Szybka i skuteczna metoda oceny patogenności Ustilago maydis na liniach kukurydzy i teosinte

Summary

Opisano użycie metody iniekcji igłą do inokulacji roślin kukurydzy i teosinte biotroficznym patogenem Ustilago maydis. Metoda inokulacji igłowej ułatwia kontrolowane dostarczanie patogenu grzybowego między liście rośliny, gdzie patogen dostaje się do rośliny poprzez tworzenie appresorii. Metoda ta jest bardzo skuteczna, umożliwiając powtarzalne inokulacje U. maydis.

Abstract

Kukurydza jest główną uprawą zbóż na całym świecie. Jednak podatność na patogeny biotroficzne jest głównym ograniczeniem zwiększającym produktywność. U. maydis jest biotroficznym patogenem grzybowym i czynnikiem wywołującym pleśń kukurydzianą na kukurydzy. Choroba ta jest odpowiedzialna za znaczne straty w plonach w wysokości około 1,0 miliarda dolarów rocznie w Stanach ^{Zjednoczonych.1} Obecnie do zwalczania pleśni kukurydzianej^stosuje się kilka metod, w tym płodozmian, stosowanie fungicydów i zaprawianie nasion. Jednak oporność żywiciela jest jedyną praktyczną metodą radzenia sobie z głownią kukurydzianą. Identyfikacja roślin uprawnych, w tym kukurydzy, pszenicy i ryżu, które są odporne na różne patogeny biotroficzne, znacznie zmniejszyła straty plonów rocznie^3-5. W związku z tym zastosowanie metody inokulacji patogenów, która skutecznie i powtarzalnie dostarcza patogen między liście rośliny, ułatwiłoby szybką identyfikację linii kukurydzy odpornych na U. maydis. Pierwszym krokiem w kierunku identyfikacji linii kukurydzy odpornych na U. maydis było zastosowanie metody inokulacji metodą iniekcji igłowej oraz metody przesiewowej reakcji odporności w celu inokulacji kukurydzy, teosinte i linii introgresji kukurydzy x teosinte szczepem U. maydis oraz selekcji odpornych roślin.

Linie introgresji kukurydzy, teosinte i kukurydzy x teosinte, składające się z około 700 roślin, zostały zasadzone, zaszczepione szczepem U. maydis i przebadane pod kątem odporności. Metody inokulacji i badań przesiewowych z powodzeniem zidentyfikowały trzy linie teosinte odporne na U. maydis. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół inokulacji iniekcyjnej igłą i przesiewowego badania przesiewowego reakcji oporności dla linii introgresji kukurydzy, teosinte i kukurydzy x teosinte. Badanie to pokazuje, że inokulacja ikłująca igłą jest nieocenionym narzędziem w rolnictwie, które może skutecznie dostarczać U. maydis między liśćmi rośliny i zapewniło linie roślin odporne na U. maydis, które można teraz łączyć i testować w programach hodowlanych w celu poprawy odporności na choroby.

Introduction

Choroby grzybowe roślin stanowią jedno z największych zagrożeń dla rolnictwa. Potrzeba rozwoju upraw o zwiększonej odporności na choroby wzrasta ze względu na potrzeby żywnościowe rosnącej populacji świata. Patogeny roślin w naturalny sposób infekują rośliny uprawne na polu, powodując choroby, które negatywnie wpływają na plony⁶. Wykazano, że identyfikacja i wykorzystanie odpornych roślin może poprawić odporność i zmniejszyć straty plonów. Odporne odmiany zostały zidentyfikowane w wielu gatunkach roślin, w tym w kukurydzy, pszenicy, ryżu i sorgo, poprzez zaszczepienie roślin patogenem roślinnym i selekcję pod kątem odpornych linii⁷. W związku z tym opracowanie i zastosowanie skutecznej metody inokulacji pozwoliłoby na zaszczepienie wielu roślin i przeprowadzenie badań przesiewowych pod kątem odporności. Zastosowano różne metody inokulacji, w tym inokulację zanurzeniową, pipetowanie kultury zawiesiny komórek patogenu do wiru rośliny oraz inokulację igłową^8-11. W przypadku każdej metody patogen musi być niezawodnie wprowadzony między liście rośliny, gdzie patogen dostaje się do rośliny poprzez tworzenie appresorii, aby zapewnić rozwój patogenu i infekcję roślin^12,13.

