Obrazowanie żywych komórek zakażeń wirusem opryszczki umożliwia analizę dynamicznych zdarzeń transportu kierowanego i rozprzestrzeniania się międzykomórkowego. W tym miejscu przedstawiamy metodologie, które wykorzystują rekombinowane szczepy wirusa eksprymujące fluorescencyjne białka fuzyjne, aby ułatwić wizualizację zespołów wirusowych podczas infekcji neuronów pierwotnych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie żywych komórek transportu i rozprzestrzeniania się wirusa alfaopryszczki
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Postępy w technikach mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek, a także budowa rekombinowanych szczepów wirusowych, które wyrażają fluorescencyjne białka fuzyjne, umożliwiły wizualizację w czasie rzeczywistym transportu i rozprzestrzeniania się infekcji neuronów wirusem alfaopryszczki. Zastosowanie nowych fluorescencyjnych białek fuzyjnych do błony wirusowej, powłoki i kapsydów, w połączeniu z obrazowaniem żywych komórek, pozwoliło zidentyfikować zespoły cząstek wirusa ulegające transportowi w aksonach. Podobne narzędzia zostały z powodzeniem wykorzystane do analiz rozprzestrzeniania się cząstek wirusa między komórkami w celu ilościowego określenia liczby i różnorodności wirionów przenoszonych między komórkami. Co ważne, techniki obrazowania żywych komórek transportu i rozprzestrzeniania się następcy dostarczają wielu informacji, w tym prędkości transportu cząstek, rozkładów cząstek i czasowych analiz lokalizacji białek. Wraz z klasycznymi technikami genetyki wirusów, metodologie te dostarczyły krytycznych informacji na ważne pytania mechanistyczne. W tym artykule szczegółowo opisujemy metody obrazowania, które zostały opracowane, aby odpowiedzieć na podstawowe pytania dotyczące transportu i rozprzestrzeniania się wirusa opryszczki alfa.
Wprowadzenie
Zakażenie obwodowego układu nerwowego (PNS) wirusami alfaopryszczki, takimi jak wirus opryszczki pospolitej (HSV) -1, -2 i wirus rzekomej wścieklizny (PRV) obejmuje kilka skomplikowanych i wysoce regulowanych etapów w całym cyklu życia wirusa. Transport PNS w obrębie neuronów ma kluczowe znaczenie zarówno podczas pierwotnej infekcji wirusowej, jak i późniejszego rozprzestrzeniania się między gospodarzami. Mechanizmy molekularne, które modulują dwa składniki cyklu życiowego wirusa; Ukierunkowany transport zespołów wirusa z dala od ciał komórkowych w aksonach (transport następczy) i późniejsze przekazywanie wirionów do wrażliwych komórek (rozprzestrzenianie się następcze) są ważne dla zrozumienia patogenezy wirusa opryszczki.
Transport i wyjście cząsteczek wirusa w neuronach zależy od złożenia dojrzałego zakaźnego wirionu 1,2. Wcześniej ustalone testy, w tym immunofluorescencja (IF) i mikroskopia elektronowa (EM), zostały wykorzystane do zbadania stanu składania cząstek i interakcji białek związanych z transportem wirionu i rozprzestrzenianiem się 3-6. Jednak dynamiczna natura transportu wirionów i artefaktów eksperymentalnych wprowadzonych przez utrwalenie chemiczne zakłóciła interpretację utrwalonych obrazów 7,8. Ostatnio opisano szereg wirusowo-fluorescencyjnych białek fuzyjnych dla HSV i PRV, które mają znikomy wpływ na funkcję białek. Fluorofory z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) i czerwonymi białkami fluorescencyjnymi (mCherry lub mRFP) są często sparowane, aby umożliwić obrazowanie dwóch z trzech składników strukturalnych dojrzałego wirionu: kapsydu, osłonki i glikoproteiny 9-11. Obrazowanie żywych komórek transportu następczego przy użyciu podwójnie znakowanych wirusów wizualizuje stan składania cząstek wirusa podczas transportu. Podobne szczepy wirusowe wykazujące ekspresję fluoroforu są wykorzystywane do wizualizacji liczby i różnorodności genomów wirusa po rozprzestrzenianiu się 12,13. Właściwości białek fluorescencyjnych (omówione w 14,15) mają ogromny wpływ na zdolność do wizualizacji zespołów wirusowych lub komórkowych. Wewnętrzne właściwości białka fluorescencyjnego, w tym wzajemne oddziaływania i stabilność, powinny być brane pod uwagę podczas projektowania i testowania nowych fuzji białek w celu zachowania funkcjonalności typu dzikiego.
