Tkanka tłuszczowa (AT) to miejsce intensywnej aktywacji i interakcji komórek odpornościowych. Prawie wszystkie komórki układu odpornościowego są obecne w AT, a ich proporcje są zmieniane przez otyłość. Właściwa izolacja, kwantyfikacja i charakterystyka populacji komórek odpornościowych AT mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich roli w chorobie immunometabolicznej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja komórek odpornościowych tkanki tłuszczowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Odkrycie zwiększonej infiltracji makrofagów w tkance tłuszczowej (AT) otyłych gryzoni i ludzi doprowadziło do intensyfikacji zainteresowania udziałem komórek odpornościowych w lokalnej i ogólnoustrojowej insulinooporności. Izolacja i kwantyfikacja różnych populacji komórek odpornościowych u szczupłych i otyłych AT jest obecnie powszechnie stosowaną techniką w laboratoriach immunometabolicznych; Należy jednak zachować szczególną ostrożność zarówno przy izolacji komórek naczyniowych zrębu, jak i przy analizie cytometrii przepływowej, aby uzyskane dane były wiarygodne i możliwe do interpretacji. W tym filmie pokazujemy, jak mielić, trawić i izolować frakcję zrębową zrębu wzbogaconą komórkami odpornościowymi. Następnie pokazujemy, jak znakować przeciwciała makrofagów i limfocytów T oraz jak prawidłowo je blokować w eksperymentach cytometrii przepływowej. Przedstawiono reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej od otyłych myszy karmionych niską ilością tłuszczu, szczupłych i karmionych dużą ilością tłuszczu. Krytycznym elementem tej analizy jest zastosowanie przeciwciał, które nie fluoryzują w kanałach, w których makrofagi AT są naturalnie autofluorescencyjne, a także zastosowanie odpowiednich kontroli kompensacyjnych.
Wprowadzenie
Historycznie tkanka tłuszczowa (AT) była postrzegana jako obojętny organ magazynujący lipidy, który rozszerza się i kurczy w odpowiedzi na bilans energetyczny. Teraz rozumiemy, że AT reprezentuje dynamiczny narząd endokrynny, który aktywnie wydziela szereg hormonów, które bezpośrednio wpływają na zachowania żywieniowe i homeostazę glukozy w układzie. Ponadto w ciągu ostatniej dekady coraz bardziej docenia się liczne populacje komórek odpornościowych znajdujących się we frakcji naczyniowej zrębu AT (SVF), a także ich wkład w homeostazę AT.
Zdolność do oddzielenia adipocytów AT i SVF za pomocą trawienia kolagenazy, a następnie wirowania różnicowego, została po raz pierwszy opisana przez Rodbella w 1964 roku 1. Kolagenaza II jest najczęściej stosowana do separacji adipocytów i SVF ze względu na utrzymanie receptorów insuliny adipocytów1. Na początku enzymatyczne frakcjonowanie AT stosowano przede wszystkim do badania metabolizmu adipocytów i izolowania preadipocytów. Ostatnio technika ta, w połączeniu z powszechną dostępnością cytometrów przepływowych i stale rosnącą liczbą dostępnych na rynku przeciwciał sprzężonych z fluoroforem, ułatwiła scharakteryzowanie komórek odpornościowych AT.
Chociaż obecność komórek odpornościowych w stanie zapalnym AT została opisana wcześniej 2, przełomowe prace Weisberga i wsp. oraz Xu i wsp. opublikowane w 2003 roku były pierwszymi, które udokumentowały akumulację makrofagów AT (ATM) w otyłości, które wydzielają cytokiny zapalne i korelują z insulinoopornością specyficzną dla AT i ogólnoustrojową 3,4. Obserwacje te posłużyły jako podstawa nowej dziedziny badań, niedawno ukutej pod nazwą "immunometabolizm", 5 i były kontynuowane w badaniach dotyczących różnych populacji komórek odpornościowych, w tym komórek dendrytycznych 6, komórek tucznych 7, limfocytów T 8-10, limfocytów B 11, komórek NKT 12, eozynofili 13 i neutrofili 14,15 w rozwoju insulinooporności związanej z otyłością.
