Wizualizacja wpływu pozytywnego wczesnego doświadczenia, stymulacji dotykowej, na morfologię dendrytyczną i łączność synaptyczną za pomocą barwienia Golgiego-Coxa

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje procedury stymulacji dotykowej szczeniąt szczurów i późniejszego barwienia morfologii neuronów metodą Golgiego-Coxa. Stymulacja dotykowa to pozytywne doświadczenie, które podaje się w okresie okołoporodowym poprzez głaskanie szczeniąt domowym miotełkiem do kurzu. Barwienie metodą Golgiego-Coxa jest niezawodną procedurą pozwalającą na wizualizację całych neuronów.

Streszczenie

Aby generować długoterminowe zmiany w zachowaniu, doświadczenia muszą powodować stabilne zmiany w morfologii neuronów i łączności synaptycznej. Stymulacja dotykowa to pozytywne wczesne doświadczenie, które naśladuje lizanie i pielęgnację matki u szczura. Wystawienie szczeniąt szczurów na to pozytywne doświadczenie można łatwo i tanio przeprowadzić przy użyciu łatwo dostępnych materiałów, takich jak domowy odkurzacz. W przypadku miotu krzyżowego młode są głaskane lub pozostawiane w spokoju przez 15 minut, trzy razy dziennie przez cały okres okołoporodowy. Aby zmierzyć zmiany neuroplastyczne związane z tym pozytywnym wczesnym doświadczeniem, stosuje się barwienie tkanki mózgowej metodą Golgiego-Coxa. Ze względu na fakt, że impregnacja Golgiego-Coxa barwi dyskretną liczbę neuronów, a nie wszystkie komórki, barwienie mózgu gryzonia roztworem Golgiego-Coxa pozwala na wizualizację całych elementów neuronalnych, w tym ciała komórki, dendrytów, aksonów i kolców dendrytycznych. Procedura barwienia trwa kilka dni i wymaga od badacza zwrócenia szczególnej uwagi na szczegóły. Jednak po zakończeniu barwienia cały mózg został zaimpregnowany i może być zachowany w nieskończoność do ciągłej analizy. Dlatego barwienie Golgiego-Coxa jest cennym źródłem do badania plastyczności zależnej od doświadczenia.

Wprowadzenie

Chociaż istnieje wiele zgłoszonych i wykorzystanych technik do badania negatywnych wczesnych doświadczeń związanych z dojrzewaniem mózgu, takich jak stres okołoporodowy ^1,2, deprywacja sensoryczna ³ i toksyczność narkotyków ⁴, istnieje bardzo niewiele metodologii stosowanych do badania efektów pozytywnych doświadczeń w tym okresie. Oprócz wzbogacenia środowiska, stymulacja dotykowa jest jedną z niewielu terapii wzmacniających mózg, której efekty zostały udowodnione ⁵. Stymulacja dotykowa to metoda stymulacji sensorycznej skóry, która naśladuje zachowanie szczura, lizanie i pielęgnację. Jego powszechna akceptacja jako pozytywna manipulacja wynika z badań wskazujących, że stymulacja dotykowa poprawia dojrzewanie wcześniaków i nowonarodzonych szczurów ⁶. Ponadto badania w laboratorium Meaney ⁷ wykazały, że wyższy poziom lizania i pielęgnacji przez matkę wiąże się z pozytywnymi wynikami u potomstwa. Dzięki tym pozytywnym wpływom stymulacja dotykowa szybko przekształciła się w strategię leczniczą mającą na celu zmniejszenie lęku ⁸, poprawę wyników związanych z uszkodzeniem mózgu ^9-11 i złagodzenie uczulenia na leki ¹². W związku z tym stymulacja dotykowa jest cenną techniką promowania pozytywnych wczesnych doświadczeń, z udowodnioną zdolnością do radykalnej reorganizacji morfologii neuronów i połączeń synaptycznych rozwijającego się mózgu.

