Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Szybka mikrojonoforeza glutaminianu i GABA: przydatne narzędzie do badania integracji synaptycznej

19.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50701

⸱

31 lipca 2013

 , 
1NRW Research Group 'Dendritic integration in the CNS', Department of Epileptology, University of Bonn, 2Neuronal Networks Group, Deutsches Zentrum für Neurodegenerative Erkrankungen e.V. (DZNE)

W tym artykule

Podsumowanie

W tym artykule przedstawiamy szybką mikrojonoforezę neuroprzekaźników jako technikę badania integracji sygnałów postsynaptycznych z dużą precyzją przestrzenną i czasową.

Streszczenie

Jednym z podstawowych zainteresowań neuronauki jest zrozumienie integracji bodźców pobudzających i hamujących wzdłuż bardzo złożonej struktury drzewa dendrytycznego, co ostatecznie prowadzi do neuronalnej produkcji potencjałów czynnościowych w aksonie. Wpływ różnych parametrów przestrzennych i czasowych określonych wejść synaptycznych na wyjście neuronów jest obecnie badany, np. tłumienie wejściowe dendrytyczne zależne od odległości, zależna od lokalizacji interakcja przestrzennie segregowanych wejść, wpływ hamowania GABAergig na integrację pobudzającą, tryby integracji liniowej i nieliniowej i wiele innych.

Dzięki szybkiej mikrojonoforezie glutaminianu i GABA możliwe jest dokładne zbadanie przestrzennej i czasowej integracji pobudzenia glutaminergicznego i hamowania GABA-ergicznego. Krytyczne wymagania techniczne to albo wyzwalana lampa fluorescencyjna, dioda elektroluminescencyjna (LED), albo dwufotonowy mikroskop skaningowy do wizualizacji gałęzi dendrytycznych bez wprowadzania znacznych fotouszkodzeń tkanki. Ponadto bardzo ważne jest posiadanie wzmacniacza mikrojonoforezy, który pozwala na szybką kompensację pojemności pipet o wysokiej rezystancji. Kolejną istotną kwestią jest to, że żaden nadajnik nie jest mimowolnie uwalniany przez pipetę podczas eksperymentu.

Po ustaleniu, ta technika da wiarygodne i powtarzalne sygnały o wysokiej neuroprzekaźniku i specyficzności lokalizacji. W porównaniu do uncage'owania glutaminianu i GABA, szybka jonoforeza pozwala na korzystanie z obu nadajników w tym samym czasie, ale w bardzo odległych miejscach bez ograniczeń co do pola widzenia. Istnieją również zalety w porównaniu z ogniskową stymulacją elektryczną aksonów: w przypadku mikrojonoforezy lokalizacja miejsca wejściowego jest zdecydowanie znana i jest pewne, że uwalniany jest tylko interesujący nas neuroprzekaźnik. Należy jednak wziąć pod uwagę, że w przypadku mikrojonoforezy aktywowana jest tylko postsynapsa, a presynaptyczne aspekty uwalniania neuroprzekaźników nie są rozwiązane. W tym artykule pokazujemy, jak skonfigurować mikrojonoforezę w eksperymentach z wycinkami mózgu.

Wprowadzenie

Neurony w ośrodkowym układzie nerwowym otrzymują różne sygnały synaptyczne dotyczące ich cienkich i rozgałęzionych procesów dendrytycznych1. Tam większość pobudzających wejść dendrytycznych jest pośredniczona przez synapsy glutaminergiczne. Synapsy te mogą być aktywowane w sposób rozproszony przestrzennie, co skutkuje postsynaptyczną liniową integracją pobudzających potencjałów postsynaptycznych (EPSP). Jeśli synapsy są aktywowane jednocześnie i w przestrzennej bliskości dendrytu, te bodźce pobudzające mogą być zintegrowane supraliniowo i generować kolce dendrytyczne2-5.

Ponadto, integracja bodźców pobudzających zależy od lokalizacji wejścia na drzewie dendrytycznym. Sygnały, które docierają do dystalnego obszaru kępek, są znacznie bardziej tłumione niż wejścia proksymalne ze względu na filtrowanie6. W hipokampie odległe dane wejściowe do dendrytów wierzchołkowych kępek są generowane przez inny region mózgu niż te na dendrytach proksymalnych7. Ekscytującym pytaniem jest zatem, w jaki sposób dane wejściowe synaptyczne są przetwarzane przez różne przedziały dendrytyczne i czy integracja dendrytyczna reguluje wpływ tych warstwowych danych wejściowych na odpalanie neuronów na różne sposoby.

