Rozwarstwienie i boczne dopasowanie zarodków danio pręgowanego: analiza rozwoju rdzenia kręgowego

Podsumowanie

Procesy rozwojowe, takie jak proliferacja, wzorzec, różnicowanie i prowadzenie aksonów, mogą być łatwo modelowane w rdzeniu kręgowym drobnicy danio pręgowanego. W tym artykule opisujemy procedurę montowania zarodków danio pręgowanego, która optymalizuje wizualizację tych zdarzeń.

Streszczenie

Rdzeń kręgowy danio pręgowanego jest skutecznym modelem badawczym do badań układu nerwowego z kilku powodów. Po pierwsze, podejścia genetyczne, transgeniczne i knockdown genów mogą być wykorzystane do zbadania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw rozwoju układu nerwowego. Po drugie, duże grupy rozwojowo zsynchronizowanych zarodków zapewniają duże rozmiary próbek eksperymentalnych. Po trzecie, przejrzystość optyczna zarodka danio pręgowanego pozwala naukowcom na wizualizację populacji progenitorowych, glejowych i neuronalnych. Chociaż zarodki danio pręgowanego są przezroczyste, grubość próbki może utrudniać skuteczną wizualizację mikroskopową. Jedną z przyczyn takiego stanu rzeczy jest tandemowy rozwój rdzenia kręgowego i leżącej nad nim tkanki somitowej. Innym powodem jest duża kulka żółtka, która jest nadal obecna w okresach wczesnej neurogenezy. W tym artykule demonstrujemy mikrodysekcję i usunięcie żółtka w utrwalonych zarodkach, co pozwala na mikroskopową wizualizację przy jednoczesnym zachowaniu otaczającej tkanki somitowej. Pokazujemy również półtrwałe mocowanie zarodków danio pręgowanego. Pozwala to na obserwację rozwoju neurologicznego w osi grzbietowo-brzusznej i przednio-tylnej, ponieważ zachowuje trójwymiarowość tkanki.

Wprowadzenie

Wizualizacja rdzenia kręgowego u danio pręgowanego jest hamowana przez wiele czynników. Ze względu na grubość leżących nad nimi somitów i wewnętrzne położenie rdzenia kręgowego, wymagana jest znacznie duża odległość robocza w celu uzyskania wysokiej rozdzielczości komórkowej. Kulka żółtkowa (która jest nadal obecna we wczesnych stadiach neurogenezy) dodatkowo zwiększa wymaganą odległość roboczą i łatwo ulega uszkodzeniu pod wpływem nacisku szkiełka nakrywkowego. Ponadto zanieczyszczenia z uszkodzonego żółtka uniemożliwiają wyraźną wizualizację tkanek. Chociaż przekroje poprzeczne w osi grzbietowo-brzusznej (DV) są możliwe, nie pozwalają one na jednoczesną wizualizację w osi przednio-tylnej (AP)¹.

Aby pokonać te przeszkody, embriony są preparowane i umieszczane na zjeżdżalniach. Ta procedura zapewnia kilka korzyści. Po pierwsze, zarodki danio pręgowanego łatwo leżą boczną stroną skierowaną do góry, co ułatwia wizualizację osi AP. Po drugie, usunięcie kulki żółtkowej zmniejsza wymaganą odległość roboczą i ogranicza zanieczyszczenia. Po trzecie, ta procedura montażu pozwala zarówno na mikroskopię fluorescencyjną, jak i w jasnym polu. Po czwarte, zamontowane zarodki są stabilne przez miesiące w temperaturze 4 °C, co pozwala na długotrwałą wizualizację próbki. Wreszcie postęp rozwoju następuje w tym, że przednie segmenty są bardziej dojrzałe niż tylne segmenty. Aby upewnić się, że dopasowane do siebie segmenty kręgosłupa są porównywane między zarodkami, jako wskazówkę stosuje się leżącą nad nimi tkankę somitową. Na przykład dziesiąty najbardziej wysunięty do tyłu somit nakłada się na dziesiąty półsegment rdzenia, który jest rozwojowo równoważny w zarodkach dopasowanych do stadium. Ta procedura montowania nienaruszonych zarodków umożliwia łatwą identyfikację somitów.