W połączeniu z fuzjami białek fluorescencyjnych, do obrazowania żywych komórek zakażenia wirusem opryszczki zastosowano dwa dobrze scharakteryzowane systemy hodowli komórkowych in vitro: zdysocjowane 16 i podzielone na przedziały 17 (Rysunek 1A) szczurzych górnych zwojów szyjnych (SCG). W obu systemach embrionalne SCG są preparowane, dysocjowane na ciała jednokomórkowe i posiane w celu hodowli in vitro 18. Neurony SCG są częścią autonomicznego układu nerwowego i mogą być łatwo hodowane i różnicowane przez neuronalny czynnik wzrostu (NGF) do dojrzałego stanu spolaryzowanego ex vivo. Zdysocjowane neurony SCG tworzą rozszerzoną sieć aksonów, która pozwala na wizualizację cząstek wirusa podczas transportu następczego 6. Podzielone na przedziały hodowle SCG zapewniają płynną izolację ciała komórki neuronalnej (przedział S) i dystalnych końców aksonów (przedział N) 19. Wcześniej opublikowano szereg szczegółowych protokołów budowy i wykorzystania neuronów podzielonych na przedziały przy użyciu oryginalnych 20 lub zmodyfikowanych komór Campenota 17. Izolacja fluidyczna pozwala na selektywne zakażenie ciał komórek nerwowych i wykrycie wirionów potomnych po transporcie do izolowanych końców aksonów. Posiew komórek nabłonkowych na końcach przed infekcją zapewnia komórkom biorczym rozprzestrzenianie się infekcji wirusowej.
Istnieje wiele istotnych elementów ważnych dla wszystkich eksperymentów z obrazowaniem żywych komórek, ale najważniejsze dla naszych protokołów to: zautomatyzowana akwizycja obrazu, oświetlenie fluorescencyjne, szybkość obrazowania i kontrola środowiska. Do wszystkich eksperymentów obrazowych używamy odwróconego, zautomatyzowanego mikroskopu z oświetleniem epifluorescencyjnym (ryc. 1B). Mikroskop jest zbudowany na podstawie Nikon Eclipse Ti i wykorzystuje szereg sterowanych komputerowo systemów zmotoryzowanych do szybkiej rekonfiguracji mikroskopu podczas automatycznej akwizycji obrazu. Do oświetlenia fluorescencyjnego używamy lampy rtęciowej o szerokim spektrum działania, która może być tłumiona za pomocą filtrów o neutralnej gęstości wzdłuż ścieżki oświetlenia. Filtry wzbudzenia ograniczają spektrum oświetlenia fluorescencyjnego, a w połączeniu z wieloprzebiegowymi zwierciadłami dichroicznymi i filtrami emisji fluorescencji wizualizują określone związki fluorescencyjne. Filtry wzbudzenia i emisji są zamontowane w niezależnych, szybko przełączających się kołach filtrowych, aby umożliwić szybką sekwencyjną akwizycję różnych kanałów fluorescencyjnych. Szybkość akwizycji obrazu jest dodatkowo zwiększona dzięki czułej i szybkiej kamerze EM-CCD, przydatnej do wykrywania sygnałów o niskiej intensywności i krótkich czasach odczytu obrazu. Kontrola otoczenia pod mikroskopem odbywa się za pomocą podgrzewanego inkubatora ze stopniem i grzałki obiektywu, która utrzymuje próbki w podwyższonych temperaturach, podczas gdy do inkubatora wprowadzana jest nawilżona i wzbogacona w CO2 atmosfera. Mikroskop jest przechowywany w zaciemnionym pomieszczeniu, w którym temperatura otoczenia jest utrzymywana na poziomie zbliżonym do 25 °C, a światło zewnętrzne jest zminimalizowane dzięki zasłonom zaciemniającym we wszystkich oknach. Poniższe protokoły opisują zastosowanie tego systemu do testów transportu następczego i rozprzestrzeniania się.
