Nanomechanika oddziaływań lek-cel i wykrywanie oporności na leki przeciwbakteryjne

Podsumowanie

Nabyta oporność na antybiotyki jest poważnym problemem publicznej opieki zdrowotnej i jest obecnie klasyfikowana przez WHO jako jedno z największych zagrożeń dla życia ludzkiego. W tym miejscu opisujemy zastosowanie technologii wspornikowej do ilościowego określenia oporności na środki przeciwbakteryjne, co ma kluczowe znaczenie dla odkrycia nowych i skutecznych środków przeciwko bakteriom wielolekoopornym.

Streszczenie

Czujnik wspornikowy, który działa jako przetwornik reakcji między modelową matrycą ściany komórkowej bakteryjnej unieruchomioną na jej powierzchni a antybiotykami w roztworze, wykazał znaczny potencjał w zastosowaniach czujników biochemicznych z niespotykaną czułością i swoistością^1-5. Interakcje lek-cel generują naprężenia powierzchniowe, powodując wyginanie się wspornika, a sygnał może być analizowany optycznie, gdy jest oświetlony laserem. Zmiana naprężeń powierzchniowych mierzona z precyzją w skali nano pozwala na śledzenie zakłóceń biomechaniki modelowych celów ściany komórkowej bakterii w czasie rzeczywistym. Pomimo znacznych korzyści, wiele matryc czujników wspornikowych nigdy nie zostało zastosowanych do ilościowego określania interakcji wiązania lek-cel.

Tutaj informujemy o użyciu wielorakich układów wspornikowych z krzemu pokrytych samoorganizującymi się monowarstwami alkanetiolu, naśladującymi matrycę ściany komórkowej bakterii, do ilościowego badania interakcji wiążących antybiotyki. Zrozumienie wpływu wankomycyny na mechanikę struktur ściany komórkowej bakterii^1,6,7. Opracowaliśmy nowy model¹, który proponuje, że zginanie wsporników można opisać za pomocą dwóch niezależnych czynników; i) mianowicie czynnik chemiczny, który jest określony przez klasyczną izotermę adsorpcji Langmuira, na podstawie której obliczamy stałą dysocjacji równowagi termodynamicznej (K_d) i ii) czynnik geometryczny, zasadniczo miarę rozmieszczenia receptorów peptydowych bakterii na powierzchni wspornika. Rozkład powierzchniowy receptorów peptydowych (p) służy do badania zależności geometrii i obciążenia ligandem. Wykazano, że wartość progowa p ~ 10% ma kluczowe znaczenie dla aplikacji czujnikowych. Poniżej której nie ma wykrywalnego sygnału zginania, podczas gdy powyżej tej wartości sygnał zginania wzrasta prawie liniowo, ujawniając, że naprężenie jest produktem lokalnego chemicznego czynnika wiążącego i czynnika geometrycznego połączonego przez mechaniczną łączność obszarów reagujących i zapewnia nowy paradygmat projektowania silnych środków do zwalczania infekcji superbakteriami.

Wprowadzenie

Paradygmat rozpoznawania molekularnego stanowi podstawę dużych obszarów biologii i medycyny. Na przykład w farmakologii celem jest ingerencja w szlak patologiczny poprzez ukierunkowanie na kluczowego uczestnika procesu biochemicznego, takiego jak transglikolacja lub transpeptydacja, która katalizuje sieciowanie peptydów ściany komórkowej bakterii. Projektowanie leku sprowadza się zatem do zdefiniowania odpowiedniej cząsteczki, która będzie celować w określone miejsce dokowania bakterii w celu wywołania idealnego dopasowania. Klasycznym przykładem naśladującym sukces tego podejścia jest wankomycyna (Van), która celuje w ścianę komórkową peptydoglikanu, konserwatywną cechę strukturalną bakterii. W powstającej bakterii Gram-dodatniej matryca peptydoglikanu składa się z peptydów kończących się sekwencją lizyna-D-alanina-D-alanina, połączonych łącznikiem lipidowym^{C55 8-10} zwanym tutaj D-Ala. Te odsłonięte peptydy na prekursorach peptydoglikanu mają zasadnicze znaczenie dla mechanicznej ochrony komórek bakteryjnych przed surowymi siłami środowiskowymi i, co ważne, nie występują w komórkach ludzkich, co czyni je idealnymi celami dla antybiotyków. Van specyficznie wiąże się z C-końcem peptydów ściany komórkowej bakterii, tworząc umiarkowanie silny kompleks peptydowy Van, jak pokazano na rysunku 1. Ta interakcja między Vanem a odsłoniętymi peptydami blokuje działanie transpeptydaz i transglikozylaz, które katalizują sieciowanie ścian komórkowych¹, skutecznie powstrzymując je przed sieciowaniem, a zatem nanomechanicznie osłabia komórkę bakteryjną, prowadząc do jej śmierci przez pęknięcie^1,6,7.

Pojawienie się Enterococcus opornego na wankomycynę (VRE) jest coraz większym problemem zdrowotnym¹¹ a ponieważ oporność bakterii u enterokoków powstaje w wyniku subtelnej zmiany wiązania amidowego na estrowe⁸, ta zwodniczo prosta zmiana strukturalna na powierzchni bakterii usuwa pojedyncze wiązanie wodorowe z Van' miejsce dokowania z późniejszą modyfikacją kieszeni na wiązanie. Co ważne, proces ten zmienia alaninę pentapeptydową obecną w Enterococcus podatnym na wankomycynę (VSE) na mleczan lizyny-D-alaniny^10,12, tutaj określany jako D-Lac, powodując znaczne zmniejszenie powinowactwa wiązania Van-D-Lac o trzy rzędy wielkości, co sprawia, że Van jest terapeutycznie nieskuteczny przeciwko infekcjom enterokokowym ¹, Alarmujący wzrost liczby bakterii opornych na antybiotyki napędza zatem rozwój innowacyjnych podejść mających na celu przyspieszenie i przywrócenie aktywności przeciwbakteryjnej środków przeciwbakteryjnych lub odkrycie skuteczniejszych leków przeciwko zakażeniom bakteryjnym opornym na wiele leków.

