Artykuł metodologiczny

Ilościowy test migracji komórek dla mysich jelitowych progenitorów nerwowych

DOI:

10.3791/50709

⸱

18 września 2013

 ,  , 
1Molecular Genetics of Development Laboratory, Biological Sciences, UQAM

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy test migracji komórek ex vivo, który pozwala na precyzyjne określenie potencjału migracji komórek grzebienia nerwowego jelit w obecności różnych czynników wzrostu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki grzebienia nerwowego (NCC) to przejściowa i multipotencjalna populacja komórek, która wywodzi się z grzbietowej cewy nerwowej i intensywnie migruje w rozwijającym się zarodku kręgowców. Oprócz dostarczania obwodowych komórek glejowych i neuronów, NCC generuje melanocyty, a także większość szkieletu czaszkowo-twarzowego. Migracja i różnicowanie NCC jest kontrolowane przez połączenie ich osiowego pochodzenia wzdłuż cewy nerwowej i ich ekspozycji na regionalnie odrębne sygnały zewnątrzkomórkowe. Taki udział ligandów zewnątrzkomórkowych jest szczególnie widoczny podczas tworzenia jelitowego układu nerwowego (ENS), złożonej, połączonej ze sobą sieci zwojów nerwowych, która lokalnie kontroluje (między innymi) ruchy mięśni jelitowych i motorykę jelit. Większość ENS pochodzi z małej początkowej puli NCC, które podejmują długą podróż w celu skolonizowania - w sposób rostralny do ogonowego - na całej długości jelita perspektywicznego. Spośród kilku szlaków sygnałowych, o których wiadomo, że wpływają na kolonizację jelitowej NCC, sygnalizacja GDNF / RET jest uznawana za najważniejszą. Rzeczywiście, czasoprzestrzennie kontrolowane wydzielanie liganda RET GDNF przez mezenchymę jelitową jest głównie odpowiedzialne za przyciąganie i kierowanie jelitowym NCC z ekspresją RET do i wewnątrz jelita embrionalnego. W tym miejscu opisujemy test migracji komórek ex vivo, wykorzystujący transgeniczną linię myszy posiadającą fluorescencyjnie znakowane NCC, co pozwala na precyzyjne określenie ilościowe potencjału migracji NCC jelitowego w obecności różnych czynników wzrostu, w tym GDNF.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki grzebienia nerwowego (NCC) są przejściowym typem komórek unikalnym dla kręgowców, który tworzy wiele pochodnych podczas rozwoju zarodka. Ta populacja komórek powstaje na granicy płytki nerwowej, w sąsiedztwie ektodermy nieneuronalnej1. Podczas neurulacji zginanie płytki nerwowej umieszcza NCC wzdłuż grzbietowej krawędzi tworzącej cewy nerwowej. NCC przechodzi następnie przejście nabłonkowo-mezenchymalne, segregując się i migrując z dala od cewy nerwowej. NCC kolonizują różne struktury embrionalne, w tym przewód pokarmowy, gdzie tworzą cały jelitowy układ nerwowy (ENS), połączoną sieć zwojów nerwowych osadzonych w ścianie jelita. Jak niedawno dokonano przeglądu2,3, wiele genów było zaangażowanych w rozwój tej skomplikowanej struktury.

