Identyfikacja ekspresji poszczególnych loci HERV w oparciu o mikromacierze: zastosowanie do odkrywania biomarkerów w raku prostaty

Summary

Abstract

Antygen specyficzny dla prostaty (PSA) jest głównym biomarkerem diagnostycznym raka prostaty w użyciu klinicznym, ale brakuje mu swoistości i czułości, szczególnie w niskich dawkach¹. "Jak stosować PSA" pozostaje aktualnym problemem, zarówno w przypadku diagnozy jako szara strefa odpowiadająca stężeniu w surowicy 2,5-10 ng/ml, która nie pozwala na wyraźne rozróżnienie między rakiem a nierakiem² lub do obserwacji pacjenta, ponieważ analiza pooperacyjnych parametrów kinetycznych PSA może stanowić poważne wyzwanie dla ich praktycznego zastosowania^3,4. Alternatywnie, niekodujące RNA (ncRNA) stają się kluczowymi cząsteczkami w nowotworach u ludzi, które mogą służyć jako nowe markery choroby, np. PCA3 w raku prostaty^5,6 i ujawniać niescharakteryzowane aspekty biologii nowotworu. Co więcej, dane z projektu ENCODE opublikowane w 2012 r. wykazały, że różne typy RNA pokrywają około 62% genomu. Wydaje się również, że ilość transkrypcyjnych motywów regulatorowych jest co najmniej 4,5 razy większa niż w przypadku eksonów kodujących białka. Tak więc długie końcowe powtórzenia (LTR) ludzkich endogennych retrowirusów (HREV) stanowią szeroki zakres przypuszczalnych/kandydujących transkrypcyjnych sekwencji regulatorowych, ponieważ jest to ich podstawowa funkcja w zakaźnych retrowirusach. HERV, które rozprzestrzeniają się w całym ludzkim genomie, pochodzą z rodowych i niezależnych infekcji w linii zarodkowej, po których następują procesy rozmnażania kopiuj-wklej i prowadzą do rodzin wielokopijnych zajmujących 8% ludzkiego genomu (należy zauważyć, że eksony obejmują 2% naszego genomu). Niektóre loci HERV nadal wyrażają białka, które są związane z kilkoma patologiami, w tym rakiem^7-10. Zaprojektowaliśmy mikromacierz o dużej gęstości w formacie Affymetrix, mającą na celu optymalne scharakteryzowanie ekspresji poszczególnych loci HERV, aby lepiej zrozumieć, czy mogą one być aktywne, czy sterują transkrypcją ncRNA, czy modulują ekspresję genów kodujących. Narzędzie to zostało zastosowane w dziedzinie raka prostaty (ryc. 1).

Introduction

Ludzkie endogenne retrowirusy (zwane również HERV) rozprzestrzeniają się po całym naszym genomie. Pochodzą one z rodowych i niezależnych infekcji w obrębie linii zarodkowej, po których następują procesy rozmnażania typu kopiuj-wklej i prowadzą do powstania rodzin wielokopijnych. Dziś nie są już zakaźne, ale zajmują 8% ludzkiego genomu; Dla porównania, eksony obejmują 2% ludzkiego genomu. Dane z projektu ENCODE opublikowane w 2012 r. wykazały, że różne typy RNA pokrywają około 62% genomu, z czego jedną trzecią w regionach międzygenowych. Co więcej, wydaje się, że ilość transkrypcyjnych motywów regulatorowych jest co najmniej 4,5 razy większa niż w przypadku eksonów kodujących białka. Długie końcowe powtórzenia HERV (LTR) reprezentują szeroki zakres potencjalnych elementów regulatorowych transkrypcji, ponieważ jest to ich zwykła funkcja w zakaźnych retrowirusach. Historycznie, poza kilkoma loci ulegającymi ekspresji w łożysku lub jądrze, powszechnie uważano, że HERV milczą ze względu na regulację epigenetyczną. W związku z tym zaprojektowaliśmy mikromacierz o dużej gęstości w formacie Affymetrix, mającą na celu optymalne scharakteryzowanie ekspresji poszczególnych loci HERV, aby lepiej zrozumieć, czy są one aktywne, czy sterują transkrypcją lncRNA, czy modulują ekspresję genów kodujących. To narzędzie, nazwane HERV-V2 GeneChip, integruje 23 583 zestawy sond HERV i może rozróżniać 5 573 odrębne elementy HERV składające się z pojedynczych LTR, a także pełnych i częściowych prowirusów (ryc. 2).

Diagnoza, ocena i plan:

Diagnoza raka prostaty opiera się na dawkowaniu biomarkera antygenu specyficznego dla prostaty (PSA) w laboratorium klinicznym, cyfrowym badaniu odbytnicy w celu oceny morfologicznej zmiany prostaty i wreszcie biopsji prostaty obserwowanej przez patologa. Brak wystarczającej swoistości i czułości wśród konwencjonalnych biomarkerów raka, takich jak PSA dla raka prostaty, został powszechnie uznany po kilku dekadach implikacji klinicznych¹. Początkowo PSA zaproponowano w diagnostyce i leczeniu gruczolakoraka gruczołu krokowego¹¹. Później zaproponowano go do badań przesiewowych w kierunku raka i monitorowania rozwoju choroby¹². Pozostaje jednak pytanie, które regularnie się pojawia: "jak stosować PSA". (i) szara strefa odpowiadająca stężeniu w surowicy wynoszącym 2,5–10 ng/ml nie pozwala na wyraźne rozróżnienie między rakiem a czynnikiem nienowotworowym²; (ii) dwa duże badania kohortowe, w których wzięły udział setki tysięcy osób w Europie i USA, nie doprowadziły do jednoznacznych wniosków na temat przydatności badań przesiewowych pod względem śmiertelności specyficznej dla choroby^13,14; (iii) analiza pooperacyjnych parametrów kinetycznych PSA, takich jak klirens PSA, prędkość PSA i czas podwojenia, choć prosta w teorii, może stanowić poważne wyzwanie w praktycznym zastosowaniu^3,4. Możemy się spodziewać, że w nadchodzących latach zastosowania biomarkerów będą wspierać kliniczny wybór między czujnym wyczekiwaniem a mniej lub bardziej agresywnym leczeniem w zależności od fenotypu nowotworu. Jeśli chodzi o diagnozę postawioną przez patologa, pierwszym czynnikiem ograniczającym jest 20% fałszywie ujemna diagnoza w biopsjach prostaty (wiele nowotworów jest pomijanych przez pobieranie próbek). Drugi problem dotyczy konieczności wykonania dodatkowej procedury biopsji po negatywnym wyniku, który może mieć niepożądane skutki.

