Metody mikroskopii fluorescencyjnej do określania żywotności bakterii w połączeniu z komórkami ssaków

Summary

Kluczowe dla dziedziny patogenezy bakteryjnej jest możliwość określenia, czy i jak mikroby przeżywają po ekspozycji na komórki eukariotyczne. W tym artykule przedstawiono protokoły stosowania barwników fluorescencyjnych, które ujawniają żywotność poszczególnych bakterii znajdujących się wewnątrz komórek gospodarza i związanych z nimi.

Abstract

Kluczowe dla dziedziny patogenezy bakteryjnej jest możliwość określenia, czy i jak mikroby przeżywają po ekspozycji na komórki eukariotyczne. Obecne protokoły mające na celu rozwiązanie tych problemów obejmują testy liczby kolonii, testy ochrony gentamycyny i mikroskopię elektronową. Testy liczby kolonii i ochrony gentamycyny oceniają jedynie żywotność całej populacji bakterii i nie są w stanie określić żywotności poszczególnych bakterii. Mikroskopia elektronowa może być wykorzystana do określenia żywotności poszczególnych bakterii i dostarczenia informacji dotyczących ich lokalizacji w komórkach gospodarza. Jednak bakterie często wykazują różne gęstości elektronów, co utrudnia ocenę żywotności. W tym artykule przedstawiono protokoły stosowania barwników fluorescencyjnych, które ujawniają żywotność poszczególnych bakterii znajdujących się wewnątrz komórek gospodarza i związanych z nimi. Testy te zostały pierwotnie opracowane w celu oceny przeżywalności Neisseria gonorrhoeae w pierwotnych ludzkich neutrofilach, ale powinny mieć zastosowanie do każdej interakcji bakteria-komórka gospodarza. Protokoły te łączą przepuszczalne przez błonę barwniki fluorescencyjne (SYTO9 i 4',6-diamidino-2-fenyloindol [DAPI]), które barwią wszystkie bakterie, z nieprzepuszczalnymi dla błony barwnikami fluorescencyjnymi (jodek propidyny i SYTOX Green), które są dostępne tylko dla bakterii niezdolnych do życia. Przed przenikaniem komórek eukariotycznych dodaje się przeciwciało lub odczynnik fluorescencyjny w celu identyfikacji bakterii zewnątrzkomórkowych. W ten sposób testy te rozróżniają żywotność bakterii przylegających do komórek eukariotycznych i wewnątrz nich. Przewidziano również protokół stosowania barwników żywotności w połączeniu z fluorescencyjnymi przeciwciałami przeciwko markerom komórek eukariotycznych w celu określenia lokalizacji subkomórkowej poszczególnych bakterii. Barwniki żywotności bakterii omówione w tym artykule są czułym uzupełnieniem i/lub alternatywą dla tradycyjnych technik mikrobiologicznych do oceny żywotności poszczególnych bakterii i dostarczają informacji o tym, gdzie bakterie przeżywają w komórkach gospodarza.

Introduction

Istnieje dynamiczna interakcja i koewolucja między bakteriami a gospodarzami, w których przebywają. Bakterie wykształciły organelle adhezyjne, systemy wydzielania i/lub zdolność do wytwarzania toksyn, które umożliwiają im produktywną infekcję komórek fagocytarnych i niefagocytarnych gospodarza. Bakterie muszą również zmagać się z rozpoznawaniem i aktywnością przeciwdrobnoustrojową układu odpornościowego gospodarza. Układ odpornościowy gospodarza składa się z elementów wrodzonych i adaptacyjnych, w tym barier fizycznych i chemicznych, komórek odpornościowych, układu dopełniacza i innych składników odporności humoralnej. Podczas gdy wiele bakterii jest podatnych na zabijanie i usuwanie przez wielowarstwową odpowiedź immunologiczną gospodarza, niektóre bakterie chorobotwórcze i oportunistyczne wyewoluowały mechanizmy infekowania różnych komórek gospodarza i podważania klirensu przez odpowiedź immunologiczną gospodarza ¹. Neisseria gonorrhoeae jest jednym z przykładów patogenu bakteryjnego, który jest wysoce przystosowany do przetrwania w organizmie ludzkiego gospodarza. N. gonorrhoeae łatwo kolonizuje powierzchnie świetlne komórek nabłonka błony śluzowej dróg moczowo-płciowych, gardła, spojówki i odbytnicy. Kolonizacja wyzwala obfitą rekrutację neutrofili w miejscach błony śluzowej. Neutrofile to profesjonalne fagocyty, które posiadają różnorodne procesy przeciwdrobnoustrojowe w celu zabijania mikroorganizmów; jednak N. gonorrhoeae jest zdolny do przetrwania w obecności neutrofili ^2-5. Zrozumienie, w jaki sposób patogeny bakteryjne, takie jak N. gonorrhoeae, osłabiają, tłumią i przejmują kontrolę nad odpowiedzią immunologiczną, aby ostatecznie przetrwać w normalnie wrogim środowisku gospodarza, ma kluczowe znaczenie dla opracowania nowych terapii zwalczania chorób zakaźnych.