Większość ENS pochodzi z małej puli NCC pochodzącej z cewy nerwowej nerwu błędnego (tj. wokół potencjalnej granicy tyłomózgowia i rdzenia kręgowego)4. Te neuronalne komórki progenitorowe docierają do jelita przedniego około dnia embrionalnego (e) 9,0 u myszy, a następnie migrują doogonowo w mezenchymie jelitowej do około e15,0, aby skolonizować całe jelita embrionalne. Niewielki podzbiór progenitorów nerwowych okrężnicy jest również zapewniony przez krzyżowe NCC, które atakują tylne jelito w przeciwnym kierunku aż do jelita ślepego4. Zarówno NCC nerwu błędnego, jak i krzyżowego wymaga wielu sygnałów promujących migrację, proliferację, przeżycie i różnicowanie, aby zapewnić pełne uformowanie ENS. W związku z tym modele zwierzęce - zwłaszcza genetycznie modyfikowane myszy - odegrały zasadniczą rolę w identyfikacji kilku niezbędnych ligandów zewnątrzkomórkowych: GDNF (czynnik neurotroficzny pochodzący z komórek glejowych), Endotelina-3, Neurotrofina-3, BMP (białka morfogenne kości), Netrin, a także Sonic i Indian Hedgehog (Shh i Ihh)5-10. Spośród nich sygnalizacja GDNF przez transbłonowy receptor kinazy tyrozynowej RET (Rearranged during transfekcji) jest uznawana za najbardziej krytyczną ścieżkę przyciągania i prowadzenia NCC do i w obrębie jelita embrionalnego. GDNF jest wydzielany przez mezenchymę jelitową i tworzy przestrzennie kontrolowany gradient rosrrocaudalny, który jest bezpośrednio chemoatrakcyjny dla jelitowego NCC, który wyraża RET11,12.

Wśród innych funkcji, ENS reguluje ruch w przewodzie pokarmowym poprzez interakcję z mięśniami gładkimi w ścianie jelita. Brak zwojów nerwowych w końcowym obszarze jelita powoduje chorobę Hirschsprunga: toniczny skurcz dotkniętego odcinka prowadzi do zablokowania, akumulacji strawionego materiału i masywnego rozdęcia jelit i brzucha. Choroba Hirschsprunga występuje u około jednego na 5 000 żywych urodzeń. Uważa się, że głównym czynnikiem przyczyniającym się do etiologii choroby Hirschsprunga jest wzorzec migracji doogonowej jelitowej NCC. Okrężnica, najbardziej oddalona od źródła migrującego NCC i ostatnia część jelita do skolonizowania, jest najbardziej podatna na defekty w tworzeniu ENS. Ze względu na kluczową rolę w migracji NCC do jelita, zakłócenie sygnalizacji GDNF/RET jest główną znaną przyczyną genetyczną choroby Hirschsprunga13.

Aby lepiej zbadać rozwój NCC i ENS, wygenerowaliśmy transgeniczną linię myszy - nazwaną Gata4p[5kb]-GFP14 - w której migrujące NCC są znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Następnie udoskonaliliśmy test migracji komórek ex vivo, zaadaptowany na podstawie opublikowanych prac innych grup11,12,15, który obecnie umożliwia precyzyjne ilościowe określenie potencjału migracji NCC jelita w obecności różnych czynników wzrostu, takich jak GDNF.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oświadczenie etyczne

Eksperymenty na myszach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady Opieki nad Zwierzętami dotyczącymi opieki i manipulacji zwierzętami wykorzystywanymi w badaniach medycznych. Protokoły dotyczące manipulacji zwierzętami zostały zatwierdzone przez instytucjonalną komisję etyczną Uniwersytetu Quebec w Montrealu (Comité Institutionnel de Protection des Animaux; numer referencyjny 0512-R3-650-0513).

1. Przygotowanie żeli kolagenowych

Pracuj w sterylny sposób, pod kapturem do hodowli tkankowej.