Radykalna prostatektomia jest obecnie jednym ze standardowych metod leczenia raka prostaty. Proponuje się go u zdrowych pacjentów, w wieku od 45 do 65 lat, zwłaszcza w przypadku agresywnych wzorców (Gleason 7 do 10), guza wieloogniskowego lub guza wyczuwalnego palpacyjnie. Obecnie odbywa się to na naszym oddziale z wykorzystaniem chirurgii wspomaganej robotem. W związku z coraz liczniejszymi dowodami na to, że markery molekularne będą miały ogromne znaczenie w nadchodzących latach, postanowiliśmy zaproponować wszystkim naszym pacjentom możliwość udziału w programie bankowania tkanek prostaty. Mówiąc dokładniej, rozwijające się programy badań molekularnych nad rakiem prostaty spowodowały rosnące zapotrzebowanie na dostęp do wysokiej jakości świeżych tkanek nowotworowych z próbek po prostatektomii. Badania te, a w szczególności podejścia genomiczne, wymagały dużych próbek o wysokiej jakości DNA/RNA. Guz i sąsiednie tkanki "nienowotworowe" od tego samego pacjenta są potrzebne. Zalecenia dotyczące postępowania i leczenia prostatektomii radykalnej mają na celu zachowanie cech patologicznych, które decydują o stanie zaawansowania i marginesu, a tym samym o potencjalnym dalszym leczeniu i rokowaniu. W związku z tym żadna metoda pobierania próbek świeżych tkanek nie powinna utrudniać późniejszych ocen patologicznych, aby mogła zostać zaakceptowana przez diagnozę. Makroskopowe rozwarstwienie prostaty jest trudne i należy zwrócić dużą uwagę na tkanki brzegowe i inwazję torebki: każda sekcja w celu bankowania prostaty powinna być zawsze przeprowadzana przez przeszkolonego uropatologa zgodnie z ustalonym protokołem. Komisja bioetyczna wydziału medycznego i stanowa rada lekarska zgodziły się na te badania i uzyskano świadomą zgodę dla wszystkich pacjentów włączonych do bankowania tkanek prostaty.

Protocol

1. Chirurgia

Po usunięciu przez chirurga, trzymaj prostatę na lodzie, dopóki nie zajmie się nią patolog.

2. Postępowanie z tkankami prostaty

1. Aby zachować opóźnienie okołooperacyjnego niedokrwienia, w ciągu 30 minut po ablacji chirurgicznej należy przenieść próbki z radykalnej prostatektomii na lodzie do laboratorium przez dedykowany personel. Opóźnienie zamrażania powinno być mniejsze niż 20-30 minut (rysunek 3A).
2. Zważyć i wybarwić prostatę zgodnie ze zwykłym protokołem (np. kolor zielony po prawej stronie, po lewej stronie, patrz rysunki 3B i 3C).
3. Wykonaj duży przekrój poprzeczny gruczołu po tylnej stronie (ryc. 3D). Zorientuj prostatę i połóż ją na przedniej stronie. Wykonaj duży przekrój poprzeczny gruczołu po tylnej stronie sterylnym nożem chirurgicznym.
4. Wypreparuj kawałki tkanki w strefie przejściowej, w lewej i prawej strefie obwodowej, pozostawiając nienaruszone brzegi (ryc. 3E).
5. Umieść rdzenie tkanek w probówce Eppendorfa, zamroź błyskawicznie i przechowuj w ciekłym azocie (ryc. 3F). Jeśli nie tworzysz biobanku, przejdź bezpośrednio do kroku 2.7.
6. Bankowanie prostaty należy wykonywać tylko wtedy, gdy całkowita długość raka w biopsjach jest większa niż 10 mm. Użyj nici do szwów, aby zamknąć prostatę i zapobiec zniekształceniu gruczołu krokowego i minimalnemu naruszeniu marginesu chirurgicznego (ryc. 3G). Następnie utrwal próbkę radykalnej prostatektomii formaliną i zanurz w parafinie zgodnie ze zwykłą procedurą analizy histologicznej.
7. Zamontuj zamrożone rdzenie tkanek pionowo na małym kopcu OCT i wykonaj sekcje w kriostacie. Weź pierwszy pojedynczy zamrożony fragment o grubości 5 μm i zabarwij go niebieską toluidyną.
8. Wykonaj szybkie badanie histologiczne, aby przeanalizować charakter tkanki (tj. łagodna lub złośliwa). W przypadku tkanki nowotworowej należy oszacować ilość komórek nowotworowych i wybrać tylko rdzenie z ponad 80% komórek nowotworowych.
9. Następnie wykonaj nowy pojedynczy zamrożony odcinek o grubości 5 μm i zabarwić go hematoksyliną, eozyną i Safranem. Następnie wytnij 15 odcinków x 30 μm i umieść je w probówce Eppendorfa bez RNA.
10. Weź ostatni 5 μm zamrożony skrawek dla hematoksyliny, eozyny i Safranu i wybarwić go, aby kontrolować ilość komórek nowotworowych pod koniec zabiegu.
11. Umieść probówkę Eppendorfa w suchym lodzie i wyślij próbkę do laboratorium biologii molekularnej.

