Wielkoskalowy knockdown genów u C. elegans przy użyciu bibliotek zasilających dsRNA do generowania odpornych fenotypów utraty funkcji

Podsumowanie

Podczas gdy karmienie dsRNA u C. elegans jest potężnym narzędziem do oceny funkcji genów, obecne protokoły dla dużych ekranów żywieniowych skutkują zmienną skutecznością eliminacji. Opisujemy ulepszony protokół wykonywania badań przesiewowych karmienia RNAi na dużą skalę, który skutkuje wysoce skutecznym i powtarzalnym obniżeniem ekspresji genów.

Streszczenie

Interferencja RNA przez karmienie robaków bakteriami eksprymującymi dsRNA była użytecznym narzędziem do oceny funkcji genów u C. elegans. Podczas gdy ta strategia działa dobrze, gdy niewielka liczba genów jest ukierunkowana na knockdown, ekrany żywieniowe na dużą skalę wykazują zmienną skuteczność knockdownu, co ogranicza ich użyteczność. Zdekonstruowaliśmy wcześniej opublikowane protokoły knockdownu RNAi i stwierdziliśmy, że główne źródło zmniejszonego knockdownu można przypisać utracie plazmidów kodujących dsRNA z bakterii podawanych zwierzętom. Na podstawie tych obserwacji opracowaliśmy protokół karmienia dsRNA, który znacznie zmniejsza lub eliminuje utratę plazmidu, aby osiągnąć wydajne, wysokowydajne knockdown. Wykazaliśmy, że protokół ten spowoduje solidne, powtarzalne knockdown genów C. elegans w wielu typach tkanek, w tym neuronach, i pozwoli na skuteczne knockdown w badaniach przesiewowych na dużą skalę. Protokół ten wykorzystuje dostępną na rynku bibliotekę karmienia dsRNA i opisuje wszystkie kroki potrzebne do zduplikowania biblioteki i wykonania badań przesiewowych dsRNA. Protokół nie wymaga użycia żadnego wyrafinowanego sprzętu i dlatego może być wykonany przez każde laboratorium C. elegans.

Wprowadzenie

Historycznie, badania genetyczne u C. elegans były przeprowadzane poprzez leczenie zwierząt chemicznym mutagenem, takim jak metanosulfonian etylu, w celu stworzenia losowych mutacji w DNA. Następnie izoluje się potomstwo lub dziadków zmutagenizowanych zwierząt, które wykazują pożądany nieprawidłowy fenotyp. Mutacja odpowiedzialna za wywołanie fenotypu jest następnie identyfikowana za pomocą pracochłonnej procedury mapowania lub sekwencjonowania całego genomu zmutowanego robaka. Wykonywanie takich badań przesiewowych mutagenezy chemicznej ma wiele zalet, ponieważ tworzą one trwałe zmiany w genomie robaka, które mogą skutkować zarówno fenotypami wzmocnienia, jak i utraty funkcji, ale procedura mapowania jest powolna i kosztowna.

Dwuniciowa interferencja RNA (dsRNAi) stanowi alternatywny sposób identyfikacji genów zaangażowanych w ważne procesy biologiczne. W tej metodzie do robaka wprowadza się dsRNA pasujące do sekwencji kodującej endogennego genu. dsRNA jest przetwarzane in vivo w celu wytworzenia małych (21-22 nukleotydów) RNA, które służą jako przewodniki do znalezienia i związania pasujących endogennych mRNA, kierując je do zniszczenia ¹. Ta procedura jest stosunkowo szybka, ale ponieważ dsRNA jest ukierunkowane na mRNA, a nie na DNA, przy użyciu tego podejścia obserwuje się tylko fenotypy redukcji funkcji.

Wprowadzenie dsRNA do zwierzęcia może być osiągnięte poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie dsRNA ², przez moczenie zwierząt w dsRNA ³ lub przez karmienie zwierząt bakteriami wykazującymi ekspresję dsRNA ⁴. Każda z tych metod dostarczania powoduje ogólnoustrojowe efekty knockdown, ponieważ większość komórek zwierzęcia wykazuje ekspresję SID-1, kanału transbłonowego zdolnego do importowania dsRNA ⁵. Pierwotnie stosowana jako podejście genetyki odwrotnej w celu obniżenia ekspresji pojedynczych genów pojedynczo, rozwój dwóch bibliotek żywieniowych pozwala obecnie na badania genetyczne na dużą skalę. Dostępne na rynku biblioteki dsRNA zawierają klony bakteryjne reprezentujące 55% lub 87% wszystkich genów C. elegans ^{6, 7}.