  1. Przygotuj kompletne 5x DMEM (zmodyfikowana pożywka eteryczna Eagle'a), w tym standardowe antybiotyki. Rozpuścić 3,37 g proszku DMEM i 0,925 g NaHCO3 w 20 ml wody. Sterylizować, przechodząc przez filtr 0,22 μm. Dodać 2,5 ml sterylnej 100x penicyliny/streptomycyny i 25 ml sterylnej, inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Na lodzie wymieszać 800 μl roztworu kolagenu I (3,77 mg/ml w 0,02 N kwasie octowym, sterylizowanym filtrem), 600 μl kompletnego 5x DMEM i 17 μl 1 N NaOH. Rozcieńczyć sterylną wodą do końcowej objętości 3 ml. Uwzględnij w tym zestawie odpowiednie czynniki wzrostu. Zwykle używamy GDNF w stężeniu 10 ng/ml w celu stymulacji migracji NCC jelitowej.
  3. Umieścić około 480 μl w każdym dołku z jednego rzędu na płytce 24-dołkowej. Unikaj bąbelków. Pozostałe rzędy można wykorzystać do przetestowania wpływu innych czynników wzrostu na migrację komórek.
  4. Pozostawić kolagen do polimeryzacji przez co najmniej 1 godzinę w sterylnym inkubatorze w temperaturze 37 °C.

2. Sekcja zwierząt16

  1. Ustaw krycia i sprawdź, czy następnego ranka nie ma czopów dopochwowych. Dzień e0,5 w południe w dniu znalezienia czopa pochwowego należy odizolować samicę i odczekać 12 dni do e12,5.
  2. Znieczulić ciężarne myszy izofluranem i poddać eutanazji przez wdychanie CO2 .
  3. Spryskaj mysz 70% etanolem. Podnieś skórę brzucha i otwórz jamę brzuszną nożyczkami preparacyjnymi.
  4. Wyjmij macicę do szklanej szalki Petriego wypełnionej lodowatym PBS (solą fizjologiczną buforowaną fosforanami). Przeciąć macicę poprzecznie między poszczególnymi obrzękami zarodka, aby wyizolować każde miejsce implantacji zarodka.
  5. Pracuj nad każdym miejscem implantacji osobno na innej szklanej szalce Petriego wypełnionej lodowatym PBS. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj cienkich kleszczy, aby usunąć warstwę mięśniową macicy.
  6. Otwórz woreczek żółtkowy trzewny i owodnię, aby odsłonić zarodek. Należy zachować ostrożność podczas przecinania naczyń krwionośnych łączących zarodek z łożyskiem/woreczkiem żółtkowym trzewnym, ponieważ są one splecione z rozwijającymi się jelitami.
  7. Odetnij głowę zarodka na szyi.
  8. Włóż zamknięte kleszcze do jamy brzusznej zarodka, tuż nad ciemnoczerwoną wątrobą i pozwól kleszczom otworzyć się (przestań wywierać nacisk), aby zrobić poprzeczny otwór w jamie brzusznej. Pociągnij otwarte kleszcze w dół w kierunku tylnego końca zarodka, aby całkowicie otworzyć brzuch.
  9. Chwyć tkankę łączną za wątrobą i wyciągnij wnętrzności z brzucha, uważając, aby nie uszkodzić jelit (okrężnica jest przyczepiona do odbytu).
  10. Przetnij okrężnicę, aby uwolnić wnętrzności od reszty zarodka. Cięcie można wykonać w dowolnym miejscu wzdłuż okrężnicy. Zarezerwuj część ogonową na później.
  11. Usuń tkankę łączną z jelita ślepego, a następnie resztę jelit. Uważaj, aby nie zranić przy tym jelit.
  12. Odetnij wątrobę i żołądek (na rostralnym końcu jelita cienkiego), a także śródnerce i grzbiety narządów płciowych, jeśli są obecne.
  13. Odizoluj jelito cienkie. Ponownie uważaj, aby nie ugryźć jelita. Od teraz orientację rosrrocaudal tkanki jelitowej można śledzić za pomocą ostrej krzywizny występującej na końcu rostralnym. Pozostawić jelito cienkie w PBS w temperaturze pokojowej na jak najkrótszy czas przed osadzeniem (patrz krok 3.3).
  14. Na koniec zapisz liczbę somitów ogonowych dla każdego zarodka, aby dokładnie określić etap rozwoju embrionalnego.

