Wyznaczanie przebiegu czasowego klirensu glutaminianu za pomocą analizy dekonwolucyjnej prądów transporterowych astrocytarnych

Podsumowanie

Opisujemy metodę analityczną do szacowania czasu życia glutaminianu na błonach astrocytarnych na podstawie elektrofizjologicznych zapisów prądów transportera glutaminianu w astrocytach.

Streszczenie

Największe zagęszczenie transporterów glutaminianu w mózgu znajduje się w astrocytach. Transportery glutaminianu sprzężają ruch glutaminianu przez błonę z kotransportem 3 Na⁺ i 1 H⁺ oraz przeciwtransportem 1 K⁺. Prąd stechiometryczny generowany w procesie transportu może być monitorowany za pomocą zapisów z astrocytów z całych komórek. Przebieg czasowy rejestrowanego prądu jest kształtowany przez przebieg czasowy profilu stężenia glutaminianu, na który narażone są astrocyty, kinetykę transporterów glutaminianu oraz pasywne właściwości elektrotoniczne błon astrocytowych. W tym miejscu opisujemy metody eksperymentalne i analityczne, które można wykorzystać do rejestrowania prądów transportera glutaminianu w astrocytach i izolowania przebiegu w czasie klirensu glutaminianu od wszystkich innych czynników kształtujących przebieg prądów transportera astrocytarnego. Opisane tutaj metody można wykorzystać do oszacowania czasu życia glutaminianu uwalnianego w mgnieniu oka i uwalnianego synaptycznie na błonach astrocytarnych w dowolnym regionie ośrodkowego układu nerwowego podczas zdrowia i choroby.

Wprowadzenie

Astrocyty to jeden z najliczniejszych typów komórek w mózgu, o gwiaździstej morfologii i drobnych wypukłościach błony, które rozciągają się przez cały neuropil i docierają do sąsiednich kontaktów synaptycznych ^1,2. Błona komórkowa astrocytów jest gęsto upakowana cząsteczkami transportera glutaminianu ³. W warunkach fizjologicznych transportery glutaminianu szybko wiążą glutaminian po zewnątrzkomórkowej stronie błony i przenoszą go do cytoplazmy komórki. W ten sposób transportery utrzymują niskie podstawowe stężenie glutaminianu w przestrzeni zewnątrzkomórkowej ⁴. Transportery glutaminianu w drobnych procesach astrocytarnych sąsiadujących z synapsami pobudzającymi są idealnie ustawione do wiązania glutaminianu uwalnianego podczas zdarzeń synaptycznych, gdy dyfunduje on ze szczeliny synaptycznej. W ten sposób transportery ograniczają również rozlewanie się glutaminianu w kierunku regionów około- i pozasynaptycznych oraz do sąsiednich synaps, zmniejszając przestrzenne rozprzestrzenianie się sygnałów pobudzających w mózgu ^5-7.

Transport glutaminianu to proces elektrogeniczny sprzężony stechiometrycznie z ruchem 3 Na⁺ i 1 H⁺ wzdłuż ich gradientu elektrochemicznego oraz z przeciwtransportem 1 K^{+ 8}. Transport glutaminianu jest związany (ale nie jest z nim sprzężony stechiometrycznie) (ale nie jest z nim sprzężony) anionowy przewodność przepuszczalna dla SCN^- (tiocyjanianu) > NO₃^- (azotan) ≈ ClO₄^- (nadchloran) > I- > Br^- > Cl^- > F^-, nie do ^CH3 SO₃^- (sulfonian metanu) i C₆H₁₁O₇^- (glukonian) ^9-11. Oba prądy (stechiometryczny i niestechiometryczny) można zarejestrować, uzyskując zapisy całokomórkowe z astrocytów, wizualnie zidentyfikowane w świetle Dodt lub kontraście różnicowym interferencji podczerwieni (IR-DIC) w ostrych wycinkach mózgu ¹². Składowa stechiometryczna prądu związanego z transportem glutaminianu przez błonę może być izolowana za pomocą roztworów wewnątrzkomórkowych na bazie_CH3, SO_{, lub} C_{, 6}, H_{, 11},_O7 i może być wywoływana przez błyskawiczne uwalnianie glutaminianu na astrocytach ^13,14 lub przez aktywację uwalniania glutaminianu z sąsiednich synaps, elektrycznie ¹² lub z ukierunkowaną kontrolą optogenetyczną.