Celem tego artykułu jest dostarczenie szczegółowego opisu techniki trawienia kolagenazy używanej do izolowania komórek AT SVF oraz scharakteryzowanie ATM i limfocytów T AT za pomocą cytometrii przepływowej. Ten protokół został zoptymalizowany pod kątem myszy AT; jednak widzowie mogą skorzystać z przeczytania doskonałego artykułu zawierającego obszerne informacje na temat optymalizacji tej techniki dla człowieka AT 16. Grupą docelową tego artykułu są badacze z ograniczonym doświadczeniem w pracy z mysim AT i wykonywaniu cytometrii przepływowej. Przedstawiono kilka praktycznych rozważań dotyczących równoważenia wydajności i żywotności komórek z czasem i zasobami, a także optymalne kontrole cytometrii przepływowej w celu scharakteryzowania populacji komórek odpornościowych AT. Oprócz naszego protokołu, czytelnicy są odsyłani do niedawnego artykułu JoVE autorstwa Basu i wsp., w którym znajduje się doskonałe omówienie niektórych technicznych aspektów cytometrii przepływowej, w tym właściwych kontroli i kompensacji 17.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Odczynniki i materiały eksploatacyjne
Przed rozpoczęciem tego eksperymentalnego protokołu przygotuj następujące odczynniki:
- 70% etanolu
- 1X PBS
- 1X DPBS (bez Ca i Mg) uzupełniony o 0,5% BSA
- Bufor FACS: 1X DPBS (bez Ca i Mg), 2 mM EDTA i 1% FCS
- Bufor ACK: 150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3 i 0,1 mM Na2EDTA w wodzie
2. Pobieranie i przygotowanie tkanki tłuszczowej
- Eutanazja myszy odbywa się zgodnie z zatwierdzonymi przez IACUC procedurami specyficznymi dla każdej instytucji.
- Dokładnie zwilż futro 70% etanolem.
- Wykonaj nacięcie na poziomie wyrostka mieczykowatego (dolna część mostka) i otwórz klatkę piersiową, aby odsłonić serce, uważając, aby nie przeciąć żadnych głównych naczyń krwionośnych.
Uwaga: W tym momencie pomocne jest również pozostawienie przepony nienaruszonej w miarę możliwości i wycięcie wcięcia po prawej stronie klatki piersiowej, aby krew i perfuzat mogły wypłynąć z klatki piersiowej.
- Przypnij prawy przedsionek, aby krew i perfuzat mogły uciec z układu krążenia.
Uwaga: Gdy mamy do czynienia z otyłymi myszami, może być konieczne usunięcie nadmiaru osierdziowego AT, aby umożliwić dostęp do serca.
- Chwyć serce kleszczami i delikatnie włóż igłę do lewej komory przez wierzchołek. Powoli przetapiaj mysz za pomocą 15 ml sterylnego PBS.
Uwaga: Zmniejsz szybkość perfuzji, jeśli płuca zaczną się wypełniać i rozszerzać.
- Otwórz jamę otrzewnej i usuń okołogonadchodzące poduszeczki tłuszczowe, uważając, aby uniknąć tkanek gonadalnych.
- Umieść poduszeczki tłuszczowe w łodzi wagowej na lodzie zawierającej 2 ml 1X DPBS (bez Mg lub Ca) uzupełnionego 0,5% BSA i zmiel AT na drobne kawałki.
Uwaga: Ogranicz ilość AT na łódź wagową do 1,2 g. Jeśli ilość AT przekracza 1,2 g, podziel ją równo między dwie łodzie wagowe.
- Próbki AT należy przechowywać na lodzie i przygotować 3 ml roztworu do trawienia kolagenazy na próbkę AT, składającego się z 1X DPBS uzupełnionego 0,5% BSA, 10 mM CaCl2 i 4 mg / ml kolagenazy typu II.