Niestety, ekrany zasilające dsRNAi na dużą skalę często skutkują zmienną skutecznością powalania ^8-10. Podczas gdy bezwzględny poziom knockdown przez RNAi nie jest łatwy do zmierzenia, zmniejszona skuteczność knockdown obserwowana w badaniach przesiewowych na dużą skalę musi być spowodowana przez resztkowe mRNA specyficzne dla genu, które unikają degradacji przez RNAi. To z kolei może być bezpośrednim skutkiem utraty plazmidu dsRNA przez bakterie podawane zwierzętom w tych badaniach przesiewowych. Wspierając tę teorię, zwierzęta karmione mieszankami bakterii, w których tylko 50% bakterii wyraża dsRNA przeciwko docelowemu genowi, wykazują znacznie zmniejszone (jeśli w ogóle) efekty knockdown w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi ^{karmionymi 11}. Zakres knockdownu genów staje się krytycznym problemem podczas wykonywania badań przesiewowych dsRNAi, ponieważ większość genów u C. elegans jest haplowystarczalna, a zatem ekspresja genów musi zostać zmniejszona o co najmniej 50%, aby spowodować utratę funkcji fenotypów ¹².

Użyliśmy wcześniej opublikowanych protokołów żywieniowych do przeprowadzenia badań przesiewowych na dużą skalę i znaleźliśmy te same zmienne efekty knockdown zgłaszane przez innych ^8-10. Poszukując możliwych przyczyn, odkryliśmy, że prawie 60% bakterii podawanych zwierzętom w badaniu przesiewowym utraciło plazmid dsRNA. Opracowaliśmy protokół duplikacji i badań przesiewowych w bibliotece, który radykalnie zmniejsza lub eliminuje utratę plazmidu i znacznie poprawia skuteczność wyłączania. Protokół ten jest odpowiedni do wykonywania badań przesiewowych na dużą skalę u C. elegans i może być używany do badań przesiewowych jednej z dostępnych na rynku bibliotek dsRNA. Korzystając z tego protokołu, stwierdzamy, że zasadniczo 100% bakterii podawanych zwierzętom podczas badania przesiewowego zachowuje plazmid kodujący dsRNA i powoduje silne i wysoce penetrujące fenotypy utraty funkcji we wszystkich badanych tkankach.

Protokół

Uwaga: Ten protokół może być używany do identyfikacji genów wymaganych do różnych procesów biologicznych w różnych typach tkanek. W ramach niezbędnej kontroli jakości podczas badania przesiewowego, zwierzęta są karmione zarówno pozytywnymi, jak i ujemnymi bakteriami eksprymującymi dsRNA, aby wykazać działanie RNAi w docelowej tkance.

Inne opublikowane protokoły żywieniowe hodują bakterie eksprymujące dsRNA w obecności 50 μg/ml ampicyliny lub 25 μg/ml karbenicyliny ^8-10. Odkryliśmy, że bakterie hodowane w którymkolwiek z tych warunków tracą plazmid dsRNA z dużą częstotliwością. Rzeczywiście, odkryliśmy, że nawet gdy bakterie są hodowane przez noc w bardzo wysokich stężeniach (do 2 mg/ml) ampicyliny, ponad 50% bakterii nie zawiera już plazmidu. Podczas gdy wzrost karbenicyliny na ogół powodował większą retencję plazmidu, 25 μg/ml nie było wystarczające, aby zapobiec utracie plazmidu. Zamiast tego stwierdziliśmy, że stężenie karbenicyliny wynoszące 500 μg / ml było wymagane do zablokowania utraty plazmidu podczas wzrostu w płynnych kulturach, a 2 mg / ml karbenicyliny było wymagane do zablokowania utraty plazmidu, gdy bakterie były hodowane na stałych podłożach agarowych.

Ponieważ retencja plazmidu jest kluczowa dla powodzenia knockdownu, tylko karbenicylina jest używana, gdy bakterie dsRNA są hodowane w tym protokole. Starannie zoptymalizowaliśmy stężenie karbenicyliny stosowanej w kulturach wzrostu bakterii opisanych w tym protokole, aby zapewnić, że bakterie, które nie zawierają plazmidu, nie rosną w tych kulturach. Jednak jako środek kontroli jakości, utrata plazmidu jest określana na kilku etapach protokołu. Aby zapewnić skuteczne knockdown, ponad 80% bakterii na każdym z tych etapów musi zawierać plazmid dsRNA. Jeśli więcej niż 20% bakterii na którymkolwiek etapie protokołu utraciło plazmid dsRNA, sprawdź jakość użytej karbenicyliny. Karbenicylina powinna być przygotowana na świeżo w dniu jej użycia. Przygotuj świeżą karbenicylinę i powtórz hodowlę.

