Wyznaczanie przebiegu czasowego klirensu glutaminianu za pomocą analizy dekonwolucyjnej prądów transporterowych astrocytarnych

Summary

Opisujemy metodę analityczną do szacowania czasu życia glutaminianu na błonach astrocytarnych na podstawie elektrofizjologicznych zapisów prądów transportera glutaminianu w astrocytach.

Abstract

Największe zagęszczenie transporterów glutaminianu w mózgu znajduje się w astrocytach. Transportery glutaminianu sprzężają ruch glutaminianu przez błonę z kotransportem 3 Na⁺ i 1 H⁺ oraz przeciwtransportem 1 K⁺. Prąd stechiometryczny generowany w procesie transportu może być monitorowany za pomocą zapisów z astrocytów z całych komórek. Przebieg czasowy rejestrowanego prądu jest kształtowany przez przebieg czasowy profilu stężenia glutaminianu, na który narażone są astrocyty, kinetykę transporterów glutaminianu oraz pasywne właściwości elektrotoniczne błon astrocytowych. W tym miejscu opisujemy metody eksperymentalne i analityczne, które można wykorzystać do rejestrowania prądów transportera glutaminianu w astrocytach i izolowania przebiegu w czasie klirensu glutaminianu od wszystkich innych czynników kształtujących przebieg prądów transportera astrocytarnego. Opisane tutaj metody można wykorzystać do oszacowania czasu życia glutaminianu uwalnianego w mgnieniu oka i uwalnianego synaptycznie na błonach astrocytarnych w dowolnym regionie ośrodkowego układu nerwowego podczas zdrowia i choroby.

Introduction

Astrocyty to jeden z najliczniejszych typów komórek w mózgu, o gwiaździstej morfologii i drobnych wypukłościach błony, które rozciągają się przez cały neuropil i docierają do sąsiednich kontaktów synaptycznych ^1,2. Błona komórkowa astrocytów jest gęsto upakowana cząsteczkami transportera glutaminianu ³. W warunkach fizjologicznych transportery glutaminianu szybko wiążą glutaminian po zewnątrzkomórkowej stronie błony i przenoszą go do cytoplazmy komórki. W ten sposób transportery utrzymują niskie podstawowe stężenie glutaminianu w przestrzeni zewnątrzkomórkowej ⁴. Transportery glutaminianu w drobnych procesach astrocytarnych sąsiadujący....

Protocol

1. Przygotowanie plastra

1. Przygotować 500 ml roztworu do krojenia/przechowywania zawierającego (w mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl₂, 1,3 MgSO,₄·_7H2O, 4 MgCl₂, 26,2_NaHCO3, 1_NaH2PO₄ i 22 glukozę, 320 mOsm, pH 7,4
2. Za pomocą zlewki o pojemności 250 ml przygotować komorę zanurzeniową na plastry, napełnić ją 200 ml roztworu do krojenia/przechowywania, ogrzać w łaźni wodnej o temperaturze 34 °C i zalać 95%_O2, 5% CO_{2 .}
3. Pozostały roztwór do krojenia/przechowywania przechowywać w szklanej butelce w temperaturze 4 °C.
4. Za pomocą kleju cyjanoa....

Results

Sukces opisanego tutaj podejścia analitycznego zależy przede wszystkim od uzyskania wysokiej jakości zapisów elektrofizjologicznych prądów transporterowych z astrocytów w dowolnym obszarze ośrodkowego układu nerwowego. W ostrych mysich wycinkach hipokampa astrocyty można łatwo zidentyfikować w świetle Dodt lub IR-DIC ze względu na ich małe ciało komórkowe (Ø = 10 μm) i wydatne jądro (ryc. 1). Ich charakterystyczną morfologię w kształcie gwiazdy można docenić za pomocą epifluorescencji, konfokalnej lub dw.......

Discussion

W tym miejscu opisujemy eksperymentalne podejście do uzyskiwania zapisów elektrofizjologicznych z astrocytów, protokół analityczny do izolowania prądów transportera glutaminianu w astrocytach oraz metodę matematyczną do wyznaczania przebiegu czasowego klirensu glutaminianu z prądów transportera astrocytarnego.

Powodzenie analizy zależy od możliwości uzyskania wysokiej jakości nagrań z astrocytów oraz od dokładności algorytmów dopasowania używanych do opisu prądów transporterowych. Analiza deko.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CGP52432	Tocris	1246
(R,S)-CPP	Tocris	173
DPCPX	Tocris	439
LY341495 sól disodowa	Tocris	4062
MSOP	Tocris	803
NBQX sól disodowa	Tocris	1044
D,L-TBOA	Tocis	1223
Pikrotoksyna	Sigma	P1675
MNI-L-glutaminian	Tocris	1490
Alexa 594	Life Technologies	A10438	Opcjonalne
elektrody matrycowe	Frederick Haer Company	MX21AES(JD3)
Kapilary ze szkła borokrzemianowego	World Precision Instruments	PG10165-4
Dwustopniowy szklany ściągacz do mikropipet	Narishige	PC-10
Loctite 404 klej błyskawiczny	Ted Pella	46551
Lampa Xe	Rapp OptoElectronic	FlashMic
Igor Pro 6	Wavemetrics