Nie tylko właściwości funkcjonalne, cechy morfologiczne dendrytu, lokalizacja i grupowanie wejść wpływają na dendrytyczną integrację wejść pobudzających, również dodatkowe wejścia hamujące z końcówek GABA-ergicznych decydują o skuteczności synaps glutaminergicznych8,9. Te różne aspekty integracji synaptycznej mogą być idealnie zbadane za pomocą mikrojonoforezy neuroprzekaźników, która umożliwia przestrzennie zdefiniowane zastosowanie różnych neuroprzekaźników w domenach dendrytycznych. Pokazujemy tutaj, jak skutecznie ustalić mikrojonoforezę glutaminianu i GABA w celu zbadania integracji sygnału w neuronach.

Do tego zastosowania używane są pipety o wysokiej rezystancji z cienką końcówką, wypełnione stężonymi roztworami neuroprzekaźników. Pipety te są umieszczone blisko zewnętrznej błony komórki, gdzie znajdują się receptory neuroprzekaźników. Wymagana jest dobra wizualizacja gałęzi dendrytycznych. Najlepiej osiągnąć to za pomocą barwników fluorescencyjnych, które wprowadza się za pomocą pipety krostowej. Następnie bardzo krótki (<1 ms) impuls prądowy (w zakresie 10 - 100 nA) jest wykorzystywany do wyrzucenia naładowanych cząsteczek neuroprzekaźnika. Dzięki tym krótkim impulsom i efektywnej kompensacji pojemności, potencjały lub prądy postsynaptyczne mogą być wywoływane z dużą precyzją czasową i przestrzenną, co oznacza, że lokalizacja wejścia pobudzającego jest dokładnie znana. Mikrojonoforeza glutaminianu może aktywować synapsy w określonym promieniu, który jest mniejszy niż 6 μm, jak pokazano tutaj (ryc. 19), ale możliwe jest również osiągnięcie rozdzielczościpojedynczej synapsy 10-12.

Heine, M., i inni wykazali, że rozdzielczość przestrzenna szybkiej mikrojonoforezy może być nawet dostosowana do rozmiarów plamek poniżej 0,5 μm, co jest mniejsze niż rozmiary plamek osiągane regularnie przy dwufotonowym rozszczepianiu glutaminianu13. Dzięki szybkiej mikrojonoforezie można łatwo użyć dwóch lub więcej pipet jonoforowych i umieścić je w różnych, nawet odległych miejscach na drzewie dendrytycznym. W ten sposób można badać integrację zdarzeń pobudzających, w tym tych z różnych szlaków. Możliwe jest również jednoczesne użycie pipety jonoforetycznej wypełnionej glutaminianem i GABA. W ten sposób można badać wpływ hamowania GABA-ergicznego w różnych miejscach w stosunku do bodźca pobudzającego (hamowanie na ścieżce, poza ścieżką). Również wpływ hamowania przez interneurony ukierunkowane na określone domeny neuronalne, takie jak dendryty dystalne, soma lub aksony14, można zbadać za pomocą jonoforezy GABA. W hodowanych neuronach szybka mikrojonoforeza daje możliwość znacznie bardziej szczegółowego zbadania rozmieszczenia pojedynczych synaps i elementarnych aspektów komunikacji synaptycznej w neuronach10,11.

W tym artykule pokazujemy szczegółowo, jak ustanowić jonoforezę glutaminianu i GABA do stosowania w ostrych wycinkach mózgu, co pozwala na badanie synaptycznej integracji bodźców pobudzających i hamujących w zależności od lokalizacji wejścia, siły wejścia i czasu, samodzielnie lub w interakcji. Wskażemy zalety i ograniczenia tej techniki oraz sposoby skutecznego rozwiązywania problemów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wymagania systemowe

