Artykuł metodologiczny

Identyfikacja ekspresji poszczególnych loci HERV w oparciu o mikromacierze: zastosowanie do odkrywania biomarkerów w raku prostaty

19.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50713

⸱

2 listopada 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Joint Unit Hospices de Lyon-bioMérieux, 2Medical Diagnostic Discovery Department, BioMérieux, 3Department of Pathology and Cytology, Centre Hospitalier Lyon Sud, Hospices Civils de Lyon, 4Medical Faculty, Lyon 1 University, 5Data and Knowledge Laboratory, BioMérieux, 6Department of Biochemistry and Molecular Biology, Centre Hospitalier Lyon Sud, Hospices Civils de Lyon, 7Department of Urology, Centre Hospitalier Lyon Sud, Hospices Civils de Lyon

W tym artykule

Podsumowanie

Streszczenie

Antygen specyficzny dla prostaty (PSA) jest głównym biomarkerem diagnostycznym raka prostaty w użyciu klinicznym, ale brakuje mu swoistości i czułości, szczególnie w niskich dawkach1. "Jak stosować PSA" pozostaje aktualnym problemem, zarówno w przypadku diagnozy jako szara strefa odpowiadająca stężeniu w surowicy 2,5-10 ng/ml, która nie pozwala na wyraźne rozróżnienie między rakiem a nierakiem2 lub do obserwacji pacjenta, ponieważ analiza pooperacyjnych parametrów kinetycznych PSA może stanowić poważne wyzwanie dla ich praktycznego zastosowania3,4. Alternatywnie, niekodujące RNA (ncRNA) stają się kluczowymi cząsteczkami w nowotworach u ludzi, które mogą służyć jako nowe markery choroby, np. PCA3 w raku prostaty5,6 i ujawniać niescharakteryzowane aspekty biologii nowotworu. Co więcej, dane z projektu ENCODE opublikowane w 2012 r. wykazały, że różne typy RNA pokrywają około 62% genomu. Wydaje się również, że ilość transkrypcyjnych motywów regulatorowych jest co najmniej 4,5 razy większa niż w przypadku eksonów kodujących białka. Tak więc długie końcowe powtórzenia (LTR) ludzkich endogennych retrowirusów (HREV) stanowią szeroki zakres przypuszczalnych/kandydujących transkrypcyjnych sekwencji regulatorowych, ponieważ jest to ich podstawowa funkcja w zakaźnych retrowirusach. HERV, które rozprzestrzeniają się w całym ludzkim genomie, pochodzą z rodowych i niezależnych infekcji w linii zarodkowej, po których następują procesy rozmnażania kopiuj-wklej i prowadzą do rodzin wielokopijnych zajmujących 8% ludzkiego genomu (należy zauważyć, że eksony obejmują 2% naszego genomu). Niektóre loci HERV nadal wyrażają białka, które są związane z kilkoma patologiami, w tym rakiem7-10. Zaprojektowaliśmy mikromacierz o dużej gęstości w formacie Affymetrix, mającą na celu optymalne scharakteryzowanie ekspresji poszczególnych loci HERV, aby lepiej zrozumieć, czy mogą one być aktywne, czy sterują transkrypcją ncRNA, czy modulują ekspresję genów kodujących. Narzędzie to zostało zastosowane w dziedzinie raka prostaty (ryc. 1).

Wprowadzenie

Ludzkie endogenne retrowirusy (zwane również HERV) rozprzestrzeniają się po całym naszym genomie. Pochodzą one z rodowych i niezależnych infekcji w obrębie linii zarodkowej, po których następują procesy rozmnażania typu kopiuj-wklej i prowadzą do powstania rodzin wielokopijnych. Dziś nie są już zakaźne, ale zajmują 8% ludzkiego genomu; Dla porównania, eksony obejmują 2% ludzkiego genomu. Dane z projektu ENCODE opublikowane w 2012 r. wykazały, że różne typy RNA pokrywają około 62% genomu, z czego jedną trzecią w regionach międzygenowych. Co więcej, wydaje się, że ilość transkrypcyjnych motywów regulatorowych jest co najmniej 4,5 razy większa niż w przypadku eksonów kodujących białka. Długie końcowe powtórzenia HERV (LTR) reprezentują szeroki zakres potencjalnych elementów regulatorowych transkrypcji, ponieważ jest to ich zwykła funkcja w zakaźnych retrowirusach. Historycznie, poza kilkoma loci ulegającymi ekspresji w łożysku lub jądrze, powszechnie uważano, że HERV milczą ze względu na regulację epigenetyczną. W związku z tym zaprojektowaliśmy mikromacierz o dużej gęstości w formacie Affymetrix, mającą na celu optymalne scharakteryzowanie ekspresji poszczególnych loci HERV, aby lepiej zrozumieć, czy są one aktywne, czy sterują transkrypcją lncRNA, czy modulują ekspresję genów kodujących. To narzędzie, nazwane HERV-V2 GeneChip, integruje 23 583 zestawy sond HERV i może rozróżniać 5 573 odrębne elementy HERV składające się z pojedynczych LTR, a także pełnych i częściowych prowirusów (ryc. 2).

Diagnoza, ocena i plan:

Diagnoza raka prostaty opiera się na dawkowaniu biomarkera antygenu specyficznego dla prostaty (PSA) w laboratorium klinicznym, cyfrowym badaniu odbytnicy w celu oceny morfologicznej zmiany prostaty i wreszcie biopsji prostaty obserwowanej przez patologa. Brak wystarczającej swoistości i czułości wśród konwencjonalnych biomarkerów raka, takich jak PSA dla raka prostaty, został powszechnie uznany po kilku dekadach implikacji klinicznych1. Początkowo PSA zaproponowano w diagnostyce i leczeniu gruczolakoraka gruczołu krokowego11. Później zaproponowano go do badań przesiewowych w kierunku raka i monitorowania rozwoju choroby12. Pozostaje jednak pytanie, które regularnie się pojawia: "jak stosować PSA". (i) szara strefa odpowiadająca stężeniu w surowicy wynoszącym 2,5–10 ng/ml nie pozwala na wyraźne rozróżnienie między rakiem a czynnikiem nienowotworowym2; (ii) dwa duże badania kohortowe, w których wzięły udział setki tysięcy osób w Europie i USA, nie doprowadziły do jednoznacznych wniosków na temat przydatności badań przesiewowych pod względem śmiertelności specyficznej dla choroby13,14; (iii) analiza pooperacyjnych parametrów kinetycznych PSA, takich jak klirens PSA, prędkość PSA i czas podwojenia, choć prosta w teorii, może stanowić poważne wyzwanie w praktycznym zastosowaniu3,4. Możemy się spodziewać, że w nadchodzących latach zastosowania biomarkerów będą wspierać kliniczny wybór między czujnym wyczekiwaniem a mniej lub bardziej agresywnym leczeniem w zależności od fenotypu nowotworu. Jeśli chodzi o diagnozę postawioną przez patologa, pierwszym czynnikiem ograniczającym jest 20% fałszywie ujemna diagnoza w biopsjach prostaty (wiele nowotworów jest pomijanych przez pobieranie próbek). Drugi problem dotyczy konieczności wykonania dodatkowej procedury biopsji po negatywnym wyniku, który może mieć niepożądane skutki.