Przebieg czasowy stechiometrycznej składowej prądu transportera jest kształtowany przez czas życia profilu stężenia glutaminianu na błonach astrocytarnych (tj. klirens glutaminianu), kinetykę transporterów glutaminianu, pasywne właściwości błony astrocytów, a podczas stymulacji synaptycznej przez synchroniczność uwalniania glutaminianu przez aktywowane synapsy ¹³. Tutaj opisujemy szczegółowo: (1) eksperymentalne podejście do izolowania stechiometrycznej składowej prądów transportera glutaminianu z zapisów całokomórkowych patch-clamp z astrocytów przy użyciu ostrych mysich wycinków hipokampa jako przykładowego preparatu eksperymentalnego; (2) Analityczne podejście do wyprowadzenia przebiegu czasowego klirensu glutaminianu z tych zapisów ^13,14. Metody te mogą być używane do rejestrowania i analizowania prądów transportujących glutaminian z astrocytów w dowolnym regionie ośrodkowego układu nerwowego.

Protokół

1. Przygotowanie skrawków

1. Przygotuj 500 ml roztworu do krojenia/przechowywania zawierającego (w mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl₂, 1,3 MgSO₄·7H₂O, 4 MgCl₂, 26,2 NaHCO₃, 1 NaH₂PO₄ oraz 22 glukozy, 320 mOsm, pH 7,4
2. Używając zlewki o pojemności 250 ml, przygotuj komorę zanurzeniową dla skrawków, wypełnij ją 200 ml roztworem do krojenia/przechowywania, ogrzej w kąpieli wodnej do 34 °C i napowietrz mieszanką 95% O₂, 5% CO₂.
3. Pozostały roztwór do krojenia/przechowywania przechowuj w szklanej butelce w temperaturze 4 °C.
4. Za pomocą kleju cyjanoakrylowego przymocuj mały bloczek agaru (6%, przygotowany w ACSF) do uchwytu na próbkę w wibratomie i przechowuj go w temperaturze 4 °C.
5. Na 30 min przed rozpoczęciem krojenia umieść szklaną butelkę z roztworem do krojenia/przechowywania w wiadrze z lodem i napowietrz mieszanką 95% O₂, 5% CO₂.

Uwaga: w opisanych poniżej krokach sekcji kluczowe są szybkość i precyzja.

6. Zanurzyć głowę znieczyszonych halotanem lub izofluranem myszy (P14-21, C57BL/6; zgłoszono, że izofluran zwiększa astrocytarny wychwyt glutaminianu¹⁵) po przeprowadzeniu dekapitacji w zlewce o pojemności 50 ml zawierającej natleniony, zimny roztwór do krojenia i przechowywania.
7. Przeprowadzić dysekcję mózgu na wkładzie chłodzącym owiniętym ręcznikami papierowymi i przechowywanym w temperaturze -20 °C.
8. Za pomocą skalpela wykonać nacięcie skóry w linii pośrodkowej sagiście na grzbietowej stronie głowy, od końca przedniego do tylnego, i odsłonić czaszkę.
9. Umieścić dolne ostrze małych nożyczek chirurgicznych w otworze potylicznym i wykonać dwa cięcia, w stronę lewą oraz prawą (pod kątem 45°).
10. Przeciąć czaszkę wzdłuż linii pośrodkowej sagiście, od końca tylnego do przedniego.
11. Wyjąć mózg za pomocą szpatułki i zanurzyć go w natlenionym, zimnym roztworze do krojenia i przechowywania.
12. Za pomocą skalpela wykonać pięć cięć, aby: (1) usunąć cebulki węchowe i korę czołową; (2) usunąć móżdżek; (3) usunąć lewy oraz (4) prawy płat skroniowy; (5) rozdzielić dwie półkule mózgu cięciem pośrodkowym sagiście.
13. Osuszyć dwie części mózgu ręcznikami papierowymi, aby usunąć nadmiar roztworu.
14. Przykleić powierzchnię boczną każdego fragmentu mózgu do zimnej płyty podstawowej wibratomu: strona grzbietowa mózgu powinna być skierowana w stronę ostrza wibratomu; strona brzuszna mózgu powinna stykać się z blokiem agaru, z dala od ostrza wibratomu.
    Uwaga: aby uzyskać przekroje najwyższej jakości, ważne jest, aby obie części mózgu były mocno przyklejone do płyty podstawowej wibratomu. W tym celu należy użyć kleju cyjanoakrylowego, który nie jest zbyt rzadki i nie wysycha zbyt szybko.
15. Zamocować płytę podstawową wibratomu w komorze do dysekcji, ustawić grubość przekroju na 250 μm i zregulować szerokość przejścia ostrza. Przystąpić do krojenia.
    Uwaga: jeśli orientacja jest prawidłowa, wibratom powinien wycinać przekroje parasagitalne od strony grzbietowej w stronę brzusznej oraz od strony przyśrodkowej w stronę bocznej mózgu.
16. Po przejściu ostrza przez korę i hipokamp, odciąć skalpelem korę/hipokamp od śródmózgowia i umieścić każdy przekrój w komorze zanurzeniowej w temperaturze 34 °C.
17. Odrzucić pierwsze kilka przekrojów. Z mózgu myszy P14-21 można zazwyczaj uzyskać 12 przekrojów (o grubości 250 μm).
18. Przechowywać przekroje w temperaturze 34 °C przez 30 min, a następnie pozwolić im ostygnąć do temperatury pokojowej przez 30 min przed wykorzystaniem do rejestracji elektrofizjologicznych.