Nasze eksperymenty z wykorzystaniem wolnostojących wsporników są inspirowane systemami takimi jak komórki, które wykorzystują energię chemiczną do ruchu. Zdolność czujników wspornikowych do przekształcania energii chemicznej w ruch mechaniczny sprawia, że są to wyjątkowe sondy o znacznych zaletach w monitorowaniu mechanicznych zakłóceń docelowych ścian komórkowych bakterii w czasie rzeczywistym. Czujniki wspornikowe nie wymagają "znaczników" reporterowych, a biomolekuły są szybko wykrywane w jednoetapowej reakcji. Mogą one badać przesiewowo wiele leków równolegle w środowiskach fizjologicznych, takich jak roztwory buforowe i cała surowica. Ponadto technologia cantilever wykorzystuje odniesienie in situ do pomiarów różnicowych, co pozwala na specyficzne wykrywanie interakcji lek-cel, a dzięki ich wytwarzaniu za pomocą standardowych ścieżek przetwarzania półprzewodników są one podatne na masową produkcję i równoległość w celu wysokowydajnych badań przesiewowych tysięcy leków na godzinę. W szczególności wiele matryc czujników wspornikowych jest użytecznym narzędziem do badania oporności antybiotyków na wankomycynę - ponieważ oporność na wankomycynę jest zasadniczo problemem mechanicznym^1,6,7. Reakcje między modelową docelową ścianą komórkową bakterii a Vanem w roztworze można wykryć poprzez monitorowanie zmian w klinicznie istotnym stresie wywołanym interakcjami wiązania lek-cel. Naprężenia powstające w wyniku reakcji powierzchniowych, które objawiają się sygnałem zginania wspornika, są analizowane optycznie przez oświetlenie czujników wiązką laserową. Co więcej, dzięki dostosowaniu receptywnej powłoki cząsteczek docelowych na powierzchni bakteryjnej na wierzchu czujnika wspornikowego, blisko nieograniczonej liczby analitów (Van), specyficzne interakcje biochemiczne i biomechanika modelowej matrycy ściany komórkowej bakterii są monitorowane w czasie rzeczywistym. Oprócz zdarzenia rozpoznawania molekularnego istnieje kilka czynników, które mogą powodować odchylenie czujników wspornikowych, do których należą - zmiany temperatury, niespecyficzne wiązanie lub zmiany współczynnika załamania światła roztworu. Aby uwzględnić sygnały niespecyficzne, przeprowadza się pomiary różnicowe in situ, w których wygięcie zarówno wsporników pomiarowych, jak i referencyjnych jest stale monitorowane w celu analizy określonych interakcji. Ponadto czułość wykrywania czujników wspornikowych, które zależą od składu chemicznego i geometrii powierzchni, można zwiększyć poprzez dostrojenie gęstości powierzchni p (gdzie p definiuje się jako stosunek powierzchni zajmowanej przez wychwytywanie cząsteczek do całego górnego obszaru powierzchni wspornika pokrytego całkowitą populacją cząsteczek określoną za pomocą rentgenowskiej spektroskopii fotoelektronów (XPS)¹.

Tutaj ten protokół szczegółowo opisuje, jak wankomycyna lub jakikolwiek inny antybiotyk wiążący się z analogami prekursorowymi ściany komórkowej bakteryjnej (mukopeptydami) w klinicznie istotnych stężeniach w roztworze buforowym i surowicy krwi może być wykrywany za pomocą technologii kantylowej bez etykiet. Używane są świeże powierzchnie złota, ponieważ samoorganizujące się monowarstwy (SAM) mają tendencję do łatwego tworzenia stabilnych warstw na czystym złocie^13,14. SAM zazwyczaj składają się z krótkich cząsteczek z ugrupowaniem tiolowym kowalencyjnie przyłączonym na powierzchni złota, podczas gdy pożądana jednostka wychwytująca na drugim końcu może swobodnie oddziaływać z celami analitu w roztworze. Tiole tworzą elastyczny system, szczególnie biorąc pod uwagę, że wiele związków tiolowych o różnych chemicznych grupach końcowych jest dostępnych na rynku lub można je łatwo zsyntetyzować w laboratorium. Należy jednak zadbać o to, aby cząsteczki z ugrupowaniem tiolowym miały właściwe grupy końcowe, na przykład w koniugacji białka lub peptydu, grupa aminowa powinna być skierowana do wewnątrz, aby zaszła reakcja z grupą karboksylową ugrupowania tiolowego uwiązanego na powierzchni. W tym przypadku tiole zostały bezpośrednio sprzężone z mimetykami tripeptydów bakteryjnego lipidu II z celów ściany komórkowej bakterii zsyntetyzowanych metodologią fazy stałej przy użyciu dostępnych na rynku wstępnie załadowanych żywic Wang-D-Ala i Wang-D-Lac oraz standardowej chemii grupy chroniącej Fmoc¹⁵. Chociaż ten opis koncentruje się na wankomycynie, oczywiście można ją rozszerzyć na inne antybiotyki i rzeczywiście naukowcy z różnych dziedzin, szczególnie w biochemii, farmakologii i materiałoznawstwie, zapraszają do dalszych badań, aby łatwo przyjąć ten protokół do własnych eksperymentów.