3. Ekstrakcja, oczyszczanie i kontrola jakości RNA

1. homogenizacja. Przeprowadzić homogenizację w obecności 1 ml Trizolu/100 mg tkanki, aż do całkowitego rozpuszczenia tkanki w roztworze. Stopniowo dodawaj roztwór Trizol i postępuj ostrożnie na lodzie za pomocą ręcznego młynka. Po homogenizacji podwielokrotnić roztwór do probówek Eppendorfa i pozostawić w Trizolu w temperaturze pokojowej na pięć minut.
2. Separacja faz. Dodać 300 μl chloroformu (lub 150 μl BCP/1,5 ml Trizolu). Wiruj 15 sekund, a następnie pozostaw w temperaturze pokojowej na 2-3 minuty. Wirować przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 2-8 °C.
3. Wytrącanie RNA. Ostrożnie przenieść górną fazę wodną do nowej probówki. Dodać 750 μl izopropanolu. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut (mieszać przez odwrócenie). Inkubować przez 2 godziny w temperaturze -19 °C/-31 °C. Odwirować próbki w temperaturze 12 000 x g przez 30 minut w temperaturze 2-8 °C.
4. Płukanie i zawiesina RNA. Po odwirowaniu usunąć supernatant. Przemyj osad RNA 1 ml 80% EtOH (delikatnie odwróć probówki). Odwirować próbki o masie 7 500 x g przez 10 minut w temperaturze 2-8 °C. Usunąć supernatant za pomocą P1000 i P10. Pozostaw pozostały EtOH do wyschnięcia na powietrzu przez 2-3 minuty. Dodaj 100 μl wody wolnej od RNaz, przenieś probówki do bloku grzewczego o temperaturze 70 °C i pozostaw na 2-3 minuty, aby rozpuścić granulkę. Następnie połóż na lodzie. Przechowywać w temperaturze -19 °C/-31 °C przy krótkotrwałym przechowywaniu i -80 °C przy długotrwałym przechowywaniu.
5. Oczyszczanie RNA. Oczyść RNA za pomocą zestawu RNeasy Mini (Qiagen). Krótko mówiąc, zacznij od dodania 350 μl buforu RLT do próbki 100 μl RNA i dobrze wymieszaj, a następnie postępuj zgodnie z procedurą Qiagen. Na koniec należy pobrać 3 μl (z 50 μl) podwielokrotności oczyszczonego produktu w celu kontroli jakości (krok 3.6). Przechowywać RNA w temperaturze -19 °C/-31 °C przez krótki okres lub w temperaturze -80 °C w przypadku długotrwałego przechowywania.
6. Kontrola jakości RNA (Figura 4A). Sprawdź jakość RNA i integralność RNA za pomocą Bioanalyzera (Agilent) i Nanodrop (Thermo), zgodnie z instrukcjami producenta. Numer integralności RNA (RIN) służy do oceny jakości RNA. W szczególności, aby odnieść sukces w wykrywaniu pików 18S i 28S, zdecydowanie zaleca się wykorzystanie próbek w dalszych krokach.

4. Amplifikacja RNA owacji WT

Zalecenia dotyczące wykonywania kroków wzmacniania przy użyciu zestawu wzmacniającego WT-Ovation w optymalnych warunkach:

• Jednorazowo należy uruchomić nie mniej niż osiem próbek do amplifikacji, aby zapewnić precyzję pipetowania. Następnie należy uwzględnić 1 objętość odpadu podczas przygotowywania mieszanek wzorcowych, które wymagają podzielenia zestawu na 3 partie po 8 reakcji.
• Rozmrożone odczynniki i probówki reakcyjne należy zawsze przechowywać na lodzie, chyba że zalecono inaczej.
• Do oczyszczania używaj tylko świeżego 80% roztworu etanolu.
• Nie zatrzymuj się na żadnym etapie protokołu.

1. Rozcieńczyć całkowity RNA, aby uzyskać stężenie 25 ng/μl. Roztworze 2 μl rozcieńczonej próbki.
2. Przygotować roztwór kontrolny Poly-A RNA przez seryjne rozcieńczanie podstawowego RNA Poly-A buforem rozcieńczania kontrolnego Poly-A (Affymetrix), aby uzyskać rozcieńczenie 1:25 000.
   
   Krok 1: Synteza pierwszej nici cDNA od 4,3 do 4,8. Wymienione odczynniki są określane przez dostawcę w następujący sposób: A1 (pierwsza nić starter mix), A2 (pierwsza nić buffer mix), A3 (pierwsza nić enzymu mieszanego).
   
3. Rozmrozić A1 i A2 w temperaturze pokojowej. Mieszaj za pomocą miksera wirowego przez 2 sekundy i wiruj przez 2 sekundy. Następnie szybko umieść na lodzie. Umieść A3 na lodzie.
4. Umieścić 2 μl całkowitego RNA (50 ng) w probówce PCR o pojemności 0,2 ml i dodać 2 μl A1 (końcowa objętość: 4 μl). Zakręć i obracaj rurkę przez 2 sekundy.
5. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 5 minut, a następnie umieścić probówkę na lodzie.
6. Przygotuj główną mieszankę cDNA z pierwszej nici w następujący sposób (podawaną dla pojedynczej reakcji). Wymieszać pipetując i krótko odwirować mieszankę główną. Natychmiast umieść na lodzie. Odczynnik głośność Mieszanka buforowa pierwszej nici (A2) 5 μl Kontrola RNA Poly-A (1:25 000) 0,5 μl Mieszanka enzymów pierwszej nici (A3) 0,5 μl
7. Dodać 6 μl Master Mix do probówki zawierającej RNA/starter. Wymieszaj, przesuwając tubkę, wiruj przez 2 sekundy i szybko umieść na lodzie (końcowa objętość: 10 μl).
8. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 1 min, następnie w temperaturze 25 °C przez 10 min, następnie w temperaturze 42 °C przez 10 min, a następnie w temperaturze 70 °C przez 15 min. Przechowywać w chłodnym miejscu w temperaturze 4 °C. Wyjąć probówkę reakcyjną z termocyklera, krótko wirować i trzymać na lodzie. Kontynuuj natychmiast krok syntezy drugiej nici cDNA.
   
   Krok 2: Synteza drugiej nici cDNA od 4,8 do 4,12. Wymienione odczynniki są określane przez dostawcę w następujący sposób: B1 (Second Strand Buffer Mix) i B2 (Second Strand Enzyme Mix).
   