2. Identyfikacja i rejestracja astrocytów

1. Przygotować roztwór wewnętrzny zawierający (w mM): 120 KCH₃SO₃, 10 EGTA, 20 HEPES, 2 MgATP, 0.2 NaGTP, 5 QX-314Br oraz 5 NaCl, 290 mOsm, pH 7.2.
2. Przygotować zewnątrzkomórkowy roztwór rejestracyjny zawierający (w mM): 119 NaCl, 2.5 KCl, 2.5 CaCl₂, 1.3 MgSO₄·7H₂O, 1 MgCl₂, 26.2 NaHCO₃, 1 NaHPO₄ oraz 22 glukozy, 300 mOsm, pH 7.4, nasycony 95% O₂ i 5% CO₂.
3. Do zewnątrzkomórkowego roztworu rejestracyjnego dodać następujące leki w celu zablokowania aktywacji receptorów GluA, GluN, mGluRII, mGluRIII, GABA_A, GABA_B i adenozyny A1 (w μM): 10 sól disodowa 2,3-diokso-6-nitro-1,2,3,4-tetrahydrobenzo[ƒ]chinoksalin-7-sulfonianu (NBQX), 10 kwas (RS)-3-(2-karboksypiperazyn-4-ylo)-propyl-1-fosfonowy (CPP), sól disodowa kwasu (2S)-2-amino-2-[(1S,2S)-2-karboksycykloprop-1-ylo]-3-(ksant-9-ylo)propanowego (LY341495), 100 (R,S)-α-metyloseryno-O-fosforan (MSOP), 100 pikrotoksyny, 5 kwas 3-[[(3,4-dichlorofenylo)metylo]amino]propyl] dietoksymetylofosfinowy (CGP52432), 1 8-cyklopentylo-1,3-dipropyloksantynę (DPCPX).
4. Ustawić temperaturę roztworu zewnątrzkomórkowego w komorze rejestracyjnej; typowe temperatury mieszczą się w zakresie 34 - 36 °C.
5. Przygotować elektrody do techniki patch-clamp z kapilar borokrzemianowych (R ≈ 2.5 MΩ) przy użyciu dwustopniowego wyciągacza mikro-pipet szklanych.
6. Pobrać jeden z fragmentów tkanki i umieścić go w komorze rejestracyjnej. Przymocować go za pomocą metalowej harfy wykonanej z drutu platynowego i nylonowych nici.
7. Obejrzeć fragmenty tkanki pod oświetleniem Dodt lub IR-DIC. Astrocytów można zidentyfikować po małym ciele komórkowym (Ø = 10 μm) i wyraźnym jądrze (Rysunek 1).
8. Do stymulacji synaptycznych umieścić bipolarną elektrodę ze stali nierdzewnej w odległości ~100 μm od astrocytu, który ma zostać poddany rejestracji.
9. Wykonanie patchu astrocytu i przejście do konfiguracji whole-cell poprzez zastosowanie bardzo delikatnego podciśnienia.
   Uwaga: Astrocytach zazwyczaj charakteryzują się niską rezystancją wejściową (~10 MΩ), hiperpolaryzowanym spoczynkowym potencjałem błony (~-90 mV) i brakiem aktywności wyładowań. Astrocytów utrzymuje się w ich spoczynkowym potencjale błony przez cały czas trwania eksperymentów w trybie voltage-clamp (t.j. prąd podtrzymujący powinien wynosić 0 pA). Przed każdą stymulacją stosuje się 10 ms hiperpolaryzujący skok napięcia (-3 mV), aby monitorować rezystancję szeregową i wejściową astrocytu.
10. Odrzucić rejestracje, jeśli rezystancja szeregowa zmieni się o >20% lub jeśli potencjał błony astrocytu ulegnie depolaryzacji. Potencjał błony astrocytu można zmierzyć bezpośrednio, przełączając tryb z voltage-clamp na current-clamp. Alternatywnie, w trybie voltage-clamp potencjał błony można monitorować, odczytując wartość potencjału podtrzymującego, która skutkuje prądem podtrzymującym 0 pA.
11. W przypadku zastosowania stymulacji synaptycznych, stosować naprzemiennie pojedyncze i sparowane bodźce (np. w odstępie 100 msec), co 10 - 20 s.
12. Do eksperymentów z fotolizą UV podłączyć lampę ksenonową do odblokowywania w porcie epifluorescencyjnym mikroskopu i dodać związek „zamknięty” (caged) do roztworu zewnątrzkomórkowego. Prądy transporterowe o amplitudzie ~100 pA można uzyskać poprzez błyskawiczne odblokowanie 100 μM MNI-L-glutaminianu w całym polu widzenia (Ø = 662.5 μm przy użyciu obiektywu 40X ¹⁴). Stosować naprzemiennie stymulacje z otwartą i zablokowaną drogą optyczną co 10 - 20 s.
13. Wywołać przejścia glutaminianowe i rejestrować prądy transporterowe w warunkach kontrolnych oraz w obecności podnasycającego stężenia szerokospektrowego antagonisty transporterów glutaminianu, kwasu D,L-threo-β-benzyloasparginowego (TBOA; 10 μM), aby zredukować amplitudę prądu transporterowego do co najmniej 30% wartości kontrolnej (patrz sekcje 4, 5) lub w obecności wysokiego stężenia TBOA (50 - 100 μM), aby całkowicie zablokować prądy transporterowe i wyizolować trwały prąd K⁺ (patrz sekcja 3).