1. Jak określić utratę plazmidu

1. Usuń małą próbkę bakterii (zgodnie z opisem na każdym odpowiednim etapie) i dodaj ją do 450 μl sterylnej wody.
2. Użyj 100 μl tej rozcieńczonej próbki, aby uzyskać dalsze seryjne rozcieńczenia 1:10, 1:100 i 1:1,000 przy użyciu sterylnej wody, dokładnie mieszając roztwory między rozcieńczeniami.
3. Rozprowadzić 100 μl każdego rozcieńczenia na płytkach LB i LB AMP i inkubować te płytki przez noc w temperaturze 37 °C.
4. Następnego dnia zidentyfikuj płytkę LB, która zawiera od 100 do 500 kolonii bakterii. Policz liczbę kolonii na tej płytce i na odpowiedniej płytce LB AMP (zawierającej takie samo rozcieńczenie bakterii).
5. Określ utratę plazmidu na podstawie tych liczb kolonii. Procent bakterii, które nie zawierają plazmidu, oblicza się za pomocą równania 1 i powinien być mniejszy niż 15%, aby skutecznie strącić dsRNA.

2. Tworzenie duplikatów tablic bibliotecznych

Przegląd: Biblioteka dsRNA zostanie dostarczona od producenta (OpenBiosystems) jako 10 566 klonów bakteryjnych na 96-dołkowych płytkach. Przechowuj talerze natychmiast w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Oryginalne płytki biblioteczne zostaną zduplikowane, a wszystkie ekrany żywieniowe będą wykorzystywać zduplikowane płytki biblioteczne jako źródło bakterii. Zaleca się przechowywanie oryginału i duplikatów płyt bibliotecznych w oddzielnych zamrażarkach. Dla ułatwienia obsługi zaleca się powielanie tylko 10 płyt bibliotecznych dziennie.

1. Wyjąć płytkę (płytki) biblioteczne z zamrażarki w temperaturze -80 °C i zdjąć uszczelkę foliową, gdy kultury są nadal zamrożone. Załóż plastikową pokrywę płytki bibliotecznej i ustaw płytkę na równej powierzchni, aby rozmroziła się w temperaturze pokojowej (nie dłużej niż 30 minut).

Uwaga: Zauważyliśmy, że znaczny procent bakterii znalezionych w każdym dołku oryginalnych płyt bibliotecznych nie zawiera plazmidu. Ponieważ jednak bakterie biblioteczne są cennym zasobem, nie zaleca się testowania utraty plazmidu w oryginalnych kulturach bibliotecznych.

2. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 150 μl pożywki do duplikacji bibliotecznej do każdego dołka pustej 96-dołkowej płytki z płaskim dnem.
3. Wymieszaj rozmrożone kultury bakterii z biblioteki, pipetując w górę i w dół cztery do pięciu razy za pomocą pipety wielokanałowej ustawionej na 100 μl. Następnie usunąć 10 μl każdej zmieszanej kultury i przenieść do odpowiednich studzienek zduplikowanej płytki. Kontynuuj przenoszenie kultur z płytki bibliotecznej na zduplikowaną płytkę, upewniając się, że końcówki pipet są wymieniane przy każdym transferze.
4. Po przeniesieniu wszystkich kultur z płytki bibliotecznej, przykryj dołki oryginalnej płytki bibliotecznej nową folią samoprzylepną za pomocą wałka Brayera, aby zapewnić dokładne uszczelnienie. Załóż plastikową pokrywkę na talerz i umieść ją pionowo w zamrażarce o temperaturze -80 °C, aż kultury zostaną ponownie zamrożone (co najmniej 30 minut). Następnie przenieś oryginalne płyty biblioteczne z powrotem do schowka bibliotecznego.
5. Potrząsać zduplikowanymi kulturami płytek bibliotecznych na płasko przez 8-10 godzin w temperaturze 37 °C (450 obr./min na mikrowytrząsarce, orbita 3 mm).
6. Określ utratę plazmidu w każdej zduplikowanej płytce bibliotecznej. Odkryliśmy, że duża część bakterii w każdym dołku oryginalnej płytki bibliotecznej nie zawierała plazmidu dsRNA. Ważne jest, aby bakterie te nie przyczyniały się do wzrostu w zduplikowanej bibliotece. Aby zapobiec ich wzrostowi, w pożywkach do powielania biblioteki stosuje się wysokie stężenie karbenicyliny (3 mg/ml). Po posiewie płytki duplikacyjnej w tych warunkach stwierdziliśmy, że ponad 90% bakterii zawiera plazmid dsRNA. Pobrać 10 μl próbki z reprezentatywnej studzienki hodowlanej z każdej zduplikowanej płytki i dodać ją do 450 μl sterylnej wody. Korzystając z tych rozcieńczonych próbek, określ utratę plazmidu na każdej zduplikowanej płytce bibliotecznej zgodnie z krokami 1.1-1.4. Jeśli zaobserwuje się znaczną utratę plazmidu (>20% bakterii w zduplikowanej bibliotece nie zawiera plazmidu), należy ponownie przygotować pożywkę hodowlaną przy użyciu świeżej karbenicyliny i powtórzyć protokół od kroku 2.1.
7. Po inkubacji umieścić nowy foliowy arkusz samoprzylepny bezpośrednio nad zduplikowanymi dołkami na płytki i umieścić pokrywki płytek na tej folii. Umieść zduplikowane tabliczki biblioteczne w pozycji pionowej w zamrażarce w temperaturze -80 °C (co najmniej 30 minut) do momentu zamrożenia. Po zamrożeniu przenieś płyty do zduplikowanego schowka bibliotecznego w celu długotrwałego przechowywania.