Używamy genetyki i technologii wyciszania genów do badania mechanizmów kierowania aksonami w rozwijającym się rdzeniu kręgowym. W szczególności ustaliliśmy, że robo2, robo3 i dcc są wymagane do znajdowania ścieżki aksonów Commissural Primary Ascending (CoPA). Korzystając z opisanej tutaj procedury montażu, byliśmy w stanie zbadać wzrost brzuszny, skrzyżowanie linii środkowej, szerokość spoidła, wzrost grzbietowy i przedni^2,3. Ta procedura montażu może być również stosowana do modelowania DV lub AP rdzenia kręgowego. Zastosowaliśmy tę procedurę do określenia różnych ról efektorów Wnt w wzorcu DV rdzenia kręgowego. Korzystając z tego mocowania, byliśmy w stanie uzyskać rozdzielczość znaczników DV na poziomie pojedynczej komórki i określić minutowe przesunięcia wzorca w wyniku zmienionego odbioru sygnału Wnt^4,5. Ta procedura montażu pozwala również na obliczenie indeksu mitotycznego poprzez różnicowanie znakowania antyfosfohistonem 3 lub BrdU (proliferacja progenitorów)⁵.

Protokół

1. Montowanie zarodków (po zakończeniu wybranych technik wizualizacji, takich jak immunocytochemia, hybrydyzacja in situ, itp.)

1. Umieścić zarodki na szalce Petriego o średnicy 35 mm wypełnionej wybranym buforem (ryc. 1A). Wybór bufora opiera się na procedurze etykietowania. Zazwyczaj odpowiednie są oparte na PBS.
2. Pod mikroskopem preparacyjnym i za pomocą kleszczy zabezpiecz głowę jedną parą kleszczy, jednocześnie odciągając żółtko drugą parą (ryc. 1B). Alternatywnie użyj szpilki do owadów w uchwycie na szpilki na owady, aby delikatnie odciągnąć żółtko.
3. Za pomocą pogrzebacza do zarodków (żyłka wędkarska o średnicy 0,41 mm przyklejona do rurki kapilarnej lub pipety Pasteura) przenieś zarodki do części szalki Petriego, która nie ma dużej ilości resztek żółtka (ryc. 1C-D).
4. Za pomocą szklanej pipety Pasteura odessać zarodki w jak najmniejszej ilości płynu i delikatnie pipetować je na szkiełku podstawowym (ryc. 1E).
5. Delikatnie odchodządź nadmiar płynu za pomocą chusteczki laboratoryjnej. Unikać kontaktu z zarodkami.
6. Dodaj jedną kroplę podłoża montażowego do zarodków. W przypadku etykiet fluorescencyjnych użyj wybranego odczynnika zapobiegającego blaknięciu. W przypadku sygnałów kolorymetrycznych jako medium montażowe można użyć 70% glicerolu.
7. Za pomocą pogrzebacza zarodków ustaw zarodki na bokach w rzędach (ryc. 1F).
8. Dodaj jedną "odrobinę" wazeliny lub smaru wysokopróżniowego do każdego rogu szkiełka nakrywkowego (rysunek 1G). Zapobiega to uszkodzeniom zarodka w wyniku nadmiernego ucisku.
9. Umieść szkiełko nakrywkowe (wazeliną do dołu) na zarodkach (ryc. 1H).
10. Delikatnie postukaj w szkiełko nakrywkowe w każdym rogu, aż nośnik montażowy (70% glicerol lub odczynnik montażowy zapobiegający blaknięciu) dotknie szkiełka nakrywkowego (Rysunek 1H).
11. W razie potrzeby dodaj więcej pożywki mocującej, pipetując bezpośrednio obok szkiełka nakrywkowego, używając pipetora o pojemności 20-200 ml. Będzie się chrząkać pod spodem.
12. Za pomocą chusteczki laboratoryjnej całkowicie wyczyść okolice szkiełka nakrywkowego. Pamiętaj, aby nie wywierać nacisku na szkiełko nakrywkowe, ponieważ może to uszkodzić zarodki. Obszar ten musi być suchy i nie może być na nim wazeliny ani mediów montażowych.
13. Użyj lakieru do paznokci, aby uszczelnić krawędź szkiełka nakrywkowego (Rysunek 1I).