  1. System mikroskopowy: Dobra wizualizacja dendrytu ma kluczowe znaczenie. Jeśli to możliwe, użyj systemu dwufotonowego laserowego mikroskopu skaningowego. W naszych eksperymentach wykorzystaliśmy TRIM Scope II, LaVision Biotec, Bielefeld, Niemcy lub system Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, wyposażony w ultraszybki laser impulsowy Ti:Sapphire (Chameleon Ultra II, Coherent) i obiektyw o wysokim NA (60X, 0,9 NA, Olympus) do wizualizacji dendrytów, które wypełniliśmy barwnikiem fluorescencyjnym za pomocą pipety punktowej. Chociaż uważa się, że fotouszkodzenia są mniej poważne przy użyciu skanowania 2-fotonowego, zmniejsz moc lasera (poniżej 8 mW w tkance) i czas przebywania (poniżej 1 μs) lub tak bardzo, jak to możliwe.
  2. Drugą możliwością jest wyzwolenie fluorescencyjnego źródła światła o szerokim polu widzenia (LED lub lampy fluorescencyjnej) synchronicznie z akwizycją, aby maksymalnie skrócić czas ekspozycji. Zastosowaliśmy monochromator ze zintegrowanym źródłem światła (TILLPhotonics, Gräfelfing, Niemcy) w mikroskopie pionowym Zeiss Axioskop 2 FS, który został wyposażony w kontrastowe oświetlenie podczerwone Dodt (TILLPhotonics, Gräfelfing, Niemcy). W naszych eksperymentach czasy naświetlania wahały się zwykle od 10 ms do maksymalnie 30 ms.
  3. Stosować szybki wzmacniacz mikrojonoforezy, np. dwukanałowy system mikrojonoforezy MVCS-C-02 (npi electronic, Tamm, Niemcy) z szybką kompensacją pojemności. Mikroelektrody jonoforetyczne z cienką końcówką mają rezystancję 25 - 100 MΩ (w zależności od rozmiaru końcówki i kształtu pipety), a szybkie czasy narastania można osiągnąć tylko wtedy, gdy kompensacja pojemności wzmacniacza jonoforetycznego jest optymalnie dostrojona. Ta szybka kompensacja jest niezbędna do dostarczania impulsów prądowych o krótkim i szybkim początku w zakresie submilisekundowym do pipety jonoforetycznej, a tym samym do wyrzucania nadajnika z wysoką rozdzielczością przestrzenną w rozmiarach plamek poniżej 1 μm13. Wzmacniacze jonoforezy są również dostępne w kilku innych firmach, których nie testowaliśmy w naszym laboratorium. O ile nam wiadomo, urządzenia te nie są wyposażone w obwody kompensacji pojemności.

2. Przygotuj rozwiązania

  1. Przygotować sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF) i roztwór wewnętrzny, zgodnie z wymaganiami projektu eksperymentalnego. Jedynym wymaganym dodatkiem do roztworu wewnętrznego jest czerwony lub zielony barwnik fluorescencyjny (np. 50 do 200 μM Alexa Fluor 488 lub 594 hydrazyd, Invitrogen), w zależności od sprzętu optycznego. Oto przykład dlasacharozy ACSF, która może być używana do rozwarstwienia, w mM: 60 NaCl, 100 sacharozy, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 1 CaCl2, 5 MgCl2, 20 glukozy; oraz dla normalnego roztworu ACSF do eksperymentów z patch-clamp w mM: 125 NaCl, 3 KCl, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 2,6 CaCl2, 1,3 MgCl2, 15 glukozy.
  2. Karbogeniczne (95%O2, 5% CO2) wszystkie roztwory zewnątrzkomórkowe stale.
  3. Przygotować roztwór wewnętrzny, na przykład w mM: 140 K-glukonian, 7 KCl, 5 HEPES-kwas, 0,5 MgCl2, 5 Fosfokreatyna, 0,16 EGTA; z 50 - 200 μM Alexa 488.
  4. Do mikrojonoforezy glutaminianu przygotować roztwór ze 150 mM kwasem glutaminowym i dostosować pH do 7,0 za pomocą NaOH. Dodaj 50 -200 μM Alexa Fluor 488 lub 594 hydrazyd (Invitrogen) w celu wizualizacji.
  5. Do jonoforezy GABA przygotować 1 M roztwór GABA i dostosować pH do 5 za pomocą HCl15. Przy tym pH GABA jest naładowany, dopiero wtedy można go stosować za pomocą jonoforezy. Należy pamiętać, że niskie pH w roztworze wyrzucanym do przestrzeni zewnątrzkomórkowej może wpływać na samą transmisję GABA 16,17,
    Chroń roztwór GABA przed światłem i często przygotowuj świeży roztwór podstawowy GABA, ponieważ starszy roztwór może stracić swoją skuteczność.
  6. Jeśli trudno jest dostrzec zdarzenia GABA-ergiczne, wewnętrzne rozwiązanie o wysokiej sile napędowej Cl, na przykład poprzez pominięcie KCl, może pomóc w wizualizacji zdarzeń GABA-ergicznych, aby sprawdzić, czy jonoforeza GABA działa; jednak do zbadania integracji synaptycznej może być zalecana fizjologiczna siła napędowa. W ogólnym wykrywaniu małych zdarzeń GABA-ergicznych pomocny może być protokół pokazany na rycinie 8C.