3. Tworzenie tymczasowych kopii biblioteki na Omniplates

Przegląd: Aby rozpocząć przygotowywanie jedzenia do badania przesiewowego dsRNA, bakterie z duplikatów biblioteki są przenoszone na stałe płytki agarowe i hodowane przez noc. Aby zapobiec utracie plazmidu na podłożach stałych, płytki dookólne zawierają karbenicylinę w dawce 2 mg/ml. Bakterie na tych płytkach mogą być używane przez okres jednego tygodnia i nie wykazują utraty plazmidu. Nie testowaliśmy utraty plazmidu u bakterii hodowanych na płytkach zbiorczych dłużej niż tydzień.

1. Wyjąć zduplikowaną płytkę (płytki) biblioteczne z zamrażarki w temperaturze -80 °C i zdjąć folię, gdy kultury są jeszcze zamrożone. Po zdjęciu folii załóż plastikową osłonę płyty i ustaw zduplikowaną tabliczkę biblioteczną na równej powierzchni, aby rozmroziła się w temperaturze pokojowej (nie dłużej niż 30 min).
2. Wysterylizuj replikator pinów Boekel 96. Styki czystego replikatora należy przepłukać wodą destylowaną, a następnie wysterylizować przed każdym użyciem. Aby wysterylizować replikator, umieść go w kąpieli etanolowej (3/4 głębokości w naczyniu Pyrex), a następnie spal etanol pokrywający szpilki za pomocą palnika Bunsena. Poczekaj, aż płomień zgaśnie, a następnie powtórz.
3. Umieść wysterylizowany replikator w dołkach rozmrożonej zduplikowanej płytki i użyj go do delikatnego wymieszania kultur. Małe objętości kultury będą przylegać do pinów replikatora.
4. Ostrożnie wyjąć replikator z dołków zduplikowanej płytki i delikatnie umieścić go (kołkami w dół) na powierzchni płytki zbiorczej, uważając, aby nie przebić powierzchni agaru. Pozostawić replikator na powierzchni płytki zbiorczej na 3-4 sekundy, tak aby bakterie z kołków replikatora zostały przeniesione na powierzchnię agaru.
5. Wyjąć replikator i pozwolić, aby niewielka objętość (2-3 μl) kultury bakteryjnej wchłonęła się do agaru. Inkubować odwrócone płytki dolotowe przez 15-18 godzin w temperaturze 37 °C. Te płytki dookólne mogą być użyte następnego ranka do zaszczepienia 96 dobrze płynnych kultur. Alternatywnie, płytki zbiorcze zawierające kolonie bakterii na noc mogą być przechowywane do siedmiu dni w temperaturze 4 °C.
6. Aby przenieść replikę na dodatkowe zduplikowane płytki, przepłucz końcówki replikatora sterylną wodą i powtórz proces sterylizacji, umieszczając replikator w etanolu i dwukrotnie go paląc, tak jak poprzednio. Po wysterylizowaniu replikator może być użyty na następnej zduplikowanej płytce.
7. Określ utratę plazmidu po całonocnej hodowli na płytkach dokrewnych. Kolonie bakterii na płytkach dookólnych po nocnym wzroście będą służyć jako tymczasowe źródło pożywienia do karmienia ekranów. Ważne jest, aby ponad 80% bakterii w każdej kolonii zawierało dsRNA. Bakterie mają tendencję do szybszej utraty plazmidu na stałych podłożach agarowych niż w kulturach płynnych. Określić utratę plazmidu dla dwóch reprezentatywnych kolonii na płytkach zbiorczych, zaszczepiając 1 ml sterylnej wody niewielką ilością bakterii z każdej kolonii i używając tej rozcieńczonej próbki do określenia utraty plazmidu zgodnie z krokami 1.1-1.4. Oczekiwanie: Ponad 90% bakterii w każdej kolonii będzie zawierało plazmid dsRNA. Jeśli zaobserwuje się znaczną utratę plazmidu (>20% bakterii z kolonii na płytce zbiorczej nie zawiera plazmidu), należy przerobić pożywkę dookamienną przy użyciu świeżej karbenicyliny i powtórzyć protokół od kroku 3.1.

4. Przygotowanie bakterii do karmienia robaków

Przegląd: Bakterie do karmienia robaków są przygotowywane jako 1 ml płynnych kultur (w formacie 96 dołków) przy użyciu bakterii z płytek zbiorczych. Te płynne kultury są hodowane przez noc w celu wytworzenia nasyconych nielogarytmicznych kultur bakterii. Wzrost z dnia na dzień zapewnia, że wszystkie kultury będą zawierały podobne stężenia bakterii, a zatem wszystkie robaki będą karmione taką samą ilością pokarmu. Nie należy zaobserwować utraty plazmidu podczas tego wzrostu.