Istnieje wiele alternatyw dla kontroli zmiennych obrazowania żywych komórek. Kontrola ustawień mikroskopu może być wykonywana ręcznie lub za pomocą zautomatyzowanych systemów zależnych od zastrzeżonego oprogramowania. Oświetlenie fluorescencyjne można uzyskać za pomocą źródeł halogenowych, LED lub laserowych. Szybkość obrazowania jest modyfikowana przez szybkość przełączania filtrów i czas wizualizacji sygnału ze sparowanym systemem detekcji. Kontrolę środowiska można osiągnąć za pomocą specjalistycznego sprzętu na stoliku mikroskopu, obudowy całości lub części mikroskopu w ogrzewanym i nawilżonym pudełku lub poprzez podniesienie temperatury w pomieszczeniu, w którym będzie wykonywana mikroskopia. Każda z tych alternatyw ma zalety i wady związane z kosztami i wydajnością.
W kolejnym protokole szczegółowo opisujemy wykorzystanie obrazowania żywych komórek do badania szybkiego transportu następczego i następczego rozprzestrzeniania się wirusów opryszczki alfa za pomocą rekombinowanych szczepów wirusów. Obrazowanie żywych komórek w czasie rzeczywistym wizualizuje kolokalizację kapsydu, osłonki i/lub glikoproteiny na dynamicznych strukturach poddawanych transportowi w obrębie aksonów 11. Nocne obrazowanie poklatkowe podzielonych kultur neuronalnych wizualizuje wydostanie się wirionu aksonalnego i infekcję wrażliwych komórek 12. Przedstawione tutaj protokoły zostały zoptymalizowane do użytku z naszym konkretnym systemem obrazowania, ale są przedstawione w szerokim ujęciu w odniesieniu do czterech elementów obrazowania żywych komórek. W dalszej części dyskusji omówimy szczegółowo niektóre z optymalizacji, które są niezbędne do udanego eksperymentowania.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Sekcja 1 - Warunki kontroli środowiska dla mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek
- 30 minut przed jakimkolwiek eksperymentem obrazowym podłącz i rozpocznij podgrzewanie górnego inkubatora ze stopniem mikroskopu.
- Włącz mikroskop, przechodzące i epifluorescencyjne źródła światła oraz zautomatyzowane sterowanie sprzętowe. Otwórz oprogramowanie sterujące mikroskopem, NIS Elements, aby połączyć się z mikroskopem i rozpocząć chłodzenie kamery EM-CCD.
- Przymocuj podgrzewacz do soczewek do odpowiedniego obiektywu (60-krotne lub 100-krotne zanurzenie w olejku). nuta: Wybierz soczewkę obiektywu w zależności od typu eksperymentu. 100-krotny różnicowy kontrast interferencyjny (DIC) jest najlepszy do śledzenia następczych transportujących zespoły wirionów, podczas gdy obiektyw 60-krotny jest odpowiedni do wizualizacji rozprzestrzeniania się następczego. Obiektywy zanurzeniowe o mniejszym powiększeniu bez oleju nie wymagają podgrzewacza do soczewek, ponieważ nie mają bezpośredniego kontaktu z próbką.
- Przymocuj inkubator górny stopnia do zmotoryzowanego stolika mikroskopu. Upewnij się, że odpowiednia wkładka, która utrzyma próbkę, jest na swoim miejscu. Podłącz przewód nawilżanego powietrza ze sterownika inkubatora do portu wejściowego w inkubatorze stage górny.
- Włącz elementy sterujące inkubatorem i podgrzewaczem obiektywu i dostosuj ustawienia temperatury do wcześniej zweryfikowanych warunków specyficznych dla obrazowanego obiektywu i próbki (patrz dyskusja).
- Otwórz zawór sterujący na zbiorniku atmosferycznym 5% CO2/95%, aby dostarczyć powietrze uzupełnione CO2 do inkubatora stage górny. Natężenie przepływu powinno wynosić od 60 do 80 ml gazu na minutę. Szybsze tempo spowoduje rozległe odwodnienie próbki pomimo komory nawilżającej.