3. Wyciągnij i przetestuj pipety jonoforetyczne

  1. Ogólnie rzecz biorąc, wyciągnięcie odpowiednich pipet jest być może najważniejszym krokiem do osiągnięcia kontrolowanej jonoforezy neuroprzekaźników. Podczas stosowania jonoforezy w hodowli komórkowej możliwe jest wyciągnięcie bardzo cienkich elektrod podobnych do ostrych mikroelektrod10. Jednak w eksperymentach z zaciskiem krosowym w ostrych plastrach te bardzo cienkie pipety wyginają się na powierzchni plastra, gdy są opuszczane w tkance pod kątem, co uniemożliwia dotarcie do głębszych dendrytów.
  2. Dlatego należy wyciągnąć pipetę z bardzo małą końcówką, aby żaden neuroprzekaźnik nie mógł wycieknąć, ale końcówka musi być nadal wystarczająco sztywna, aby wniknąć w tkankę (ryc. 2). Na przykład użyj 150 GB F 8P pipety klasy (Science Products, Hofheim, Niemcy) i ściągacz poziomy (na przykład DMZ-Universal Puller, Zeitz-Instruments GmbH, Martinsried, Niemcy; lub P-97 Puller, Sutter Instrument Company, Novato, CA) z kilkoma krokami ciągnięcia w celu uzyskania małego otworu, ale także krótkim gwintownikiem o dużym kącie nachylenia (ilustracja 2 i tabela 2).
  3. Możliwe jest również użycie pipet ze szkła kwarcowego do wyciągania pipet jonoforetycznych10. Mają one mieć lepsze właściwości mechaniczne i być bardziej niezawodne; Wymagane są jednak specjalne ściągacze laserowe. Ale możliwe jest również osiągnięcie dobrych wyników za pomocą zwykłych pipet szklanych, które są zwykle używane do wyciągania pipet z plastrami.
  4. Przetestuj wydajność i wytrzymałość pipet w komorze bez chusteczki przed pierwszym użyciem, ponieważ wyciek glutaminianu może uszkodzić tkankę.
  5. Ustaw prawidłowo wzmacniacz jonoforezy. Następnie napełnij pipetę roztworem zawierającym neuroprzekaźnik i barwnik i umieść ją w kąpieli (ACSF).
  6. Skompensuj pojemność (ilustracja 3). Zazwyczaj bardzo ostre pipety będą miały większą pojemność niż.
  7. Sprawdź rezystancję pipety: Zastosowany tutaj wzmacniacz mikrojonoforezy ma wbudowaną funkcję pomiaru oporu pipety. Wywołuje krótkie prostokątne impulsy testowe, które mogą być monitorowane za pomocą standardowego oscyloskopu lub płytki A/D podłączonej do komputera z oprogramowaniem do akwizycji. W zależności od kształtu i rozmiaru końcówki, końcówka powinna mieć rezystancję w zakresie 25 - 90 MΩ.
  8. Skoncentruj się na końcówce za pomocą obiektywu 60X lub 40X zanurzonego w wodzie i przełącz się na obrazowanie fluorescencyjne i, jeśli to możliwe, powiększ obraz. Jeśli barwnik fluorescencyjny wycieka z końcówki pipety, nałóż mały dodatni (w przypadku glutaminianu) lub ujemny (w przypadku GABA), który utrzymuje prąd (<0,02 μA). Jeśli to nie pomoże, aby anulować wyciek, wymień pipetę.
  9. Zastosuj silny prąd krokowy lub użyj ręcznego spustu i monitoruj końcówkę na obrazie fluorescencyjnym, aby sprawdzić, czy roztwór można wyrzucić z pipety. Jak wspomniano powyżej, biegunowość impulsu prądu zależy od ładunku cząsteczki, która ma zostać wyrzucona. Aby wyrzucić glutaminian, jest to prąd ujemny, a dla GABA prąd dodatni (ryc. 4).
  10. Pęcherzyki powietrza w pipecie, które blokują wyrzut barwnika i przetwornika, można usunąć poprzez kilkukrotne przyłożenie wysokiego prądu wyrzutowego.
  11. Podsumowując, jeśli nie ma widocznego wycieku, a wyrzut testowy się powiódł, skompensuj pojemność i rozpocznij eksperyment.
  12. Ostrzeżenie: Ponieważ kompensacja pojemności jest osiągana przez obwód sprzężenia zwrotnego, obwód ten może przeregulować lub oscylować, jeśli jest nadmiernie skompensowany. Delikatnie użyj ustawienia pokrętła do kompensacji pojemności.
  13. W zależności od stabilności ściągacza czasami konieczne jest dostosowanie ustawień ściągacza od czasu do czasu, ponieważ filament mógł zmienić swoje właściwości. Jeśli jednak raz zaprojektuje się dobrą pipetę, można jej używać przez kilka dni. Dlatego po zakończeniu eksperymentu pipetę jonoforetyczną należy przechowywać w zamkniętym pojemniku, nie uszkadzając końcówki.
  14. W następnym eksperymencie napełnij pipetę roztworem neuroprzekaźnika, zastosuj kilka silnych impulsów wyrzutowych, aby oczyścić końcówkę, a następnie sprawdź, czy właściwości (np. opór) uległy znaczącej zmianie. Następnie skompensuj pojemność i ponownie użyj pipety. Nie należy używać jednej pipety z różnymi roztworami neuroprzekaźników.