Radykalna prostatektomia jest obecnie jednym ze standardowych metod leczenia raka prostaty. Proponuje się go u zdrowych pacjentów, w wieku od 45 do 65 lat, zwłaszcza w przypadku agresywnych wzorców (Gleason 7 do 10), guza wieloogniskowego lub guza wyczuwalnego palpacyjnie. Obecnie odbywa się to na naszym oddziale z wykorzystaniem chirurgii wspomaganej robotem. W związku z coraz liczniejszymi dowodami na to, że markery molekularne będą miały ogromne znaczenie w nadchodzących latach, postanowiliśmy zaproponować wszystkim naszym pacjentom możliwość udziału w programie bankowania tkanek prostaty. Mówiąc dokładniej, rozwijające się programy badań molekularnych nad rakiem prostaty spowodowały rosnące zapotrzebowanie na dostęp do wysokiej jakości świeżych tkanek nowotworowych z próbek po prostatektomii. Badania te, a w szczególności podejścia genomiczne, wymagały dużych próbek o wysokiej jakości DNA/RNA. Guz i sąsiednie tkanki "nienowotworowe" od tego samego pacjenta są potrzebne. Zalecenia dotyczące postępowania i leczenia prostatektomii radykalnej mają na celu zachowanie cech patologicznych, które decydują o stanie zaawansowania i marginesu, a tym samym o potencjalnym dalszym leczeniu i rokowaniu. W związku z tym żadna metoda pobierania próbek świeżych tkanek nie powinna utrudniać późniejszych ocen patologicznych, aby mogła zostać zaakceptowana przez diagnozę. Makroskopowe rozwarstwienie prostaty jest trudne i należy zwrócić dużą uwagę na tkanki brzegowe i inwazję torebki: każda sekcja w celu bankowania prostaty powinna być zawsze przeprowadzana przez przeszkolonego uropatologa zgodnie z ustalonym protokołem. Komisja bioetyczna wydziału medycznego i stanowa rada lekarska zgodziły się na te badania i uzyskano świadomą zgodę dla wszystkich pacjentów włączonych do bankowania tkanek prostaty.

Protokół

1. Chirurgia

Po usunięciu przez chirurga, trzymaj prostatę na lodzie, dopóki nie zajmie się nią patolog.

2. Postępowanie z tkankami prostaty

  1. Aby zachować opóźnienie okołooperacyjnego niedokrwienia, w ciągu 30 minut po ablacji chirurgicznej należy przenieść próbki z radykalnej prostatektomii na lodzie do laboratorium przez dedykowany personel. Opóźnienie zamrażania powinno być mniejsze niż 20-30 minut (rysunek 3A).
  2. Zważyć i wybarwić prostatę zgodnie ze zwykłym protokołem (np. kolor zielony po prawej stronie, po lewej stronie, patrz rysunki 3B i 3C).
  3. Wykonaj duży przekrój poprzeczny gruczołu po tylnej stronie (ryc. 3D). Zorientuj prostatę i połóż ją na przedniej stronie. Wykonaj duży przekrój poprzeczny gruczołu po tylnej stronie sterylnym nożem chirurgicznym.
  4. Wypreparuj kawałki tkanki w strefie przejściowej, w lewej i prawej strefie obwodowej, pozostawiając nienaruszone brzegi (ryc. 3E).
  5. Umieść rdzenie tkanek w probówce Eppendorfa, zamroź błyskawicznie i przechowuj w ciekłym azocie (ryc. 3F). Jeśli nie tworzysz biobanku, przejdź bezpośrednio do kroku 2.7.
  6. Bankowanie prostaty należy wykonywać tylko wtedy, gdy całkowita długość raka w biopsjach jest większa niż 10 mm. Użyj nici do szwów, aby zamknąć prostatę i zapobiec zniekształceniu gruczołu krokowego i minimalnemu naruszeniu marginesu chirurgicznego (ryc. 3G). Następnie utrwal próbkę radykalnej prostatektomii formaliną i zanurz w parafinie zgodnie ze zwykłą procedurą analizy histologicznej.
  7. Zamontuj zamrożone rdzenie tkanek pionowo na małym kopcu OCT i wykonaj sekcje w kriostacie. Weź pierwszy pojedynczy zamrożony fragment o grubości 5 μm i zabarwij go niebieską toluidyną.
  8. Wykonaj szybkie badanie histologiczne, aby przeanalizować charakter tkanki (tj. łagodna lub złośliwa). W przypadku tkanki nowotworowej należy oszacować ilość komórek nowotworowych i wybrać tylko rdzenie z ponad 80% komórek nowotworowych.
  9. Następnie wykonaj nowy pojedynczy zamrożony odcinek o grubości 5 μm i zabarwić go hematoksyliną, eozyną i Safranem. Następnie wytnij 15 odcinków x 30 μm i umieść je w probówce Eppendorfa bez RNA.
  10. Weź ostatni 5 μm zamrożony skrawek dla hematoksyliny, eozyny i Safranu i wybarwić go, aby kontrolować ilość komórek nowotworowych pod koniec zabiegu.
  11. Umieść probówkę Eppendorfa w suchym lodzie i wyślij próbkę do laboratorium biologii molekularnej.

3. Ekstrakcja, oczyszczanie i kontrola jakości RNA

  1. homogenizacja. Przeprowadzić homogenizację w obecności 1 ml Trizolu/100 mg tkanki, aż do całkowitego rozpuszczenia tkanki w roztworze. Stopniowo dodawaj roztwór Trizol i postępuj ostrożnie na lodzie za pomocą ręcznego młynka. Po homogenizacji podwielokrotnić roztwór do probówek Eppendorfa i pozostawić w Trizolu w temperaturze pokojowej na pięć minut.
  2. Separacja faz. Dodać 300 μl chloroformu (lub 150 μl BCP/1,5 ml Trizolu). Wiruj 15 sekund, a następnie pozostaw w temperaturze pokojowej na 2-3 minuty. Wirować przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 2-8 °C.
  3. Wytrącanie RNA. Ostrożnie przenieść górną fazę wodną do nowej probówki. Dodać 750 μl izopropanolu. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut (mieszać przez odwrócenie). Inkubować przez 2 godziny w temperaturze -19 °C/-31 °C. Odwirować próbki w temperaturze 12 000 x g przez 30 minut w temperaturze 2-8 °C.
  4. Płukanie i zawiesina RNA. Po odwirowaniu usunąć supernatant. Przemyj osad RNA 1 ml 80% EtOH (delikatnie odwróć probówki). Odwirować próbki o masie 7 500 x g przez 10 minut w temperaturze 2-8 °C. Usunąć supernatant za pomocą P1000 i P10. Pozostaw pozostały EtOH do wyschnięcia na powietrzu przez 2-3 minuty. Dodaj 100 μl wody wolnej od RNaz, przenieś probówki do bloku grzewczego o temperaturze 70 °C i pozostaw na 2-3 minuty, aby rozpuścić granulkę. Następnie połóż na lodzie. Przechowywać w temperaturze -19 °C/-31 °C przy krótkotrwałym przechowywaniu i -80 °C przy długotrwałym przechowywaniu.
  5. Oczyszczanie RNA. Oczyść RNA za pomocą zestawu RNeasy Mini (Qiagen). Krótko mówiąc, zacznij od dodania 350 μl buforu RLT do próbki 100 μl RNA i dobrze wymieszaj, a następnie postępuj zgodnie z procedurą Qiagen. Na koniec należy pobrać 3 μl (z 50 μl) podwielokrotności oczyszczonego produktu w celu kontroli jakości (krok 3.6). Przechowywać RNA w temperaturze -19 °C/-31 °C przez krótki okres lub w temperaturze -80 °C w przypadku długotrwałego przechowywania.
  6. Kontrola jakości RNA (Figura 4A). Sprawdź jakość RNA i integralność RNA za pomocą Bioanalyzera (Agilent) i Nanodrop (Thermo), zgodnie z instrukcjami producenta. Numer integralności RNA (RIN) służy do oceny jakości RNA. W szczególności, aby odnieść sukces w wykrywaniu pików 18S i 28S, zdecydowanie zaleca się wykorzystanie próbek w dalszych krokach.