Aby zbadać i określić ilościowo zmiany w morfologii neuronów, konieczne jest wizualizację nienaruszonych neuronów. Procedura barwienia Golgiego-Coxa jest modyfikacją techniki Camillo Golgiego opublikowanej pod koniec XIX wieku, która zapewnia dyskretne barwienie niewielkiej liczby kompletnych ^neuronów. Chociaż procedura wydaje się barwić neurony losowo, a odtwarzalność jest powszechnie wymieniana jako główna wada, mały wskaźnik zapłodnienia pozwala na wizualizację całego elementu neuronalnego, w tym ciał komórkowych, dendrytów, kolców dendrytycznych i aksonów. Podobnie, czas potrzebny do zapłodnienia danego mózgu roztworem Golgiego był również wymieniany jako upadek. Biorąc jednak pod uwagę, że po całkowitym barwieniu tkanka może być przechowywana w nieskończoność, a czas między perfuzją mózgu a wizualizacją neuronów za pomocą mikroskopu może trwać mniej niż 21 dni, okres ten nie jest nierozsądny. Ponadto, przy niewielkich modyfikacjach protokołu, barwienie Golgiego-Coxa może być skutecznie stosowane do impregnacji mózgów gryzoni ze wszystkich grup wiekowych. Ponieważ zmiany na poziomie strukturalnym zostały powiązane z trwałymi modyfikacjami funkcjonowania behawioralnego i psychologicznego, technika barwienia Golgiego-Coxa dostarcza naukowcom cennego narzędzia do pomiaru neuroplastyczności.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Kanadyjską Radą Opieki nad Zwierzętami i zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Lethbridge.

1. Hodowla i stymulacja dotykowa

1. Zamów ciężarne szczury od zwykłych dostawców zwierząt lub hoduj młode we własnym zakresie, korzystając ze standardowych procedur hodowli laboratoryjnej.
2. Trzymanie wszystkich zwierząt w pomieszczeniu hodowlanym o kontrolowanej temperaturze (21 °C), utrzymywanym w cyklu światła i ciemności o godzinie 12:12 i zapewniającym dostęp do pożywienia i wody ad libitum.
3. Kiedy rodzą się młode, trzymaj samice szczurów indywidualnie z ich potomstwem.
4. Aby uniknąć dodatkowego stresu związanego z obchodzeniem się z młodymi bezpośrednio po urodzeniu, rozpocznij stymulację dotykową szczeniąt w punkcie P3.
5. Stymulacja dotykowa powinna być przeprowadzana trzy razy dziennie (9:00, 13:00 i 16:00) od P3-P21, a młode powinny być odsadzone od matek w P21.
6. W przypadku stosowania miotu krzyżowego, połowa szczeniąt z każdego miotu będzie poddawana stymulacji dotykowej, a druga połowa będzie służyć jako kontrola. Losowo przypisz równą liczbę szczeniąt płci męskiej i żeńskiej do każdej grupy. Aby odróżnić młode poddawane stymulacji dotykowej i kontrolom, oznacz jedną grupę szczeniąt trwałym znacznikiem na ich tylnych nogach i ogonie. Oznakowanie należy ponownie nakładać co drugi dzień.