4. Przygotuj plastry mózgu

  1. Jeśli mikrojonoforeza jest stosowana po raz pierwszy, zdecydowanie przygotuj plastry po ustaleniu niezawodnie działającego programu ściągacza.
  2. Wykonaj zabiegi znieczulenia i dekapitacji zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami obowiązującymi w Twojej instytucji lub władzach lokalnych.
  3. Po usunięciu mózgu przenieś go do lodowatejsacharozy ACSF (patrz Protokół 2.1).
  4. Pokrój interesujący Cię obszar na plastry o odpowiedniej grubości (na przykład 300 μm).
  5. Inkubować plastry wsacharozie ACSF w temperaturze 35 °C przez 30 minut. Następnie przenieś je do zanurzonej komory przetrzymywania zawierającej normalny ACSF w temperaturze pokojowej.
  6. W trakcie przygotowania i eksperymentu należy karbonizować ACSF otaczający plastry 95%O2, 5% CO2 .

5. Ustanów zapis całej komórki

  1. Pipety do jonoforezy należy umieścić już w pobliżu powierzchni plastra przed zaklejeniem komórki, aby uniknąć długotrwałego pozycjonowania po ustawieniu trybu całej komórki.
  2. Wyciągnąć pipetę krosową o niskiej rezystancji (3 - 5 mΩ), napełnić ją wewnętrznym roztworem zawierającym barwnik i przyłożyć nadciśnienie do pipety (30 - 60 mbar).
  3. Wejdź do wanny i podejdź do celi pod nadzorem wizualnym (kontrast w podczerwieni lub kontrast gradientu dwóch fotonów).
  4. Monitoruj rezystancję pipety za pomocą impulsu testowego (np. -10 mV, 20 ms) w trybie cęgów napięciowych. Dotykając tkanki, skoryguj potencjał przesunięcia.
  5. Zbliż się do celi i delikatnie wepchnij do niej końcówkę pipety, aż będzie wyraźnie widoczny "wgłębienie". Natychmiast zwolnić ciśnienie pipety, zastosować podciśnienie 40 - 60 mbar i przełączyć potencjał membrany na -65 mV.
  6. Gdy prąd podtrzymania osiągnie wartości poniżej 100 pA, zwolnij podciśnienie.
  7. Po ustanowieniu giga uszczelnienia (rezystancja >1 GΩ) należy rozerwać membranę przy krótkim, silnym zassaniu do pipety lub krótkiej nadmiernej kompensacji obwodu kompensacji pojemności.
  8. W zależności od tego, który tryb (cęgi napięciowe lub prądowe) jest wymagany do projektu eksperymentalnego, należy odpowiednio skompensować.
  9. Zacznij ustawiać pipetę jonoforetyczną w końcowej pozycji. Jeśli potrzebny jest bardziej szczegółowy opis, jak skutecznie wykonywać nagrania z użyciem zacisków krosowych, dostępnych jest kilka doskonałych wskazówek18,19.