9. Obracaj B2 i B3 przez 2 sekundy i szybko połóż na lodzie. Rozmrozić B1 w temperaturze pokojowej. Mieszaj za pomocą miksera wirowego przez 2 sekundy, wiruj przez 2 sekundy i szybko umieść na lodzie.
10. Przygotuj Drugą Nici Główną Mieszankę w następujący sposób (podawaną dla pojedynczej reakcji). Wymieszać pipetując i krótko odwirować mieszankę główną. Natychmiast umieść na lodzie. Odczynnik głośność Mieszanka buforowa drugiej nici (B1) 9,75 μl Mieszanka enzymów drugiej nici (B2) 0,25 μl
11. Dodać 10 μl Master Mix do każdej probówki reakcyjnej pierwszej nici. Wymieszać pipetując 3x, wirować przez 2 sekundy i umieścić na lodzie (końcowa objętość: 20 μl).
12. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 1 min, następnie w temperaturze 25 °C przez 10 min, następnie w temperaturze 50 °C przez 30 min, a następnie w temperaturze 70 °C przez 5 min. Przechowywać w chłodnym miejscu w temperaturze 4 °C. Wyjąć probówkę reakcyjną z termocyklera, krótko wirować i trzymać na lodzie. Kontynuuj natychmiast krok po wzmocnieniu drugiej nici.
    
    Krok 3: Wzmocnienie po drugiej nici od 4,13 do 4,15. Wymienione odczynniki są określane przez dostawcę w następujący sposób: B1 (Second Strand Buffer Mix), B3 (Reaction Enhancement Enzyme Mix).
    
13. Przygotować mieszankę główną, łącząc mieszaninę B1 i B3 w następujący sposób (podawaną dla pojedynczej reakcji). Wymieszać pipetując i krótko odwirować mieszankę główną. Natychmiast umieść na lodzie. Odczynnik głośność Mieszanka buforowa drugiej nici (B1) 1,9 μl Mieszanka enzymów wzmacniających reakcję (B3) 0,1 μl
14. Dodaj 2 μl Master Mix do każdej probówki reakcyjnej drugiej nici. Wymieszać pipetując 3x, wirować przez 2 sekundy i umieścić na lodzie (końcowa objętość: 22 μl).
15. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 1 minutę, następnie w temperaturze 37 °C przez 15 minut, a następnie w temperaturze 80 °C przez 20 minut. Przechowywać w chłodzie w temperaturze 4 °C. Wyjąć probówkę reakcyjną z termocyklera, krótko wirować i umieścić na lodzie. Kontynuuj natychmiast krok amplifikacji SPIA.
    
    Krok 4: Synteza jednoniciowego cDNA (sscDNA) metodą SPIA od 4.16 - 4.19. Wymienione odczynniki są określane przez dostawcę w następujący sposób: C1 (SPIA Primer Mix), C2 (SPIA Buffer Mix), C3 (SPIA Enzyme Mix).
    
16. Rozmrozić C1 i C2 w temperaturze pokojowej. Wymieszaj za pomocą miksera wirowego, wiruj przez 2 sekundy i szybko ułóż na lodzie. Rozmrozić C3 na lodzie. Wymieszaj zawartość, delikatnie odwracając 5x. Upewnij się, że nie wprowadzasz pęcherzyków powietrza. Następnie wiruj przez 2 sekundy i umieść na lodzie.
17. Przygotować SPIA-Master Mix, biorąc pod uwagę 0,5 objętości odpadu, w następujący sposób. Wymieszać pipetując i krótko odwirować mieszankę główną. Natychmiast umieść na lodzie. Odczynnik głośność SPIA-Mieszanka buforowa (C2) 5 μl SPIA-Mieszanka gruntująca (C1) 5 μl SPIA-Mieszanka enzymatyczna (C3) 10 μl
18. Dodać 20 μl SPIA Master Mix do ulepszonej probówki reakcyjnej z drugą nicią. Wymieszać pipetując 6-8 razy, odwirować i szybko umieścić na lodzie (końcowa objętość: 42 μl).
19. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 1 minutę, następnie w temperaturze 47 °C przez 60 minut, a następnie w temperaturze 95 °C przez 5 minut. Przechowywać w chłodzie w temperaturze 4 °C. Wyjąć probówkę z termocyklera, krótko wirować i umieścić na lodzie.

5. Oczyszczanie i kontrola jakości sscDNA

1. oczyszczanie sscDNA. Oczyść sscDNA za pomocą zestawu do oczyszczania QIAquik PCR (Qiagen). Krótko mówiąc, zacznij od dodania 200 μl buforu PB do 42 μl amplifikowanego produktu cDNA, wymieszaj i załaduj na kolumnę. Następnie postępuj zgodnie z procedurą Qiagen. Na koniec należy pobrać 3 μl (z 30 μl) podwielokrotności oczyszczonego produktu sscDNA w celu kontroli jakości (krok 5.2).
2. weryfikacja wydajności i rozkładu wielkości sscDNA (ryc. 4B). Sprawdź wydajność i rozkład wielkości sscDNA za pomocą Bioanalizatora i Nanodrop, zgodnie z instrukcjami producenta. Wielkość dystrybucji amplifikowanego cDNA powinna zwykle składać się z długości od 100 do 1,500 zasad ze szczytem około 600 zasad.

6. Fragmentacja sscDNA

1. Przygotuj 2 μg cDNA w 30 μl, dostosowując objętość wodą bez nukleaz.
2. Przygotuj 1x One-Phor-All Buffer PLUS (OPA), zaczynając od 10x roztworu OPA buffer PLUS.
3. Przygotować 0,2 U/μl DNazy I (5-krotne rozcieńczenie 1 U/μl DNazy I).
4. Przygotuj Mistrzowską Mieszankę Fragmentacji w następujący sposób (podaną dla pojedynczej reakcji): Odczynnik głośność 10X bufor One-Phor-All PLUS 3,6 μl DNaza I (0,2 U/μl) 3 μl
5. Dodać 6,6 μl mieszanki do fragmentacji do 30 μl sscDNA.
6. Wirować i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut, następnie dezaktywować DNazę I w temperaturze 95 °C przez 10 minut i przechowywać na lodzie. Podwielokrotność 1 μl rozdrobnionego cDNA do weryfikacji rozkładu na podstawie Agilent.
7. weryfikacja rozkładu wielkości sscDNA (ryc. 4C). Sprawdź rozkład wielkości sscDNA za pomocą Bioanalyzera (Agilent). Rozkład wielkości rozdrobnionego cDNA powinien zwykle składać się z 35 do 200 zasad.