Protokół

1. Przygotowanie wsporników

1. Za pomocą pęsety teflonowej zanurzyć wybraną liczbę wiórów wspornikowych (każdy wspornik o długości 500 μm, szerokości 100 μm i grubości 0,9 μm) w świeżo przygotowanym roztworze piranii (w proporcji 1:1 H_2SO4 i_H2O2) na 20 min.
2. Po około 20 minutach wyjmij wiórki wspornikowe z roztworu piranii i dokładnie spłucz je wodą dejonizowaną i natychmiast przenieś do świeżo przygotowanego roztworu piranii. Powtórz krok 1.1 powyżej, jeśli wióry zawierają plamy brudu, w przeciwnym razie przejdź do następnego kroku.
3. Po dokładnym oczyszczeniu w wodzie dejonizowanej spłukać czystym etanolem i wysuszyć wióry wspornikowe na płycie grzejnej w temperaturze 75 °C, aby usunąć wszelkie ślady wody. Sprawdź je za pomocą mikroskopu optycznego, aby potwierdzić ich czystość.
4. Przenieś oczyszczone wióry wspornikowe do komory parowania i odpompuj, dążąc do osiągnięcia podciśnienia ^10-7 mbar.
5. Po osiągnięciu wymaganego podciśnienia należy najpierw pokryć jedną stronę każdej matrycy wspornikowej tytanem o długości fali 2 nm, który będzie działał jako warstwa adhezyjna, a następnie dodatkową warstwą złota o grubości 20 nm. Aby potwierdzić ich grubość, użyj monitora kwarcowego umieszczonego bezpośrednio nad źródłem docelowym.
6. Pozostaw pokryte złotem chipy czujnika wspornikowego w komorze na 1-2 godziny, aby ostygły w próżni przed otwarciem.
7. Przenieś świeżo odparowane wióry do próżniowego naczynia do przechowywania wypełnionego argonem, aby zapobiec wszelkim zanieczyszczeniom.

2. Funkcjonalizacja chipów Cantilever

1. Najpierw ułóż rurki mikrokapilarne na etapie funkcjonalizacji² zgodnie z wielkością podziałki wspornika 250 μm.
2. Następnie wstrzyknąć 2 mM etanolowe roztwory tiolu powierzchniowych cząsteczek docelowych, tj. bakteryjnych mukopeptydów (D-Ala i D-Lac) oraz "obojętnego" alkanetiolu zakończonego glikolem trietylenowym (PEG), o którym wiadomo, że jest odporny na adsorpcję biomolekularną. ¹⁶ Każdy z przewodów kapilarnych powinien zawierać różne cząsteczki wychwytujące powierzchnię, wyznaczone losowo, aby uniknąć stronniczości użytkownika.
3. Następnie inkubować przez 20 minut wsporniki w mikronaczyniach włosowatych wypełnionych roztworami tiolu zawierającymi cząsteczki wychwytujące powierzchnię. Upewnij się, że roztwory cząsteczek wychwytujących powierzchnię są zamknięte na każdym pojedynczym czujniku wspornikowym, aby uniknąć lub zminimalizować zanieczyszczenie krzyżowe. Jeśli proces ten zostanie zastosowany prawidłowo, powinien systematycznie przekształcać świeżo przygotowane wsporniki pokryte złotem w chemicznie aktywne czujniki utworzone poprzez umożliwienie SAM bakteryjnych celów mukopeptydowych tworzenia się na powierzchniach pokrytych złotem jako receptorów.

3. Przygotowanie roztworu

1. Rozpuścić 0,1 M mono- i dwuzasadowe sole fosforanu sodu w ultraczystej wodzie (rezystywność 18,2 MΩ·cm) i wymieszać, aby uzyskać wartość pH 7,4.
2. Dodaj 0,002% PS80 do buforowanych roztworów, aby zminimalizować efekty agregacji spowodowane niespecyficznymi interakcjami cząsteczek leku ze szkłem.
3. Rozcieńczyć leki świeżo zbuforowanymi roztworami do pożądanych różnych stężeń, które umożliwią obliczenie K_d.
4. Przefiltrować świeżo przygotowane roztwory leków za pomocą filtrów 0,2 μm i poddać sonizacji przez 5 minut w temperaturze pokojowej przed przeczyszczeniem argonem.
5. Powtórz procedurę z lekiem w buforowanej surowicy, używając całej surowicy. Delikatnie wirować przez 15 minut z dodatkowymi 5 minutami, aby zapewnić całkowitą rozpuszczalność.

4. Wykrywanie naprężeń powierzchniowych

1. Załaduj funkcjonalny chip czujnika wspornikowego do komory komory przepływu cieczy.
2. Wyrównaj plamkę lasera na wolnym końcu każdego czujnika i potwierdź wyrównanie, podgrzewając komorę cieczy do 1 °C. Wszystkie osiem pokrytych złotem matryc czujników wspornikowych powinno być zginanych przy ściskaniu w dół ze względu na efekt bimetaliczny spowodowany różnicami w szybkościach rozszerzalności krzemu i złota.
3. Po podgrzaniu przez około 10 minut pozwól wspornikom ostygnąć przez kolejne 10 minut.
4. Oblicz zmienność gięcia przy maksymalnych sygnałach gięcia między poszczególnymi czujnikami wspornikowymi, a jeśli względne odchylenie standardowe sygnałów gięcia wynosi ≤5%, zaakceptuj wyrównanie jako pożądane, w przeciwnym razie powtórz proces.
5. Następnie zmierz częstotliwości rezonansowe wszystkich ośmiu wsporników, aby obliczyć ich stałe sprężystości. Jeśli zmiana stałej sprężystości między każdym czujnikiem wspornikowym w chipie wynosi ≤1%, zaakceptuj chip jako mający stałe właściwości mechaniczne, w przeciwnym razie wymień czujnik chipów wspornikowych.
6. Następnie należy użyć systemu fluidycznego (Model Genie Plus) za pośrednictwem zaworu sześciodrogowego, aby osiągnąć wymianę cieczy w komorze przepływowej, podczas gdy akwizycja danych powinna odbywać się za pomocą zautomatyzowanego oprogramowania LabView.
7. Aby monitorować dane dotyczące zginania wsporników, należy zastosować następujące protokoły pomiarowe: i) wstrzyknąć roztwór buforowy lub surowicę bez leku do pomiaru kontrolnego trwającego 5-30 minut w celu ustalenia linii podstawowej; ii) wstrzykiwać roztwór leku przez 30-60 min; iii) wstrzyknąć 10 mM HCl płukać przez 10-60 minut w celu dysocjacji związanego kompleksu leków; iv) Na koniec wstrzyknąć kolejny etap płukania za pomocą roztworu buforowego przez kolejne 5-30 minut w celu regeneracji peptydów powierzchniowych i przywrócenia sygnału podstawowego. Zawsze upewnij się, że wszystkie sygnały są odbierane przy stałym natężeniu przepływu cieczy 30-180 μl/min i przy stałej temperaturze 25 °C w szafie z kontrolowaną temperaturą.
8. Bezwzględne sygnały zginania wszystkich ośmiu wsporników powinny być monitorowane za pomocą metody wiązki optycznej multipleksowanej w czasie szeregowym z pojedynczym detektorem czułym na położenie.
9. Aby przeanalizować sygnały zginania z każdego stężenia leku, wynikowe zginania różnicowe są przekształcane w naprężenie różnicowe między górną i dolną stroną wspornika za pomocą równania Stoneya.