6. Umieść pipetę jonoforetyczną i wygeneruj postsynaptyczny potencjał jonoforetyczny

  1. Ogólnie rzecz biorąc, zdarzenia jonoforetyczne mogą być wywoływane w określonych miejscach w zależności od pożądanego eksperymentu, na przykład na kolczastym dendrycie do mikrojonoforezy glutaminianu, na trzonie dendrytycznym, somie lub segmencie początkowym aksonu w przypadku mikrojonoforezy GABA.
  2. Zbliżyć się do ogniwa na odległość do około 1 μm, nie dotykając go. Po osiągnięciu interesującej nas pozycji ważne jest, aby żaden neuroprzekaźnik nie wyciekał i aby pojemność pipety była prawidłowo skompensowana.
  3. Jeśli zbliżenie się do komórki z pipetą jonoforetyczną wypełnioną glutaminianem powoduje wykrywalną depolaryzację potencjału błonowego, wyreguluj prąd zatrzymania, jeśli to możliwe, lub zmień pipetę.
  4. Stosować krótkie impulsy prądu ujemnego, zaczynając od zera i systematycznie zwiększać prąd (np. 0,1 - 0,4 ms, impulsy 0,01 - 1 μA). Pomaga to dowiedzieć się, w jakim zakresie prąd jonoforetyczny wywołuje pożądane reakcje w określonej konfiguracji eksperymentalnej.
  5. Jeśli nie jest wykrywalna żadna reakcja, podnieś pipetę o kilkaset mikrometrów i zastosuj silny prąd wyrzutowy (>0,1 μA), aby wyczyścić końcówkę. Wyreguluj kompensację pojemności, zbliż się do ogniwa i spróbuj ponownie.
  6. Jeśli nadal nie ma odpowiedzi, zmniejsz prąd podtrzymania. Bądź bardzo ostrożny z ustawieniami pokrętła, ponieważ ta procedura może spowodować niekontrolowane uwalnianie neuroprzekaźników. Dlatego należy stale monitorować nagranie, aby wykryć odpowiednie zmiany potencjału błony.
  7. Jeśli trudno jest wykryć zdarzenia GABA-ergiczne, pomocne może być zastosowanie wewnętrznej kompozycji roztworu dającej wysoką siłę napędową Cl-. W tym celu należy zmniejszyć stężenie Cl- w roztworze pipety (patrz punkt 2.6 protokołu). Spowoduje to większe zdarzenia GABA-ergiczne przy spoczynkowym potencjale błonowym ze względu na większą siłę napędową.
  8. Alternatywnie, wstrzyknąć długie kroki prądu, co skutkuje szansami na potencjał membrany od -100 mV do -48 mV (ilustracja 8C). Dzięki temu protokołowi siła napędowa Cl- jest zwiększana przy hiperspolaryzowanych potencjałach, powodując depolaryzującą odpowiedź GABA.
  9. Możliwe jest również zastosowanie protokołu iniekcji prądu krokowego w celu określenia potencjału odwrócenia wywołanych zdarzeń, co pomaga określić GABA-ergiczny charakter zdarzeń. Wyciek GABA jest trudniejszy do wykrycia niż wyciek glutaminianu. W takim przypadku pomocne może być stałe monitorowanie rezystancji wejściowej, gdy zbliża się do pipety wypełnionej GABA. Jeśli rezystancja wejściowa zmniejszy się, można zwiększyć prąd podtrzymania lub użyć innej pipety.
  10. Jako eksperymenty kontrolne dla jonoforezy glutaminianu sugerujemy eksperyment obrazowania Ca2 + z użyciem 200 μM OGB-1 i braku EGTA w roztworze pipety w celu wizualizacji lokalnego napływu wapnia, który może być spowodowany wyciekiem glutaminianu.
  11. Ogólnie rzecz biorąc, aby uzyskać stabilną reakcję, bardzo ważne jest, aby mieć mechanicznie stabilną pipetę, aby uniknąć dryftu w czasie. Dryft może być spowodowany zmianami temperatury, dlatego zaleca się włączenie sprzętu co najmniej pół godziny przed pomiarami, aby uniknąć dryfu termicznego. Upewnij się, że używasz dobrych uszczelek wkładu w uchwycie pipety, a końcówka jest naprawdę zamocowana. Sam uchwyt można dodatkowo przymocować taśmą teflonową; Ponadto upewnij się, że nie ma naprężeń na od stacji czołowej lub manipulatora, co również jest potencjalnym źródłem dryfu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Prostym podejściem do określenia zasięgu przestrzennego jontoforezy jest stopniowe wycofywanie pipety jontoforetycznej z dendrytu, przy zachowaniu stałego poziomu wyrzucanego glutaminianu. Stwierdziliśmy, że zasięg przestrzenny stymulacji mikro-jontoforetycznej miał średnicę około 12 μm (Rysunek 1 przedstawia promień). Głębokość, na jaką jontoforeza może być zastosowana w tkance, zależy od sztywności pipety. Jednakże pipety jontoforetyczne niezbędne do eksperymentów na skrawkach (Rysunek 2