- Dodaj olej do soczewek do soczewek obiektywowych i natychmiast umieść kulturę, która zostanie zobrazowana, w inkubatorze stage top.
- Pozwól na wyrównanie temperatury w kulturze przez co najmniej 10 minut. Preferowana jest jedna godzina, szczególnie w przypadku obrazowania nocnego opisanego w punkcie 3.
Sekcja 2 - Protokół obrazowania zdarzeń transportu następczego wirionu w czasie rzeczywistym
- Sześć do ośmiu godzin przed obrazowaniem należy zainfekować 35-milimetrowe naczynie z dnem szkiełka nakrywkowego dojrzałych, zdysocjowanych neuronów SCG jednostkami tworzącymi 1 x 106 blaszek tworzących interesującego wirusa (patrz Tabela 1 dla przykładu wirusów) przy użyciu metody opisanej w Taylor et al. 2012a 11. W przypadku testowania więcej niż jednego wirusa, należy przesunąć inokulację o 30-60 minut, aby umożliwić obrazowanie sekwencyjnych próbek w podobnym czasie po zakażeniu.
- Włóż naczynie do inkubatora stage top na co najmniej 10 minut przed przeprowadzeniem jakiegokolwiek eksperymentu. Podczas gdy temperatura się równoważy, płaszczyzna ogniskowej przesuwa się, co negatywnie wpływa na wszelkie eksperymenty obrazowe.
- Korzystając ze światła przechodzącego i okularu mikroskopu, znajdź ciało komórki neuronalnej, które ma wyraźnie izolowane przedłużenie aksonalne. Alternatywnie, użyj odpowiedniego oświetlenia fluorescencyjnego, aby znaleźć komórkę wyrażającą wykrywalne ilości białek fluorescencyjnych. Ważne jest, aby ograniczyć ekspozycję próbki na oświetlenie fluorescencyjne, na tym etapie i kolejnych krokach, ze względu na uszkodzenie komórek wywołane światłem i bielenie białek fluorescencyjnych.
- Osłabij oświetlenie fluorescencyjne, aby zmniejszyć intensywność światła wzbudzającego, na które narażone są komórki. Włącz tłumiące światło filtry o neutralnej gęstości (ND) w ścieżce światła oświetlenia fluorescencyjnego. W przypadku filmów trwających dłużej niż 1 minutę należy użyć co najmniej ND4, aby zapobiec fotowybielaniu białek fluorescencyjnych i rozległym uszkodzeniom fotologicznym aksonów. Struktury o wysokiej fluorescencji można zazwyczaj wizualizować za pomocą założonego filtra ND8.
- Za pomocą oprogramowania mikroskopu (Rysunek 2 i film uzupełniający 1A) przełącz ścieżkę światła na kamerę EM-CCD.
- Określ optymalne czasy i warunki obrazowania dla każdego kanału fluorescencyjnego.
- Uruchom okno obrazu na żywo za pomocą przycisku "Odtwórz".
- Określ optymalne ustawienia ekspozycji aparatu dla każdego białka fluorescencyjnego. Nie przekraczaj 300 ms na kanał, ponieważ wystąpią aberracje ruchowe szybko poruszających się struktur wirionowych. Wykorzystaj wzmocnienie EM kamery do ustawienia 300 (sugerowane przez producenta maksymalne wzmocnienie), aby zminimalizować czas ekspozycji i poprawić wykrywanie przyciemnionych sygnałów. Prawidłowe czasy naświetlania powinny dać obraz o niskiej intensywności tła i wysokich sygnałach specyficznych.
- Po ustawieniu ekspozycji i znalezieniu dobrze zdefiniowanego obszaru aksonu, oprogramowanie musi być skonfigurowane do wykonywania automatycznej akwizycji obrazu. Zatrzymaj okno obrazowania na żywo, aby zapobiec wybielaniu próbki.
- W oprogramowaniu NIS Elements wybierz aplikację 6D - Define/Run Experiment z menu rozwijanego "Aplikacje".