Wyniki

Zmiana naprężeń, mierzona z precyzją w skali nano i bezprecedensową czułością pozwalającą wykryć usunięcie pojedynczego wiązania wodorowego, jest wykorzystywana do monitorowania w czasie rzeczywistym zaburzeń biomechaniki modelowej ściany komórkowej bakterii (Ryciny 2a-d). Granica czułości detekcji leku dla Van zbadano poprzez seryjne rozcieńczanie stężeń w krokach od 1,000 μM do ≤10 nM, co wykazało, że najniższym wykrywalnym stężeniem jest 10 nM (~15 ng/ml), dającym średni sygnał różnicowego ugięcia wynoszący ~ -9±2 nm (Rycina 2c). Zdolność do wykrywania antybiotyków w środowisku fizjologicznym została następnie zbadana w surowicy w klinicznie istotnym zakresie stężeń od 3-27 μM¹⁷Po wstrzyknięciu 7 μM Van w surowicy (90% płodowej surowicy cielęcej oraz 10% buforu fosforanowego sodu o pH 7,4) we wszystkich belkach dwuoporowych w identycznych warunkach, sygnał różnicowy dla DAla w surowicy był/była/było 105±4 nm, natomiast w przypadku DLac powlekane belki wspornikowe, nie zaobserwowano zginania (Rycina 3). Znaczne sygnały zgięciowe obserwowane dla DAla powleczone (wrażliwe na wankomycynę) wsporniki są wynikiem silnych oddziaływań wiążących między lekiem a celem. Jednak w przypadku DLac powlekane (odporne na wankomycynę) belki wspornikowe, obecność odpychania stanu podstawowego wolnej pary elektronowej tlenu oraz zredukowane wiązanie NH w kieszeni wiążącej wankomycyny^10,12 przyczynia się do osłabienia oddziaływań wiążących lek z celem, co skutkuje mniejszym lub brakiem ugięcia wspornika, szczególnie w przypadku niższych stężeń wankomycyny (Rysunek 3). Jednak w przypadku wysokiego stężenia wankomycyny obserwujemy mierzalne sygnały zgięcia dla DLacPonadto, nasz plan eksperymentalny jest istotny dla in situ odnosząc się do wszystkich wsporników pokrytych obiema DAla i DLac są jednocześnie eksponowane na ten sam analityt w czasie rzeczywistym.

Aby zrozumieć dokładną rolę chemii i geometrii, opracowaliśmy model¹ opisujący korelację między oddziaływaniami rozpuszczalnika a mechaniką powierzchni. Pozwala to na wyznaczenie naprężenia powierzchniowego:

dla p > pc oraz zero w przeciwnym razie (1)

Pierwszy człon w równaniu (1) to izoterma adsorpcji Langmuira, uwzględniająca zdarzenia wiązania leku z celem, a drugi człon to postać prawa potęgowego opisująca wielkoskalowe skutki mechaniczne tworzenia naprężonej sieci. Stała a odpowiada maksymalnemu naprężeniu powierzchniowemu, gdy wszystkie dostępne miejsca wiązania są zajęte, a K_d jest powierzchniową stałą dysocjacji równowagowej na wsporniku. Analiza przedstawiona na Rysunku 4 jest wynikiem globalnego dopasowania równania (1) nałożonego na zmierzone sygnały naprężenia różnicowego, co wykazuje: a  ~29,7±1,0 lub 14,1±3,0 mN/m oraz K_d ~1,0±0,3 lub 800±310 μM dla peptydów D-Ala lub DLac, gdzie a odpowiada mierze naprężenia powierzchniowego, gdy wszystkie dostępne miejsca wiązania są zajęte. Zwiększoną czułość wspornika dostrojono poprzez systematyczną zmianę gęstości peptydów p przy jednoczesnym monitorowaniu danych o naprężeniu w funkcji p, podczas gdy stężenia antybiotyków były ustalone odpowiednio na 10, 100 i 250 μM (Rysunek 5). Proces powtórzono, analizując naprężenie w funkcji stężeń Van, przy stałej gęstości peptydów p ~100%.

Rycina 1. Detekcja oddziaływań wiązania antybiotyku z powierzchnią za pomocą belki wspornikowej. a) Schematyczny przedstawienie macierzy czujników wspornikowych oraz sposobu nanomechanicznego wykrywania oddziaływań lek-cel. b) Chemiczne oddziaływanie wiążące między cząsteczką leku (Van) a analogiem mukopeptydu bakteryjnego (D-Ala lub D-Lac). c) Mechanizm, dzięki któremu zmutowane bakterie wrażliwe na wankomycynę (VSE) nabywają oporności na wankomycynę poprzez usunięcie jednego wiązania wodorowego w kieszeni wiążącej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinię.

Rycina 2. Monitorowanie w czasie rzeczywistym zaburzeń biomechaniki modelowej ściany komórkowej bakterii. a) Bezwzględne sygnały ugięcia wsporników powlekanych D-Ala, D-Lac oraz PEG w buforze fosforanowym i 250 μM wankomycyny. Dyferencjalne sygnały referencyjne dla PEG przedstawiono czarnymi liniami. b) Dyferencjalne sygnały ugięcia wsporników powlekanych D-Ala i D-Lac w buforze fosforanowym i 250 μM wankomycyny. c) Dyferencjalne ugięcie wspornika jako sygnał zależny od dawki w funkcji czasu w obecności stężeń wankomycyny wynoszących odpowiednio 10 nM (linia żółta), 100 nM (linia czerwona) i 1,000 nM (linia ciemnoczerwona). d) Dyferencjalne sygnały ugięcia wspornika dla trzech czujników wspornikowych powlekanych D-Ala w funkcji czasu w obecności 10 nM wankomycyny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Rycina 3. Śledzenie zaburzeń biomechaniki modelowej ściany komórkowej bakterii w czasie rzeczywistym dla wsporników powlekanych D-Ala i D-Lac w obecności 7 μM wankomycyny w płodowej surowicy cielęcej.