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj wyjaśniamy, jak zastosować szybką mikrojonoforezę neuroprzekaźników do zbadania integracji synaptycznej na dendrytach. Technika ta została z powodzeniem wykorzystana do zbadania glutaminergicznej i GABA-ergicznej transmisji synaptycznej w różnych regionach mózgu in vitro i in vivo9,20-22. Mikrojonoforeza jest stosowana od ponad 60 lat, ale we wczesnych latach była głównie stosowana do miejscowego stosowania neuroprzekaźników i leków w powolnych lub pośrednich skalach czasowych23

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy Hansowi Reinerowi Polderowi, Martinowi Fuhrmannowi i Walkerowi Jacksonowi za uważne przeczytanie rękopisu. Autorzy otrzymali dofinansowanie, które zostało zapewnione przez Ministerstwo Badań Naukowych MIWF kraju związkowego Nadrenia Północna-Westfalia (SR), BMBF-Projekträger DLR Amerykańsko-niemiecka współpraca w dziedzinie neuronauki obliczeniowej (CRCNS; S.R.), Centra Doskonałości w Chorobach Neurodegeneracyjnych (COEN; S.R.) oraz programu finansowania studiów stacjonarnych Uniwersytetu w Bonn (BONFOR; S.R.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
 Material
Dwufotonowy laserowy mikroskop skaningowy (TRIM Scope II) oraz Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin)LaVision Biotec, Bielefeld, Niemcy 
Dwufotonowy laserowy mikroskop skaningowy Ultima IVPrairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA&nbsp;
Ti:Szafirowy ultraszybki laser impulsowyChameleon Ultra II, koherentny 
Obiektyw 60x, NA 0.9Olympus 
Mikroskop pionowy Zeiss Axioskop 2 FSTILLPhotonika, Grä felfing, Niemcy 
MonochromatorTILLPhotonika, Grä felfing, Niemcy 
System mikrojonoforetyczny MVCS-02NPI Electronics, Tamm, Niemcy 
Ściągacz Sutter P-97Sutter Instrument Company, Novato, CA&nbsp;
Włókna szklane (150 GB F 8P)Science Products, Hofheim, Niemcy 
 Reagent
Alexa Fluor 488 hydrazydowesondy molekularne technologie życiaA-10436 
Sondy molekularneAlexa Fluor 594A-10438 
NaClSigma AldrichS7653 
KClSigma AldrichP9333 
NaH2PO4Sigma AldrichS8282 
NaHCO3Sigma AldrichS6297 
SacharozaSigma AldrichS7903 
CaCl2Sigma AldrichC5080 
MgCl2Sigma AldrichM2670 
GlukozaSigma AldrichG7528 
K-GluconateSigma AldrichG4500 
HEPES-acidSigma AldrichH4034 
FosfokreatynaSigma AldrichP7936 
EGTASigma AldrichE3889 
Kwas glutaminowySigma AldrichG8415 
GABASigma AldrichA5835 
NaOHMerck1.09137.1000 
HClMerck1.09108.1000 
technologie życia