Stymulacja dotykowa

7. Usuń tamy z ich domowej klatki i umieść je w tymczasowej klatce z jedzeniem i wodą. Trzymaj matkę i tymczasową klatkę w pomieszczeniu hodowlanym/inwentarskim.
8. Zważ młode szczurów w grupie przed poranną sesją stymulacji dotykowej (9:00). Podczas każdej sesji młode szczurów są umieszczane w ich domowych klatkach do oddzielnego pomieszczenia testowego w celu stymulacji dotykowej. Umieść klatkę domową na poduszce grzewczej ustawionej na 24 °C.
9. Użyj sztywnej deski, aby podzielić klatkę domową na dwie połowy. Umieść młode szczurów w grupie stymulacji dotykowej w jednej połowie, a szczenięta kontrolne w drugiej połowie. Ustaw minutnik na 15 minut.
10. Używając miękkiego miotełka do kurzu przypominającego pióro, szczotkuj wszystkie szczenięta w grupie stymulacji dotykowej w tym samym czasie przez 15 kolejnych minut. Młode szczenięta szczurów (~P3-P12) zwykle tulą się do siebie i wydają się wchodzić w cykl głębokiego snu, co bardzo ułatwia stymulację wszystkich szczeniąt jednocześnie. Wraz z wiekiem szczenięta stają się bardziej aktywne, a niektóre szczenięta chodzą i badają podczas sesji. Eksperymentator powinien stale przenosić wędrujące młode do grupy, aby upewnić się, że każde szczenię otrzymuje równą stymulację.
11. Po zakończeniu 15-minutowej sesji przetransportuj młode z powrotem do pomieszczenia hodowlanego i wróć matkę do klatki.
12. Powtarzaj ten proces trzy razy dziennie przez 19 dni stymulacji dotykowej. Po ostatniej sesji stymulacji dotykowej w P21 młode powinny zostać odstawione od matki. Młode powinny być następnie trzymane w klatkach z 5 lub 6 innymi odsadzonymi od matki zwierzętami tej samej płci.
13. Jeśli szczury nie są poddawane dodatkowym badaniom, należy je pozostawić w spokoju, w normalnym cyklu światło-ciemność z dostępem do jedzenia i wody ad libitm (poza regularnym czyszczeniem i obsługą klatek), aż osiągną wiek około 100 dni. W przypadku poddawania je innym manipulacjom doświadczalnym zwierzęta powinny być poddawane leczeniu lub badane zgodnie z tymi protokołami laboratoryjnymi.

2. Ofiara i barwienie Golgiego-Coxa

1. W wieku około 100 lat należy podać szczurom przedawkowanie pentobarbitalu sodu we wstrzyknięciu dożylnym i wykonać perfuzję dosercową z około 100 ml 0,9% soli fizjologicznej.
2. Wyodrębnij mózgi po zakończeniu perfuzji. Usuń mózg z czaszki, przecinając nerw wzrokowy pod spodem, starając się utrzymać móżdżek w stanie nienaruszonym; Badacze mogą zdecydować o zachowaniu lub usunięciu opuszki węchowej. Umieść wyekstrahowane mózgi w nieprzezroczystej butelce Nalgene z 20 ml roztworu Golgiego-Coxa ¹⁴.
3. Trzymaj mózgi w roztworze Golgiego-Coxa przez 14 dni. Po 14 dniach zastąp roztwór Golgiego-Coxa 30% roztworem sacharozy. Trzymaj mózgi w roztworze sacharozy przez 2-5 dni przed sekcją.

Uwaga: Jeśli mózgi nie mogą zostać podzielone na sekcje w ciągu 14 dni od przeniesienia do roztworu sacharozy, badacz musi zastąpić sacharozę nowym zapasem 30% sacharozy. Badacz może wymieniać sacharozę co dwa tygodnie przez 4 miesiące bez negatywnego wpływu na barwienie.

4. W celu przecięcia mózgu, mózg powinien zostać osuszony i przymocowany do etapu cięcia za pomocą kleju cyjanokrylowego. Aby zapobiec rozdarciu lub nierównemu podziałowi, badacz musi zachować ostrożność i upewnić się, że cały mózg jest mocno przymocowany do sceny.
5. Zbiornik wibratomu musi być wypełniony 6% roztworem sacharozy do poziomu zakrywającego ostrze sekcyjne. Ustaw parametry wibratomu na prędkość i amplitudę na 5 (punkt środkowy na obu skalach). Pokrój mózg na sekcje o wielkości 200 μm i umieść je na 2% zżelowanym szkiełku mikroskopowym. Upewnij się, że sekcje są mokre w trakcie cięcia.
6. Po zebraniu wszystkich interesujących Cię sekcji, dociśnij je do szkiełek, dociskając je zwilżonym bibulous paperem. Przechowuj szkiełka w stojaku na szkiełka w komorze wilgotnościowej, aż będą gotowe do barwienia. Powinny pozostawać w komorze wilgotnościowej przez co najmniej 12 godzin, ale nie dłużej niż 4 dni. Szkiełka muszą być wilgotne i nie powinny dopuszczać do wyschnięcia.
7. Przygotuj pułk barwienia przed rozpoczęciem procesu barwienia. Oznacz dwanaście szklanych naczyń do barwienia (10,7 x 8,5 x 6,8 cm) i przetwórz w następujący sposób:
   1. Woda destylowana - 1 min
   2. Wodorotlenek amonu - 30 min (w ciemności)
   3. Woda destylowana - 1 min
   4. Kodak Fix for Film - 30 min (w ciemności)
   5. Woda destylowana - 1 min
   6. 50% alkoholu - 1 min
   7. 70% alkoholu - 1 min
   8. 95% alkoholu - 1 min
   9. 100% alkoholu - 5 min
   10. 100% alkoholu - 5 min
   11. Roztwór (1/3 chloroformu, 1/3 hemody, 1/3 100% alkoholu) - 15 min
   12. HemoDe - 15 min