- W oknie Akwizycja ND kliknij zakładkę Czas, która określi częstotliwość akwizycji obrazu. Ustaw interwał na "Bez opóźnienia", a czas trwania na 5 minut. Następnie oprogramowanie będzie rejestrować klatki obrazu z najwyższą możliwą częstotliwością przez czas trwania 5 minut.
- Wybierz zakładkę "Lambda", która umożliwia wybór wstępnie ustawionych konfiguracji sprzętowych używanych do wielokrotnej akwizycji obrazu fluorescencyjnego. Kliknij pierwsze pole, a następnie w kolejnym menu rozwijanym, aby wybrać odpowiednią konfigurację sprzętową. Powtórz tę czynność dla wszystkich białek fluorescencyjnych, które mają być zobrazowane.
- Upewnij się, że zakładki "Pozycje XY", "Seria Z" i "Duży obraz" są odznaczone.
- Nad zakładkami zaznacz pole "Zapisz do pliku", aby automatycznie zapisywać obrazy na dysku twardym podczas akwizycji. Skonfiguruj lokalizację i nazwę pliku wyjściowego eksperymentu. Podczas wykonywania eksperymentów sekwencyjnych oprogramowanie doda kolejny numer na końcu wyznaczonej nazwy pliku.
- Po wybraniu wszystkich zakładek. Rozpocznij eksperyment, klikając przycisk "Uruchom teraz".
- Zoptymalizuj szybkość akwizycji obrazu za pomocą ustawień ekspozycji i rozmiaru obrazu. Użycie małego obszaru obrazu, z którego można uzyskać obraz, często przyspiesza szybkość pozyskiwania klatek. Zdefiniuj obszar zainteresowania za pomocą narzędzia ROI w NIS-Elements, wybierając obszar od 25% do 50% całkowitego obszaru obrazu. Alternatywnie, krótsze czasy naświetlania zwiększą szybkość akwizycji klatek, ale obniżą jakość sygnału (patrz dyskusja).
Sekcja 3 - Nocne obrazowanie poklatkowe zdarzeń rozprzestrzeniania się następcy
- Cztery godziny przed obrazowaniem należy zainfekować podzieloną na przedziały hodowlę neuronów zbudowaną na 35-milimetrowym naczyniu μ. Zaszczepić ciała komórek nerwowych jednostkami tworzącymi płytki 1 x 106 wirusa będącego przedmiotem zainteresowania (patrz tabela 1, na przykład wirusy) przy użyciu metody opisanej w Taylor et al. 2012b 12.
- Delikatnie umieść naczynie hodowlane w inkubatorze znajdującym się na górze sceny. Upewnij się, że pozycja obiektywu jest ustawiona z boku naczynia. Powoli ustawiaj ostrość obiektywu, upewniając się, że obiektyw nie wciska się w próbkę. Po zidentyfikowaniu pola ostrości powoli przesuń obiektyw na środek czaszy, w pobliżu wewnętrznej bariery wyznaczającej wewnętrzną stronę komory aksonu. Podczas ruchu upewnij się, że głębokość ostrości jest zachowana i unikaj wciskania się w próbkę. Ugięcie powierzchni tworzywa sztucznego przez obiektyw spowoduje uszkodzenie aksonów i tworzywa sztucznego.
- Dodać około 2 ml ciepłej (~37 ° C) soli fizjologicznej buforowanej fosforanem do naczynia hodowlanego poza pierścieniem teflonowym. Otacza on kulturę neuronalną pierścieniem PBS, aby zminimalizować odwodnienie próbki i zapewnić izolację termiczną.
- Odczekać, aby temperatura wyrównała się przez co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem automatycznej akwizycji obrazu (3.8). W tym czasie można skonfigurować kroki od 3.5 do 3.7.
- Ogranicz intensywność oświetlenia do najniższego możliwego poziomu, włączając wszystkie filtry o neutralnej gęstości. Umożliwi to częste pozyskiwanie obrazów przez długi czas bez nadmiernych uszkodzeń fotograficznych. Zmniejszenie oświetlenia spowoduje słaby sygnał, co będzie wymagało dłuższych ekspozycji (patrz dyskusja).
- Wykorzystać historyczne ustawienia narażenia lub przed przygotowaniem doświadczenia wygenerować równoległe naczynie z zakażonych komórek nabłonkowych wykazujących ekspresję docelowych białek fluorescencyjnych w celu ustalenia ustawień ekspozycji opisanych w sekcji 2.5.