7. Znakowanie rozdrobnionego sscDNA

1. Rozcieńczyć DLR-1a 7.5 mM do 5 mM w wodzie DEPC.
2. Przygotuj etykietę Master Mix w następujący sposób (podawaną dla pojedynczej reakcji): Odczynnik głośność 5x bufor reakcyjny TdT 14 μl CoCl₂ (25 mM) 14 μl DLR-1a (5 mM) 1 μl Transferaza końcowa (400 U/μl) 4,4 μl
3. Dodać 33,4 μl mieszaniny znakującej do każdej rozdrobnionej próbki cDNA.
4. Wymieszać, przesuwając probówkę, krótko odwirować i inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut, a następnie trzymać na lodzie.

8. Hybrydyzacja do mikromacierzy chipowej HERV

1. Wstępnie zwilżyć HERV GeneChip 200 μl mieszanki do wstępnej hybrydyzacji (Affymetrix) i inkubować w temperaturze 50 °C, 60 obr./min, przez 10 minut.
2. Przygotuj mieszaninę hybrydyzacyjną w następujący sposób (podaną dla pojedynczej reakcji): Odczynnik głośność Regulator Oligo B2 (3nM) 3,3 μl 20x kontrola hybrydyzacji eukariotycznej 10 μl 2x Mieszanka Hybrydyzacji 100 μl 99,9% DMSO 17,7 μl
3. Dodaj 131 μl mieszanki hybrydyzacyjnej do 69 μl rozdrobnionego i znakowanego cDNA w temperaturze pokojowej, aby uzyskać końcową objętość 200 μl.
4. Mieszać i denaturować przez 2 minuty w temperaturze 95 °C, następnie inkubować w temperaturze 50 °C przez 5 minut i wirować z maksymalną prędkością przez 5 minut.
5. Opróżnij wstępnie zwilżony HERV GeneChip i załaduj preparat docelowy o pojemności 200 μl. Zastosuj twarde miejsca na dwóch przegrodach.
6. Hybrydyzować w temperaturze 50 °C, 60 obr./min, przez 18 godzin.
7. Po 18 godzinach opróżnij HERV GeneChip i przechowuj zebrany roztwór hybrydyzacyjny w temperaturze 4 °C. Napełnij matrycę sondy 250 μl buforu płuczącego A. Jeśli wióry nie zostaną natychmiast wprowadzone do płynu, należy je przechowywać w temperaturze 4 °C.

9. Mycie i barwienie

1. Uruchom narzędzie Fluidics z paska menu GCOS. W oknie dialogowym Fluidics wybierz interesującą Cię pikietę (1 - 4), a następnie wybierz opcję Shutdown_450 dla wszystkich modułów, a następnie uruchom. Zanurz 3 linie aspiracyjne Fluidics w wodzie Milli-Q. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie LCD.
2. Zastosuj program Prime_450 do wszystkich modułów. Umieścić rurkę buforu do płukania A w butelce zawierającej 400 ml buforu do przemywania A, a rurkę do buforu do płukania B w butelce zawierającej 200 ml buforu do płukania B. Następnie ponownie postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie LCD.
3. Podnieś igły i umieść 600 μl koktajlu barwiącego 1 (SAPE Solution Mix) i 600 μl koktajlu barwiącego 2 (mieszanka roztworu przeciwciał) zawierających mikrowirówki w pozycjach # 1 i # 2, a 800 μl roztworu buforowego zawierającego roztwór buforowy w pozycji # 3.
4. Przypisz odpowiedni układ do każdego modułu, wybierz protokół FS450-004 i uruchom każdy moduł, postępując zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie.

10. Skanowanie

1. Rozgrzej skaner GS3000. Jest gotowy do skanowania, gdy światło zmieni kolor na zielony.
2. Nałóż twarde miejsca na przegrodę, aby uniknąć wycieku, a następnie załaduj chip do automatycznego podajnika lub alternatywnie bezpośrednio do skanera. Rozpocznij skanowanie.
3. Po zeskanowaniu chipa generowane są pliki .cel. Sprawdź obraz i wyrównaj siatkę z miejscem, aby zidentyfikować komórki sondy (rysunki 4D-F).

11. Analiza danych

1. Kontrola jakości. Zapoznaj się ze standardowymi elementami sterującymi Affymetrix, aby sprawdzić, czy chipy HERV-V2 spełniają kryteria kontroli jakości. W tym celu można użyć następujących reprezentacji: rozkładu wartości logarytmu intensywności (wykresy gęstości i wykresy pudełkowe), wykresy mediany odchylenia bezwzględnego (MAD) w funkcji mediany intensywności (MAD-Med), wykresy tła, znormalizowane nieskalowane wykresy błędu standardowego (NUSE) oraz wykresy względnego wyrażenia logarytmicznego (RLE).
2. normalizacja. Ponadto należy zbadać zbiór danych w celu podkreślenia nieoczekiwanych efektów partii i skorygowania ich przed analizą statystyczną. Wstępne przetwarzanie danych obejmuje zatem korektę tła (np. w oparciu o sygnał wyjściowy sondy tryptofanowej), po której następuje normalizacja RMA i podsumowanie¹⁵.
3. Eksploracja danych i poszukiwanie genów o zróżnicowanej ekspresji. Znormalizuj mikroukłady i zastosuj hierarchiczne podejście do klastrowania w celu zbadania zestawu danych (Rysunek 6A). Następnie przeprowadź poszukiwanie genów o zróżnicowanej ekspresji (DEG) przy użyciu klasycznej procedury znaczącej analizy mikromacierzy (SAM)¹⁶, po której następuje korekta współczynnika fałszywych odkryć (FDR)¹⁷. Należy pamiętać, że te kroki są w pełni zintegrowane z niektórymi pakietami do analizy oprogramowania, takimi jak Partek GS, ale alternatywnie można je wykonać za pomocą oprogramowania statystycznego R¹⁸ z pakietami z projektu Bioconductor¹⁹. Po przeprowadzeniu analizy statystycznej przefiltruj zestaw danych, aby wykluczyć zestawy sond, dla których wartości wyrażeń są mniejsze niż 2⁶.
4. Wizualizacja i interpretacja. Interpretacja wyników z mikromacierzy HERV-V2 w dedykowanym interfejsie przy użyciu baz danych adnotacji.