3. Trawienie kolagenazy
- Przenieść AT do stożkowych probówek o pojemności 50 ml, wlewając homogenat i przepłukując łódkę wagową 1 ml DPBS (0,5% BSA) i 3 ml roztworu trawiącego kolagenazy II.
- Inkubować homogenat w wytrząsarce rotacyjnej (200 obr./min) w temperaturze 37 °C przez 20 min.
- Dodaj 10 ml DPBS (0,5% BSA) do stożkowych probówek i umieść na lodzie.
- Rozcierać, wielokrotnie homogenizować za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml i przepuszczać zawiesiny komórek przez filtr 100 μm do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
- Zawiesinę komórek odwirować w temperaturze 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
- Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad komórek SVF w 3 ml buforu ACK w celu lizy zanieczyszczających erytrocytów.
- Dodać 12 ml buforu FACS i zawiesiny komórek wirówkowych o sile 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
- Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad komórek SVF w buforze FACS.
Uwaga: Użyj rozmiaru komórki jako wskazówki, ile bufora FACS należy ponownie zawiesić. Jeśli osad komórkowy pokrywa dno stożkowej probówki o pojemności 50 ml, należy użyć 0,5-1 ml buforu FACS; W przeciwnym razie ponownie zawiesić w 0,25-0,5 ml.
- Umieścić próbki na lodzie i przygotować porcje każdej próbki o rozcieńczeniu 1:10 do zliczania komórek, mieszając 40 μl buforu FACS, 50 μl roztworu błękitu trypanowego (0,2%) i 10 μl zawiesiny komórek.
- Policz żywe komórki na podstawie wykluczenia błękitu trypanowego i rozcieńczonych zawiesin komórek do końcowego stężenia 5-10 x10 6 komórek/ml.
4. Barwienie antygenów na powierzchni komórki
- Dodać przeciwciało anty-mysie CD16/CD32 (blok Fc) do końcowego stężenia 0,5-1 μg/106 komórek i inkubować na lodzie przez 10 minut.
- Przenieść próbki (≥10,6 komórek) do probówek z okrągłym dnem z polistyrenu o wymiarach 12 x 75 mm. Przygotuj oddzielne probówki podczas analizy ATM i limfocytów T i połącz dodatkowe ogniwa, aby przygotować odpowiednią liczbę probówek, aby pomieścić wymaganą kompensację i zmodyfikowaną fluorescencję minus jeden (FMO) kontrole.
Uwaga: Na przykład, przy ilościowym określaniu proporcji bankomatów na podstawie F4/80 i CD11b, konieczne będzie przygotowanie następujących kontroli kompensacji i FMO:
- Niebarwione (komórki)
- DAPI lub jodek propidyny (PI) pojedyncze barwienie (komórki; nie dodawaj barwnika żywotności aż do kroku 5.1)
- F4/80 APC pojedyncza plama (komórki lub koraliki kompensacyjne)
- CD11b FITC pojedyncza plama (komórki lub koraliki kompensacyjne)
- FMO 1 (komórki): kontrola izotypu κ IgG2a szczura APC + CD11b FITC + barwnik żywotności (dodany w kroku 5.1)
- FMO 2 (komórki): F4/80 APC + Rat IgG2b κ kontrola izotypu FITC + barwnik żywotności (dodany w kroku 5.1)
- Dodać sprzężone z fluoroforem przeciwciała pierwszorzędowe i/lub kontrole izotypu w odpowiednim stężeniu (patrz Tabela odczynników i materiałów).
- Chronić próbki przed światłem i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
- Dodać 2 ml buforu FACS i zawiesiny komórek wirówek o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
- Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad komórek SVF w 2 ml buforze FACS.
- Zawiesinę komórek SVF odwirować 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić osad komórek SVF w buforze FACS o pojemności ≥400 μl.
- Próbki należy przenieść do probówek z okrągłym dnem z polistyrenu o wymiarach 12 x 75 mm, wyposażonych w górną rurkę z sitkiem o średnicy 35 μm.