Rysunek 4. Badanie nanomechaniki oddziaływań lek-cel. Wykres przedstawiający zmierzoną odpowiedź różnicowego naprężenia powierzchniowego dla wsporników powlekanych D-Ala (czarne kropki) i D-Lac (czerwone kropki) w funkcji stężenia wankomycyny w roztworze [Van]. Dane są opisane równaniem (1) (linie ciągłe).¹

Rycina 5. Optymalizacja czułości detekcji nanomechanicznej oddziaływań receptor-ligand poprzez badanie zależności od obciążenia receptorem i geometrii za pomocą mieszanych monowarstw. Zmierzone odpowiedzi różnicowego naprężenia powierzchniowego sensorów wspornikowych w funkcji pokrycia powierzchni D-Ala, p, w obecności stałych stężeń wankomycyny w roztworze wynoszących 10 μM (linia czarna), 100 μM (linia czerwona) i 250 μM (linia zielona).

Dyskusja

Wyniki te pokazują, że czujniki cantilever array mają czułość pozwalającą na wykrywanie i ilościowe określanie zmian w interakcjach wiązania lek-cel, zwłaszcza w oporności na wankomycynę związanej z delecją pojedynczego wiązania H z kieszeni wiążącej leku. Pokazujemy czułość wykrywania nanomolowego Van zgodnie z poprzednimi badaniami powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR)^18,19 i ujawniamy, że metoda wspornikowa może bezpośrednio wykrywać i określać ilościowo cząsteczki leku we krwi w klinicznie istotnych stężeniach, jak rutynowo stosuje się w praktyce klinicznej. Nasze dane sugerują, że różnicowe naprężenie powierzchniowe można opisać za pomocą równania postaci produktu (1), tj. (i) terminu chemicznego opisującego określone zdarzenia wiązania lek-cel oraz (ii) terminu geometrycznego opisującego mechaniczne połączenie między chemicznie przereagowanymi miejscami powierzchni, co oznacza, że lokalne interakcje chemiczne odsprzęgają się od globalnych oddziaływań mechanicznych wspornika. Podczas gdy termin chemiczny jest podawany przez klasyczną izotermę adsorpcji Langmuira, termin geometryczny ujawnia perkotoracyjny mechanizm zmian naprężeń powierzchniowych wywołanych przez lek-cel. Próg krytyczny pc ~10% (rysunek 5) był niezbędny do wykrycia różnicowego wygięcia wspornika, pokazując, że naprężenia powierzchniowe są przenoszone zbiorowo, gdy stosunkowo duża frakcja powierzchniowa jest zajęta przez cząsteczki antybiotyku. W przypadku p≥pc stopniowo ustanawia się mechaniczne połączenie między chemicznie przekształconymi miejscami powierzchni, a oddziaływania odpychające krótkiego zasięgu, takie jak oddziaływania steryczne między węzłami sieci nanomechanicznej, powodują narastające zginanie w dół całego wspornika. Spekuluje się, że nasz nanomechaniczny model perkolacji może odgrywać ważną rolę w sposobie działania antybiotyku glikopeptydowego w prawdziwych bakteriach. Odkrycia te podkreślają wysoką czułość technologii wspornikowej do badania sposobu działania antybiotyków i stanowią nowatorskie narzędzie badawcze do badania leków w celu lepszego zrozumienia działania antybiotyków w skali nano, dostarczania informacji i umożliwienia odkrywania potężnych leków do kontrolowania problemów związanych z infekcjami superbakteriami. Aby przygotować system wspornikowy do powtarzalnych i czułych pomiarów, zajęliśmy się zestawem celów w protokole, w szczególności w zakresie ładowania próbki w komórce mikroprzepływowej i standardowych procedur operacyjnych, aby umożliwić ilościowe detekcje nanomechaniczne.

Znaczenie technologii wspornikowej w odniesieniu do istniejących metod

Podsumowując, zwracamy uwagę, że chociaż technologia ta została zaproponowana ponad 25 lat temu, nie znalazła ona drogi do praktyki klinicznej z powodu braku dokładnych i powtarzalnych pomiarów na celach istotnych z medycznego punktu widzenia. W tym miejscu pokazujemy procedury, które ustalają znaczenie stosowania wsporników nanomechanicznych do badania mechanicznego wpływu antybiotyków na cele ściany komórkowej bakterii i wykrywania oporności na środki przeciwbakteryjne. Konwencjonalne metody badań przesiewowych leków wymagają pewnego rodzaju fluorescencyjnego lub radioaktywnego znakowania cząsteczki reporterowej w celu zmierzenia wiązania analitu z jego celem, często w połączeniu z konkurencyjnym lub enzymatycznym testem wiązania i testami białkowymi²⁰. Znakowanie biomolekuł jest nie tylko czasochłonne i kosztowne, ale etykietowanie może również zakłócać interakcję molekularną, blokując miejsce wiązania, co prowadzi do wyników fałszywie ujemnych. Ponadto związki fluorescencyjne są często hydrofobowe, co może prowadzić do wiązania tła i wyników fałszywie dodatnich. Ze względu na te ograniczenia rośnie zainteresowanie nowatorskimi technikami bezznacznikowymi, które umożliwiają badanie przesiewowe praktycznie każdego kompleksu molekularnego przy minimalnym opracowaniu testu. Najbardziej znanymi obecnie technologiami powierzchni bez etykiet są SPR i mikrowaga kwarcowa (QCM). W przeciwieństwie do SPR, które mierzą stałą dielektryczną, technologia wspornikowa bez etykiety wykrywa odkształcenie powierzchniowe generowane przez interakcję ligand-receptor, która może bezpośrednio mierzyć siły nanomechaniczne generowane przez specyficzne wiązanie ligandów z receptorami powierzchniowymi. Wyjątkowość tych czujników polega na tym, że ich czułość nie opiera się na właściwościach dielektrycznych spowodowanych zmianą masy spowodowaną wiązaniem analitu, jak w SPR i QCM, ale raczej na najdrobniejszej indukowanej zmianie naprężeń powierzchniowych w płaszczyźnie, co sprawia, że technologia ta jest wyjątkowo odpowiednia do badania nanomechaniki cząsteczek leków przy klinicznie istotnych stężeniach antybiotyków (3-27 μM)¹⁷. Wsporniki są również szczególnie dobrze przystosowane do wykrywania małych cząsteczek (takich jak fragmenty DNA i leki) w warunkach fizjologicznych, w tym w złożonych środowiskach, co jest w dużej mierze podstawą przemysłu farmaceutycznego i dlatego będzie służyć jako narzędzie uzupełniające w odkrywaniu leków. Technologia Cantilever została z powodzeniem zastosowana w dziedzinie genomiki^3,5, wykrywania gazów²¹, proteomiki²² i leków¹. Co więcej, wsporniki są wytwarzane przy użyciu taniej technologii krzemowej, a ze względu na ich kompatybilność z procesami mikrofabrykacji, wsporniki można zminiaturyzować w celu poprawy czułości i zrównoleglenia w duże macierze czujników do badań przesiewowych wielu związków leków i bardziej przepustowych, bogatych w informacje testów przesiewowych. Ulepszenia oprzyrządowania i projektu eksperymentalnego pozwolą na analizę szerokiej gamy interakcji w czasie rzeczywistym, co pomoże w poszukiwaniach nowej generacji superleków, które pozwolą rozwiązać problemy związane z infekcjami wielolekoopornymi.