Metoda inokulacji zanurzeniowej polega na zanurzeniu sadzonki rośliny w hodowli zawiesiny komórek patogenu, podczas gdy metoda pipetowania wymaga umieszczenia kultury zawiesiny komórek patogenu w wirze sadzonki rośliny. Istnieją jednak problemy z obiema metodami. Po pierwsze, obie metody zależą od naturalnego przemieszczania się patogenu z powierzchni liścia do tkanki roślinnej, która jest bardzo zmienna. Większość patogenów naturalnie dostaje się do rośliny przez otwory szparkowe lub rany na powierzchni liści rośliny. Istnieje jednak znaczna zmienność w zdolności patogenów do przenikania przez powierzchnię liścia rośliny przez aparaty szparkowe i/lub rany na powierzchni liścia. W związku z tym penetracji patogenów nie można kontrolować za pomocą żadnej z metod inokulacji, co może prowadzić do niespójnych danych. Po drugie, w przypadku badań przesiewowych dużej liczby roślin, zanurzenie sadzonek w kulturze zawiesiny komórek patogenu może być czasochłonne i może ograniczyć liczbę roślin, które można przesiewać. I odwrotnie, opisany tutaj protokół inokulacji metodą iniekcji igłowej dostarcza kulturę zawiesiny komórek patogenu między liśćmi rośliny, ułatwiając tworzenie appressorii¹⁴. Następnie patogen wykorzystuje nowo opracowaną apresorię, aby dostać się do rośliny, eliminując problem z penetracją patogenu. Dodatkowo, protokół inokulacji metodą iniekcji igłowej zapewnia szereg fenotypów dla roślin kukurydzy i teosinte, które zostały zaszczepione U. maydis i wykazują dobrą infekcję. Fenotypy można wykorzystać jako marker do określenia najlepszego stężenia dla hodowli zawiesiny komórek patogenu, co skutkuje spójnymi fenotypami roślin w ramach różnych eksperymentów i pomiędzy nimi.

Po zaszczepieniu roślin kulturą zawiesiny komórek patogenu, rośliny są zazwyczaj badane w celu wykrycia opornego lub podatnego fenotypu^8-11,15. Podczas gdy skale oceny chorób są szeroko stosowane do badań przesiewowych i klasyfikacji fenotypów roślin, skale oceny różnią się w zależności od analizowanego patogenu. W związku z tym w przypadku podobnych patogenów grzybowych można zastosować protokół skali oceny choroby dla interakcji U. maydis i kukurydzy¹⁶.

Obecna seria protokołów szczegółowo opisuje inokulację metodą iniekcji igłowej za pomocą hodowli zawiesiny komórek U. maydis oraz badanie przesiewowe reakcji odporności na choroby kukurydzy, teosinte i kukurydzy x teosinte linii introgresji. Obecne protokoły nie ograniczają się do inokulacji igłami U. maydis w roślinach kukurydzy, ale mogą być stosowane do stosunkowo każdego patogenu grzybowego i gatunku roślin. W związku z tym włączenie szczegółów obu metod do tego samego protokołu umożliwi naukowcom bezpośrednie wykorzystanie protokołów do inokulacji i badań przesiewowych lub manipulowanie oryginalnymi protokołami, aby lepiej dopasować patogeny i gatunki roślin będące przedmiotem zainteresowania.