Results

Wartość badań transkryptomicznych polega przede wszystkim na jakości wyjściowego materiału biologicznego. Jeśli ekstrakcja RNA jest przeprowadzana w optymalnych warunkach, liczba integralności RNA (RIN) wynosi zwykle 7 lub więcej (ryc. 4A). Konieczność hybrydyzacji 2 μg cDNA na chipie Affymetrix HERV-V2 implikuje zastosowanie procesu amplifikacji. Pomyślny etap wzmacniania prowadzi do rozkładu w kształcie dzwonu (ilustracja 4B). Następnie przeprowadza się fragmentację DNAse1 w celu homogenizacji rozkładu wielkości cDNA około 100 nukleotydów przed hybrydyzacją (Figura 4C). Po hybrydyzacji i skanowaniu (Rysunek 4D) oględziny obrazu umożliwiają sprawdzenie, czy siatka jest dobrze wyrównana do plam (Rysunek 4E) i czy kontrola hybrydyzacji jest spójna (Rysunek 4F). Ten krok jest również przydatny w celu wykluczenia mikromacierzy, w których podczas eksperymentu wystąpiły pęcherzyki powietrza lub błędy.

Gdy chipy przeszły kontrolę jakości (Rysunek 5) i po normalizacji, analiza statystyczna 5 próbek RNA guza i prawidłowej prostaty ze szpitala Lyon-Sud doprowadziła do identyfikacji 207 sond HERV o zróżnicowanych wartościach ekspresji (p.val <0,05) (Rysunek 6A). Aby potwierdzić te zapisy i uzyskać informacje specyficzne dla prostaty, do analizy dodano 35 dodatkowych próbek dopasowanych par (okrężnicy, jajnika, jądra, piersi, płuc i prostaty), a procedura SAM-FDR (FDR = 20%) ostatecznie zidentyfikowała 44 sondy HERV specyficzne dla prostaty. Wśród nich opisano 10 najistotniejszych struktur HERV (ryc. 6B). Konieczne będą dalsze badania kliniczne w celu oceny wartości czułości i swoistości tych potencjalnych biomarkerów.

Rysunek 1. Schemat całej procedury od kliniki (1: prostatektomia przez lekarza i przygotowanie tkanek przez patologa) do stanowiska (2-6: przygotowanie próbki, przygotowanie celu, przetwarzanie mikromacierzy) prowadzący do identyfikacji potencjalnych biomarkerów (7: analiza biokomputerowa mikromacierzy HERV). Kwasy nukleinowe pochodzące z normalnej tkanki są przedstawione na pomarańczowo; Kwasy nukleinowe pochodzące z obszaru nowotworowego składają się z mieszanki normalnych (pomarańczowych) i specyficznych dla nowotworu (czarnych) kwasów nukleinowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 2. Koncepcja i zawartość chipa HERV-V2: Sekwencje HERV pobrane z ludzkiego genomu są przechowywane w bazie danych o nazwie HERV-gDB3, następnie 25-merowe sondy kandydujące przechodzą przez dedykowaną procedurę modelowania hybrydyzacji (EDA+), zanim zostaną ostatecznie zsyntetyzowane w macierzy (wynikowe docelowe podregiony są przedstawione dla każdej rodziny). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 3. Postępowanie z prostatą przez patologa. (A) Świeża próbka z radykalnej prostatektomii jest przenoszona do laboratorium. (B-C) Prostata jest przebarwiona (zielona po prawej stronie, po lewej stronie). (D) Duży przekrój poprzeczny gruczołu po stronie tylnej. (E) Pozostawiając nienaruszone brzegi, fragmenty tkanek są wycinane z różnych obszarów gruczołu krokowego. (F) Rdzenie tkanek umieszcza się w probówce Eppendorfa. (G) Nić do szwów służy do zamykania prostaty i zapobiegania zniekształceniu gruczołu i minimalnemu naruszeniu marginesu chirurgicznego. Następnie próbka po radykalnej prostatektomii jest gotowa do utrwalenia w formalinie zgodnie ze zwykłą procedurą analizy histologicznej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 4. Kontrole jakości przygotowania kwasów nukleinowych i wydajności hybrydyzacji. (A) integralność RNA, (B) amplifikowane cele cDNA i (C) pofragmentowane cele stosowane na etapie hybrydyzacji. Te trzy kontrole jakości uzyskano za pomocą bioanalizatora przy użyciu nanochipów RNA i testu Eukaryote Nano Serie II. (D) Ogólny obraz obszaru hybrydyzacji mikromacierzy HERV-V2 po zeskanowaniu, (E) powiększenie lewego górnego rogu pokazujące kontrolki wyrównania siatki i (F) powiększenie środkowego obszaru pokazujące punktowe kontrole hybrydyzacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 5. Przetwarzanie sygnałów. (A) Kontrola skokowego wzmocnienia Affymetrix polyA. PoliA kontroluje transkrypty Dap, Thr, Phe i Lys z genów B. subtilis są wzbogacane w próbce RNA i służą do oceny ogólnego sukcesu docelowych etapów przygotowania. Intensywność powinna być wykrywana przy malejących wartościach wśród tych kontrolnych skoków, aby upewnić się, że nie było stronniczości podczas amplifikacji WT-Ovation między genami o wysokiej i niskiej ekspresji. (B) Kontrola hybrydyzacji Affymetrix ze skokiem. Te cele wyizolowane z bakteriofagów E. coli i P1 są wzbogacane przed procedurą etykietowania. Rosnące wartości z BioB, BioC, BioD i Cre wskazują na ogólny sukces hybrydyzacji. (C) Rozkład intensywności sygnałów chipa po normalizacji RMA. Większość zestawów sond wykazuje sygnały o wartościach niższych niż 2⁶ (tło), co wskazuje na ogólną ekspresję ograniczoną głównie do niektórych określonych loci HERV. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 6. Analiza danych. (A) Hierarchiczna analiza grupowania próbek prawidłowych i nowotworowych. Partycjonowanie grupowania zastosowano do znormalizowanych wartości wyrażeń przy użyciu euklidesowego algorytmu funkcji odległości, grupując zestawy sond w górę (czerwony) i w dół (niebieski) wśród próbek normalnych i nowotworowych. (B) Wybór 10 najważniejszych struktur HERV zidentyfikowanych jako potencjalny biomarker raka gruczołu krokowego. Dla każdego elementu HERV podaje się powiązaną rodzinę HREV, współrzędne genomowe (NCBI 36/hg18) oraz krótki opis struktury HERR. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 7. Repertuar marki HERR. Sekwencjonowanie ludzkiego genomu ujawniło 25 000 genów kodujących białka (eksony, 2%) i ogromną ilość elementów transpozycyjnych, w tym 200 000 retrotranspozonów z długimi powtórzeniami końcowymi (LTR) (HERV, 8%). (B) Ekstrapolacja na podstawie zawartości chipa HERV-V2 i związanych z nią danych dotyczących ekspresji (79 próbek pochodzących z 8 normalnych typów tkanek w porównaniu z nowotworem) sugeruje, że jedna trzecia repertuaru HERV jest aktywna transkrypcyjnie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 8. Funkcjonalna interpretacja sygnałów z chipa. (A) Identyfikacja promotora i kontrola epigenetyczna: Sygnał ujemny U3 (czerwona sonda, 5'LTR) w porównaniu z sygnałem dodatnim R-U5 (niebieska sonda, 5'LTR) sugeruje transkrypcję sterowaną przez U3, wspieraną przez różną zawartość metylacji CpG (stałe czarne kółka) U3 w normalnych tkankach okołonowotworowych w porównaniu z tkankami nowotworowymi. (B) Strategia splicingu: przypuszczalna otoczka 3,1 kb kodująca mRNA wyrażane wyłącznie w guzie jest identyfikowana za pomocą nakładającej się sondy SD1 / SA2 splicing. *Wywnioskowane przez porównanie z innymi tkankami niełożyskowymi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Discussion