Krytyczne kroki w ramach protokołu

Opracowanie solidnych protokołów pomiarowych ma kluczowe znaczenie dla zastosowań tej technologii. Aby uzyskać zadowalające ilościowe pomiary docelowe leku i określić najniższe stężenie antybiotyków, które można wykryć w buforze lub surowicy krwi, zajęto się krytycznymi etapami w ramach protokołu. Pierwsze zadanie polega na dostrojeniu i optymalizacji składu chemicznego wychwytywania powierzchni w celu zwiększenia specyficzności i czułości wykrywania wsporników. Niezaprzeczalnie transdukcja naprężeń powierzchniowych jest zjawiskiem zbiorowym, wymagającym pokrycia stosunkowo dużej części powierzchni w celu ustanowienia łączności między obszarami reaktywnymi chemicznie. Pokazujemy, że zmieniając gęstość leżących pod spodem peptydów powierzchniowych, próg krytyczny ~p ≥10% jest określany tam, gdzie skala naprężeń powierzchniowych jest skalowana w funkcji gęstości peptydów i zero w przeciwnym razie (ryc. 5). Ważne jest, aby eksperymenty były zaprojektowane tak, aby zbadać jednorodność naprężeń wzdłuż wsporników, aby zapewnić maksymalne odchylenia sygnału dla czułych pomiarów. Ponadto konieczne jest wdrożenie wydajnych protokołów regeneracji powierzchni, które umożliwią pomiary w wielu cyklach i obniżą koszty każdego testu. Podczas projektowania powierzchni receptora przy użyciu tiolowanego końca hydrofobowego, orientacja cząsteczki receptora i odstępy między nimi są niezbędne, aby umożliwić samoorganizację gęstego upakowania w wyniku interakcji Van-der-Waalsa między cząsteczkami w celu zminimalizowania oddziaływań niespecyficznych. Ponadto cząsteczki wychwytujące powinny zawierać łącznik z glikolem polietylenowym (PEG), aby umożliwić hydrofilowość części matrycy czujnikowej, aby zapobiec bezpośredniej reakcji cząsteczek w roztworze analitu z niepowlekaną powierzchnią złota. Cząsteczki łącznikowe PEG muszą działać jak przekładki, aby zmniejszyć ograniczenia steryczne, a tym samym umożliwić analitom roztworu specyficzną interakcję z receptorami powierzchniowymi w celu wywołania mierzalnej zmiany naprężeń powierzchniowych. Czujnik matrycy wspornikowej musi być poddany co najmniej pomiarowi referencyjnemu in situ , a sygnał wyświetlany w czasie rzeczywistym jest odchyleniem różnicowym, uzyskanym przez odjęcie bezwzględnego odchylenia wspornika odniesienia od wsporników czujników. W związku z tym wspornik referencyjny jest niezbędny do uwzględnienia oddziaływań niespecyficznych, takich jak zmiany temperatury, zmiany współczynnika załamania światła lub interakcje na niefunkcjonalizowanym spodzie wspornika. Optymalizacja natężenia przepływu (~30-150 μl/min) stanowi krytyczny krok w ramach protokołu, ponieważ zapewnia wydajną wymianę cieczy i wystarczająco stały transport masy roztworów. Konstrukcja celi cieczowej musi zapewniać optymalną objętość (5-80 μl) dla dużych prędkości przepływu, aby umożliwić doskonałą wymianę cieczy w celu pokonania ograniczeń transportu masy. Natężenie przepływu jest szczególnie istotne podczas wykonywania pomiarów kinetycznych²³. Komory cieczowe o dużej objętości wymagają niekontrolowanie wysokich natężeń przepływu, co prowadzi do wymagań dotyczących dużej objętości próbki, co niepotrzebnie zwiększa cenę testu. Wcześniej używaliśmy przepływu grawitacyjnego do wstrzykiwania różnych próbek do komory cieczy pomiarowej. Przepływ grawitacyjny ma tę zaletę, że nie wymaga żadnych części mechanicznych, a zatem nie wprowadza dodatkowego hałasu do systemu. Jednak jego istotną wadą jest to, że działa niezawodnie tylko przy stosunkowo wysokich natężeniach przepływu (~200 μl/min). Oczywiście niższe natężenie przepływu (≤1 μl/min) wymagałoby ograniczonej objętości próbki w jednostce czasu, ale z drugiej strony sprawia, że reakcje są znacznie wolniejsze, a tym samym wymagają dłuższych czasów kontaktu. Co więcej, przepływ grawitacyjny ma dużą zmienność w natężeniu przepływu, ponieważ zależy od różnicy wysokości między wlotem a wylotem, która zmniejsza się wraz ze zużyciem roztworów próbek podczas eksperymentu. Aby uniknąć problemów z przepływem grawitacyjnym, należy użyć pompy strzykawkowej. Zaletą stosowania pompy strzykawkowej jest to, że pozwala ona na stałe natężenie przepływu przez długi czas, co pozwala na realizację eksperymentów w bardziej kontrolowanym środowisku.