3. Sekcja jelit embrionalnych

  1. Przed przystąpieniem do sekcji zarodków należy rozpuścić 1,5 g agarozy w 100 ml PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) i przechowywać w temperaturze 50 °C.
  2. Wlej stopioną agarozę do formy do zatapiania (np. zamkniętej probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml, która została przecięta wzdłuż, aby wyciąć około 1/4 ścianki probówki). Pozwól agarozie ostygnąć do około 42-45 °C, powinna być tylko lekko ciepła w dotyku.
  3. Osadź jelito embrionalne tuż przed zestaleniem się agarozy (można to ocenić za pomocą końcówek kleszczy i nastąpi to około 36-38 °C). Trzymając jelito kleszczami za złożony koniec rostralny, przeciągnij je bardzo powoli przez agarozę wzdłuż formy. Pomaga to utrzymać jelita prosto, podczas gdy agaroza tężeje. Uwolnij tkankę, gdy tylko zacznie opierać się ruchom. Śledź orientację rostralno-ogonową jelit.
  4. Wstaw foremkę do lodówki na 2-3 minuty, aby upewnić się, że agaroza całkowicie stwardniała.
  5. Wyjmij agarozę z formy (wysuwając ją z otwartej rurki Eppendorfa). Za pomocą ostrza usuń nadmiar agarozy na obu końcach, wykonując nacięcia prostopadłe do jelita.
  6. Przyklej rostralny koniec bloku jelita/agarozy na metalowym stoliku mikrotomu za pomocą wibrującego ostrza. Przytnij nadmiar agarozy po bokach bloku jelitowego/agarozowego.
  7. Zamontuj metalowy stolik na wibrującej komorze mikrotomu. W razie potrzeby dostosuj kąt etapu tak, aby jelito było jak najbardziej pionowe (a więc prostopadłe do ostrza). Przykryj próbkę lodowatym PBS. Zmniejsz ostrze mikrotomu do kilku milimetrów pod powierzchnię bufora.
  8. Wykonaj wibratome poprzeczne nacięcia jelita cienkiego o grubości 200 μm, upewniając się, że każdy plasterek agarozy zawiera pełny wycinek jelita.

4. Kultura eksplantatów jelitowych

  1. Delikatnie umieść świeżo ścięte plastry jelita/agarozy płasko na żelach kolagenowych za pomocą kleszczy, umieszczając jeden plasterek w kierunku środka każdej studzienki.
  2. Inkubować przez 3 dni w temperaturze 37 °C, w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO2 , aby umożliwić migrację NCC z eksplantatu.
  3. Bardzo delikatnie zdejmij plastry jelita/agarozy z żelu kolagenowego za pomocą kleszczy. Uważaj, aby nie uszkodzić znajdującego się poniżej żelu.
  4. Unikaj dotykania żelu kolagenowego bezpośrednio podczas kolejnych etapów inkubacji i mycia, aby upewnić się, że wzorzec migracji komórek nie zostanie zakłócony. Utrwalić za pomocą 500 μl 4% PFA (paraformaldehydu) (w PBS) na studzienkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  5. Zastąp utrwalacz 500 μl roztworu DAPI (4',6-diamidyn-2-fenyloindolowego) (5 μg/ml w PBS) na basenik i inkubuj 10 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Myć każdą studzienkę 3x 500 μl PBS przez 5 min.
  7. Sfotografuj komórki fluorescencyjne (kanały GFP i DAPI) osadzone w żelu kolagenowym w każdym dołku.

5. Analiza obrazu

Intensywnie korzystaliśmy z ImageJ17 do przetwarzania i ilościowego określania obrazów generowanych po hodowli eksplantatów.