1. Dozować 1 ml pożywki do rozwoju bakterii do każdej studzienki zawierającej 2 ml płytki z 96 dołkami za pomocą powtarzalnego pipetora i 50 ml końcówki Combitip.
2. Umieścić sterylny replikator na powierzchni płytek zbiorczych zawierających kolonie bakteryjne wygenerowane w krokach 3.1-3.6, upewniając się, że szpilki stykają się z każdą z 96 kolonii bakteryjnych.
3. Ostrożnie przesunąć replikator z powierzchni płytki dookólnej do płytki studni głębokiej, upewniając się, że kołki nie ocierają się o boki studni głębokich, dopóki nie zostaną zanurzone w pożywce wzrostowej. Przesuwaj replikator powoli ruchem prostopadłym, podążając za wewnętrzną ścianą płytki studzienki głębinowej, aby usunąć bakterie z pożywki wzrostowej. Uważaj, aby nie rozpryskiwać i nie zanieczyszczać krzyżowo studni.
4. Studzienki kontrolne: Do każdej 96-dołkowej płytki do hodowli głębinowej dodać bakterię wyrażającą dsRNA do jednej studzienki, która będzie działać jako pozytywna kontrola dla oczekiwanego fenotypu knockdown, a następnie dodać bakterie zawierające pusty wektor dsRNA (pL4440) jako kontrolę ujemną do innego dołka. Raz w tygodniu ponownie umieszczamy bakterie kontrolne wykazujące ekspresję dsRNA na płytkach LB zawierających tetracyklinę (15 μg / ml) i karbenicylinę (2 mg / ml), aby bakterie pozostały świeże i zachowały plazmid.
5. Używając sterylnej pętli inokulacyjnej, usuń pojedynczą dobrze wyizolowaną kolonię z płytki kontrolnej (mniej więcej taką samą ilość bakterii przenoszoną przez replikator) i zaszczepij pustą studzienkę na płytce do hodowli głębinowej. Zapisz położenie studzienki, która została zaszczepiona. Alternatywnie, pętlę z bakteriami można przenieść do probówki Eppendorfa zawierającej 250 μl pożywki wzrostowej, a następnie wykorzystać do zaszczepienia kilku studzienek.
6. Wstrząsnąć płytkami głębokiej studzienki w pozycji płaskiej z prędkością 650 obr./min na mikrowytrząsarce (orbita: 3 mm) w temperaturze 37 °C przez noc. Kultury zostaną nasycone do następnego ranka. Niezależnie od tego, stężenie karbenicyliny stosowane w tych kulturach powinno zapobiegać utracie plazmidu.
7. Określić utratę plazmidu w 1 ml kultur na noc. Kultury zostaną wykorzystane bezpośrednio do karmienia robaków na ekran. Ważne jest, aby ponad 80% bakterii w każdej kulturze zawierało plazmid dsRNA. Określ utratę plazmidu dla dwóch reprezentatywnych kultur zgodnie z krokami 1.1-1.4. Oczekiwanie: Ponad 90% bakterii w każdej kulturze będzie zawierało plazmid dsRNA. Nigdy nie zaobserwowaliśmy znaczącej utraty plazmidu w tych nocnych hodowlach, nawet gdy są uprawiane do nasycenia. Jeśli jednak zaobserwuje się znaczną utratę plazmidu (>20%), należy ponownie przygotować pożywkę wzrostową przy użyciu świeżej karbenicyliny i powtórzyć protokół od kroku 4.1. Kultury można wznowić z oryginalnych płytek zbiorczych, o ile płytki dookólne mają mniej niż 1-2 tygodnie.
8. Po użyciu do rozpoczęcia hodowli o objętości 1 ml, płytki dookólne są przechowywane w temperaturze 4 °C do czasu zakończenia badania przesiewowego i mogą być wykorzystane jako źródło pożywienia do rozpoczęcia powtórnego badania kultur.
9. Po całonocnej inkubacji kultur należy za pomocą 12-kanałowej pipety wielokanałowej usunąć 150 μl kultury bakteryjnej z płytki głębokiej studzienki i wyrzucić na powierzchnię płytki do karmienia. Ważne jest, aby nie przebijać powierzchni agaru podczas przenoszenia, ponieważ robaki będą się zakopywać i nie żywić się bakteriami wykazującymi ekspresję dsRNA. Transfer można wykonać jednocześnie w czterech dołkach (rysunek 1). W tym celu należy umieścić końcówki pipet na co trzecim kanale pipety wielokanałowej (ponieważ na płycie podającej znajdują się tylko 4 dołki na rząd). Po przeniesieniu każdego zestawu 4 studzienek należy wymienić końcówki do pipet na nowe, sterylne. Każda 96 płytek do hodowli głębokiej będzie wymagała 96 końcówek do przeniesienia na osiem 12-dołkowych płytek do karmienia.
10. Przechowuj talerze z nasionami pionowo w ciemności przez noc, aby bakterie mogły wchłonąć się do agaru.