Ograniczenia protokołu

Głównym wyzwaniem w uzyskaniu powtarzalnej i specyficznej detekcji biologicznej za pomocą czujników wspornikowych jest zapewnienie, że właściwości warstwy receptorowej są biochemicznie "aktywne" i jednolite dla każdego testu. Sekret sukcesu eksperymentalnego tkwi w starannej wstępnej obróbce chipa czujnika za pomocą ustandaryzowanego protokołu czyszczenia i immobilizacji z chemikaliami łącznikowymi w celu zorientowania cząsteczek receptora w ich aktywnej konformacji. W naszej obecnej konfiguracji funkcjonalizujemy układy wspornikowe za pomocą małych szklanych kapilarn, które mogą mieć pewne wady, a w niektórych przypadkach mogą być problematyczne. Te szklane kapilary są otwarte na obu końcach, dzięki czemu rozpuszczalniki próbek mogą łatwo odparować. Na przykład, jeśli temperatura etapu funkcjonalizacji nie jest dokładnie kontrolowana, szybkość parowania może się znacznie różnić w różnych momentach, szczególnie w przypadku stosowania lotnych rozpuszczalników, takich jak etanol. Istnieje również możliwość niewielkich różnic w czasie inkubacji między poszczególnymi wspornikami, biorąc pod uwagę, że ciecze czujnikowe muszą być kolejno ładowane do kapilarek. Innym czynnikiem ograniczającym funkcjonalizację naczyń włosowatych jest brak możliwości zapewnienia, że wsporniki są zawsze wprowadzane do naczyń włosowatych w dokładnie ten sam sposób. Ponadto czasami wsporniki muszą być lekko wyciągnięte z kapilarn, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu, ponieważ próbki cieczy mogą spływać na korpus wióra. Możemy rozwiązać te problemy, zatrudniając skanery atramentowe jako alternatywną procedurę powlekania powierzchni do powlekania wsporników. Chociaż pozwoliłoby to na dokładną kontrolę powlekania próbki z możliwością skalowania w górę dla dużych matryc, najczęstszą wadą jest to, że małe krople, które osadzają się na wspornikach, mogą odparować w ciągu kilku sekund i wymagają kontrolowanego środowiska wilgotności. W związku z tym czasu inkubacji nie można łatwo dostosować, co może być pożądane w przypadku niektórych zastosowań. Subtelne wzajemne oddziaływanie czynników, takich jak objętość próbki, czas inkubacji i szybkość parowania, ma bezpośredni wpływ na ekspozycję wsporników na próbkę funkcjonalizacyjną i należy zadbać o zapewnienie zoptymalizowanej chemii powierzchni do testów wspornikowych, ponieważ każda niewielka zmiana gęstości cząsteczkowej receptora będzie miała duży wpływ na odpowiedź wspornika.

Eksperymentalne modyfikacje projektu (tj. alternatywne techniki lub materiały)

Aby sprostać głównemu wyzwaniu, jakim jest uzyskanie powtarzalnej procedury powlekania dla przyszłego rozwoju technologii wspornikowej, potrzebne są różne strategie, które wykorzystywałyby wsporniki zintegrowane z kanałami mikroprzepływowymi. Chodzi o to, aby specjalne chipy wspornikowe były zaprojektowane tak, aby każdy wspornik był umieszczany w swoim własnym kanale, aby umożliwić procedury funkcjonalizacji online in situ , w których kanały są adresowane indywidualnie. Te eksperymentalne modyfikacje projektu pozwoliłyby na przeprowadzenie procesu powlekania w kontrolowanym i zamkniętym środowisku, w którym ekspozycja na rozpuszczalnik jest precyzyjnie monitorowana przez czas inkubacji i natężenie przepływu w celu automatycznego unieruchomienia cząsteczek wychwytujących na wiórach wspornikowych. Te same kanały można następnie wykorzystać do rzeczywistych eksperymentów wiązania, w których wszystkie wsporniki mogą być wystawione na działanie tego samego roztworu analitu. Oprócz procedury funkcjonalizacji wspornika, udoskonalenia wymagałby również mechanizm odczytu wspornika. Metoda odchylania wiązki optycznej jest bardzo czuła i od wielu lat jest z powodzeniem stosowana w technologii mikroskopii sił atomowych (AFM). Niemniej jednak w przypadku wolnostojących czujników wspornikowych odczyt optyczny ma pewne wady, na przykład nie pozwala na pomiary w nieprzezroczystych cieczach, takich jak krew, wyrównanie matrycy laserów może być czasochłonne i żmudne, a obecna konfiguracja nie jest w stanie rozróżnić odchyleń pochylonych i pionowych. W związku z tym przyszły rozwój technologii wspornikowej będzie musiał uwzględniać aspekty ogólnej konstrukcji czujnika (np. geometrię wspornika) i odczyt wspornika w celu uzyskania solidnych protokołów pomiarowych zarówno w terenie, jak i w środowisku laboratoryjnym. Manalis i jego współpracownicy^opracowali nowe typy pustych czujników wspornikowych, w których wsporniki mają wbudowany kanał mikroprzepływowy wewnątrz wiązki, co pozwala na pracę urządzenia w próżni z wykorzystaniem wysokiej jakości czynników. W tym trybie wsporniki działają jak mikrowaga²², a zatem nie jest już konieczna asymetria między dwiema stronami w odniesieniu do funkcjonalizacji, dzięki czemu cząsteczki wychwytywane mogą być fizysorbowane lub kowalencyjnie przyłączane bezpośrednio do krzemu, zwykle przy użyciu SAM lub silanów²⁴. Wsporniki mogą być również modyfikowane cienką warstwą polimeru, która jest następnie sprzęgana z przeciwciałami²⁵ w celu wykrywania biochemicznego.