- Chronić przed światłem i przechowywać próbki w temperaturze 4 °C do czasu analizy FACS.
Uwaga: Dla optymalnych wyników komórki powinny być analizowane natychmiast; jednak analiza FACS za pomocą tego protokołu została pomyślnie przeprowadzona na znakowanych komórkach przechowywanych w buforze FACS przez 1-2 godziny w temperaturze 4 °C. Jeśli konieczne jest utrwalenie komórek w celu wydłużenia czasu przechowywania, oznakowane komórki można utrwalić za pomocą 2% paraformaldehydu w temperaturze 4 °C przez 24 godziny przed analizą FACS. Firmy produkujące przeciwciała sugerują, że znakowane komórki mogą być przechowywane przez okres do jednego tygodnia; Nie zostało to jednak przetestowane w ramach tej procedury.
5. Analiza FACS
- Przed analizą FACS należy dodać do próbek barwnik żywotności i odpowiednie kontrole, aby umożliwić dyskryminację żywych i martwych komórek.
Uwaga: Liczne barwniki żywotności są dostępne na rynku, ale DAPI i PI są zalecane w zależności od profili wzbudzenia/emisji używanych przeciwciał sprzężonych z fluoroforem. DAPI i jodek propidyny dodaje się do każdej próbki w końcowym stężeniu 0,2 mg/ml.
- Użyć niebarwionej ujemnej próbki kontrolnej, najlepiej komórek wyizolowanych z tej samej tkanki co próbki doświadczalne, w celu dostosowania rozproszenia bocznego (SSC) i rozproszenia do przodu (FSC) tak, aby populacja komórek będących przedmiotem zainteresowania była zgodna ze skalą.
Uwaga: Do analizy komórek AT SVF zaleca się, aby SSC było wyświetlane w skali logarytmicznej, a FSC w skali liniowej. Użycie skali logarytmicznej dla SSC jest szczególnie ważne podczas analizy bankomatów, które często są bardzo duże i szczegółowe.
- Narysuj początkową bramkę rozpraszania światła w oparciu o typ analizowanych komórek i dostosuj wzmocnienie lampy fotopowielacza (PMT) tak, aby niebarwione komórki znajdowały się po lewej stronie histogramu z jednym parametrem (w przybliżeniu wyśrodkowanym na 102) dla odpowiednich kanałów.
Uwaga: Zaleca się, aby limfocyty i makrofagi (lub inne komórki szpikowe) były analizowane oddzielnie ze względu na różnice w autofluorescencji.
- Użyj pojedynczych barwionych kontrolek lub koralików kompensujących wychwytywanie przeciwciał, aby wykonać kompensację wielokolorową.
Uwaga: Zaleca się stosowanie koralików kompensacyjnych; jednak zgodność każdego przeciwciała musi być zapewniona. Na przykład kulki kompensacyjne mogą nie reagować krzyżowo z przeciwciałami królików, w którym to przypadku izolowane komórki są wymagane do uzyskania odpowiedniej kontroli pojedynczego barwienia.
- Ustawianie bramek eksperymentalnych w oparciu o zmodyfikowane kontrolki FMO.
- Ustaw cytometr przepływowy tak, aby zbierał odpowiednią liczbę zdarzeń w oparciu o rozpowszechnienie populacji będącej przedmiotem zainteresowania i rejestrował dane eksperymentalne.