Protocol

1. Wzrost materiału roślinnego

1. Wybierz linie roślin do inokulacji i badań przesiewowych. Do pracy wykorzystano dwie linie kukurydzy, pięć linii teosinte i czterdzieści linii kukurydzy x teosinte o niescharakteryzowanej odporności na U. maydis (Tabela 1).
2. Nasiona roślin do eksperymentalnych (wstrzyknięcie U. maydis) i kontrolnych (wstrzyknięcie wody) eksperymentów inokulacji igłowej. Zrób to dla każdej linii roślin.
3. Posadź cztery nasiona (powtórzenia) dla każdej linii roślin w małych mieszkaniach, wciskając nasiona na około 1/2 cala w glebę palcem i lekko przykrywając ziemią (rysunki 1A i 1B). Nie pakuj ziemi na nasiona. Sadzenie nasion głębiej lub pakowanie gleby na nasionach może powodować problemy ze wschodami sadzonek.
4. Wlej nasiona do gleby. Upewnij się, że gleba jest przemoczona, a nasiona pozostają pod ziemią po podlaniu.
5. Po podlaniu umieść rośliny w komorze wzrostowej ze środowiskiem dziennym i nocnym o temperaturze odpowiednio 28/20 °C i 14/10 godzinach fotoperiodu i około 500 μmol/m² sek fotosyntetycznie aktywne promieniowanie na szczycie baldachimu. Utrzymuj wilgotność względną w dzień i w nocy na poziomie odpowiednio około 70% i 90%.
6. Trzymaj wszystkie rośliny w tej samej komorze wzrostu, aby utrzymać środowisko wzrostu, które jest zgodne w całym eksperymencie.
7. Po 10 dniach wyjąć rośliny z komory wzrostowej i zaszczepić rośliny kulturą zawiesiny komórek U. maydis metodą inokulacji igłowej. Uwaga: Rośliny kukurydzy można zaszczepić 7 dni po posadzeniu^8-10. Jednak rośliny teosinte są zbyt małe po 7 dniach. Dlatego należy zaszczepić zarówno kukurydzę, jak i teosinte 10 dni po posadzeniu, aby zachować spójność w eksperymencie (patrz krok 2.12).

2. Inokulacja iniekcją igły

1. Wszystkie prace wykonuj w okapie z przepływem laminarnym. Usuń zapasy glicerolu U. maydis z zamrażarki. Użyj sterylnej pętli i smug glicerolu szczepów U. maydis typu dzikiego 1/2 (typ krycia a1b1) i 2/9 (typ krycia a2b2, prawie izogeniczny do 1/2) na płytkach z agatorem z dekstrozą ziemniaczaną (PDA). Utrzymuj naprężenia oddzielnie.
2. Umieść płytki PDA z prążkami U. maydis w inkubatorze w temperaturze 30 °C na dwa dni. W przypadku stosowania innego patogenu biotroficznego należy użyć odpowiedniego szczepu, pożywki i warunków wzrostu. Monitoruj wzrost patogenu przez okres dwóch dni, aby upewnić się, że szczep U. maydis dobrze rośnie.
3. Po dwóch dniach należy wyjąć płytki PDA z inkubatora. Płytki powinny mieć dobry wzrost patogenów i zawierać pojedyncze kolonie (ryc. 2A). Ważne jest, aby uzyskać pojedyncze kolonie. Jeśli pojedyncze kolonie nie są obecne, należy ponownie umieścić płytki w niższym stężeniu.
4. Całą pracę wykonuj w okapie z przepływem laminarnym. Użyj sterylnej wykałaczki, aby wybrać pojedynczą kolonię dla każdego szczepu z płytek PDA. Umieść wykałaczkę zawierającą pojedynczą kolonię w 3 ml bulionu z dekstrozy ziemniaczanej (PDB). Zaleca się posiadanie 2-3 kultur.
5. Umieścić 3 ml kultur PDB w inkubatorze/wytrząsarce o temperaturze 30 °C na dwa dni przy prędkości 200 obr./min. Monitoruj wzrost kultury w ciągu dwóch dni, aby zapewnić wzrost kultury. Kultura powinna wydawać się bardzo mętna.
6. Wyjąć płynne kultury z inkubatora/wytrząsarki i zmierzyć stężenie przy OD₆₀₀, aby upewnić się, że komórki zostały wyhodowane do OD 1,0 (~1 x 10⁷ komórek/ml)¹⁷.
7. Doprowadzić hodowle zawiesiny komórek U. maydis do końcowego stężenia 1 x 10⁶ komórek/ml, używając wody w końcowej objętości hodowli wynoszącej 30 ml. Stężenie to konsekwentnie skutkuje dobrym zakażeniem roślin kulturą zawiesiny komórek patogenu. ¹⁷