* Ksylen może być użyty zamiast HemoDe. Aby zapewnić stałą jakość barwienia, do każdego przetwarzanego stojaka na szkiełka należy stosować świeże roztwory.

8. Po ostatnich 15 minutach emersji w HemoDe, nakryj szkiełka za pomocą Permount.
9. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przed badaniem pod mikroskopem.

Wyniki

Gdy ta procedura barwienia zostanie odpowiednio przeprowadzona, generowane jest spójne i jednolite barwienie dendrytów i kolców. Na rycinie 1 przedstawiono barwienie neuronów metodą Golgiego-Coxa. Procedura ta pozwala na barwienie, które jest porównywalne z nowo opracowanymi metodami in vitro i może pozwolić na wizualizację pól dendrytycznych, które są nieprzerywane po osadzeniu tkanki. Stwierdzono, że technika barwienia Golgiego-Coxa oparta na wibratomie powoduje bardziej rozległe barwienie końcowych gałęzi i neuronów piramidalnych niż barwienie tkanką zatopioną w celulidynie i przeciętą kriostatem^. Ponadto, ponieważ ta metoda barwienia zapładnia cały mózg, wszystkie sekcje mogą być analizowane albo natychmiast, albo w przyszłości. Ponieważ lokalizacja zmiany morfologicznej nie zawsze jest oczywista podczas generowania oryginalnej hipotezy, proces ten pozwala na eksplorację dodatkowych obszarów mózgu i zapobiega usuwaniu tkanek, które mogą być przydatne w przyszłości.

Ta metoda barwienia może być użyta do niezawodnego barwienia dowolnych starych mózgów szczurów (P0-starość). Jednak podczas barwienia młodych mózgów (<1 gram) mózg powinien pozostać w roztworze Golgiego-Coxa tylko przez 6 dni, a nie 14 dni zalecanych dla mózgów dorosłych; Wszystkie inne procedury są utrzymywane na stałym poziomie. Główną trudnością, którą można napotkać podczas tego procesu barwienia Golgiego-Coxa, jest niemożność uzyskania wysokiej jakości barwienia centralnych obszarów mózgu, w tym wzgórza. Ponieważ cały mózg jest impregnowany w tym samym czasie, centralne obszary mogą nie otrzymać idealnych stężeń barwnika. Pomimo tego odkrycia, technika Golgiego-Coxa daje wyjątkowe barwienie obszarów podkorowych, takich jak hipokamp i prążkowie. Ostatnim ograniczeniem procedury jest niepełne usunięcie krwi z mózgu podczas procesu perfuzji. Krew może wytwarzać artefakty w tkance mózgowej, które utrudniają fotografowanie i śledzenie neuronów.

Techniki barwienia Golgiego-Coxa dostarczają wiarygodnego pomiaru morfologii dendrytycznej i neuroanatomii, który jest przydatny w szerokim zakresie badań mających na celu zbadanie zmian na poziomie neuronalnym. Podczas badania struktury neuronalnej w korze przedczołowej po stymulacji dotykowej we wczesnym okresie poporodowym, barwienie Golgiego-Coxa wykazało dramatyczny wzrost złożoności dendrytycznej. Zmiany anatomiczne związane z wczesną stymulacją dotykową można wykazać wizualnie, porównując gęstość kręgosłupa neuronów piramidowych u szczura kontrolnego z neuronami piramidowymi u szczura, który został poddany stymulacji dotykowej (patrz ryc. 1). Ponadto parametry, takie jak arboryzacja dendrytyczna, długość dendrytyczna i gęstość kręgosłupa, mogą być obliczane i analizowane statystycznie w celu generowania ciągłych danych, które można porównywać między zwierzętami. Aby uzyskać wiarygodne wyniki, analizę należy przeprowadzić na co najmniej trzech zwierzętach na grupę badaną i losowo wybrać około pięciu neuronów na półkulę dla każdego analizowanego regionu mózgu. Rysunek 2 przedstawia złożoność dendrytyczną (kolce/μm x μm dendrytu) zwierząt, które otrzymały stymulację dotykową, i zwierząt, które jej nie otrzymały. Zarówno w polu wierzchołkowym, jak i podstawnym neuronów analizowanych z mPFC (Cg3) stymulacja dotykowa powodowała proliferację parametrów neuronalnych.