3. Farmakologiczna izolacja trwałego prądu K⁺

1. Zarejestruj prądy astrocytarne w warunkach kontrolnych oraz w obecności wysokiego, nasycającego stężenia TBOA (50 - 100 μM).
2. Uśrednij co najmniej 20 przebiegów w obecności TBOA (50 - 100 μM).
3. Dopasuj uśrednione ślady uzyskane w punkcie 3.2 do funkcji:
   
   Uwaga: komponent niewrażliwy na TBOA (t.j. ten, który jest rejestrowany w obecności TBOA (50 - 100 μM)) reprezentuje trwały prąd K⁺. Jego przebieg czasowy jest przybliżony powyższą funkcją mono-wykładniczą.
4. Powtórz to dopasowanie dla różnych astrocytów i wyznacz średnią wartość Τ_rise (t.j. średni czas wzrostu trwałego prądu K⁺ (patrz sekcja 5)).

4. Izolacja wspomaganej części prądów transporterów aktywowanych synaptycznie (fSTCs)

1. Oblicz średnią z co najmniej 20 rejestracji (sweep) uzyskanych przy stymulacjach sparowanych, w warunkach kontrolnych oraz w obecności TBOA (10 μM) (Rycina 2a lewa).
2. Oblicz średnią z identycznej liczby rejestracji uzyskanych przy pojedynczych stymulacjach, w warunkach kontrolnych oraz w obecności TBOA (10 μM) (Rycina 2a środek).
3. Porównaj amplitudę średniej odpowiedzi prądowej na skok napięcia do -3 mV w czterech uśrednionych przebiegach (pojedynczy impuls kontrolny, impulsy sparowane kontrolne, pojedynczy impuls TBOA, impulsy sparowane TBOA).
4. Jeśli amplituda odpowiedzi prądowej jest taka sama we wszystkich czterech przebiegach, przejdź do kroku 4.7.
5. Jeśli amplituda średniej odpowiedzi prądowej różni się w którymkolwiek z czterech przebiegów, sprawdź, czy wszystkie poszczególne rejestracje nadawały się do ujęcia w średniej.
6. Jeśli amplituda średniego prądu różni się w którymkolwiek z czterech przebiegów, ale wszystkie poszczególne rejestracje nadają się do ujęcia w średniej, zweryfikuj, czy w każdym przebiegu wielkość fSTC skaluje się liniowo z wielkością odpowiedzi prądowej na testowy skok napięcia. Jeśli tak jest, przeskaluj wszystkie przebiegi względem siebie tak, aby odpowiedzi prądowe na testowy skok napięcia miały taką samą amplitudę.