4. Amplifikacja RNA owacji WT

Zalecenia dotyczące wykonywania kroków wzmacniania przy użyciu zestawu wzmacniającego WT-Ovation w optymalnych warunkach:

  • Jednorazowo należy uruchomić nie mniej niż osiem próbek do amplifikacji, aby zapewnić precyzję pipetowania. Następnie należy uwzględnić 1 objętość odpadu podczas przygotowywania mieszanek wzorcowych, które wymagają podzielenia zestawu na 3 partie po 8 reakcji.
  • Rozmrożone odczynniki i probówki reakcyjne należy zawsze przechowywać na lodzie, chyba że zalecono inaczej.
  • Do oczyszczania używaj tylko świeżego 80% roztworu etanolu.
  • Nie zatrzymuj się na żadnym etapie protokołu.

  1. Rozcieńczyć całkowity RNA, aby uzyskać stężenie 25 ng/μl. Roztworze 2 μl rozcieńczonej próbki.
  2. Przygotować roztwór kontrolny Poly-A RNA przez seryjne rozcieńczanie podstawowego RNA Poly-A buforem rozcieńczania kontrolnego Poly-A (Affymetrix), aby uzyskać rozcieńczenie 1:25 000.

    Krok 1: Synteza pierwszej nici cDNA od 4,3 do 4,8. Wymienione odczynniki są określane przez dostawcę w następujący sposób: A1 (pierwsza nić starter mix), A2 (pierwsza nić buffer mix), A3 (pierwsza nić enzymu mieszanego).
  3. Rozmrozić A1 i A2 w temperaturze pokojowej. Mieszaj za pomocą miksera wirowego przez 2 sekundy i wiruj przez 2 sekundy. Następnie szybko umieść na lodzie. Umieść A3 na lodzie.
  4. Umieścić 2 μl całkowitego RNA (50 ng) w probówce PCR o pojemności 0,2 ml i dodać 2 μl A1 (końcowa objętość: 4 μl). Zakręć i obracaj rurkę przez 2 sekundy.
  5. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 5 minut, a następnie umieścić probówkę na lodzie.
  6. Przygotuj główną mieszankę cDNA z pierwszej nici w następujący sposób (podawaną dla pojedynczej reakcji). Wymieszać pipetując i krótko odwirować mieszankę główną. Natychmiast umieść na lodzie. Odczynnik głośność Mieszanka buforowa pierwszej nici (A2) 5 μl Kontrola RNA Poly-A (1:25 000) 0,5 μl Mieszanka enzymów pierwszej nici (A3) 0,5 μl
  7. Dodać 6 μl Master Mix do probówki zawierającej RNA/starter. Wymieszaj, przesuwając tubkę, wiruj przez 2 sekundy i szybko umieść na lodzie (końcowa objętość: 10 μl).
  8. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 1 min, następnie w temperaturze 25 °C przez 10 min, następnie w temperaturze 42 °C przez 10 min, a następnie w temperaturze 70 °C przez 15 min. Przechowywać w chłodnym miejscu w temperaturze 4 °C. Wyjąć probówkę reakcyjną z termocyklera, krótko wirować i trzymać na lodzie. Kontynuuj natychmiast krok syntezy drugiej nici cDNA.

    Krok 2: Synteza drugiej nici cDNA od 4,8 do 4,12. Wymienione odczynniki są określane przez dostawcę w następujący sposób: B1 (Second Strand Buffer Mix) i B2 (Second Strand Enzyme Mix).
  9. Obracaj B2 i B3 przez 2 sekundy i szybko połóż na lodzie. Rozmrozić B1 w temperaturze pokojowej. Mieszaj za pomocą miksera wirowego przez 2 sekundy, wiruj przez 2 sekundy i szybko umieść na lodzie.
  10. Przygotuj Drugą Nici Główną Mieszankę w następujący sposób (podawaną dla pojedynczej reakcji). Wymieszać pipetując i krótko odwirować mieszankę główną. Natychmiast umieść na lodzie. Odczynnik głośność Mieszanka buforowa drugiej nici (B1) 9,75 μl Mieszanka enzymów drugiej nici (B2) 0,25 μl
  11. Dodać 10 μl Master Mix do każdej probówki reakcyjnej pierwszej nici. Wymieszać pipetując 3x, wirować przez 2 sekundy i umieścić na lodzie (końcowa objętość: 20 μl).
  12. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 1 min, następnie w temperaturze 25 °C przez 10 min, następnie w temperaturze 50 °C przez 30 min, a następnie w temperaturze 70 °C przez 5 min. Przechowywać w chłodnym miejscu w temperaturze 4 °C. Wyjąć probówkę reakcyjną z termocyklera, krótko wirować i trzymać na lodzie. Kontynuuj natychmiast krok po wzmocnieniu drugiej nici.

    Krok 3: Wzmocnienie po drugiej nici od 4,13 do 4,15. Wymienione odczynniki są określane przez dostawcę w następujący sposób: B1 (Second Strand Buffer Mix), B3 (Reaction Enhancement Enzyme Mix).
  13. Przygotować mieszankę główną, łącząc mieszaninę B1 i B3 w następujący sposób (podawaną dla pojedynczej reakcji). Wymieszać pipetując i krótko odwirować mieszankę główną. Natychmiast umieść na lodzie. Odczynnik głośność Mieszanka buforowa drugiej nici (B1) 1,9 μl Mieszanka enzymów wzmacniających reakcję (B3) 0,1 μl
  14. Dodaj 2 μl Master Mix do każdej probówki reakcyjnej drugiej nici. Wymieszać pipetując 3x, wirować przez 2 sekundy i umieścić na lodzie (końcowa objętość: 22 μl).
  15. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 1 minutę, następnie w temperaturze 37 °C przez 15 minut, a następnie w temperaturze 80 °C przez 20 minut. Przechowywać w chłodzie w temperaturze 4 °C. Wyjąć probówkę reakcyjną z termocyklera, krótko wirować i umieścić na lodzie. Kontynuuj natychmiast krok amplifikacji SPIA.

    Krok 4: Synteza jednoniciowego cDNA (sscDNA) metodą SPIA od 4.16 - 4.19. Wymienione odczynniki są określane przez dostawcę w następujący sposób: C1 (SPIA Primer Mix), C2 (SPIA Buffer Mix), C3 (SPIA Enzyme Mix).
  16. Rozmrozić C1 i C2 w temperaturze pokojowej. Wymieszaj za pomocą miksera wirowego, wiruj przez 2 sekundy i szybko ułóż na lodzie. Rozmrozić C3 na lodzie. Wymieszaj zawartość, delikatnie odwracając 5x. Upewnij się, że nie wprowadzasz pęcherzyków powietrza. Następnie wiruj przez 2 sekundy i umieść na lodzie.
  17. Przygotować SPIA-Master Mix, biorąc pod uwagę 0,5 objętości odpadu, w następujący sposób. Wymieszać pipetując i krótko odwirować mieszankę główną. Natychmiast umieść na lodzie. Odczynnik głośność SPIA-Mieszanka buforowa (C2) 5 μl SPIA-Mieszanka gruntująca (C1) 5 μl SPIA-Mieszanka enzymatyczna (C3) 10 μl
  18. Dodać 20 μl SPIA Master Mix do ulepszonej probówki reakcyjnej z drugą nicią. Wymieszać pipetując 6-8 razy, odwirować i szybko umieścić na lodzie (końcowa objętość: 42 μl).
  19. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 1 minutę, następnie w temperaturze 47 °C przez 60 minut, a następnie w temperaturze 95 °C przez 5 minut. Przechowywać w chłodzie w temperaturze 4 °C. Wyjąć probówkę z termocyklera, krótko wirować i umieścić na lodzie.