Wyniki

Podczas wyjaśniania mechanizmów leżących u podstaw różnych zdarzeń rozwojowych, takich jak wzorowanie komórkowe, różnicowanie i prowadzenie aksonów, istotna jest możliwość wizualizacji komórek w kontekście ich tkanki. Defekty wzorowania grzbietowo-brzusznego zazwyczaj objawiają się przesunięciem brzuszny lub grzbietowym domeny ekspresji czynników transkrypcyjnych z rodzin pax, nkx lub dbx⁴. Czasami zmiany mogą być subtelne i obejmować zaledwie kilka średnic komórek⁴. Analiza przekrojów poprzecznych umożliwia tego typu badania. Jednakże odczynniki generujące słabsze sygnały lub przekroje, które nie są prostopadłe do osi AP, mogą ograniczać interpretację. Co więcej, analiza przekrojów poprzecznych nie uwzględnia w łatwy sposób tego, czy zmiany utrzymują się wzdłuż osi AP, i jest zależna od dostępności kriotomu. Ograniczenie to jest omijane dzięki obrazowaniu rdzenia kręgowego w rzucie bocznym. Jak pokazano na Rysunku 2B, mRNA nkx6.1 jest rozprowadzone w przybliżeniu w brzusznej połowie rdzenia kręgowego 24 h po zapłodnieniu (hpf), w obrębie domeny progenitorowej. Komórki progenitorowe są odróżnialne od komórek pomitotycznych dzięki obecności płytki dna, która znajduje się w przyśrodkowej części rdzenia kręgowego. W obrazowaniu z użyciem optyki DIC poszczególne komórki są wyraźnie rozróżnialne i widoczna jest zdefiniowana granica między komórkami wykazującymi ekspresję a komórkami jej pozbawionymi.

Wyjście komórek progenitorowych z cyklu komórkowego wiąże się ze zmianami w ekspresji genów. Na przykład wszystkie neurony pomitotyczne wykazują ekspresję HuC/D, którą można wykryć za pomocą immunocytochemii^1,5. Sondy mRNA dla rodzin islet, gata i vsx znakują specyficzne neurony pomitotyczne o stałej pozycji i liczbie w każdym hemisegmencie rdzenia kręgowego⁶. Ponadto receptory kierowania aksonów, takie jak te z rodziny robo, są eksprymowane w ograniczonych populacjach neuronów pomitotycznych (Rysunek 2C)^2,7,8. Montowanie embrionów w pozycji bocznej umożliwia dokładne przeliczenie neuronów pomitotycznych. Podobnie, progenitorzy, które nadal się dzielą, mogą być kwantyfikowane za pomocą immunocytochemii przeciwko fosfo-histonie 3 oraz znakowania BrdU. Ponadto śmierć komórek można ocenić za pomocą znakowania TUNEL^4-6.

W 24 hpf aksony następujących neuronów postmitotycznych można zwizualizować różnymi metodami i rozróżnić na poziomie pojedynczych komórek: Dorsal Lateral Ascending (DoLA), Commissural Primary Ascending (CoPA), Commissural Secondary Ascending (CoSA), Ventral Longitudinal Descending (VeLD), Kolmer-Agdur (KA), Commissural Bifurcating/Longitudinal (CoB/L), Circumferential Ascending (CiA), Circumferential Descending (CiD), Unipolar Commissural Descending (UCoD), Rohon-Beard (R-B) oraz motoneurony (M)⁹. Aksony tych neuronów rozciągają się w kierunkach grzbietowym, brzusznym, przednim i tylnym. Rozgałęziają się, przecinają linię środkową i opuszczają rdzeń kręgowy zarówno od strony grzbietowej, jak i brzusznej. Przy zastosowaniu konfokalnej mikroskopii skaningowej, te zróżnicowane zachowania komórkowe są widoczne w embrionach zamontowanych bocznie, z wykorzystaniem immunocytochemii i genetycznie kodowanych białek fluorescencyjnych, takich jak GFP². Na Rysunku 2D zastosowano immunocytochemię znp-1 w celu oznakowania rozwijających się motoneuronów. Motoneurony opuszczają rdzeń kręgowy od strony brzusznej, aby unerwić otaczającą go rozwijającą się muskulaturę.