W ciągu ostatnich 10 lat większość prób pomiaru ekspresji HERV wykorzystywała techniki RT-PCR w celu skupienia się na konkretnym locus^20-24 lub w oparciu o względną konserwację genów pol w celu oceny ogólnych trendów w obrębie rodzajów HERV^25,26. Dodatkowo, amplifikacje PCR przy użyciu wysoce zdegenerowanych starterów w połączeniu z mikromacierzami o niskiej gęstości przeznaczone do wykrywania i ilościowego określania ekspresji rodzin HERV^27,28. Aby prześledzić ekspresję poszczególnych locus w rodzinie, podejścia oparte na amplifikacji PCR konserwatywnych regionów w połączeniu z późniejszym klonowaniem i sekwencjonowaniem umożliwiły identyfikację transkrypcyjnie aktywnych odrębnych elementów rodzin HML-2^29,30 lub HERV-E4.1³¹ . Technika monitorowania ekspresji powtórzeń genomu, również zakończona etapami klonowania i sekwencjonowania, mająca na celu identyfikację promotorów wśród powtórzeń, zidentyfikowała aktywne pojedyncze pojedyncze LTR dla człowieka specyficzne dla HML-2^32,33. Sukcesywnie opracowaliśmy dwie generacje mikromacierzy o dużej gęstości dedykowanych do analizy transkryptomu HERV, wprowadzając metodologie odpowiednie do projektowania sond wieloelementowych w celu zminimalizowania reakcji krzyżowych między pierwiastkami paralogicznymi w rodzinie^34,35. Chip HERV-V2, który celuje w 2 690 różnych prowirusów i 2 883 pojedyncze LTR z rodzin HERV-W, HERV-H, HERV-E 4.1, HERV-FRD, HERV-K HML-2 i HERV-K HML-5, ujawnił ekspresję 1 718 loci HERV (figury 7A i B) w szerokim zakresie tkanek³⁵, zilustrowanych w tym artykule przez identyfikację przypuszczalnych biomarkerów raka prostaty. Ponadto zastosowanie wielu zestawów sond w danym locus dostarcza informacji na temat jego regulacji transkrypcji. Po pierwsze, sygnał ujemny U3 w połączeniu z dodatnim sygnałem U5 klasyfikuje LTR jako promotor i odwrotnie, sygnały dodatnie U3 i ujemne U5 mogą odzwierciedlać rolę poliadenylacji. W ten sposób zidentyfikowaliśmy 326 promotorów LTR w szerokim zakresie tkanek 35 i na podstawie tych dychotomicznych informacji U3-U5 dostarczonych przez matrycę, zaproponowaliśmy i eksperymentalnie potwierdziliśmy dla niektórych wybranych przypadków, że taka autonomiczna transkrypcja była kontrolowana przez proces epigenetyczny zależny od metylacji³⁴ (Figura 8). Po drugie, wykrywanie sygnałów pochodzących np . z niezależnych zestawów sond LTR, gag i env lub wysyłanych z sond ukierunkowanych na określone złącze splicingowe dostarcza informacji na temat strategii splicingu prowirusowego, co ilustruje profil ekspresji ERVWE1 / Syncytyna1 w łożysku lub w jądrze guza³⁴. Wskazuje to, że proces selekcji sondy specyficznej dla HERV jest wystarczająco solidny, aby wspierać identyfikację strategii splicingu związanej z tkanką, równie skutecznie, jak w przypadku konwencjonalnych genów³⁶ (Figura 8).