Uwaga: Różne stężenia zawiesiny komórek powinny być testowane przy użyciu różnych szczepów patogenów, aby określić odpowiednie miano komórek potrzebne do inokulacji^18,19. Podane końcowe stężenie dla hodowli zawiesiny komórkowej może być użyte jako punkt wyjścia do titteringu. Odpowiednie stężenie hodowli zawiesiny komórek patogenu należy zweryfikować poprzez wizualizację fenotypów roślin z dobrą infekcją (ryc. 3A-E).

8. Wymieszać równe objętości dwóch szczepów U. maydis przed inokulacją. W przypadku korzystania z jednego szczepu patogenu przejdź do kroku 2.9. Przygotuj świeże kultury zawiesinowe komórek U. maydis do każdego eksperymentu inokulacji i odrzuć kultury zawiesiny komórkowej po dwóch dniach.
9. W celu eksperymentalnego zaszczepienia igłą należy napełnić strzykawkę o pojemności 3 ml kulturą zawiesiny komórek U. maydis, wciągając kulturę zawiesiny komórkowej do strzykawki.
10. W celu zaszczepienia igłą kontrolną należy napełnić strzykawkę o pojemności 3 ml wodą¹⁷. Tę samą procedurę należy zastosować do eksperymentalnego zaszczepiania iniekcją igły.
11. Założyć igłę podskórną o wymiarach 0,457 mm x 1,3 cm na końcu każdej strzykawki o pojemności 3 ml. Wybrany rozmiar igły dostarczy kulturę zawiesiny komórkowej między liśćmi rośliny przy minimalnym uszkodzeniu tkanki roślinnej.
12. Usunąć rośliny doświadczalne i kontrolne z komory wzrostowej 10 dni po posadzeniu w ramach przygotowań do inokulacji iniekcyjnych igłami (Rysunek 2B) (patrz krok 1.7).
13. Ostrożnie wprowadzić igłę podskórną zawierającą kulturę zawiesiny komórek U. maydis do łodygi rośliny doświadczalnej pod kątem 90° tuż nad linią gleby. Włóż igłę, aż znajdzie się w środku łodygi. Nie należy przepychać igły przez trzpień (Rysunek 2C).
14. Wstrzyknąć do rośliny doświadczalnej około 100 μl kultury zawiesinowej komórek U. maydis ^18,19. Będzie się to nieznacznie różnić w zależności od wysokości sadzonki. Kultura zawiesiny komórkowej przepchnie się przez łodygę i przejdzie do wiru rośliny. Hodowla zawiesiny komórkowej będzie widoczna w wirze rośliny. Kontynuować wstrzykiwanie 100 μl kultury zawiesiny komórkowej do każdej rośliny z osobna, aż strzykawka o pojemności 3 ml będzie pusta.
15. Po wstrzyknięciu należy ostrożnie usunąć igłę z łodygi rośliny. Wyjąć igłę z pustej strzykawki o pojemności 3 ml i napełnić ją wodą. Przymocować igłę z powrotem do strzykawki i przepchnąć wodę przez igłę, aby usunąć wszelkie tkanki roślinne, które mogą zostać uwięzione w końcówce igły.
16. Powtórzyć kroki 2.9-2.15 dla każdego zakładu doświadczalnego. Postępuj zgodnie z tym samym protokołem dla roślin kontrolnych, wstrzykując wodę.
17. Umieść zaszczepione rośliny doświadczalne i kontrolne z powrotem w komorze wzrostowej. Podlewaj rośliny codziennie, zwilżając glebę, a nie tkankę roślinną.
18. Codziennie sprawdzaj rośliny, aby wykryć rozwój patogenów i reakcje odporności roślin.