Rysunek 1. A. Reprezentatywne zdjęcie neuronu piramidowego barwionego metodą Golgiego-Coxa z warstwy III obszaru Cg3 u szczura, który otrzymał stymulację dotykową podczas rozwoju. Ur. Reprezentatywna powiększona (1000X) fotografia kolców dendrytycznych na końcowych dendrytach w polu podstawnym Cg3; Jaśniejszy obraz po lewej stronie dotyczy szczura w grupie kontrolnej, a ciemniejszy obraz po prawej stronie pochodzi od szczura, który otrzymał stymulację dotykową.

Rysunek 2. Ilustracyjne przedstawienie średniej złożoności dendrytycznej wierzchołkowej i podstawnej (kolce/μm x μm) dla neuronów w obszarze Cg3 od dorosłych szczurów, które albo otrzymały stymulację dotykową podczas rozwoju, albo nie otrzymały (*p <0,01).

Dyskusja

Ze względu na jawną plastyczność rozwijającego się mózgu, ważne jest, aby procedury eksperymentalne obejmujące wczesne doświadczenia były dokładnie analizowane i podejmowane były próby kontrolowania wszystkich zmiennych pośrednich. Z tego powodu podczas procedury stymulacji dotykowej stosuje się projekt miotu krzyżowego, aby zapewnić, że młode otrzymują podobne doświadczenia we wszystkich innych dziedzinach rozwoju. Ponadto ważne jest również, aby do analizy wybierano wiele młodych z wielu miotów, aby uniknąć możliwości, że skutki wynikają z odchylenia w jednym szczenię lub miocie.

Uważa się, że stymulacja dotykowa naśladuje naturalnie występujące zachowanie matki, lizanie i pielęgnację, co uważa się za korzystne dla rozwoju potomstwa. Chociaż wcześniejsze badania podkreślały, że pierwszy tydzień życia (P0-P7) jest krytycznym okresem dla lizania i pielęgnacji ¹⁶, sama skala zmian zidentyfikowanych po 18 dniach stymulacji dotykowej może sugerować, że chociaż istnieją wrażliwe czasy, lepsza jest dłuższa ekspozycja. Ważne jest również, aby pamiętać, że szczenięta otrzymujące stymulację dotykową w tym eksperymentalnym paradygmacie doświadczają również lizania i pielęgnacji przez matki, stąd stymulacja dotykowa jest dodatkiem do normalnej stymulacji podawanej przez matkę. Wreszcie, trzeba być również świadomym zmian zależnych od regionu. Chociaż stymulacja dotykowa podczas rozwoju zwiększyła złożoność dendrytyczną w korze przedczołowej, nie gwarantuje to, że zmiany strukturalne tego rodzaju będą widoczne we wszystkich obszarach mózgu. Możliwe, że morfologia neuronów w innych obszarach mózgu, takich jak kora ciemieniowa, zareagowałaby w uderzająco różny sposób na to samo doświadczenie. Ponieważ jednak procedura stymulacji dotykowej jest łatwa do przeprowadzenia i nie stanowi zagrożenia dla potomstwa ani matek, może ona służyć jako cenne narzędzie w wielu badaniach naukowych mających na celu poprawę wyników rozwojowych.