- Po ustawieniu ekspozycji dla niezbędnych kanałów przychodzi czas na skonfigurowanie oprogramowania do automatycznej akwizycji obrazu. Zatrzymaj okno obrazowania na żywo, aby ograniczyć wybielanie próbki.
- W oprogramowaniu Elements (Rysunek 2 i film uzupełniający 2) wybierz aplikację 6D - Define/Run Experiment z menu rozwijanego "Aplikacje", aby wyświetlić okno ND Acquisition.
- W oknie ND Acquisition kliknij zakładkę Time. Ustaw Interwał na "5 min". Ustaw czas trwania na 20 godzin. Pole pętli zostanie automatycznie obliczone na liczbę powtórzeń, które wykona program.
- Wybierz zakładkę "Lambda". Kliknij pierwsze pole, a następnie w kolejnym menu rozwijanym wybierz odpowiednią konfigurację lambda dla Kontrastu fazowego. Powtórz dla kolejnych pozycji, wybierając odpowiednie konfiguracje dla każdego białka fluorescencyjnego, które ma być zobrazowane.
- Wybierz zakładkę "Duży obraz", która określa parametry wielu obrazów, które mają zostać połączone w jedno większe pole widzenia. Obszar o dobrej wielkości składa się z obrazów 5 x 2 z 7% nakładaniem się na siebie. Pozwoli to na zobrazowanie maksymalnej liczby komórek na pozycję bez wpływu na częstotliwość pozyskiwania obrazu. Usuń także zaznaczenie pola wyboru "Zamknij aktywną migawkę podczas ruchu stołu montażowego". Ta opcja zwiększa szybkość akwizycji, nie zamykając migawki między obrazami.
- Wybierz zakładkę "Pozycje XY", aby zidentyfikować wiele pozycji, które będą sekwencyjnie obrazowane równolegle w trakcie trwania filmu w nocy. Zaznacz pozycje definiujące punkt środkowy dla każdego dużego obszaru obrazu. Wybierz od 6 do 8 pozycji obrazu w próbce. Dobry obszar obrazu będzie zawierał małe skupiska komórek w bliskim sąsiedztwie wyraźnie zdefiniowanych aksonów. Komórki nie powinny być ułożone jedna na drugiej, a wiązanie aksonów powinno być zminimalizowane. Punktem skupienia jest jądro komórki. Ustaw obiektyw w taki sposób, aby dla większości komórek widoczna była wyraźnie zdefiniowana otoczka jądrowa.
- Upewnij się, że karta "Seria Z" nie jest zaznaczona.
- Skonfiguruj funkcję automatycznego zapisywania zgodnie z powyższym opisem w sekcji 2.6.5.
- Przetestuj ustawienia ekspozycji i pozycji, klikając "1 pętla czasowa". Oceń wynikowe obrazy pod kątem oświetlenia światłem przechodzącym, ostrości i kadrowania. Jeśli ostrość uległa przesunięciu, zresetuj ostrość dla każdej pozycji na karcie X-Y. Odczekaj 10 minut i powtarzaj ten krok, aż ostrość się ustabilizuje.
- Po zweryfikowaniu i przetestowaniu wszystkich ustawień rozpocznij automatyczny eksperyment, klikając przycisk "Uruchom teraz".
Sekcja 4 - Przetwarzanie i eksport obrazów
Eksport danych
- Zestawy danych uzyskane podczas obrazowania na żywo komórek zdarzeń transportu lub rozprzestrzeniania się powinny zostać wyeksportowane z oprogramowania NIS Elements do powszechnie używanych typów plików w celu późniejszego wykorzystania w prezentacjach i publikacjach (film uzupełniający 3). Aby wyeksportować filmy, otwórz odpowiedni plik RAW .nd2 w NIS Elements i wybierz widok "podzielonego komponentu", aby wyświetlić żądane kanały fluorescencyjne. Odtwarzanie pliku z odpowiednią prędkością; 5 klatek na sekundę to dobry punkt wyjścia do wizualizacji szybkiego transportu.