Rozwiązywanie problemów

Częstym problemem związanym z pomiarami wsporników jest wprowadzanie pęcherzyków powietrza do mikroprzepływowej celi przepływowej. Należy zadbać o to, aby podczas montażu chipa do ogniwa cieczowego nie dostały się pęcherzyki powietrza. Dryfowanie sygnału jest również kolejnym częstym problemem spowodowanym różnicami w temperaturze próbek. Wsporniki muszą być zrównoważone, aby ustabilizować się przed podjęciem pomiarów. Wszystkie, anality i roztwory regeneracyjne muszą być przechowywane w tym samym pomieszczeniu co przyrząd wysięgnikowy, aby wszystkie roztwory miały tę samą temperaturę. Chociaż pompa strzykawkowa może zapewnić bardzo dokładne i wyjątkowo niskie natężenia przepływu, jest to na ogół związane z szumem mechanicznym w pomiarach wsporników. Dlatego ważne jest, aby opracować prosty i skuteczny reduktor szumów, aby uniknąć niepotrzebnych szumów w sygnałach odchylenia. Reduktor hałasu składa się z małego zbiornika cieczy umieszczonego między pompą strzykawkową a ogniwem cieczowym, który pochłania hałas mechaniczny z pompy. Ze względu na czułą naturę detektora optycznego, wspornikowy system pomiarowy powinien być najlepiej obsługiwany w zamkniętej konfiguracji, aby zablokować wszelkie rozproszone światła przed zakłóceniami w optycznym systemie odczytu. Ponadto jakość warstw czujnikowych może się znacznie obniżyć, jeśli na wspornikach wykonywana jest duża liczba etapów mycia, co ogranicza żywotność chipa czujnika.

Alternatywne lub przyszłe zastosowania po opanowaniu tej techniki

Wsporniki pokryte SAM zakończonymi grupą aminową lub karboksylową mogą być używane jako czujniki pH. Funkcjonalne grupy końcowe protonują lub deprotonują w zależności od pH roztworu i mogą generować ładunek powierzchniowy, który prowadzi do wygięcia wspornika²⁴. Biorąc pod uwagę, że czujniki wspornikowe mogą śledzić interakcje lek-cel związane z destabilizacją ściany komórkowej żywych bakterii^1,6,7, pomogą one w poszukiwaniu i opracowaniu nowej generacji antybiotyków do zwalczania zakażeń lekoopornych. W przyszłości wsporniki będą wykorzystywane jako mikrowagi do pomiaru masy i tempa wzrostu pojedynczych komórek²⁶. Technologia wspornikowa okaże się korzystna dla badania odpowiedzi komórkowych na różne czynniki wzrostu lub leki. Będzie to również nowatorskie narzędzie do szybkiego wykrywania wielu biomarkerów, które ma bezpośrednie znaczenie w zastosowaniach medycznych i przyłóżkowych. Biorąc pod uwagę wszechstronność, niewielkie rozmiary i solidność czujników wspornikowych, będą one stanowić czuły monitor szkodliwych czynników środowiskowych. Wykazały one już swoją czułość w wykrywaniu toksycznych i szkodliwych gazów, które mogą ulatniać się z laboratoriów i przemysłowych jednostek produkcyjnych do środowiska, takich jak kwas fluorowodorowy²⁷ lub cyjanowodór²⁸.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Scentris		Scentris, Veeco Instruments, Inc	Nie w produkcji
Zawór		MVP, Hamilton, Reno, NV	Umożliwia wtrysk wielu stężeń
Parownik		BOC Edwards Auto 500, Wielka Brytania	Wiązka elektronów jest preferowana ze względu na odkształcenie wsporników spowodowane problemami z ogrzewaniem termicznym
Naczynie		magazynowe Agar Scientific, Wielka Brytania	Utrzymuje świeżość folii pokrytych złotem
Kapilara szklana		King Precision Glass, Claremont, CA, USA	Do funkcjonalnej kapilary układów wspornikowych
Model pompy		Genie Plus, Kent Scientific, Torrington, CT, USA	Dobry do kontrolowanego natężenia przepływu próbek cieczy w kanałach mikroprzepływowych
0,2-4,5 i mu; m Filtry	1511940001	Merck Millipore	Do filtrowania próbek
Chipy		Londyńskie Centrum Nanotechnologii (LCN)	Bardzo czuły
Fosforan sodu jednozasadowy	10049-21-5	Sigma-Aldrich, Wielka Brytania	Do sporządzania roztworów buforowych
Fosforan sodu dwuzasadowy	7558-79-4	Sigma-Aldrich, Wielka Brytania	Do wytwarzania roztworów buforowych
Polisorbat 80 (PS80) lub Tween 80	9005-65-6	Sigma-Aldrich, Wielka Brytania	Stosowany w roztworach buforowych w celu zapobiegania niespecyficznym interakcjom na naczyniach szklanych
DI woda		Millipore Co., Billerica, MA, USA	Używany do wytwarzania roztworów
Cała surowica	GEM-700-110-H	Sera Laboratories International Ltd, Wielka Brytania	Stosowany w pomiarach naśladujących warunki fizjologiczne
Wankomycyna (Van)	1404-93-9	Sigma-Aldrich, Wielka Brytania	Używany lek
Kwas siarkowy	7664-93-9	Sigma-Aldrich, Wielka Brytania	Używany do procedur czyszczenia naczyń szklanych
Nadtlenek wodoru	7722-84-1	Sigma-Aldrich, Wielka Brytania	Używany do procedur czyszczenia naczyń szklanych
D-Ala i D-Lac		Londyńskie Centrum Nanotechnologii (LCN)	Receptory powierzchniowe pokryte na wsporniku do wykrywania interakcji
LabView		National Instruments Co., Austin, Teksas, Stany Zjednoczone	Oprogramowanie używane do interfejsu instrumentalnego umożliwiające kontrolowane pomiary

sześciodrogowy EB Cantilever lek-cel