Rysunek 1. Disekcja i montaż boczny embrionów danio pręgowanego. (A) Po przygotowaniu do immunofluorescencji, in situ hybrydyzacja, itp.zarodki umieszcza się w 35 mm szalce Petri wypełnionej PBT (PBS z 0,5% Triton X-100) lub PTw (PBS z 0,1% Tween-20). Widoczna jest kula żółtkowa (YB). (B) Żółtko usuwa się poprzez unieruchomienie głowy zarodka, a następnie przeprowadzenie ostrożnej dyssekcji. (CDo oddzielenia embrionów od resztek żółtka używa się tzw. „pukera” do embrionów (żyłki wędkarskiej przyklejonej do pipety Pasteura) (D). Oczyszczone embriony przenosi się pipetą na szkiełko przedmiotowe (E) i wyrównane (F). (GW narożnikach szkiełka zakryjącego nanosi się wazelinę.H) Szkiełko zakrywkowe delikatnie nakłada się na zarodki w medium montażowym. (I) Do uszczelnienia krawędzi szkiełka nakrywkowego należy użyć laku do paznokci. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rycina 2. Analiza wzorców ekspresji genów i prowadzenia aksonów w embrionach danio pręgowanego zamontowanych bocznie. (A) Rysunek embrionu danio pręgowanego w 24 hpf. Na zdjęciach B-D zwizualizowano około cztery hemisegmenty powyżej przedłużenia worka żółtkowego (obszar w ramce). (B) nkx6.1 jest wyrażany w brzusznej części rdzenia kręgowego, w tym w płytce dna (FP). (C) robo3 jest wyrażany w neuronach postmitotycznych (PMN). Płytka dna i strefa progenitorowa nie są widoczne w tej bardziej bocznej płaszczyźnie ogniskowej. Na zdjęciach B,C rdzeń kręgowy jest ograniczony nawiasem po lewej stronie obrazu. (D) Mikroskopia konfokalna została wykorzystana do obrazowania immunofluorescencji znp-1, która znakuje aksony ruchowe opuszczające brzusznie rdzeń kręgowy. Na wszystkich zdjęciach przód znajduje się po lewej stronie, a góra (grzbiet) u góry. Użyto obiektywu z zanurzeniem w wodzie o 40-krotnym powiększeniu, długiej odległości roboczej (N.A. 0.8) (3.3 mm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Dyskusja

Boczne mocowanie nieruchomych zarodków danio pręgowanego pomaga w wizualizacji rozwoju rdzenia kręgowego. Poprzez usunięcie kulki żółtkowej zmniejsza się odległość robocza wymagana do wyjątkowego obrazowania mikroskopowego. Nasze reprezentatywne wyniki były ograniczone do stadium 24 hpf, jednak technika ta może być stosowana już przy 18 hpf, chociaż wcześniejsze zarodki są trudniejsze do wypreparowania ze względu na wielkość zarodka i kruchość tkanki. Technika ta ma również zastosowanie do zarodków starszych niż 24 hpf. Dzięki jasności optycznej embrionalnego danio pręgowanego, zdolności do wykonywania badań genetycznych do przodu, genetyki odwrotnej i podejść transgenicznych, można zbadać kilka procesów rozwojowych. Obejmuje to wskaźniki mitotyczne neuronalnych komórek progenitorowych z markerami takimi jak BrdU i antyfosfohiston 3 ^4-6 oraz wzorcowanie poprzez ekspresję neuronalnych i glejowych markerów progenitorowych w rodzinach pax, nkx, dbx i olig ^1,4-6. Można stosować odczynniki, które informują o oznaczaniu gleju i neuronów (takie jak białko kwasu fibrylarnego glejowego (GFAP) i HuC/D)^1,4,5,10. Różnicowanie podtypów neuronalnych można analizować poprzez ekspresję genów wysp trzustkowych, vsx, engrailed i gata ^1,4-6. I wreszcie, analiza prowadzenia aksonów jest możliwa dzięki przeciwciałom, takim jak antyacetylowana tubulina, 3A10 i znp-1 ^2,11,12. Chociaż inne systemy modelowe kręgowców (mysz i pisklę) są wykorzystywane do badania rozwoju rdzenia kręgowego, tylko danio pręgowany pozwala na jednoczesne oglądanie wszystkich osi rozwojowych w nienaruszonym zarodku.