Bibliografia

  1. Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
  2. Gasparini, S., Migliore, M., Magee, J. C. On the initiation and propagation of dendritic spikes in CA1 pyramidal neurons. J. Neurosci. 24, 11046-11056 (2004).
  3. Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50, 291-307 (2006).
  4. Remy, S., Csicsvari, J., Beck, H. Activity-dependent control of neuronal output by local and global dendritic spike attenuation. Neuron. 61, 906-916 (2009).
  5. Stuart, G., Schiller, J., Sakmann, B. Action potential initiation and propagation in rat neocortical pyramidal neurons. J. Physiol. 505 (Pt. 3), 617-632 (1997).
  6. Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nat. Rev. Neurosci. 1, 181-190 (2000).
  7. Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31, 571-591 (1989).
  8. Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16, 815-823 (1996).
  9. Muller, C., Beck, H., Coulter, D., Remy, S. Inhibitory control of linear and supralinear dendritic excitation in CA1 pyramidal neurons. Neuron. 75, 851-864 (2012).
  10. Murnick, J. G., Dube, G., Krupa, B., Liu, G. High-resolution iontophoresis for single-synapse stimulation. J. Neurosci. Methods. 116, 65-75 (2002).
  11. Liu, G., Choi, S., Tsien, R. W. Variability of neurotransmitter concentration and nonsaturation of postsynaptic AMPA receptors at synapses in hippocampal cultures and slices. Neuron. 22, 395-409 (1999).
  12. Renger, J. J., Egles, C., Liu, G. A developmental switch in neurotransmitter flux enhances synaptic efficacy by affecting AMPA receptor activation. Neuron. 29, (2001).
  13. Heine, M., et al. Surface mobility of postsynaptic AMPARs tunes synaptic transmission. Science. 320, 201-205 (2008).
  14. Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J. Physiol. 562, 9-26 (2005).
  15. Pugh, J. R., Jahr, C. E. Axonal GABAA receptors increase cerebellar granule cell excitability and synaptic activity. J. Neurosci. 31, 565-574 (2011).
  16. Mozrzymas, J. W., Zarnowska, E. D., Pytel, M., Mercik, K. Modulation of GABA(A) receptors by hydrogen ions reveals synaptic GABA transient and a crucial role of the desensitization process. J. Neurosci. 23, 7981-7992 (2003).
  17. Pasternack, M., Smirnov, S., Kaila, K. Proton modulation of functionally distinct GABAA receptors in acutely isolated pyramidal neurons of rat hippocampus. Neuropharmacology. 35, 1279-1288 (1996).
  18. Single-Channel Recording. , Springer. (2009).
  19. Davie, J. T., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nat. Protoc. 1, 1235-1247 (2006).
  20. Major, G., Polsky, A., Denk, W., Schiller, J., Tank, D. W. Spatiotemporally graded NMDA spike/plateau potentials in basal dendrites of neocortical pyramidal neurons. J. Neurophysiol. 99, 2584-2601 (2008).
  21. Rose, G. J. Combining pharmacology and whole-cell patch recording from CNS neurons, in vivo. J. Neurosci Methods. , (2012).
  22. Behrends, J. C., Lambert, J. C., Jensen, K. Repetitive activation of postsynaptic GABA(A )receptors by rapid, focal agonist application onto intact rat striatal neurones in vitro. Pflugers Arch. 443, 707-712 (2002).
  23. Hahnel, C. Practical Electrophysiological methods. Kettenmann, H., Grantyn, R. , Wiley-Liss. (1992).
  24. Wetzel, C. H., et al. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. J. Neurosci. 19, 7426-7433 (1999).
  25. Cash, S., Yuste, R. Linear summation of excitatory inputs by CA1 pyramidal neurons. Neuron. 22, 383-394 (1999).
  26. Eccles, J. C., Jaeger, J. C. The relationship between the mode of operation and the dimensions of the junctional regions at synapses and motor end-organs. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 148, 38-56 (1958).
  27. Kwon, H. B., Sabatini, B. L. Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex. Nature. 474, 100-104 (2011).
  28. Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Front Neural Circuits. 3, 2(2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Aplikacja glutaminianuaplikacja GABAdrzewo dendrytycznekonfiguracja whole-cellkompensacja pojemnościoporność pipetyobrazowanie fluorescencyjneskrawek mózgu
Szybka mikrojonoforeza glutaminianu i GABA: przydatne narzędzie do badania integracji synaptycznej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.