5. Oczyszczanie i kontrola jakości sscDNA

  1. oczyszczanie sscDNA. Oczyść sscDNA za pomocą zestawu do oczyszczania QIAquik PCR (Qiagen). Krótko mówiąc, zacznij od dodania 200 μl buforu PB do 42 μl amplifikowanego produktu cDNA, wymieszaj i załaduj na kolumnę. Następnie postępuj zgodnie z procedurą Qiagen. Na koniec należy pobrać 3 μl (z 30 μl) podwielokrotności oczyszczonego produktu sscDNA w celu kontroli jakości (krok 5.2).
  2. weryfikacja wydajności i rozkładu wielkości sscDNA (ryc. 4B). Sprawdź wydajność i rozkład wielkości sscDNA za pomocą Bioanalizatora i Nanodrop, zgodnie z instrukcjami producenta. Wielkość dystrybucji amplifikowanego cDNA powinna zwykle składać się z długości od 100 do 1,500 zasad ze szczytem około 600 zasad.

6. Fragmentacja sscDNA

  1. Przygotuj 2 μg cDNA w 30 μl, dostosowując objętość wodą bez nukleaz.
  2. Przygotuj 1x One-Phor-All Buffer PLUS (OPA), zaczynając od 10x roztworu OPA buffer PLUS.
  3. Przygotować 0,2 U/μl DNazy I (5-krotne rozcieńczenie 1 U/μl DNazy I).
  4. Przygotuj Mistrzowską Mieszankę Fragmentacji w następujący sposób (podaną dla pojedynczej reakcji): Odczynnik głośność 10X bufor One-Phor-All PLUS 3,6 μl DNaza I (0,2 U/μl) 3 μl
  5. Dodać 6,6 μl mieszanki do fragmentacji do 30 μl sscDNA.
  6. Wirować i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut, następnie dezaktywować DNazę I w temperaturze 95 °C przez 10 minut i przechowywać na lodzie. Podwielokrotność 1 μl rozdrobnionego cDNA do weryfikacji rozkładu na podstawie Agilent.
  7. weryfikacja rozkładu wielkości sscDNA (ryc. 4C). Sprawdź rozkład wielkości sscDNA za pomocą Bioanalyzera (Agilent). Rozkład wielkości rozdrobnionego cDNA powinien zwykle składać się z 35 do 200 zasad.

7. Znakowanie rozdrobnionego sscDNA

  1. Rozcieńczyć DLR-1a 7.5 mM do 5 mM w wodzie DEPC.
  2. Przygotuj etykietę Master Mix w następujący sposób (podawaną dla pojedynczej reakcji): Odczynnik głośność 5x bufor reakcyjny TdT 14 μl CoCl2 (25 mM) 14 μl DLR-1a (5 mM) 1 μl Transferaza końcowa (400 U/μl) 4,4 μl
  3. Dodać 33,4 μl mieszaniny znakującej do każdej rozdrobnionej próbki cDNA.
  4. Wymieszać, przesuwając probówkę, krótko odwirować i inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut, a następnie trzymać na lodzie.

8. Hybrydyzacja do mikromacierzy chipowej HERV

  1. Wstępnie zwilżyć HERV GeneChip 200 μl mieszanki do wstępnej hybrydyzacji (Affymetrix) i inkubować w temperaturze 50 °C, 60 obr./min, przez 10 minut.
  2. Przygotuj mieszaninę hybrydyzacyjną w następujący sposób (podaną dla pojedynczej reakcji): Odczynnik głośność Regulator Oligo B2 (3nM) 3,3 μl 20x kontrola hybrydyzacji eukariotycznej 10 μl 2x Mieszanka Hybrydyzacji 100 μl 99,9% DMSO 17,7 μl
  3. Dodaj 131 μl mieszanki hybrydyzacyjnej do 69 μl rozdrobnionego i znakowanego cDNA w temperaturze pokojowej, aby uzyskać końcową objętość 200 μl.
  4. Mieszać i denaturować przez 2 minuty w temperaturze 95 °C, następnie inkubować w temperaturze 50 °C przez 5 minut i wirować z maksymalną prędkością przez 5 minut.
  5. Opróżnij wstępnie zwilżony HERV GeneChip i załaduj preparat docelowy o pojemności 200 μl. Zastosuj twarde miejsca na dwóch przegrodach.
  6. Hybrydyzować w temperaturze 50 °C, 60 obr./min, przez 18 godzin.
  7. Po 18 godzinach opróżnij HERV GeneChip i przechowuj zebrany roztwór hybrydyzacyjny w temperaturze 4 °C. Napełnij matrycę sondy 250 μl buforu płuczącego A. Jeśli wióry nie zostaną natychmiast wprowadzone do płynu, należy je przechowywać w temperaturze 4 °C.

9. Mycie i barwienie

  1. Uruchom narzędzie Fluidics z paska menu GCOS. W oknie dialogowym Fluidics wybierz interesującą Cię pikietę (1 - 4), a następnie wybierz opcję Shutdown_450 dla wszystkich modułów, a następnie uruchom. Zanurz 3 linie aspiracyjne Fluidics w wodzie Milli-Q. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie LCD.
  2. Zastosuj program Prime_450 do wszystkich modułów. Umieścić rurkę buforu do płukania A w butelce zawierającej 400 ml buforu do przemywania A, a rurkę do buforu do płukania B w butelce zawierającej 200 ml buforu do płukania B. Następnie ponownie postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie LCD.
  3. Podnieś igły i umieść 600 μl koktajlu barwiącego 1 (SAPE Solution Mix) i 600 μl koktajlu barwiącego 2 (mieszanka roztworu przeciwciał) zawierających mikrowirówki w pozycjach # 1 i # 2, a 800 μl roztworu buforowego zawierającego roztwór buforowy w pozycji # 3.
  4. Przypisz odpowiedni układ do każdego modułu, wybierz protokół FS450-004 i uruchom każdy moduł, postępując zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie.

10. Skanowanie

  1. Rozgrzej skaner GS3000. Jest gotowy do skanowania, gdy światło zmieni kolor na zielony.
  2. Nałóż twarde miejsca na przegrodę, aby uniknąć wycieku, a następnie załaduj chip do automatycznego podajnika lub alternatywnie bezpośrednio do skanera. Rozpocznij skanowanie.
  3. Po zeskanowaniu chipa generowane są pliki .cel. Sprawdź obraz i wyrównaj siatkę z miejscem, aby zidentyfikować komórki sondy (rysunki 4D-F).