5. Generowanie L1 Zatrzymane larwy C. elegans

Przegląd: Larwy zatrzymane w L1 są używane do uruchamiania zsynchronizowanych kultur robaków na płytkach zasilających dsRNA. Larwy te są generowane przez bielenie populacji grawitacyjnych dorosłych osobników w celu wyizolowania zdrowych jaj, a następnie umożliwienie wyklucia się jaj w pożywce S bez pożywienia. W przypadku braku pożywienia wyklute larwy L1 zatrzymują rozwój, tworząc synchroniczną populację larw L1. Podczas badania przesiewowego co tydzień należy przygotowywać świeże larwy zatrzymane w L1, ponieważ te wygłodzone zwierzęta z czasem chorują i muszą zostać wyrzucone. Wybór tła genetycznego zwierząt wykorzystywanych w szczepie zasilającym dsRNA może się różnić w zależności od zastosowania, w przypadku badań przesiewowych neuronów zaleca się mutanty eri-1; lin-15B.

1. Zbierz 10-20 larw L4 na sześć oddzielnych płytek NGM zawierających trawnik bakterii OP50 i odczekaj 6-7 dni, aż płytki będą zawierały wiele świeżo złożonych jaj i grawitacyjnych osobników dorosłych.
2. Usuń zwierzęta i jaja z talerzy, dodając 3 ml wody na powierzchnię każdej płytki i użyj palca w rękawiczce, aby usunąć jaja, bakterie i zwierzęta z powierzchni każdej płytki do wody. Pamiętaj, aby pokryć wszystkie obszary talerza, zwracając szczególną uwagę na trawnik bakteryjny. Usunąć wodę, bakterie, robaki i jaja z każdej płytki za pomocą szklanej pipety i przenieść do jednej sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
3. Dodaj kolejne 3 ml wody na powierzchnię każdej płytki, pipetując w górę i w dół po powierzchni, aby usunąć wszystkie pozostałe bakterie, robaki i jaja. Dodać tę objętość do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
4. Wirować stożkową probówkę z prędkością 1 500 obr./min przez 1 minutę w wirówce stołowej. Robaki i jaja powinny osadzać się na dnie probówki, a bakterie powinny pozostać zawieszone. Ostrożnie zassać z probówki wszystko, z wyjątkiem 4 ml płynu, upewniając się, że unika się granulowanych robaków i jaj.
5. Zawiesić osad robaka w pozostałej wodzie i przenieść do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą szklanej pipety. Doprowadzić objętość do 10 ml sterylną wodą.
6. Wiruj z prędkością 1 500 obr./min przez 1 minutę, tak jak poprzednio. Odessać supernatant pozostawiając 200 μl wody, aby nie naruszyć osadu robaka/jaja.
7. Dodaj 10 ml wody do stożka, aby umyć robaki i jaja i odwiruj jak poprzednio, aby usunąć dodatkowe bakterie.

Uwaga: W krokach 5.8-5.11 robaki i jaja są wystawione na działanie roztworu wybielacza. Wybielacz zniszczy robaki i pozostawi jaja stosunkowo nienaruszone. Jeśli jednak jaja zostaną pozostawione w roztworze wybielacza zbyt długo, również zostaną zniszczone. Ustaw minutnik po dodaniu wybielacza w kroku 5.8, aby mieć pewność, że jajka nie pozostaną wystawione na działanie wybielacza przez ponad 10 minut.

8. Usunąć wszystkie z wyjątkiem 200 μl supernatantu, ponownie unikając osadu, a następnie dodać 10 ml roztworu wybielacza i uruchomić stoper.
9. Wysiaduj robaki i jaja w roztworze wybielacza przez 3-4 minuty, od czasu do czasu mieszając przez inwersję. Następnie wiruj z prędkością 1 500 obr./min przez 45 sekund w wirówce stołowej. Poszukaj granulki na dnie tuby, powinna być mniejsza i bardziej zwarta niż oryginalna granulka i może przybrać żółty wygląd.
10. Zassać roztwór wybielacza, pozostawiając 200 μl, aby nie naruszyć osadu.
11. Dodaj kolejne 10 ml świeżego roztworu wybielacza i odwróć jak poprzednio. Gdy minutnik wskaże 10 minut, ponownie odkręć i odessaj roztwór wybielacza, pozostawiając 200 μl i szybko dodaj 10 ml sterylnej wody. Zbadaj roztwór pod mikroskopem preparacyjnym. Larwy i wiele dorosłych osobników powinno było rozpuścić się w roztworze wybielacza, pozostawiając głównie jaja.
12. Wirować jak poprzednio przez 45 sekund i ponownie zassać supernatant, aby nie naruszyć osadu. Ten granulat powinien zawierać przede wszystkim jajka i będzie bardzo luźny.
13. Dodaj kolejne 10 ml wody, odwróć do wymieszania, odwiruj i zaaspiruj, pozostawiając trochę wody. Ważne jest, aby usunąć jak najwięcej roztworu wybielacza.
14. Dodać 4 ml pożywki S-complete do stożkowej probówki, ponownie zawiesić jaja i przenieść do sterylnej kolby Erlenmeyera o pojemności 100 ml. Umieścić kolbę w inkubatorze o temperaturze 20 °C na wytrząsarce, która porusza się na tyle szybko, aby spowodować zawirowanie zawartości kolby. Zapewni to wystarczające napowietrzenie, aby utrzymać larwy L1 po wykluciu. W ciągu 15 godzin wszystkie jaja powinny się wykluć, tworząc synchroniczną populację zatrzymanych larw L1.