- Dołącz sygnaturę czasową reprezentującą zegar czasu rzeczywistego podczas odtwarzania filmu. Kliknij obraz prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Dodaj informacje o ND. W lewym górnym rogu pojawi się licznik cyfrowy.
- Edytuj sygnaturę czasową, aby wyświetlić informacje. Kliknij prawym przyciskiem myszy licznik i wybierz Edytuj informacje ND. W kolejnym oknie podręcznym edytuj tekst, aby odzwierciedlić ważne parametry obrazowania. Edytuj czcionkę, kolor i rozmiar, aby uzyskać przejrzystość.
- Przejdź do menu "Edycja" i znajdź "Utwórz migawkę widoku" lub naciśnij "x". To polecenie otwiera okno "wyświetl migawkę". Wybierz opcję "Zastosuj do wszystkich klatek", aby wygenerować 8-bitowy plik RGB gotowy do eksportu, zawierający kanały fluorescencyjne z całego filmu.
- Zapisz jako plik .avi, aby zapewnić zgodność między platformami. Ustaw szybkość odtwarzania na 200 ms na klatkę. Pliki .avi wygenerowane przez NIS Elements mogą być następnie dalej kompresowane za pomocą innego oprogramowania do konwersji do żądanego typu pliku.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Transport anterogradowy
Zastosowanie niniejszego protokołu do infekcji dysocjowanych kultur SCG szczepem PRV 348, rekombinowanym szczepem PRV wykazującym ekspresję białek fuzji błonowych GFP-Us9 i gM-mCherry, umożliwiło wizualizację transportu anterogradnego wirionów (Rycina 3 oraz Film uzupełniający 4). Wbudowanie tych białek fuzyjnych do cząstek wirusowych pozwala na ich wykrycie w transportowanych punktach (puncta), a wspomniane warunki obrazowania minimalizuj...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Celem obrazowania żywych komórek jest obserwacja procesów biologicznych zachodzących bez znaczących zmian w akcie obserwacji. Cel ten osiąga się poprzez optymalizację trzech zmiennych: kontroli środowiska, szybkości obrazowania i oświetlenia fluorescencyjnego. Te współzależne zmienne muszą być zrównoważone, aby osiągnąć realne warunki obrazowania. Przedstawione protokoły wykorzystują określone warunki w celu uzyskania reprezentatywnych wyników. Pokrótce omówimy kontrolę środowiska i szkody obserwacyjne, zanim szczegółowo...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
L.W.E. i R.K. są wspierane przez amerykańskie National Institutes of Health granty R37 NS033506-16 i R01 NS060699-03. M.P.T. był wspierany przez American Cancer Society Postdoctoral Research Fellowship (PF-10-057-01-MPC). Porady i wiedza dr Matthew Lymana i dr Orena Kobilera odegrały kluczową rolę w projektowaniu konfiguracji mikroskopu i metod obrazowania żywych komórek. Podziękowania kierujemy również do Neala Barlowa i Briana T. Kaina z firmy Nikon Instruments za ich pomoc techniczną w zakupie, instalacji i eksploatacji mikroskopu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Naczynie hodowlane ze szklanym dnem 35 mm | MatTek Corporation; Ashland, MA | P35G-1.5-20-C | |
| 35 mm μ-Dish | Ibidi USA LLC, Werona, WI | 81156 | |
| Korpus mikroskopu | Nikon Instruments Inc. | Nikon Eclipse Ti | |
| Mikroskop zmotoryzowany X-Y stage | Prior Scientific; Rockland, MA | H117 ProScan Flat Top | |
| Zmotoryzowane koła filtrowe | Prior Scientific | HF110 10-pozycyjne koło | |
| filtrów Źródło oświetlenia fluorescencyjnego | Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario, Kanada | X-Cite 120Q | |
| Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT | 89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry - Kamera ET | ||
| EM-CCD | Andor Technology USA; South Windsor, CT | iXon3 897 | |
| Etap Chamlide Inkubator środowiskowy | Live Cell Instruments; Seul, Korea Południowa | TC-L-10 | |
| Grzałka obiektywu | Bioptecs; Butler, PA | 150803 Kontroler 150819-12-08 Oprogramowanie do analizy grzałek | |
| Nikon Instruments Inc.; Melville, Nowy Jork | NIS Elementy |
Bibliografia
- Johnson, D. C., Baines, J. D. Herpesviruses remodel host membranes for virus egress. Nature reviews. Microbiology. 9 (5), 382-394 (2011).