Oczywistym ograniczeniem tego podejścia jest to, że zarodki są utrwalone, co wyklucza obrazowanie na żywo. W rzeczywistości usunięcie (lub uszkodzenie) żółtka powoduje szybką śmierć zarodka, dlatego nie jest możliwe zmniejszenie odległości roboczej w żywych zarodkach przy użyciu tej techniki. Możliwe jest jednak obrazowanie rdzenia kręgowego w dużym powiększeniu w żywych zarodkach. W celu zachowania żółtka podczas obrazowania na żywo, zarodki można umieszczać w szkiełkach depresyjnych, które zapewniają większą przestrzeń między próbką a szkiełkiem nakrywkowym. Alternatywnie, kilka szkiełek nakrywkowych o wymiarach 22 mm x 22 mm można przykleić na dowolnym szkiełku mikroskopowym o wymiarach 3 cale x 1 cal. Szkiełka nakrywkowe służą jako "mostek" dla leżącego nad nim szkiełka nakrywkowego. Jeśli zarodki są starsze niż 18 hpf, trikaina jest stosowana do znieczulania zarodków, aby zapobiec ruchowi. Podczas gdy odległość robocza 0,288 mm jest wymagana dla zarodków pozbawionych żółtka przy 24 hpf, podczas pracy z żywymi zarodkami osadzonymi w agarozie, z nienaruszonymi żółtkami, wystarczająca jest mikroskopijna soczewka o odległości roboczej 3,3 mm. Alternatywnie, kultury eksplantatów pochodzące z zarodków pozbawionych żółtka mogą być wizualizowane przy użyciu techniki unieruchamiania skrzepów osocza¹³. Różne populacje komórek można obserwować za pomocą genetycznie kodowanych białek fluorescencyjnych, takich jak GFP, mCherry lub fotokonwertowalny barwnik Kaede (by wymienić tylko kilka). Co więcej, za pomocą tego podejścia można również oglądać fluorescencyjnie znakowane komórki w chimerycznych zarodkach¹⁴.

Konsekwentna technika montażu, która jest stabilna przez wiele miesięcy, jest kluczowym narzędziem dla biologów rozwojowych i komórkowych. Ta prosta technika jest powtarzalna, co pozwala na łatwe porównanie różnych prób eksperymentalnych. Co więcej, ułożenie zarodków w rzędach pozwala na łatwą identyfikację określonych zarodków do późniejszej analizy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
szalki Petriego 35 mm x 10 mm	VWR	p>25373-041
Kleszcze Dumonta #3	Fisher Scientific	NC9839169
Szkło nakrywkowe	Fisher Scientific	12-541-B22X22-1.5
Slajdy	Fisher Scientific	12-550-343
SlowFade Gold	Fisher Scientific	S36936
ProLong Gold	Life Technologies	P36934
Petroleum Jelly	każdy sklep spożywczy
uchwyty pętli	VWR	80094-482
Szpilki do owadów	Narzędzia do nauki pięknej	26002-10
niklowane uchwyty na szpilki	Narzędzia do nauki	26016-12
Mikroskop stereoskopowy Olympus Olympus<		p>SZ61