- Eksport plików danych FCS do analizy w trybie offline. Dostępnych jest wiele programów do analizy danych cytometrii przepływowej. Polecamy Cytobank, platformę internetową, która umożliwia śledczym przechowywanie i analizowanie danych oraz generowanie danych z dowolnego komputera z dostępem do Internetu 18. Dodatkowo Cytobank oferuje możliwość publicznego udostępniania danych lub ograniczania dostępu do współpracowników.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Do wyizolowania SVF z poduszek tłuszczowych nadjądrzowych samców myszy C57BL/6J karmionych dietą niskotłuszczową (10% kcal z tłuszczu) lub wysokotłuszczową (60% kcal z tłuszczu) (odpowiednio LFD i HFD) przez 16 tygodni wykorzystano trawienie tkanki tłuszczowej (AT) kolagenazą, a następnie różnicowe wirowanie. Komórki SVF znakowano następnie przeciwciałami pierwszorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem, aby określić proporcję żywych makrofagów tkanki tłuszczowej (ATMs) (Rysunek 1) i limfocytów T tkanki tłusz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Rosnące zainteresowanie rolą układu odpornościowego w metabolicznych konsekwencjach otyłości doprowadziło do powszechnego stosowania cytometrii przepływowej do charakteryzowania komórek odpornościowych AT. Chociaż dokładny protokół będzie się różnić w zależności od laboratoriów w oparciu o ich własne doświadczenie i dostępny sprzęt, kluczowe etapy obejmują trawienie kolagenazy, wirowanie różnicowe i znakowanie antygenu na powierzchni komórki. Celem niniejszego artykułu jest dostarczenie szczegółowego protokołu i praktycz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
JSO jest wspierane przez NIH Ruth L. Kirschstein NRSA (F32 DK091040), AK jest wspierany przez stypendium podoktoranckie Amerykańskiego Towarzystwa Diabetologicznego (7-10-MI-05), a AHH jest wspierany przez American Heart Association Established Investigator Award (12EIA8270000). Eksperymenty z cytometrią przepływową przeprowadzono w udostępnionym zasobie VMC Flow Cytometry. Wspólny zasób cytometrii przepływowej VMC jest wspierany przez Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DPBS (bez Ca lub Mg) 10 x 500 ml | Life Technologies | 14190-250 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| BSA | Sigma A2153-100G | ||
| kolagenaza | Sigma | C6885-5G | |
| roztwór jodku propydyny | Sigma | P4864-10 ml | |
| stabilny stos 20 mikrolitrów | Rainin | Końcówki filtrujące SS-L10 | |
| 20 mikrolitrów | Końcówki Rainin | SRL10F | |
| do stabilnego stosu 250 mikrolitrów | Końcówki Rainin | SS-L250 | |
| 1000 mikrolitrów | Końcówki | Rainin GPS-L1000 | |
| 1000 mikrolitrów | Końcówki filtra Rainin | GP-L1000F | |
| 250 mikrolitrów | Blok Rainin | SR-L200F | |
| FC | BD Biosciences | 553142 | |
| sitka fisher 100mn | Fisherbrand | 22-363-549 | |
| naczynie o średniej wadze | Fisherbrand | 02-202B | |
| folia aluminiowa | Fisherbrand | 1213100 | |
| nożyczki do mielenia | mięsa Fisherbrand | 089531B | |
| Vortex | Fisherbrand | 2215365 | |
| Probówki stożkowe 50 ml | BD Falcon | 14-959-49A Rurki | |
| FACS z filtrem górnym | BD Falcon | 352235 | |
| Pojemnik na pipety 10 ml 200 | BD Falcon | 1367520 | |
| probówki z okrągłym dnem | BD Falcon | ||
| 5 ml | Płytki | 309646 | |
| V | Costar | 07-200-107 | |
| pipeta z bańką transferową | Thermo Scientific | 13-711-22 | |
| Shaker | Thermo Scientific | 11 676 071 | |
| Mata samoprzylepna | Thermo Scientific | 1368750 | |
| Wirówka do hodowli komórkowych | Sorvall | 75253839 | |
| Adaptery | Sorvall | 75003723 | |
| Szczur anty-mysz CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Stężenie: 0,5 - 1 μ g/ 106 komórki |
| Szczur anty-mysz F4/80 | eBioscience | 17-4801 | Koniugat fluoroforowy: APC Stężenie: 0,2 μ g / 106 komórek Numer katalogowy kontroli izotypu: 17-4321 |
| Szczurzy anty-mysz CD11b | eBioscience | 11-0112 | Koniugat fluoroforowy: FITC Stężenie: 0,5 μ g / 106 komórek Numer katalogowy kontroli izotypu: 11/1/4031 |