3. Badanie przesiewowe reakcji oporności

1. Oceń i zapisz reakcje odporności dla każdej rośliny 7, 10, 14 i 21 dni po inokulacji (dpi) przy użyciu skali oceny reakcji odporności od 1 do 5. Nasilenie choroby wzrasta wraz ze wzrostem wartości liczbowych na skali ocen (Tabela 2). Reakcja odporności 1C (chloroza liści), 1A (produkcja antocyjanów w liściach) lub 2 (małe galasy liściowe) wskazuje na odporność. Reakcja odporności na 3 (galasy łodygi), 4 (galas podstawowy) lub 5 (śmierć rośliny) wskazuje na podatność (ryc. 3A-E i tabela 2)^18,19.
2. Oceniaj zarówno rośliny doświadczalne, jak i kontrolne oraz rejestruj oceny odporności reakcji.
3. Porównaj reakcje oporności w zakładach doświadczalnych i kontrolnych. Wybierz rośliny doświadczalne o wskaźniku reakcji odporności 1C, 1A lub 2. Rośliny te są uważane za odporne na U. maydis^18,19.
4. Powtórz cały eksperyment, aby zweryfikować fenotypy roślin.

Results

Udane inokulacje igłowe można określić poprzez wizualizację fenotypu roślin zaszczepionych U. maydis (eksperymentalne). Większość roślin doświadczalnych była podatna na zakażenie U. maydis. Podatne rośliny wykazywały bardzo silny rozwój choroby, co przejawia się w tworzeniu łodyg i podstaw żółci z czarnymi teliosporami (ryc. 3D i 3E, tabela 2). Kilka roślin było martwych po zaszczepieniu z powodu ciężkości choroby. Zidentyfikowano trzy linie introgresji...

Discussion

W tym badaniu skuteczna okazała się metoda inokulacji igłowej zastosowana w celu dostarczenia szczepu U. maydis do łodygi 700 roślin kukurydzy i teosinte. Ponadto wykorzystano zmienioną skalę oceny odporności na choroby do badań przesiewowych roślin i wykrywania rozwoju patogenów. W wyniku zastosowania obu metod zidentyfikowano linie roślin odporne na U. maydis wśród 700 roślin kukurydzy i teosinte, które można teraz łączyć i testować w programach hodowlanych w celu zwiększenia odporności na choroby.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nasiona roślin			Zebrane z oryginalnych krzyżówek
Komora wzrostowa	Conviron	PGR14 REACH-IN
Mieszkania do sadzenia	Hummert International	14-3385-2
Gleba (3 części kory sosnowej; 1 część mchu torfowego z perlitem)	Hummert International	10-1059-2
Okap z przepływem laminarnym	Lab Conoco	70875372
Zapas glicerolu patogenu (U. maydis) lub patogenu grzybowego będącego przedmiotem zainteresowania			Zapasy wyhodowano z oryginalnej kultury
Sterylna pętla	Fisher Scientific S17356A
Płytki z agarem z dekstrozą ziemniaczaną (PDA)	Inkubator Fisher Scientific	R454311
ustawiony na 30 stopni C	Fisher Scientific	11-690-650F
Sterylne wykałaczki	Walmart		Zakupione w Walmart i sterylizowane w autoklawie
Rosół z dekstrozy ziemniaczanej (PDB)	Fisher Scientific	ICN1008617
Inkubator-wytrząsarka zestaw na 30 ° C	Nowy Brunszwik	14-278-179
Spektrofotometr	Fisher Scientific	4001000
U. maydis  hodowla zawiesiny komórkowej (1 x 106 komórek/ml)			Wyhodowane z glicerolu zgodnie z opisem w
metodach Strzykawki 3 ml	Becton Dickinson
mm x 1,3 cm Igły podskórne	Kendall Brands	8881250321