   Uwaga: W opisanych tutaj warunkach rejestracji (tj. wewnątrzkomórkowy CH₃SO₃^- lub C₆H₁₁O₇^-), stymulacje synaptyczne aksonów pobudzających generują prądy astrocytarne o złożonych kształtach fali, składające się z szybko narastającego przejściowego wewnątrzkomórkowego prądu stechiometrycznego oraz powolnie narastającego, trwałego prądu K⁺ w kierunku wewnątrzkomórkowym, odzwierciedlającego ponowne ustalanie równowagi K⁺ w przestrzeni zewnątrzkomórkowej po propagacji potencjału czynnościowego wzdłuż sąsiednich aksonów. Kluczowe jest usunięcie tego trwałego prądu K⁺, ponieważ jakikolwiek prąd resztkowy prowadziłby do przeszacowania czasu życia glutaminianu.
7. Odejmij średni przebieg uzyskany przy pojedynczych stymulacjach od średniego przebiegu uzyskanego przy stymulacjach sparowanych (Rycina 2a prawa). Krok ten pozwala wyizolować prąd stechiometryczny oraz trwały prąd K⁺ wywołany przez drugi bodziec.
8. Przesuń średni przebieg uzyskany przy pojedynczych stymulacjach o przedział czasowy odpowiadający interwałowi międzyimpulsowemu użytemu do podania impulsów sparowanych (tj. 100 msec) (Rycina 2b).
9. Odejmij przesuniętą w czasie średnią odpowiedź uzyskaną przy pojedynczych stymulacjach od średniej odpowiedzi na drugi bodziec uzyskanej w kroku 4.7 (Rycina 2c). Krok ten izoluje ułatwioną część prądu transportera wywołaną przez drugi bodziec (fSTC).
10. W większości przypadków poprzedni krok całkowicie usuwa trwały prąd K⁺. Jeśli tak się stanie, izolacja fSTC jest zakończona i można przystąpić do analizy dekonwolucyjnej oraz wyznaczyć przebieg czasowy usuwania glutaminianu z astrocytów. W niektórych przypadkach jednak wciąż obecny jest niewielki trwały prąd K⁺ (Rycina 2d) i wymagana jest dalsza analiza (patrz sekcja 5).
    Uwaga: pamiętaj, że analiza opisana w punktach 4.7-4.10 musi zostać przeprowadzona na średnich przebiegach uzyskanych w warunkach kontrolnych oraz w obecności TBOA (10 μM).

5. Odjęcie resztkowego prądu K⁺ od fSTC

1. Zmierz amplitudę utrzymującego się prądu K⁺ pozostałego po przeprowadzeniu analizy opisanej w sekcji 4.
2. Przeskaluj amplitudę funkcji monoeksponencjalnej opisanej w punkcie 3.3 do amplitudy pozostałego utrzymującego się prądu K⁺ zmierzonego w punkcie 5.1 (Rycina 2d lewa i środkowa). Aby to zrobić, w równaniu 3.3 przyjmij wartość członu A równą amplitudzie utrzymującego się prądu K⁺ zmierzonego w punkcie 5.1 oraz wartość członu Τ_rise równą średniej wartości Τ_rise oszacowanej w punkcie 3.4.
3. Odejmij otrzymaną funkcję monoeksponencjalną od fSTC i utrzymującego się prądu K⁺ uzyskanego w punkcie 4.10 (Rycina 2d prawa). Ten krok kończy izolację fSTC.