| Chomik ormiański anty-mysz CD11c | eBioscience | 12-0114 | Koniugat fluoroforu: PE Stężenie: 0,8 μ g/ 106 komórek Numer katalogowy kontroli izotypu: Dec-88 |
| Kozioł anty-mysz MGL1/2 | R& Układy D | FAB4297P | koniugatu fluoroforowego: PE Stężenie: 0,1 μ g/ 106 komórek Numer katalogowy kontroli izotypu: IC108P |
| Koza przeciw myszom CD206 | R& Układy D | FAB2535P | koniugatu fluoroforowego: PE Stężenie: 0,1 μ g/ 106 komórek Numer katalogowy kontroli izotypu: IC108P |
| Szczur anty-mysz CCR2 | R& Układy D | FAB5538P | koniugat fluoroforu: PE Stężenie: 0,1 μ g/ 106 komórek Numer katalogowy kontroli izotypu: IC013P |
| Chomik ormiański anty-mysz TCRβ | BD Biosciences | 553174 | Koniugat fluoroforu: APC Stężenie: 0,2 μ g / 106 komórek Numer katalogowy kontroli izotypu: 553956 |
| Szczur anty-mysi CD8a | BD Biosciences | 552877 | koniugat fluoroforowy: PE-Cy7 Stężenie: 0,8 μ g/ 106 komórki Numer katalogowy kontroli izotypu: 552784 |
| Szczur anty-mysi CD4 | BD Biosciences | 557956 | koniugat fluoroforowy: Alexa Fluor 700 Stężenie: 0,2 μ g/ 106 komórek Numer katalogowy kontroli izotypu: 557963 |
Tabela 1. Lista materiałów i odczynników. |
Bibliografia
- Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. The Journal of Biological Chemistry. 239, 375-380 (1964).
- Danse, L. H., Verschuren, P. M. Fish oil-induced yellow fat disease in rats. III. Lipolysis in affected adipose tissue. Veterinary Pathology. 15, 544-548 (1978).
- Weisberg, S. P., et al. Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1796-1808 (2003).
- Xu, H., et al. Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1821-1830 (2003).
- Mathis, D., Shoelson, S. E. Immunometabolism: an emerging frontier. Nature Reviews. Immunology. 11, 81(2011).
- Stefanovic-Racic, M., et al. Dendritic cells promote macrophage infiltration and comprise a substantial proportion of obesity-associated increases in CD11c+ cells in adipose tissue and liver. Diabetes. 61, 2330-2339 (2012).
- Liu, J., et al. Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice. Nature Medicine. 15, 940-945 (2009).
- Feuerer, M., et al. Lean, but not obese, fat is enriched for a unique population of regulatory T cells that affect metabolic parameters. Nature Medicine. 15, 930-939 (2009).
- Nishimura, S., et al. CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity. Nature Medicine. 15, 914-920 (2009).
- Winer, S., et al. Normalization of obesity-associated insulin resistance through immunotherapy. Nature Medicine. 15, 921-929 (2009).
- Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610-617 (2011).
- Wu, L., et al. Activation of invariant natural killer T cells by lipid excess promotes tissue inflammation, insulin resistance, and hepatic steatosis in obese mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109. , 1143-1152 (2012).
- Wu, D., et al. Eosinophils sustain adipose alternatively activated macrophages associated with glucose homeostasis. Science. 332, 243-247 (2011).
- Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding. Journal of Lipid Research. 49, 1894-1903 (2008).
- Talukdar, S., et al. Neutrophils mediate insulin resistance in mice fed a high-fat diet through secreted elastase. Nature Medicine. 18, 1407-1412 (2012).
- Hagman, D. K., et al. Characterizing and quantifying leukocyte populations in human adipose tissue: impact of enzymatic tissue processing. Journal of Immunological Methods. 386, 50-59 (2012).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546(2010).
- Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments. Current Protocols in Cytometry. Chapter 10, Unit 10(2010).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100, e47-e57 (2007).
- Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45, 194-205 (2001).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