Zatrzymane larwy L1 powinny być świeże co tydzień podczas seansu. Po wykonaniu pierwszej partii, kolejne partie można rozpocząć poprzez dodanie 500 zatrzymanych larw L1 (z partii z poprzedniego tygodnia) do każdej z czterech standardowych, wysianych 6 cm płytek (zawierających 100 μl nocnej kultury OP50) i inkubowanych w temperaturze 20 °C przez 4 dni. Czwartego dnia na talerzach powinno znajdować się wiele jaj i dorosłych osobników, które można wybielić, aby przygotować świeże jaja dla bardziej zsynchronizowanych larw L1.

6. Przenoszenie zatrzymanych larw L1 na talerze do karmienia

Przegląd: Aby przeprowadzić badanie przesiewowe dsRNA, 20-30 zatrzymanych larw L1 jest przenoszonych na płytki zasilające dsRNA. Wczesne efekty knockdown, takie jak zatrzymanie larw lub śmiertelność, będą obserwowane po tym, jak zwierzęta żywiły się bakteriami wykazującymi ekspresję dsRNA przez 2-3 dni. W zależności od przeprowadzonego badania przesiewowego, pożądane fenotypy można zaobserwować zarówno u zwierząt pierwotnych umieszczonych na karmie (zwierzęta P0), jak i u ich potomstwa (zwierzęta F1). Prezentacja fenotypu będzie zależała od wielu zmiennych, w tym trwałości białka kodowanego przez gen, którego ekspresja jest obniżona, oraz czasu podczas rozwoju, w którym wymagany jest gen będący przedmiotem zainteresowania. Rozpoczęcie hodowli żywiących się dsRNA z zaledwie 20-30 zwierzętami powinno umożliwić obserwację zarówno fenotypów P0, jak i F1, zanim zwierzęta wyczerpią źródło pożywienia.

Aby łatwo przenieść 20-30 zwierząt na płytki karmowe, najpierw określ stężenie zatrzymanych zwierząt L1 w zatrzymanej kulturze L1.

1. Wymieszać kolbę Erlenmeyera zawierającą zatrzymane larwy L1 w celu rozprowadzenia zwierząt.
2. Wyjmij podwielokrotność 10 μl i umieść kroplami na nieziarnistej płytce NGM o średnicy 6 cm w 4-5 kroplach wzdłuż środka płytki, upewniając się, że wszystkie media zostały usunięte z pipety.
3. Za pomocą końcówki pipety rozprowadź kropki zawiesiny ślimakowej, tworząc pojedynczą ciągłą linię cieczy, która rozciąga się na całej średnicy płytki.
4. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego policz wszystkie zwierzęta, zaczynając od jednego końca linii cieczy i kontynuując do drugiego końca, zanim ciecz wchłonie się na płytkę i zwierzęta się rozproszyją. Może to wymagać ciągłego ustawiania ostrości lunety sekcyjnej, aby mieć pewność, że żadne zwierzęta nie zostaną pominięte.
5. Powtórzyć tę czynność dla trzech oddzielnych podwielokrotności po 10 μl i uśrednić te trzy liczby, aby określić średnią liczbę robaków na μl zawiesiny robaków i zapisać tę liczbę bezpośrednio w kolbie Erlenmeyera.

7. Rozpocznij ekran karmienia

Przegląd: Aby rozpocząć badanie przesiewowe dsRNA, 20-30 zatrzymanych larw L1 dodaje się do każdej studzienki 12-dołkowych płytek żywieniowych zawierających cienki trawnik bakterii wykazujących ekspresję dsRNA. Płytki do karmienia zawierają standardowe pożywki wzrostowe nicieni (NGM) i są uzupełnione 500 μg/ml karbenicyliny (w celu zapobieżenia utracie plazmidu) i 1 mM IPTG (w celu indukcji ekspresji dsRNA). Zwierzętom pozwala się żywić i rozwijać przez kilka dni w temperaturze 20 °C. Dwa typowe schematy żywienia zwierząt to 3 dni w przypadku wykonywania badania przesiewowego P0 i 6-7 dni w przypadku wykonywania badania przesiewowego F1. Czas karmienia może być jednak zróżnicowany w zależności od konkretnych fenotypów poszukiwanych na ekranie.