  1. Zacznij od zobrazowania szkiełka mikrometrycznego w tym samym powiększeniu, co zdjęcia komórek fluorescencyjnych. Zmierz długość jednego mikrona w pikselach (za pomocą narzędzia Linia prosta).
  2. Ustaw skalę (Analizuj/Ustaw skalę; wprowadź liczbę pikseli/mikron).
  3. Dla każdego zdjęcia fluorescencyjnego GFP zmień format obrazu na 8-bitową skalę szarości (Obraz/Typ/8-bitowy).
  4. Dostosuj intensywność sygnału (Obraz/Regulacja/Jasność/Kontrast).
  5. W razie potrzeby odejmij szum tła (Proces/Odejmij tło; dostosuj promień toczącej się piłki).
  6. Ustaw próg, aby podświetlić komórki i skupiska komórek (Obraz/Dostosuj/Próg), a następnie zastosuj zlewnię, aby podzielić kępy (Proces/Binarny/Zlewnia).
  7. Analizuj cząstki, aby określić obszary zainteresowania (ROI) i generować statystyki liczby komórek (Analizuj/Analizuj cząstki; ustaw minimalny rozmiar, aby wykluczyć pozostałe piksele).
  8. Ustaw opcje pomiaru tak, aby uwzględniały średnicę Fereta (Analizuj/Ustaw pomiary).
  9. Grupuj ROI i mierz jako całość, aby określić średnicę Feret, wskazanie rozmieszczenia komórek (Analiza/Narzędzia/Menedżer ROI/Więcej/OR, następnie Menedżer ROI/Dodaj i Menedżer ROI/Pomiar).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poniższe wyniki są reprezentatywne dla tego, co można uzyskać za pomocą opisanej tutaj techniki (Rysunek 1). Zastosowanie czynników wzrostu (tj. GDNF) stymuluje migrację jelitowego NCC z ekspresją GFP z eksplantatu jelitowego do żelu kolagenowego (ryc. 2). Chociaż niektóre komórki wychodzą z eksplantatu przy braku czynników wzrostu, w większości nie są one znakowane GFP i stanowią pasywne wejście. Konieczne jest usunięcie wycinka jelitowego z żelu kolagenowego w celu zarejestrow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pokazujemy, w jaki sposób nasza technika hodowli eksplantatów ex vivo może być wykorzystana do precyzyjnego określenia ilościowego potencjału migracji NCC w jelitach w obecności GDNF. Tak precyzyjna kwantyfikacja jest znacznie ułatwiona dzięki użyciu wibratotycznych skrawków jelit o grubości 200 μm zamiast dużych kawałków o przybliżonej wielkości, jak opisano wcześniej11,12,15. Rzeczywiście, pozwala nam to pracować z rozsądną liczbą komórek w wysoce powtarzalnym otoczeniu. Warto zauważyć, że równomier...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Denisowi Flipo za porady dotyczące przetwarzania i analizy obrazu, oraz Davidowi W. Silversidesowi, w którego laboratorium wygenerowano linię myszy Gata4p[5kb]-GFP. Badania w laboratorium Pilon są finansowane przez CIHR, NSERC, FRQS i FRQNT.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM w proszkuŻubr219-010-XK 
NaHCO3BioshopSOB999
filtracji próżniowej Steriflip klasy biotechnologicznej (0,22 mikrona)EMD MilliporeSCGP00525 
Roztwór penicyliny-streptomycyny, 100xŻubr450-201-EL 
Płodowa surowica bydlęcaŻubr095-150Wysokiej jakości
Kolagen IBD biosciences354236 
NaOHBioshopSHY700Rozcieńczony z 10 N bulionu, a następnie sterylnie przefiltrowany
GDNFCedarlaneCLCYT305 
Falcon 24-dołkowa płytkaBD biosciences353047 
Nożyczki preparacyjneFisher Scientific089515 
Szklana szalka PetriegoVWR89000-306 
PBSSigmaP5493klasy hodowli komórkowych
LeicaM125 
Dumont #5 KleszczeNarzędzia do nauki11251-20 
AgaroseBioshopAGA001klasy biotechnologicznej
Pióro21 
Uniwersalny długopis z klejem błyskawicznym Krazy GlueKG824 
HM 650V Mikrotom z ostrzem wibracyjnymThermo Scientific920110 
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148 
DAPISigma-AldrichD9564 

Tabela konkretnych odczynników i sprzętu.

