Metody mikroskopii fluorescencyjnej do określania żywotności bakterii w połączeniu z komórkami ssaków

Summary

Kluczowe dla dziedziny patogenezy bakteryjnej jest możliwość określenia, czy i jak mikroby przeżywają po ekspozycji na komórki eukariotyczne. W tym artykule przedstawiono protokoły stosowania barwników fluorescencyjnych, które ujawniają żywotność poszczególnych bakterii znajdujących się wewnątrz komórek gospodarza i związanych z nimi.

Abstract

Kluczowe dla dziedziny patogenezy bakteryjnej jest możliwość określenia, czy i jak mikroby przeżywają po ekspozycji na komórki eukariotyczne. Obecne protokoły mające na celu rozwiązanie tych problemów obejmują testy liczby kolonii, testy ochrony gentamycyny i mikroskopię elektronową. Testy liczby kolonii i ochrony gentamycyny oceniają jedynie żywotność całej populacji bakterii i nie są w stanie określić żywotności poszczególnych bakterii. Mikroskopia elektronowa może być wykorzystana do określenia żywotności poszczególnych bakterii i dostarczenia informacji dotyczących ich lokalizacji w komórkach gospodarza. Jednak bakterie często wykazują różne gęstości elektronów, co utrudnia ocenę żywotności. W tym artykule przedstawiono protokoły stosowania barwników fluorescencyjnych, które ujawniają żywotność poszczególnych bakterii znajdujących się wewnątrz komórek gospodarza i związanych z nimi. Testy te zostały pierwotnie opracowane w celu oceny przeżywalności Neisseria gonorrhoeae w pierwotnych ludzkich neutrofilach, ale powinny mieć zastosowanie do każdej interakcji bakteria-komórka gospodarza. Protokoły te łączą przepuszczalne przez błonę barwniki fluorescencyjne (SYTO9 i 4',6-diamidino-2-fenyloindol [DAPI]), które barwią wszystkie bakterie, z nieprzepuszczalnymi dla błony barwnikami fluorescencyjnymi (jodek propidyny i SYTOX Green), które są dostępne tylko dla bakterii niezdolnych do życia. Przed przenikaniem komórek eukariotycznych dodaje się przeciwciało lub odczynnik fluorescencyjny w celu identyfikacji bakterii zewnątrzkomórkowych. W ten sposób testy te rozróżniają żywotność bakterii przylegających do komórek eukariotycznych i wewnątrz nich. Przewidziano również protokół stosowania barwników żywotności w połączeniu z fluorescencyjnymi przeciwciałami przeciwko markerom komórek eukariotycznych w celu określenia lokalizacji subkomórkowej poszczególnych bakterii. Barwniki żywotności bakterii omówione w tym artykule są czułym uzupełnieniem i/lub alternatywą dla tradycyjnych technik mikrobiologicznych do oceny żywotności poszczególnych bakterii i dostarczają informacji o tym, gdzie bakterie przeżywają w komórkach gospodarza.

Introduction

Istnieje dynamiczna interakcja i koewolucja między bakteriami a gospodarzami, w których przebywają. Bakterie wykształciły organelle adhezyjne, systemy wydzielania i/lub zdolność do wytwarzania toksyn, które umożliwiają im produktywną infekcję komórek fagocytarnych i niefagocytarnych gospodarza. Bakterie muszą również zmagać się z rozpoznawaniem i aktywnością przeciwdrobnoustrojową układu odpornościowego gospodarza. Układ odpornościowy gospodarza składa się z elementów wrodzonych i adaptacyjnych, w tym barier fizycznych i chemicznych, komórek odpornościowych, układu dopełniacza i innych składników odporności humoralnej. Podczas gdy wiele bakterii jest podatnych na zabi....

Protocol

1. Ocena żywotności bakterii za pomocą jodku propidyny i SYTO9

1. Zainfekuj komórki, które przylegają do okrągłych szklanych szkiełek nakrywkowych o średnicy 12 mm na 24-dołkowych płytkach, interesującymi Cię bakteriami. NIE mocuj komórek aldehydami ani rozpuszczalnikami organicznymi.
2. Raz delikatnie przepłukać komórki w 0,1 M kwasie 3-(N-morfolino)propanosulfonowym (MOPS), pH 7,2, zawierającym 1 mM MgCl₂ (MOPS/MgCl₂).
3. Inkubuj komórki przez 10 minut w ciemności w temperaturze pokojowej z przeciwciałem sprzężonym z Alexa Fluor 647 lub lektyną, która wiąże się z interesującymi gatunkami bakterii, w MOPS ....

Results

Przedstawione protokoły zostały wykorzystane do zbadania przeżywalności N. gonorrhoeae po ekspozycji na pierwotne ludzkie neutrofile ^5,26. Neutrofile zostały zakażone N. gonorrhoeae i przetworzone za pomocą protokołu 1, przy użyciu barwnika żywotności o zielonej fluorescencji SYTO9 i jodku propydyny o czerwonej fluorescencji (Figura 4A). Barwniki dodawano w obecności saponiny, która sekwestruje cholesterol, aby preferencyjnie przenikać błony plazmatyczne komórek gospodarza, a.......

Discussion

Przedstawiono tutaj dwa protokoły, które wykorzystują barwniki wiązania DNA i żywotności w połączeniu z fluorescencyjną lektyną do identyfikacji żywych i martwych bakterii przyczepionych do i wewnątrz komórek ludzkich. Ponieważ oba protokoły skutecznie odróżniają żywe bakterie od martwych, wybór protokołu zależy od celu eksperymentu. Pierwszy protokół wykorzystuje jodek propidyny do wykrywania bakterii niezdolnych do życia i SYTO9 do wykrywania nienaruszonych bakterii. Na rycinie 4A przedstawiono repreze.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Igły motylkowe 21 G 3/4 do pobierania krwi	Becton Dickinson	367251
Probówki do pobierania krwi z heparyną sodową 10 ml	Becton Dickinson	366480
Sterylna woda do irygacji	Baxter	07-09-64-070
Dekstran 500	Sigma	31392
Chlorek sodu	Fisher Scientific	S641
Dekstroza	Ricca Chemical Company	RDCD0200
PBS firmy Dulbecco no Ca2+ lub Mg2+	Thermo Scientific	SH3002802
Rozwiązanie Ficoll	GE Healthcare	17-1440-03
Kwas octowy	Fisher Scientific	BP2401
Szkiełka nakrywkowe okrągłe szklane 12 mm	Fisher Scientific	12-545-80 12CIR-1
Płytki 24-dołkowe	Corning Incorporated	3524
Zbiorcze serum ludzkie	Sigma	S7023
RPMI	Mediatech	15-040-CV&	nbsp;
Surowica bydlęca płodu	Thermo Scientific	SH3007103
Ludzka interleukina-8	R& D Systems	208-IL/CF&	nbsp;
MOPS	Sigma	M3183
MgCl2	Fisher Scientific	BP214
Technologie życia	jodku propidyny	L7007 lub L7012
SYTO9	Life Technologies	L7007 lub L7012
Saponina	Fluka Analityczna	47036
Alexa Fluor 647-sprzężona lektyna sojowa	Life Technologies	L-32463
DAPI	Sigma	D8417
SYTOX Green	Life Technologies	S7020
myszy anty-CD63	Hybridoma Bank	H5C6
Zestaw do znakowania przeciwciał Alexa Fluor 555 Life Technologies		A20187
Hemacytometr Jasna Linia	Hausser Scientific	1492
Kleszcze	EMS	78320
Wirówka Sorvall Legend RT +	Thermo Scientific	75004377