11. Analiza danych

  1. Kontrola jakości. Zapoznaj się ze standardowymi elementami sterującymi Affymetrix, aby sprawdzić, czy chipy HERV-V2 spełniają kryteria kontroli jakości. W tym celu można użyć następujących reprezentacji: rozkładu wartości logarytmu intensywności (wykresy gęstości i wykresy pudełkowe), wykresy mediany odchylenia bezwzględnego (MAD) w funkcji mediany intensywności (MAD-Med), wykresy tła, znormalizowane nieskalowane wykresy błędu standardowego (NUSE) oraz wykresy względnego wyrażenia logarytmicznego (RLE).
  2. normalizacja. Ponadto należy zbadać zbiór danych w celu podkreślenia nieoczekiwanych efektów partii i skorygowania ich przed analizą statystyczną. Wstępne przetwarzanie danych obejmuje zatem korektę tła (np. w oparciu o sygnał wyjściowy sondy tryptofanowej), po której następuje normalizacja RMA i podsumowanie15.
  3. Eksploracja danych i poszukiwanie genów o zróżnicowanej ekspresji. Znormalizuj mikroukłady i zastosuj hierarchiczne podejście do klastrowania w celu zbadania zestawu danych (Rysunek 6A). Następnie przeprowadź poszukiwanie genów o zróżnicowanej ekspresji (DEG) przy użyciu klasycznej procedury znaczącej analizy mikromacierzy (SAM)16, po której następuje korekta współczynnika fałszywych odkryć (FDR)17. Należy pamiętać, że te kroki są w pełni zintegrowane z niektórymi pakietami do analizy oprogramowania, takimi jak Partek GS, ale alternatywnie można je wykonać za pomocą oprogramowania statystycznego R18 z pakietami z projektu Bioconductor19. Po przeprowadzeniu analizy statystycznej przefiltruj zestaw danych, aby wykluczyć zestawy sond, dla których wartości wyrażeń są mniejsze niż 26.
  4. Wizualizacja i interpretacja. Interpretacja wyników z mikromacierzy HERV-V2 w dedykowanym interfejsie przy użyciu baz danych adnotacji.

Wyniki

Wartość badań transkryptomicznych zależy przede wszystkim od jakości wyjściowego materiału biologicznego. Jeśli ekstrakcja RNA zostanie przeprowadzona w optymalnych warunkach, wskaźnik integralności RNA (RIN) zazwyczaj wynosi 7 lub więcej (Rysunek 4A). Konieczność hybrydyzacji 2 µg cDNA na chipie Affymetrix HERV-V2 wiąże się z zastosowaniem procesu amplifikacji. Pomyślny etap amplifikacji prowadzi do uzyskania rozkładu w kształcie dzwonu (Rysunek 4B). Następnie przeprowadza się fragmentację za pomocą DNAse1 w celu ujednolicenia rozkładu wielkości cDNA wokół 100 nukleotydów przed hybrydyzacją (Rysunek 4C). Po hybrydyzacji i skanowaniu (Rysunek 4D) wizualna inspekcja obrazu pozwala sprawdzić, czy siatka jest prawidłowo dopasowana do plamek (Rysunek 4E) oraz czy kontrole hybrydyzacji są spójne (Rysunek 4F). Etap ten jest również przydatny do wykluczenia mikrotablic, w których podczas eksperymentu pojawiły się pęcherzyki powietrza lub błędy.

Po przejściu chipów przez kontrolę jakości QC (Rycina 5) i po normalizacji, analiza statystyczna 5 par dopasowanych próbek RNA z guza i zdrowej tkanki prostaty z Lyon-Sud Hospital doprowadziła do zidentyfikowania 207 zestawów sond (probesets) HERV o wartościach ekspresji różnicowej (p.val <0,05) (Rycina 6A). Aby wesprzeć te wyniki i uzyskać informacje specyficzne dla prostaty, do analizy dodano 35 dodatkowych par dopasowanych próbek (jelita grubego, jajnika, jądra, piersi, płuc i prostaty), a procedura SAM-FDR (FDR = 20%) ostatecznie zidentyfikowała 44 specyficzne dla prostaty zestawy sond HERV. Wśród nich opisano 10 najistotniejszych struktur HERV (Rycina 6B). Dalsze badania kliniczne będą wymagane w celu oceny czułości i swoistości tych potencjalnych biomarkerów.

Schemat ekstrakcji i analizy RNA; amplifikacja RNA WT-Ovation; mapa ciepła loci HERV; analiza SAM-FDR.
Rycina 1. Schemat całej procedury od etapu klinicznego (1: prostatektomia wykonana przez lekarza i przygotowanie tkanki przez patomorfologa) po etap laboratoryjny (2-6: przygotowanie próbek, przygotowanie celu, procesy mikroarray), prowadzący do identyfikacji potencjalnych biomarkerów (7: analiza bioinformatyczna mikroarray HERV). Kwasy nukleinowe pochodzące z tkanki prawidłowej przedstawiono na pomarańczowo; kwasy nukleinowe z obszaru guza składają się z mieszaniny kwasów nukleinowych prawidłowych (pomarańczowych) i specyficznych dla nowotworu (czarnych). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Schemat procesu identyfikacji HERV, analiza genomiczna, zestawianie bazy danych, metoda wyboru sond.
Rysunek 2. Koncepcja i zawartość chipa HERV-V2: Sekwencje HERV pobrane z ludzkiego genomu są przechowywane w bazie danych zwanej HERV-gDB3, następnie 25-merowe sondy kandydackie przechodzą przez dedykowaną procedurę modelowania hybrydyzacji (EDA+), zanim zostaną ostatecznie zsyntetyzowane na macierzy (wynikowe ukierunkowane podregiony przedstawiono dla każdej rodziny). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Etapy utrwalania tkanek; panele A-G, biopsje skalpelem, strzykawka; badanie medyczne.
Rysunek 3. Przygotowanie prostaty przez patomorfologa. (A) Świeży preparat po radykalnej prostatektomii zostaje przekazany do laboratorium. (B-C) Prostata zostaje oznakowana (kolor zielony po prawej stronie, czarny po lewej stronie). (D) Duży przekrój poprzeczny gruczołu od strony tylnej. (E) Pozostawiając marginesy nienaruszone, wycina się fragmenty tkanek z różnych obszarów gruczołu przedstawczego. (F) Rdzenie tkankowe zostają umieszczone w probówce Eppendorf. (G) Nitka chirurgiczna służy do zamknięcia prostaty w celu zapobiegania zniekształceniu gruczołu i minimalizacji naruszenia marginesu chirurgicznego. Następnie preparat po radykalnej prostatektomii jest gotowy do utrwalenia w formalinie zgodnie ze standardową procedurą analizy histologicznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Analiza fragmentacji DNA; wykresy elektroferogramów, wykresy rozrzutu; badanie hybrydyzacji mikrociągu.
Rycina 4. Kontrola jakości preparatyki kwasów nukleinowych i wydajności hybrydyzacji. (A) integralność RNA, (B) amplifikowane cele cDNA oraz (C) pofragmentowane cele użyte na etapie hybrydyzacji. Te trzy kontrole jakości uzyskano za pomocą Bioanalyzer, stosując RNA nano chips oraz test Eukaryote Nano Serie II. (D) Ogólny obraz obszaru hybrydyzacji mikrociągu HERV-V2 po skanowaniu, (E) powiększenie lewego górnego rogu pokazujące kontrole wyrównania siatki oraz (F) powiększenie obszaru centralnego pokazujące kontrole hybrydyzacji naniesionych punktów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Wykresy analizy ekspresji genów przedstawiające metryki QC i rozkład częstotliwości.
Rysunek 5. Przetwarzanie sygnałów. (A) Kontrole amplifikacji polyA spike-in firmy Affymetrix. Kontrole polyA dla transkryptów Dap, Thr, Phe i Lys z genów B. subtilis są dodawane do próbki RNA i służą do oceny ogólnego sukcesu etapów przygotowania celu. Intensywność powinna być wykrywana przy malejących wartościach wśród tych kontroli spike-in, aby upewnić się, że podczas amplifikacji WT-Ovation nie wystąpiło obciążenie (bias) między genami o wysokiej i niskiej ekspresji. (B) Kontrole hybrydyzacji spike-in firmy Affymetrix. Cele te, wyizolowane z E. coli oraz bakteriofaga P1, są dodawane przed procedurą znakowania. Rosnące wartości dla BioB, BioC, BioD i Cre wskazują na ogólny sukces hybrydyzacji. (C) Rozkład intensywności sygnałów z chipa po normalizacji RMA. Większość zestawów sond (probesets) wykazuje sygnały o wartościach niższych niż 26 (tło), co wskazuje na ogólną ekspresję ograniczoną głównie do niektórych specyficznych loci HERV. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Mapa ciepła ekspresji HERV i tabela 10 najważniejszych struktur prowirusowych; analiza różnicowej ekspresji genów.
Rycina 6. Analiza danych. (A) Analiza hierarchicznego grupowania próbek prawidłowych i nowotworowych. W odniesieniu do znormalizowanych wartości ekspresji zastosowano algorytm grupowania partycyjnego z funkcją odległości euklidesowej, co pozwoliło na pogrupowanie zestawów sond w zależności od nadekspresji (kolor czerwony) i niedoekspresji (kolor niebieski) w próbkach prawidłowych i nowotworowych. (B) Wybór 10 najważniejszych struktur HERV zidentyfikowanych jako potencjalne biomarkery raka prostaty. Dla każdego elementu HERV podano powiązaną rodzinę HERV, współrzędne genomiczne (NCBI 36/hg18) oraz krótki opis struktury HERV. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Wykresy kołowe składu genomowego DNA; procenty niekodujących i transkrybowanych sekwencji; wyniki analizy genetycznej.
Rysunek 7. Repertuar HERV. (A) Sekwencjonowanie ludzkiego genomu ujawniło 25 000 genów kodujących białka (egzony, 2%) oraz ogromną liczbę elementów transpozycyjnych, w tym 200 000 retrotranspozonów z długimi powtórzeniami końcowymi (LTR) (HERV, 8%). (B) Ekstrapolacja z zawartości chipa HERV-V2 i powiązanych danych o ekspresji (79 próbek pochodzących z 8 typów tkanek prawidłowych w porównaniu z nowotworowymi) sugeruje, że jedna trzecia repertuaru HERV jest aktywna transkrypcyjnie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Schemat locus ERVWE1; kontrola epigenetyczna, strategia splicingu; sondy Affymetrix; analiza jąder.
Rysunek 8. Interpretacja funkcjonalna sygnałów z chipa. (A) Identyfikacja promotora i kontrola epigenetyczna: ujemny sygnał U3 (czerwona sonda, 5'LTR) versus dodatni sygnał R-U5 (niebieska sonda, 5'LTR) sugerują transkrypcję sterowaną przez U3, co potwierdza różny poziom metylacji CpG (pełne czarne kółka) w obrębie U3 w tkankach prawidłowych okołoguzowych versus tkankach nowotworowych. (B) Strategia splicingu: domniemany mRNA kodujący otoczkę o długości 3,1 kb, ekspresowany wyłącznie w guzie, zidentyfikowano za pomocą sondy nakładającej się na złącze splicingowe SD1/SA2. *Wnioskowane na podstawie porównania z innymi tkankami pozapłodowymi. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Dyskusja

