórz pysk danio pręgowanego za pomocą rurki cewnika 22-G.
- Delikatnie włóż rurkę, aż końcówka znajdzie się poza skrzelami (około 1 cm lub długość rurki). Rurka do implantacji nie powinna być zmuszana na siłę. Opór sugeruje, że rurka może uderzać w łuk skrzelowy lub serce.
- Jeśli występuje opór, delikatnie wycofaj się, zmień pozycję i spróbuj ponownie.
- Wstrzykiwać materiał powoli.
- Podczas wstrzykiwania należy upewnić się, że roztwór nie wydostaje się przez skrzela lub usta.
- Wyjmij rybę z gąbki i umieść ją w zbiorniku rekuperacyjnym.
- Rekonwalescencja następuje zwykle w czasie krótszym niż 1 minuta i jest sygnalizowana przez pływanie w pozycji pionowej i utrzymywanie równowagi.
- Monitoruj ryby pod kątem niedomykalności, jak pokazano, wizualizując rybę aktywnie wydalającą materiał z pyska lub brak ruchu wieczkowego.
- Ryby mogą zostać zwrócone do swojego zwykłego zbiornika po wyzdrowieniu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Z powodzeniem przeprowadzono zgłębnikowanie ryb obu płci, w tym samic w stanie ciążowym (Rycina 1). Prawidłowo wykonany zabieg trwa mniej niż minutę, przy czym z skrzeli lub pyska nie wycieka żadna ciecz. Rurka wchodzi łatwo, bez użycia siły, a po usunięciu cewnika nie stwierdzono obecności krwi. Procedura jest szybka i wymaga około 10 min na podanie pokarmu 3 do 4 rybom, przy średnim czasie 30-45 s na jedną rybę.
Danio pręgowane nie powinny otrzymywać drogą zgłębnika więcej n...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Znaczenie
Ta technika jest ulepszeniem i zapewnia kilka zalet w porównaniu z dwiema wcześniej opisanymi technikami oddawania dorosłego danio pręgowanego. Po pierwsze, użycie gąbki do krępowania ryby pozwala jednej osobie na wykonanie zabiegu, w przeciwieństwie do wcześniej opisanej techniki wymagającej dwóch osób. 7 Po drugie, rurki do implantacji cewnika są bardziej elastyczne niż cewniki dożylne, co może pomóc zminimalizować wtórne urazy spowodowane perforacją, podobnie jak w przyp...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Centrum Nauk Biologicznych Uniwersytetu Rockefellera udzieliło wsparcia dla tego projektu. Dziękujemy Janelle Monnas za pomoc techniczną.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| A gąbka | |||
| 1-cc strzykawka typu luer lock | Becton Dickinson Co | ||
| 22-G Rurka do implantacji Micro-Renathane (cięta) | Braintree Scientific, Inc. | ||
| 1 igła 22-G (cięta, w razie potrzeby) | Miernik pH Becton Dickinson Co | ||
| Sonda | |||
| 1 ostrze | |||
| [nagłówek] | |||
| Odczynnik/Materiał | |||
| MS-222 (Finquel) | Argent Laboratories | ||
Bibliografia
- Royes, J. -A. B., Chapman, F. Preparing Your Own Fish Feeds. , Department of Fisheries and Aquatic Sciences, Florida Cooperative Extension Service, Insitute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida. (2009).
- Gomez-Gil, B., Cabanillas-Ramos, J., Paez-Brambila, A., Roque, A. Standardization of the bioencapsulation of enrofloxacin and oxytetracycline in Artemia fransciscana Kellogg. Aquaculture. 196, 1-12 (1906).
- Langdon, C. Microparticle types for delivering nutrients to marine fish larvae. Aquaculture. 227, 259-275 (2003).
- Langdon, C., Nordgreen, A., Hawkyard, M., Hamre, K. Evaluation of wax spray beads for delivery of low-molecular weight, water soluble nutrients and antibiotics to Artemia. Aquaculture. 284, 151-158 (2008).
- Zang, L., Morikane, D., Shimada, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A Novel Protocol for the Oral Administration of Test Chemicals to Adult Zebrafish. Zebrafish. 8, 203-210 (2011).
- Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think Small: Zebrafish as a Model System of Human pathology. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , (2012).
- Tysnes, K. R., Jorgensen, A., Poppe, T., Midtlyng, P. J., Robertson, L. J. Preliminary expermients on use of zebrafish as a laboratory model for Giardia duodenalis infection. Acta Parasitologica. 57, 1-6 (2012).
- Marie, B., Huet, H., et al. Effects of a toxic cyanobacterial bloom (Planktothris agardhii) on fish: Insights from histopathological and quantitative proteomic assessments following the oral exposure of medaka fish (Oryzias latipes). Aquatic Toxicology. 114-115, 39-48 (2012).
- Canadian Council on Animal Care. CCAC guidelines on: the care and use of fish in research, teaching and testing. , CCAC. Ottawa, Ontario, Canada. (2005).
- Harper, C., Lawrence, C. The Laboratory Zebrafish. , CRC Press. Boca Raton, Florida, USA. (2011).
- De Tolla, L. J., Srinivas, S., et al. Guidelines for the Care and Use of Fish in Research. ILAR Journal. 37 (4), (1995).
- Topic Popovic, N., Strunjak-Perovic, I., et al. Tricaine methane-sulfonate (MS-222) application in fish anaesthesia. Journal of Applied Ichthyology. 28, 553-564 (2012).
- Field, H. A., Kelley, K. A., Martell, L., Goldstein, A. M., Serluca, F. C. Analysis of gastrointestinal physiology using a novel intestinal transit assay in zebrafish. Neurogastroenterology & Motility. 21, 304-312 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