6. Izolacja prądów transporterów aktywowanych błyskiem (FTCs)

1. Wyciągnij średnią z co najmniej 20 przebiegów uzyskanych przy otwartej ścieżce świetlnej, w warunkach kontrolnych oraz w obecności TBOA (10 μM).
2. Wyciągnij średnią z identycznej liczby przebiegów uzyskanych przy zamkniętej ścieżce świetlnej, w warunkach kontrolnych oraz w obecności TBOA (10 μM).
3. Porównaj amplitudę odpowiedzi prądowej na skok napięcia do -3 mV w czterech uśrednionych śladach (kontrola pojedynczy impuls, kontrola impulsy parowane, TBOA pojedynczy impuls, TBOA impulsy parowane).
4. Jeśli amplituda odpowiedzi prądowej jest taka sama we wszystkich czterech śladach, przejdź do kroku 6.7.
5. Jeśli amplituda średniej odpowiedzi prądowej różni się w którymkolwiek z czterech śladów, sprawdź, czy wszystkie poszczególne przebiegi nadawały się do włączenia do średniej.
6. Jeśli amplituda średniego prądu różni się w którymkolwiek z czterech śladów, ale wszystkie poszczególne przebiegi nadają się do włączenia do średniej, zweryfikuj, czy w każdym śladzie z otwartą ścieżką świetlną wielkość FTC skaluje się liniowo z wielkością odpowiedzi prądowej na testowy skok napięcia. Jeśli tak jest, przeskaluj wszystkie ślady względem siebie tak, aby odpowiedzi prądowe na testowy skok napięcia miały taką samą amplitudę.
   Uwaga: w opisanych tutaj warunkach rejestracji (tj. wewnątrzkomórkowy CH₃SO₃^- lub C₆H₁₁O₇^-), bodźce błyskowe generują prądy astrocytarne składające się wyłącznie z szybko narastającego, przejściowego stechiometrycznego prądu wewnątrzpochodnego.
7. Odejmij średni ślad uzyskany przy zablokowanej ścieżce świetlnej od średniego śladu uzyskanego przy otwartej ścieżce świetlnej. Krok ten pozwala na usunięcie artefaktu bodźca i wyizolowanie FTC.
   Uwaga: analiza opisana w punkcie 6.7 musi zostać przeprowadzona na średnich śladach uzyskanych w warunkach kontrolnych i w obecności TBOA (10 μM).

7. Analiza dekonwolucji

1. Dopasuj funkcję wielo-wykładniczą do prądu transportera (fSTC lub FTC) zarejestrowanego w warunkach kontrolnych (Ryc. 3a lewa strona) oraz w obecności TBOA (10 μM) (Ryc. 3a prawa strona), wyizolowanego zgodnie z opisem w sekcjach 4 - 6:
   
2. Utwórz funkcję natychmiastowo rosnącą, która zanika mono-wykładniczo zgodnie z funkcją:
   
   która najlepiej opisuje fazę zaniku prądu transportera zarejestrowanego w TBOA (10 μM) (Ryc. 3b).
   Uwaga: funkcja opisana w punkcie 7.2 (tj. H(t)) reprezentuje przebieg czasowy usuwania glutaminianu z astrocytów w obecności TBOA (10 μM).
3. Wykonaj dekonwolucję funkcji mono-wykładniczej uzyskanej w punkcie 7.2 (Ryc. 3b oraz 3c środek) z dopasowania prądu transportera zarejestrowanego w TBOA (10 μM), uzyskanego w punkcie 7.1 (Ryc. 3a prawa strona, c lewa strona).
   Uwaga: dekonwolucja jest operacją matematyczną dostępną w wielu pakietach oprogramowania analitycznego (np. Matlab, Python). W IgorPro, kodzie programistycznym zazwyczaj używanym do tego rodzaju analiz, operację dekonwolucji można efektywnie obliczyć za pomocą dyskretnych szybkich transformat Fouriera, zgodnie z poniższym opisem. Najpierw użyj operacji FFT, aby obliczyć dyskretną szybką transformatę Fouriera funkcji mono-wykładniczej uzyskanej w punkcie 7.2 oraz dopasowania prądu transportera zarejestrowanego w TBOA uzyskanego w punkcie 7.1. Następnie użyj operacji IFFT, aby obliczyć odwrotną dyskretną szybką transformatę Fouriera stosunku dwóch funkcji FFT. Wynikową funkcję I(t) można opisać w następujący sposób:
   