W ciągu ostatnich 10 lat większość prób pomiaru ekspresji HERV wykorzystywała techniki RT-PCR w celu skupienia się na konkretnym locus20-24 lub w oparciu o względną konserwację genów pol w celu oceny ogólnych trendów w obrębie rodzajów HERV25,26. Dodatkowo, amplifikacje PCR przy użyciu wysoce zdegenerowanych starterów w połączeniu z mikromacierzami o niskiej gęstości przeznaczone do wykrywania i ilościowego określania ekspresji rodzin HERV27,28. Aby prześledzić ekspresję poszczególnych locus w rodzinie, podejścia oparte na amplifikacji PCR konserwatywnych regionów w połączeniu z późniejszym klonowaniem i sekwencjonowaniem umożliwiły identyfikację transkrypcyjnie aktywnych odrębnych elementów rodzin HML-229,30 lub HERV-E4.131 . Technika monitorowania ekspresji powtórzeń genomu, również zakończona etapami klonowania i sekwencjonowania, mająca na celu identyfikację promotorów wśród powtórzeń, zidentyfikowała aktywne pojedyncze pojedyncze LTR dla człowieka specyficzne dla HML-232,33. Sukcesywnie opracowaliśmy dwie generacje mikromacierzy o dużej gęstości dedykowanych do analizy transkryptomu HERV, wprowadzając metodologie odpowiednie do projektowania sond wieloelementowych w celu zminimalizowania reakcji krzyżowych między pierwiastkami paralogicznymi w rodzinie34,35. Chip HERV-V2, który celuje w 2 690 różnych prowirusów i 2 883 pojedyncze LTR z rodzin HERV-W, HERV-H, HERV-E 4.1, HERV-FRD, HERV-K HML-2 i HERV-K HML-5, ujawnił ekspresję 1 718 loci HERV (figury 7A i B) w szerokim zakresie tkanek35, zilustrowanych w tym artykule przez identyfikację przypuszczalnych biomarkerów raka prostaty. Ponadto zastosowanie wielu zestawów sond w danym locus dostarcza informacji na temat jego regulacji transkrypcji. Po pierwsze, sygnał ujemny U3 w połączeniu z dodatnim sygnałem U5 klasyfikuje LTR jako promotor i odwrotnie, sygnały dodatnie U3 i ujemne U5 mogą odzwierciedlać rolę poliadenylacji. W ten sposób zidentyfikowaliśmy 326 promotorów LTR w szerokim zakresie tkanek 35 i na podstawie tych dychotomicznych informacji U3-U5 dostarczonych przez matrycę, zaproponowaliśmy i eksperymentalnie potwierdziliśmy dla niektórych wybranych przypadków, że taka autonomiczna transkrypcja była kontrolowana przez proces epigenetyczny zależny od metylacji34 (Figura 8). Po drugie, wykrywanie sygnałów pochodzących np . z niezależnych zestawów sond LTR, gag i env lub wysyłanych z sond ukierunkowanych na określone złącze splicingowe dostarcza informacji na temat strategii splicingu prowirusowego, co ilustruje profil ekspresji ERVWE1 / Syncytyna1 w łożysku lub w jądrze guza34. Wskazuje to, że proces selekcji sondy specyficznej dla HERV jest wystarczająco solidny, aby wspierać identyfikację strategii splicingu związanej z tkanką, równie skutecznie, jak w przypadku konwencjonalnych genów36 (Figura 8).