Metoda ta jest pierwszą próbą identyfikacji indywidualnej ekspresji locus HERV przy użyciu niestandardowej mikromacierzy o wysokiej gęstości opartej na technologii Affymetrix. Wyraźnie zidentyfikowane zalety formatu mikromacierzy do rozszyfrowania transkryptomu HERV polegające na (i) skoordynowanej eksploracji kilku rodzin HERV oraz (ii) jednoczesnej i niezależnej analizie różnych regionów dla każdego locus, np. Domeny U3 i U5 dla pojedynczych i prowirusowych LTR, regionów gag lub env oraz możliwych połączeń splicingowych związanych ze strukturami prowirusowymi, bez żadnych a priori dotyczących funkcjonalności elementu HERR. Perspektywy opierają się na ulepszeniu adnotacji w narzędziach biokomputerowych związanych z mikromacierzami. Powinno to pozwolić na przekształcenie sygnałów chipowych w hipotezy biologiczne, takie jak to, czy udowodnione aktywne HERV napędzają transkrypcję lncRNA, czy modulują mniej lub bardziej proksymalną ekspresję genów kodujących. Rzeczywiście, takie założenie jest poparte ostatnimi badaniami, które zidentyfikowały transkrypty ncRNA związane z rakiem prostaty zawierające składniki wirusowych ORF z endogennej rodziny retrowirusów HERV-K lub części wirusowego regionu promotora LTR³⁷, a także dwa zdarzenia fuzji genów, a mianowicie HERV-K22q11-ETV1 i HERV-K17-ETV^38,39. Podsumowując, całe to podejście transkryptomiczne w połączeniu z funkcją LTR i identyfikacją strategii splicingu może pomóc w rozszyfrowaniu markera w porównaniu ze składnikami wyzwalającymi ekspresję HERV w przewlekłych^40,41 i chorobach zakaźnych^42,43.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizol	Invitrogen	15596-026
RNA poli-A zapas kontrolny	Affymetrix	900433
DNAza 1	Promega	M6101	1,000 U (1 U/&mikro; l)
Transferaza końcowa	Roche	3333574001	400 j. W tym enzym i koenzym (CoCl2).
DLR-1a	Affymetrix	900542
Hybrydyzacja Kontrole wewnętrzne B2 i 20x Kontrola hybrydyzacji eukariotycznej	Affymetrix	900454
GeneChip Hybrydyzacja, mycie i barwienie	Affymetrix	900720	Z mieszanką prehybrydyzacyjną i 2x mieszanką hybrydyzacyjną dla 30 reakcji
10x bufor One-Phor-All PLUS			Skład w wodzie uzdatnionej DEPC: 100 mM octan trisu pH 7,5; 100 mM octan magnezu; 500 mM octanu potasu.
Zestaw RNeasy Mini	Qiagen	74104	Protokół oczyszczania RNA
System amplifikacji RNA WT-Ovation Nugen		2210-24
Zestaw do oczyszczania QIAquik PCR	Qiagen	28104
EQUIPMENT
Nazwa materiału		Numer katalogowy	Komentarze
Nanodrop 1000	Skaner Thermo Scientific
GeneChip 3000 7G	Affymetrix	GS30007G	Opcjonalnie: autoloader
GeneChip Fluidics Station 450	Affymetrix	FS450
GeneChip Hybridization 640 Piekarnik	Affymetrix	640	Zawiera 4 nośniki
macierzy GeneChip ProbeStacja robocza wyposażona w oprogramowanie operacyjne GeneChip (GCOS), w tym GeneChip Scanner 3000 High-Resolution Scanning Patch
HERV-V2 chip	Affymetrix		Custom array. W sprawie dostępności mikromacierzy (wyłącznie do użytku badawczego) prosimy o kontakt: Franç ois Mallet Laboratoire Commun de Recherche Hospices Civils de Lyon-bioMé rieux Dział Diagnostyki Medycznej Centre Hospitalier Lyon Sud, Bâ timent 3F 69495, Pierre Bé nite cedex Francja Telefon: 33 (0)4 72 67 87 85 E-mail: francois.mallet@biomerieux.com
HERV-V2 conception Dedykowana baza danych i adnotacje Budowa dedykowanej bazy danych, grupującej genomowe sekwencje HERV należące do 6 rodzin HERV, osiągnięto za pomocą następującej procedury: (i) najbardziej kompletną i reprezentatywną sekwencję z każdej rodziny HERV wybrano z literatury i zdefiniowano jako sekwencję prototypową (Rysunek 2). (ii) 6 prototypów zostało funkcjonalnie opatrzonych adnotacjami w odniesieniu do ich LTR (U3/R/U5) i części wewnętrznych (gag/pol/env). (iii) RepeatMasker 44 został następnie zastosowany przy użyciu tych sekwencji funkcjonalnych jako bibliotek wejściowych. Przeprowadzono przeszukiwanie całego genomu wszystkich powiązanych sekwencji w ludzkim genomie na podstawie co najmniej 80% homologii (NCBI 36/hg18). (iv) Wreszcie, sekwencje funkcjonalne odzyskane w tym procesie zostały połączone w odrębne loci na podstawie ich lokalizacji genomowej i ostatecznie zaimplementowane w dedykowanej bazie danych HERV. Ta baza danych, nazwana HERV-gDB3, zawiera 10 035 indywidualnych loci35. Locus specyficzne dla sond design Począwszy od HERV-gDB3, najpierw wygenerowano nakładające się na siebie ścieżki 25-merowych sond kandydujących. Każda potencjalna sonda została następnie dopasowana do ludzkiego genomu za pomocą KASH 45 w celu oceny potencjału hybrydyzacji krzyżowej. To ostatnie oszacowanie zostało przeprowadzone za pomocą modelu opracowanego specjalnie w tym celu i określanego jako EDA+. Krótko mówiąc, zasada EDA+ polega na uwzględnieniu niestabilności spowodowanej niedopasowaniami i lukami w 25-merowym kompleksie hybrydyzacyjnym cel/sonda. Sondy kandydujące wykazujące niskie ryzyko hybrydyzacji krzyżowej (tj. niska liczba niespecyficznych celów genomowych) są wybierane i ostatecznie łączone w probesety. Niestandardowa mikromacierz HERV GeneChip Niestandardowy HERV GeneChip integruje 23 583 zestawy sond HERV i może rozróżniać 5 573 różne elementy HERV, składa się z pojedynczych LTR, pełnych i częściowych prowirusów (Rysunek 2). W mikromacierzy uwzględniono również standardowe sondy kontrolne Affymetrix do bezstronnej amplifikacji i hybrydyzacji.