System Mikroskop preparacyjny Ostrze chirurgiczne

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bronner, M. E., Le Douarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: An overview. Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).
  2. Bergeron, K. F., Silversides, D. W., Pilon, N. The developmental genetics of Hirschsprung's disease. Clin. Genet. 83 (1), 15-22 (2013).
  3. Obermayr, F., Hotta, R., Enomoto, H., Young, H. M. Development and developmental disorders of the enteric nervous system. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 10 (1), 43-57 (2012).
  4. Sasselli, V., Pachnis, V., Bursn, A. J. The enteric nervous system. Dev. Biol. 366 (1), 64-73 (2012).
  5. Sanchez, M. P., Silos-Santiago, I., et al. Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacking GDNF. Nature. 382 (6586), 70-73 (1996).
  6. Baynash, A. G., Hosoda, K., et al. Interaction of endothelin-3 with endothelin-B receptor is essential for development of epidermal melanocytes and enteric neurons. Cell. 79 (7), 1277-1285 (1994).
  7. Chalazonitis, A., Pham, T. D., et al. Neurotrophin-3 is required for the survival-differentiation of subsets of developing enteric neurons. J. Neurosci. 21 (15), 5620-5636 (2001).
  8. Goldstein, A. M., Brewer, K. C., Doyle, A. M., Nagy, N., Roberts, D. J. BMP signaling is necessary for neural crest cell migration and ganglion formation in the enteric nervous system. Mech. Dev. 122 (6), 821-833 (2005).
  9. Jiang, Y., Liu, M. T., Gershon, M. D. Netrins and DCC in the guidance of migrating neural crest-derived cells in the developing bowel and pancreas. Dev. Biol. 258 (2), 364-384 (2003).
  10. Ramalho-Santos, M., Melton, D. A., McMahon, A. P. Hedgehog signals regulate multiple aspects of gastrointestinal development. Development. 127 (12), 2763-2772 (2000).
  11. Natarajan, D., Marcos-Gutierrez, C., Pachnis, V., de Graaf, E. Requirement of signaling by receptor tyrosine kinase RET for the directed migration of enteric nervous system progenitor cells during mammalian embryogenesis. Development. 129 (22), 5151-5160 (2002).
  12. Young, H. M., Hearn, C. J., et al. GDNF Is a chemoattractant for enteric neural cells. Dev. Biol. 229 (2), 503-516 (2001).
  13. Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J. Med. Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
  14. Pilon, N., Raiwet, D., Viger, R. S., Silversides, D. W. Novel pre- and post-gastrulation expression of Gata4 within cells of the inner cell mass and migratory neural crest cells. Dev. Dyn. 237 (4), 1133-1143 (2008).
  15. Nagy, N., Goldstein, A. M. Endothelin-3 regulates neural crest cell proliferation and differentiation in the hindgut enteric nervous system. Dev. Biol. 293 (1), 203-217 (2006).
  16. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersen, K., Behringer, R. Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , 3rd ed, CSH Press. Cold Spring Harbor. 209-250 (2003).
  17. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  18. Byth, K. F., Thomas, A., et al. AZD5438, a potent oral inhibitor of cyclin-dependent kinases 1, 2, and 9, leads to pharmacodynamic changes and potent antitumor effects in human tumor xenografts. Mol. Cancer Ther. 8 (7), 1856-1866 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Fluorescencyjne kom rki grzebienia neuronalnegowibrotominkubacja w elu kolagenowymmikroskopia fluorescencyjnasygnalizacja GDNFsekcja jelita embrionalnegozatapianie w agaroziestymulacja czynnikami wzrostu

Powiązane artykuły