Metoda ta jest pierwszą próbą identyfikacji indywidualnej ekspresji locus HERV przy użyciu niestandardowej mikromacierzy o wysokiej gęstości opartej na technologii Affymetrix. Wyraźnie zidentyfikowane zalety formatu mikromacierzy do rozszyfrowania transkryptomu HERV polegające na (i) skoordynowanej eksploracji kilku rodzin HERV oraz (ii) jednoczesnej i niezależnej analizie różnych regionów dla każdego locus, np. Domeny U3 i U5 dla pojedynczych i prowirusowych LTR, regionów gag lub env oraz możliwych połączeń splicingowych związanych ze strukturami prowirusowymi, bez żadnych a priori dotyczących funkcjonalności elementu HERR. Perspektywy opierają się na ulepszeniu adnotacji w narzędziach biokomputerowych związanych z mikromacierzami. Powinno to pozwolić na przekształcenie sygnałów chipowych w hipotezy biologiczne, takie jak to, czy udowodnione aktywne HERV napędzają transkrypcję lncRNA, czy modulują mniej lub bardziej proksymalną ekspresję genów kodujących. Rzeczywiście, takie założenie jest poparte ostatnimi badaniami, które zidentyfikowały transkrypty ncRNA związane z rakiem prostaty zawierające składniki wirusowych ORF z endogennej rodziny retrowirusów HERV-K lub części wirusowego regionu promotora LTR37, a także dwa zdarzenia fuzji genów, a mianowicie HERV-K22q11-ETV1 i HERV-K17-ETV38,39. Podsumowując, całe to podejście transkryptomiczne w połączeniu z funkcją LTR i identyfikacją strategii splicingu może pomóc w rozszyfrowaniu markera w porównaniu ze składnikami wyzwalającymi ekspresję HERV w przewlekłych40,41 i chorobach zakaźnych42,43.

Oświadczenia

Prace te były wspierane przez bioMérieux SA, Hospices Civils de Lyon oraz francuską agencję publiczną OSEO (Advanced Diagnostics for New Therapeutic Approaches, finansowany przez rząd francuski program poświęcony medycynie spersonalizowanej). PP, VC, GO, NM i FM są pracownikami bioMérieux SA. PP, NM i FM złożyły wnioski patentowe obejmujące wyniki tego artykułu.

Podziękowania

Dziękujemy Cecile Montgiraud, Juliette Gimenez, Magali Jaillard i Bertrandowi Bonnaudowi za ich wkład w początkowy rozwój i optymalizację protokołu HERV-V2. Pragniemy również podziękować Haderowi Haidousowi za jego wskazówki dotyczące kwestii etycznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
TrizolInvitrogen15596-026
RNA poli-A zapas kontrolnyAffymetrix900433
DNAza 1PromegaM61011,000 U (1 U/&mikro; l)
Transferaza końcowaRoche3333574001400 j. W tym enzym i koenzym (CoCl2).
DLR-1aAffymetrix900542
Hybrydyzacja Kontrole wewnętrzne B2 i 20x Kontrola hybrydyzacji eukariotycznejAffymetrix900454
GeneChip Hybrydyzacja, mycie i barwienieAffymetrix900720Z mieszanką prehybrydyzacyjną i 2x mieszanką hybrydyzacyjną dla 30 reakcji
10x bufor One-Phor-All PLUSSkład w wodzie uzdatnionej DEPC: 100 mM octan trisu pH 7,5; 100 mM octan magnezu; 500 mM octanu potasu.
Zestaw RNeasy MiniQiagen74104Protokół oczyszczania RNA
System amplifikacji RNA WT-Ovation Nugen2210-24
Zestaw do oczyszczania QIAquik PCRQiagen28104
EQUIPMENT
Nazwa materiałuNumer katalogowyKomentarze
Nanodrop 1000Skaner Thermo Scientific
GeneChip 3000 7GAffymetrixGS30007GOpcjonalnie: autoloader
GeneChip Fluidics Station 450AffymetrixFS450
GeneChip Hybridization 640 PiekarnikAffymetrix640Zawiera 4 nośniki
macierzy GeneChip ProbeStacja robocza wyposażona w oprogramowanie operacyjne GeneChip (GCOS), w tym GeneChip Scanner 3000 High-Resolution Scanning Patch
HERV-V2 chipAffymetrixCustom array.
W sprawie dostępności mikromacierzy (wyłącznie do użytku badawczego) prosimy o kontakt:
Franç ois Mallet
Laboratoire Commun de Recherche Hospices Civils de Lyon-bioMé rieux
Dział Diagnostyki Medycznej
Centre Hospitalier Lyon Sud, Bâ timent 3F
69495, Pierre Bé nite cedex Francja
Telefon: 33 (0)4 72 67 87 85
E-mail: francois.mallet@biomerieux.com
HERV-V2 conception
Dedykowana baza danych i adnotacje

Budowa dedykowanej bazy danych, grupującej genomowe sekwencje HERV należące do 6 rodzin HERV, osiągnięto za pomocą następującej procedury: (i) najbardziej kompletną i reprezentatywną sekwencję z każdej rodziny HERV wybrano z literatury i zdefiniowano jako sekwencję prototypową (Rysunek 2). (ii) 6 prototypów zostało funkcjonalnie opatrzonych adnotacjami w odniesieniu do ich LTR (U3/R/U5) i części wewnętrznych (gag/pol/env). (iii) RepeatMasker 44 został następnie zastosowany przy użyciu tych sekwencji funkcjonalnych jako bibliotek wejściowych. Przeprowadzono przeszukiwanie całego genomu wszystkich powiązanych sekwencji w ludzkim genomie na podstawie co najmniej 80% homologii (NCBI 36/hg18). (iv) Wreszcie, sekwencje funkcjonalne odzyskane w tym procesie zostały połączone w odrębne loci na podstawie ich lokalizacji genomowej i ostatecznie zaimplementowane w dedykowanej bazie danych HERV. Ta baza danych, nazwana HERV-gDB3, zawiera 10 035 indywidualnych loci35.

Locus specyficzne dla sond design
Począwszy od HERV-gDB3, najpierw wygenerowano nakładające się na siebie ścieżki 25-merowych sond kandydujących. Każda potencjalna sonda została następnie dopasowana do ludzkiego genomu za pomocą KASH 45 w celu oceny potencjału hybrydyzacji krzyżowej. To ostatnie oszacowanie zostało przeprowadzone za pomocą modelu opracowanego specjalnie w tym celu i określanego jako EDA+. Krótko mówiąc, zasada EDA+ polega na uwzględnieniu niestabilności spowodowanej niedopasowaniami i lukami w 25-merowym kompleksie hybrydyzacyjnym cel/sonda. Sondy kandydujące wykazujące niskie ryzyko hybrydyzacji krzyżowej (tj. niska liczba niespecyficznych celów genomowych) są wybierane i ostatecznie łączone w probesety.

Niestandardowa mikromacierz HERV GeneChip
Niestandardowy HERV GeneChip integruje 23 583 zestawy sond HERV i może rozróżniać 5 573 różne elementy HERV, składa się z pojedynczych LTR, pełnych i częściowych prowirusów (Rysunek 2). W mikromacierzy uwzględniono również standardowe sondy kontrolne Affymetrix do bezstronnej amplifikacji i hybrydyzacji.
Firma