- Mettenleiter, T. C., Klupp, B. G., Granzow, H. Herpesvirus assembly: a tale of two membranes. Current Opinion in Microbiology. 9 (4), 423-429 (2006).
- Saksena, M. M., Wakisaka, H., et al. Herpes simplex virus type 1 accumulation, envelopment, and exit in growth cones and varicosities in mid-distal regions of axons. Journal of Virology. 80 (7), 3592-3606 (2006).
- Snyder, A., Wisner, T. W., Johnson, D. C. Herpes Simplex Virus Capsids Are Transported in Neuronal Axons without an Envelope Containing the Viral Glycoproteins. Journal of Virology. 80 (22), 11165-11177 (2006).
- Snyder, A., Polcicova, K., Johnson, D. C. Herpes simplex virus gE/gI and US9 proteins promote transport of both capsids and virion glycoproteins in neuronal axons. Journal of Virology. 82 (21), 10613-10624 (2008).
- Tomishima, M. J. A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins. The Journal of Cell Biology. 154 (4), 741-752 (2001).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
- Kratchmarov, R., Taylor, M. P., Enquist, L. W. Making the case: Married versus Separate models of alphaherpes virus anterograde transport in axons. Reviews in Medical Virology. 22 (6), 378-391 (2012).
- Antinone, S. E., Smith, G. A. Two modes of herpesvirus trafficking in neurons: membrane acquisition directs motion. Journal of Virology. 80 (22), 11235-11240 (2006).
- Del Rio, T., Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Heterogeneity of a fluorescent tegument component in single pseudorabies virus virions and enveloped axonal assemblies. Journal of Virology. 79 (7), 3903-3919 (2005).
- Taylor, M. P., Kramer, T., Lyman, M. G., Kratchmarov, R., Enquist, L. W. Visualization of an alphaherpesvirus membrane protein that is essential for anterograde axonal spread of infection in neurons. mBio. 3 (2), (2012).
- Taylor, M. P., Kobiler, O. Alphaherpesvirus axon-to-cell spread involves limited virion transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2012).
- Kobiler, O., Brodersen, P., Taylor, M. P., Ludmir, E. B., Enquist, L. W. Herpesvirus replication compartments originate with single incoming viral genomes. mBio. 2 (6), (2011).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
- Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 292-299 (2005).
- Curanovic, D., Ch'ng, T. H., Szpara, M., Enquist, L. Compartmented neuron cultures for directional infection by alpha herpesviruses. Current protocols in cell biology. Chapter 26 (Unit 26.4), (2009).
- Zareen, N., Greene, L. A. Protocol for culturing sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG). J. Vis. Exp. (23), e988(2009).
- Ch'ng, T. H., Enquist, L. W. Neuron-to-Cell Spread of Pseudorabies Virus in a Compartmented Neuronal Culture System. Journal of Virology. 79 (17), 10875-10889 (2005).
- Campenot, R. B., Lund, K., Mok, S. -A. Production of compartmented cultures of rat sympathetic neurons. Nature Protocols. 4 (12), 1869-1887 (2009).
- Kramer, T., Greco, T. M., Taylor, M. P., Ambrosini, A. E., Cristea, I. M., Enquist, L. W. Kinesin-3 Mediates Axonal Sorting and Directional Transport of Alphaherpesvirus Particles in Neurons. Cell Host & Microbe. 12 (6), 806-814 (2012).
- Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Herpesviruses use bidirectional fast-axonal transport to spread in sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466(2001).
- Kramer, T., Enquist, L. W. Alphaherpesvirus Infection Disrupts Mitochondrial Transport in Neurons. Cell Host & Microbe. 11 (5), 504-514 (2012).
- Swedlow, J. R., Platani, M. Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution. Cell Structure and Function. 27 (5), 335-341 (2002).
- Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. Short-Term High-Resolution Imaging of Developing Hippocampal Neurons in Culture. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), (2012).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