1. Za pomocą zawiesiny zatrzymanych larw L1 i sterylnej wody należy przygotować roztwór zawierający 2 000 robaków/ml. Każda 12-dołkowa płytka do karmienia będzie wymagała 120 μl tej zawiesiny robaków. Dokładnie wymieszać, aby zapewnić równomierne rozłożenie zwierząt, a następnie przenieść je do sterylnego zbiornika w celu pipetowania.
2. Za pomocą pipety wielokanałowej z końcówkami w co trzeciej pozycji (patrz rysunek 1) przenieś 10 μl roztworu robaka bezpośrednio na trawnik bakteryjny na płytkach podających. Uważaj, aby nie przebić powierzchni agaru, ponieważ robaki zagrzebią się w agarze i nie będą żywić się bakteriami wykazującymi ekspresję dsRNA.
3. Wymieszaj roztwór robaka w zbiorniku (delikatnie go chlupąc) po każdych dwóch rzędach płytek do karmienia, ponieważ robaki szybko się osiadają. Kontynuuj dozowanie zawiesiny ślimakowej, aż na wszystkich płytkach podających pojawią się robaki. Zbadaj kilka studni na wczesnym etapie pod zakresem sekcji, aby upewnić się, że w każdej studni znajduje się 20-30 robaków.
4. Przechowywać płytki w pozycji pionowej w nawilżonym pudełku w inkubatorze o temperaturze 20 °C. Następnego dnia, po wchłonięciu zawiesiny robaków przez płytkę, odwróć płytki i wróć do humidora w temperaturze 20 °C. Zwierzęta na tych płytkach można obserwować po 3 dniach (dla fenotypów P0) i ponownie po 6 dniach (dla fenotypów F1).

Uwaga: Bakterie, które pozostały na karmionce po 7 dniach wzrostu robaka, zostały przetestowane pod kątem utraty plazmidu i prawie 100% zachowały plazmid dsRNA.

Wyniki

fenotypy knockdown P0 zaczną pojawiać się po 2-3 dniach karmienia zwierząt bakteriami eksprymującymi dsRNA. Niektóre wczesne fenotypy obejmują zatrzymanie larw i śmiertelność i powinny być obserwowane w 2-3% wszystkich studni żywieniowych. Te same fenotypy będą również obserwowane u zwierząt z pokolenia F1. Obecność jaj F1, które się nie wykluwają, jest kolejnym powszechnym fenotypem F1, a razem te trzy fenotypy będą obserwowane w prawie 10% wszystkich studzienek w badaniach przesiewowych F1.

...

Dyskusja

Opisaliśmy protokół, który wykorzystuje dostępną na rynku bibliotekę karmienia dsRNA do wykonywania badań przesiewowych na dużą skalę u C. elegans. Udostępniamy wszystkie instrukcje, jak zduplikować bibliotekę i efektywnie z niej korzystać. Pokazujemy, że takie podejście jest w stanie zidentyfikować geny zaangażowane w różne procesy biologiczne w różnych tkankach zwierzęcia. Podczas gdy fenotypy, które tutaj opisujemy, są łatwe do zaobserwowania (Unc, Egl i Dpy), protokół ten można dostosować do poszukiwania gen...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynnik/Materiał
96-well Falcon flat bottom plate	Fisher Scientific	353072	sterylna
folia samoprzylepna	USA Scientific	2923-0100
Płytka dookólna Nunc	Fisher Scientific	267060
2,0 ml głęboki 96-dołkowy polipropylen Masterblock	USA Scientific	5678-0285	autoklawowalne
pokrywki do płytek głębokich	USA Scientific	5665-6101
50 ml combitips	USA Scientific	4796-5000	pakowane pojedynczo
Reservoir	USA Scientific	2977-8500	autoklawowalne
płytki 12-dołkowe	USA Scientific	CC7682-7512	indywidualnie pakowana
biblioteka karmienia dsRNA	OpenBiosystems	RCE1181	sklepie -80 ° C
Ampicylina	Fisher Scientific	BP1760-5
Tetracyklina	Fisher Scientific	BP912-100
Karbenicylina			Dostawa trwa 2-4 tygodnie www.biochemicaldirect.com
Agar bakteriolgiczny Ultraczysty stopień A	Affymetrix	10906	dla płyt ślimakowych
Equipment
Brayer roller	USA Scientific	9127-2940
B– kel 96-pinowy replikator	Fisher Scientific	05-450-9	autoklawowalny
mikroshaker	Thomas Scientific	1231A93	mm orbita
12-kanałowa pipeta wielokanałowa (0,5-10 μ l)	USA Scientific	7112-0510
12-kanałowa pipeta wielokanałowa (30-300 μ l)	Pipeta ręczna USA Scientific	7112-3300
Repeater Plus	USA Scientific	4026-0201