Bibliografia

  1. Artibani, W. Landmarks in prostate cancer diagnosis: the biomarkers. BJU Int. 110, Suppl 1. 8-13 (2012).
  2. Girometti, R., et al. Negative predictive value for cancer in patients with "gray-zone" PSA level and prior negative biopsy: preliminary results with multiparametric 3.0 Tesla MR. J. Magn. Reson. Imaging. 36, 943-950 (2012).
  3. You, B., et al. Prognostic value of modeled PSA clearance on biochemical relapse free survival after radical prostatectomy. Prostate. 69, 1325-1333 (2009).
  4. Vickers, A. J., Brewster, S. F. PSA Velocity and Doubling Time in Diagnosis and Prognosis of Prostate Cancer. Br. J. Med. Surg. Urol. 5, 162-168 (2012).
  5. Bussemakers, M. J., et al. DD3: a new prostate-specific gene, highly overexpressed in prostate cancer. Cancer Res. 59, 5975-5979 (1999).
  6. Vlaeminck-Guillem, V., Ruffion, A., Andre, J., Devonec, M., Paparel, P. Urinary prostate cancer 3 test: toward the age of reason. Urology. 75, 447-453 (2010).
  7. Buscher, K., et al. Expression of the human endogenous retrovirus-K transmembrane envelope, Rec and Np9 proteins in melanomas and melanoma cell lines. Melanoma Res. 16, 223-234 (2006).
  8. Ishida, T., et al. Identification of the HERV-K gag antigen in prostate cancer by SEREX using autologous patient serum and its immunogenicity. Cancer Immun. 8, 15(2008).
  9. Sauter, M., et al. Human endogenous retrovirus K10: expression of Gag protein and detection of antibodies in patients with seminomas. J. Virol. 69, 414-421 (1995).
  10. Pérot, P., Bolze, P. A., Mallet, F. Viruses: Essential Agents of Life. Witzany, G. , Springer-Verlag. 325-361 (2012).
  11. Stamey, T. A., Kabalin, J. N. Prostate specific antigen in the diagnosis and treatment of adenocarcinoma of the prostate. I. Untreated patients. Untreated patients. J. Urol. 141, 1070-1075 (1989).
  12. Catalona, W. J., et al. Measurement of prostate-specific antigen in serum as a screening test for prostate cancer. New Engl. J. Med. 324, 1156-1161 (1991).
  13. Schroder, F. H. Prostate cancer around the world. An overview. Urol. Oncol. 28, 663-667 (2010).
  14. Klotz, L. Active surveillance for favorable-risk prostate cancer: background, patient selection, triggers for intervention, and outcomes. Curr. Urol. Rep. 13, 153-159 (2012).
  15. Irizarry, R. A., et al. Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data. Biostatistics. 4, 249-264 (2003).
  16. Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).
  17. Storey, J. D., Tibshirani, R. Statistical significance for genomewide studies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 9440-9445 (2003).
  18. Team, R. D. C. R: A language and environment for statistical computing. , (2008).
  19. Gentleman, R. C., et al. Bioconductor: open software development for computational biology and bioinformatics. Genome Biol. 5, R80(2004).
  20. de Parseval, N., Lazar, V., Casella, J. F., Benit, L., Heidmann, T. Survey of human genes of retroviral origin: identification and transcriptome of the genes with coding capacity for complete envelope proteins. J. Virol. 77, 10414-10422 (2003).
  21. Wang-Johanning, F., et al. Detecting the expression of human endogenous retrovirus E envelope transcripts in human prostate adenocarcinoma. Cancer. 98, 187-197 (2003).
  22. Smallwood, A., et al. Temporal regulation of the expression of syncytin (HERV-W), maternally imprinted PEG10, and SGCE in human placenta. Biol. Reprod. 69, 286-293 (2003).
  23. Okahara, G., et al. Expression analyses of human endogenous retroviruses (HERVs): tissue-specific and developmental stage-dependent expression of HERVs. Genomics. 84, 982-990 (2004).
  24. Buscher, K., et al. Expression of human endogenous retrovirus K in melanomas and melanoma cell lines. Cancer Res. 65, 4172-4180 (2005).
  25. Forsman, A., et al. Development of broadly targeted human endogenous gammaretroviral pol-based real time PCRs Quantitation of RNA expression in human tissues. J. Virol. Methods. 129, 16-30 (2005).
  26. Muradrasoli, S., Forsman, A., Hu, L., Blikstad, V., Blomberg, J. Development of real-time PCRs for detection and quantitation of human MMTV-like (HML) sequences HML expression in human tissues. J. Virol. Methods. 136, 83-92 (2006).
  27. Seifarth, W., et al. Comprehensive analysis of human endogenous retrovirus transcriptional activity in human tissues with a retrovirus-specific microarray. J. Virol. 79, 341-352 (2005).
  28. Pichon, J. P., Bonnaud, B., Mallet, F. Quantitative multiplex degenerate PCR for human endogenous retrovirus expression profiling. Nat. Protoc. 1, 2831-2838 (2006).
  29. Flockerzi, A., et al. Expression pattern analysis of transcribed HERV sequences is complicated by ex vivo recombination. Retrovirology. 4, 39(2007).
  30. Flockerzi, A., et al. Expression patterns of transcribed human endogenous retrovirus HERV-K(HML-2) loci in human tissues and the need for a HERV Transcriptome Project. BMC Genomics. 9, 354(2008).
  31. Gosenca, D., et al. HERV-E-Mediated Modulation of PLA2G4A Transcription in Urothelial Carcinoma. PLoS ONE. 7, e49341(2012).
  32. Buzdin, A., Kovalskaya-Alexandrova, E., Gogvadze, E., Sverdlov, E. GREM, a technique for genome-wide isolation and quantitative analysis of promoter active repeats. Nucleic Acids Res. 34, e67(2006).
  33. Buzdin, A., Kovalskaya-Alexandrova, E., Gogvadze, E., Sverdlov, E. At least 50% of human-specific HERV-K (HML-2) long terminal repeats serve in vivo as active promoters for host nonrepetitive DNA transcription. J. Virol. 80, 10752-10762 (2006).
  34. Gimenez, J., et al. Custom human endogenous retroviruses dedicated microarray identifies self-induced HERV-W family elements reactivated in testicular cancer upon methylation control. Nucleic Acids Res. 38, 2229-2246 (2010).
  35. Pérot, P., et al. Microarray-based sketches of the HERV transcriptome landscape. PLoS ONE. 7, e40194(2012).
  36. Fehlbaum, P., Guihal, C., Bracco, L., Cochet, O. A microarray configuration to quantify expression levels and relative abundance of splice variants. Nucleic Acids Res. 33, e47(2005).
  37. Prensner, J. R., et al. Transcriptome sequencing across a prostate cancer cohort identifies PCAT-1, an unannotated lincRNA implicated in disease progression. Nat. Biotechnol. 29, 742-749 (2011).
  38. Tomlins, S. A., et al. Distinct classes of chromosomal rearrangements create oncogenic ETS gene fusions in prostate cancer. Nature. 448, 595-599 (2007).
  39. Hermans, K. G., et al. Truncated ETV1, fused to novel tissue-specific genes, and full-length ETV1 in prostate cancer. Cancer Res. 68, 7541-7549 (2008).
  40. Brodziak, A., et al. The role of human endogenous retroviruses in the pathogenesis of autoimmune diseases. Med. Sci. Monit. 18, RA80-RA88 (2012).
  41. Mullins, C. S., Linnebacher, M. Human endogenous retroviruses and cancer: Causality and therapeutic possibilities. World J. Gastroenterol. 18, 6027-6035 (2012).
  42. Young, G. R., et al. Resurrection of endogenous retroviruses in antibody-deficient mice. Nature. 491, 774-778 (2012).
  43. Vander Kuyl, A. C. HIV infection and HERV expression: a review. Retrovirology. 9, 6(2012).
  44. Smit, A. F. A., Hubley, R. RepeatMasker Open-3.0. , (1996).
  45. Navarro, G., Raffinot, M. Flexible Pattern Matching in Strings: Practical On-Line Search Algorithms for Texts and Biological Sequences. , Cambridge University Press. (2002).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza mikromacierzybiomarkery raka prostatyekstrakcja RNAamplifikacja całego transkryptomuchip genów HERVprotokół hybrydyzacjianaliza ekspresji różnicowejwalidacja funkcjonalna
Identyfikacja ekspresji poszczególnych loci HERV w oparciu o mikromacierze: zastosowanie do odkrywania biomarkerów w raku prostaty
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.