   Krok opisany w punkcie 7.3 pozwala na wyprowadzenie filtra prądu transportera w TBOA (10 μM) (Ryc. 3c prawa strona). Filtr ten reprezentuje czynniki zniekształceń, które przekształcają czas trwania obecności glutaminianu w błonach astrocytarnych w prąd transportera wyizolowany w sekcjach 4 - 6 (tj. fSTC lub FTC).
4. Wykonaj dekonwolucję filtra (Ryc. 3c prawa strona, Ryc. 3d środek) z dopasowania prądu transportera w warunkach kontrolnych (Ryc. 3a lewa strona, Ryc. 3d lewa strona).
   Uwaga: krok ten pozwala na wyprowadzenie przebiegu czasowego usuwania glutaminianu z astrocytów w warunkach kontrolnych (Ryc. 3d prawa strona). Założeniem leżącym u podstaw tego etapu dekonwolucji jest to, że profil czasowy filtra pozostaje niezmieniony w warunkach kontrolnych oraz w TBOA (10 μM).
5. Aby uzyskać ilościową ocenę całkowitego przebiegu czasowego usuwania glutaminianu, oblicz centroid () kształtu fali uzyskanego w kroku 7.4. Należy to zrobić, obliczając jako:
   
   gdzie G(t) to kształt fali uzyskany w kroku 7.1. W powyższym równaniu termin t odpowiada oknu czasowemu, dla którego obliczana jest całka.
   Uwaga: podczas pierwszego opracowania tej metody, obliczano w oknach czasowych, które nie były ograniczone ¹³. Takie podejście można stosować tak długo, jak okno całkowania jest ustawione szerzej niż czas trwania usuwania glutaminianu, a kształt fali usuwania całkowicie powraca do linii bazowej. Jeśli jednak tak nie jest, ta metoda szacowania napotyka pewne ograniczenia. Na przykład, jeśli kształt fali usuwania nie powraca dokładnie do linii bazowej, wtedy zwiększa się wraz z szerokością okna całkowania. Aby uniknąć potencjalnych błędów w szacowaniu , obecnie obliczamy go w oknie czasowym odpowiadającym 10% piku prądu transportera, przed i po jego wystąpieniu ¹⁴. To drugie podejście poprawia spójność pomiarów między komórkami. Jest to szczególnie przydatne przy analizie niewielkich efektów działań farmakologicznych na przebieg czasowy usuwania.

Wyniki

Sukces opisanego tutaj podejścia analitycznego zależy w sposób krytyczny od uzyskania wysokiej jakości zapisów elektrofizjologicznych prądów transporterowych z astrocytów w dowolnym regionie ośrodkowego układu nerwowego. W ostrych skrawkach hipokampa myszy astrocyty można łatwo zidentyfikować przy użyciu oświetlenia Dodt lub IR-DIC ze względu na ich małe ciało komórki (Ø = 10 μm) i wyraźne jądro (Rysunek 1). Ich charakterystyczna, gwiaździsta morfologia jest widoczna w mikroskopii epifluorescencyjnej, ko...

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy eksperymentalne podejście do uzyskiwania zapisów elektrofizjologicznych z astrocytów, protokół analityczny do izolowania prądów transportera glutaminianu w astrocytach oraz metodę matematyczną do wyznaczania przebiegu czasowego klirensu glutaminianu z prądów transportera astrocytarnego.

Powodzenie analizy zależy od możliwości uzyskania wysokiej jakości nagrań z astrocytów oraz od dokładności algorytmów dopasowania używanych do opisu prądów transporterowych. Analiza deko...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
CGP52432	Tocris	1246
(R,S)-CPP	Tocris	173
DPCPX	Tocris	439
LY341495 sól disodowa	Tocris	4062
MSOP	Tocris	803
NBQX sól disodowa	Tocris	1044
D,L-TBOA	Tocis	1223
Pikrotoksyna	Sigma	P1675
MNI-L-glutaminian	Tocris	1490
Alexa 594	Life Technologies	A10438	Opcjonalne
elektrody matrycowe	Frederick Haer Company	MX21AES(JD3)
Kapilary ze szkła borokrzemianowego	World Precision Instruments	PG10165-4
Dwustopniowy szklany ściągacz do mikropipet	Narishige	PC-10
Loctite 404 klej błyskawiczny	Ted Pella	46551
Lampa Xe	Rapp OptoElectronic	FlashMic
Igor Pro 6	Wavemetrics