Jeśli chodzi o barwienie tkanki mózgowej metodą Golgiego-Coxa, kluczowe etapy pomyślnej wizualizacji komórek nerwowych są następujące: 1) musi nastąpić odpowiednia perfuzja mózgu roztworem soli fizjologicznej. Niewłaściwa lub niewystarczająca perfuzja tkanki mózgowej powoduje artefakty naczyń krwionośnych, które utrudniają wizualizację komórek neuronalnych w labiryncie naczyń krwionośnych, jednocześnie komplikując możliwość fotografowania zabarwionych neuronów. 2) Perfundowane mózgi powinny być przechowywane w roztworze Golgiego-Coxa i roztworze sacharozy w ciemności. Przechowywanie tkanki mózgowej w ciemności zmniejsza zabarwienie tła tkanki, ponownie zwiększając szansę na udaną wizualizację wysokiej jakości komórek neuronalnych. 3) Tkanka mózgowa jest przechowywana w roztworze sacharozy po 14-dniowym przechowywaniu w roztworze Golgiego-Coxa. Gdy tkanka jest zanurzona w 30% roztworze sacharozy na 2-5 dni, mózgi są bardziej giętkie, co zapobiega pękaniu i rozrywaniu skrawków podczas cięcia. Ważne jest, aby zapobiec pozostawaniu tkanki mózgowej w roztworze sacharozy przez dłuższy czas (chyba że roztwór sacharozy jest stale zastępowany świeżym roztworem), ponieważ długotrwałe przechowywanie w sacharozie obniża jakość barwienia. 4) Na koniec, po zabarwieniu szkiełek i wsunięciu okładki, należy dać im odpowiedni czas na wyschnięcie przed wizualizacją pod mikroskopem. Jeśli szkiełka nie mogą odpowiednio wyschnąć na powietrzu, tkanka może ciemnieć, co utrudnia udaną wizualizację neuronów korowych.

Uważa się, że stabilne zmiany w funkcjonowaniu psychologicznym i reakcjach behawioralnych, które zachodzą w odpowiedzi na doświadczenia, są ułatwione przez reorganizację morfologii neuronów i połączeń synaptycznych ¹⁷. Ponieważ te zmiany strukturalne stanowią mierzalne źródło plastyczności zależnej od doświadczenia, ważne jest zastosowanie niezawodnej procedury barwienia. Ta procedura barwienia Golgiego-Coxa oparta na wibratomie zapewnia niezawodne barwienie drobnych gałęzi i kolców dendrytycznych, które mogą nie być widoczne w przypadku innych protokołów, takich jak osadzanie celoidyny. Wyjątkowość procedury Golgiego-Coxa wynika z jej zdolności do barwienia jedynie niewielkiej części elementów neuronalnych (1-10%), co pozwala na śledzenie pojedynczych neuronów na duże odległości. Pomimo faktu, że tylko niewielka część neuronów jest impregnowana barwnikiem, komórki, które stają się widoczne, zachowują wszystkie cechy, w tym ciało komórki, dendryty, kolce dendrytyczne i aksony. Co więcej, gdy procedura barwienia jest przeprowadzona prawidłowo, wybarwione komórki wyraźnie i wyraźnie wyróżniają się na przezroczystym tle, ponieważ inne struktury korowe pozostają niezabarwione i przezroczyste. Ze względu na uświadomienie sobie, że trwałe zmiany w funkcjonowaniu zewnętrznym muszą być związane z plastycznością układu nerwowego, tj . zdolnością neuronów do modyfikowania swojej struktury i łączności, procedura barwienia Golgiego-Coxa zapewnia naukowcom wiarygodną technikę wizualizacji i ilościowego określenia tej plastyczności.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dwuchromian potasu	Fisher	P188
Chlorek rtęci	Fisher	M1561
Chromian potasu	Fisher	P220
Wodorotlenek amonu	Fisher	A669-500
Kodak Rapid Fix	Vistek	Kodak 146 4016
EtOH-95 & Bezwodne	alkohole komercyjne	Brak numerów kotów	Wszystkie inne Et-OH są rozcieńczeniami
Swiffers- Soft Feather-Like Dusters	Safeway		Można znaleźć w większości sklepów spożywczych
Sacharoza	Sigma-Aldrich	S-9378
HemoDe	Mikroskopia elektronowa Sciences	23410
Szkiełka Permount	Fisher	Sp15
	VWR	160004-365
Szkiełka nakrywkowe	VWR	062011-9