Eksperymentalne protokoły często używane do badania przeżywalności bakterii w komórkach gospodarza obejmują testy liczenia kolonii, testy ochrony gentamycyny i mikroskopię elektronową. W testach liczenia kolonii populacja zakażonych komórek jest poddawana lizie (na przykład za pomocą detergentu, na który bakterie są odporne) w celu uwolnienia bakterii. Lizaty rozcieńcza się i posiewa na pożywkach na bazie agaru, a jednostki tworzące kolonie w lizatach są wyliczane dla każdego punktu czasowego i/lub warunków doświadczalnych. Takie podejście informuje o żywotności całej populacji bakterii, ale nie jest w stanie różnicować przeżycia wewnątrzkomórkowego i zewnątrzkomórkowego. Odmiana testu liczby kolonii, test ochrony gentamycyny, w szczególności mierzy przeżycie bakterii wewnątrzkomórkowych, w oparciu o niezdolność antybiotyku gentamycyny do przekroczenia eukariotycznej błony plazmatycznej ⁶. Jednak test ten jest zależny od tego, czy bakterie są podatne na zabijanie przez gentamycynę (lub inny antybiotyk, który jest podobnie nieprzepuszczalny dla błony eukariotycznej) i niezdolność antybiotyku do dostępu do bakterii wewnętrznych. W związku z tym test ochrony gentamycyny może nie być skuteczny w badaniu wszystkich gatunków bakterii lub podczas badania przeżywalności bakterii w komórkach o wysokim poziomie pinocytów, takich jak neutrofile. Żadne z tych podejść nie ujawnia lokalizacji subkomórkowej ani innego zachowania poszczególnych bakterii (np. jeśli bakterie tworzą agregaty lub mikrokolonie, które zachowują się inaczej niż pojedyncze komórki bakteryjne). Innym często stosowanym podejściem do badania żywotności poszczególnych bakterii zewnętrznych i wewnętrznych jest cienkowarstwowa transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM). Takie podejście jest korzystne, ponieważ może dostarczyć informacji dotyczących lokalizacji bakterii w komórkach gospodarza (np. fagosomie, cytoplazmie, autofagosomie), które można dalej badać za pomocą mikroskopii immunoelektronowej z przeciwciałami sprzężonymi ze złotem przeciwko markerom subkomórkowym. Jednak mikroskopia elektronowa nie jest szczególnie czuła w ocenie żywotności bakterii. Gdy osadzone skrawki są barwione octanem uranylu, cytrynianem ołowiu lub innymi odczynnikami o dużej gęstości elektronów i obrazowane za pomocą mikroskopii elektronowej, bakterie o dużej gęstości elektronów są uważane za żywotne, a przezroczyste elektronowo za nieżywotne ^7,8. Jednak to założenie przecenia żywotność bakterii, ponieważ tylko te martwe bakterie z poważnie przerwanymi błonami i pozbawione cytoplazmy wydają się przezroczyste dla elektronów. Ponadto niektóre gatunki bakterii mogą wykazywać szereg gęstości elektronów w zależności od etapu wzrostu, co utrudnia określenie żywotności.

Jako alternatywę lub dodatek do tych powszechnie stosowanych metod, tutaj podajemy protokoły i uzasadnienie dla stosowania barwników fluorescencyjnych, które wskazują na żywotność bakterii, aby ocenić przeżywalność bakterii przyczepionych i internalizowanych przez komórki gospodarza. Aby zidentyfikować bakterie zewnątrzkomórkowe, zakażone komórki są najpierw wystawione na działanie odczynnika fluorescencyjnego, takiego jak lektyna lub przeciwciało specyficzne dla bakterii. Zainfekowane komórki są następnie przepuszczane i wystawiane na działanie barwników specyficznych dla DNA, które są różnie dostępne dla bakterii z nienaruszonymi i zdegradowanymi błonami, jako substytut żywotności bakterii. W pierwszym protokole przepuszczalny dla błony barwnik SYTO9 identyfikuje całą populację bakterii, podczas gdy jodek propidyny jest dostępny tylko dla tych bakterii, które mają uszkodzone błony i dlatego są uważane za niezdolne do życia. Jodek propidyny i SYTO9 wykorzystano do oceny żywotności bakterii w biofilmach, odróżnienia bakterii chorobotwórczych od niepatogennych i wyliczenia żywotnych bakterii przenoszonych przez wodę ^9-12. W drugim protokole 4',6'-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI) identyfikuje bakterie ogółem, podczas gdy SYTOX Green jest dostępny tylko dla populacji niezdolnej do życia. Te pary barwników żywotności można połączyć z immunofluorescencją w celu określenia lokalizacji każdej bakterii w stosunku do białka będącego przedmiotem zainteresowania, na przykład w celu określenia lokalizacji subkomórkowej bakterii. Zastosowanie tych testów dostarcza kluczowych informacji na temat interakcji, które skutkują zabijaniem lub przeżywalnością bakterii podczas infekcji komórek gospodarza. Protokoły przedstawione w tym artykule zostały wykorzystane do oceny żywotności N. gonorrhoeae, która jest przyczepiona do pierwotnych ludzkich neutrofili i wewnątrz nich, w tym w różnych populacjach fagosomów neutrofili ^5,13,14. Jednak protokoły te można zastosować do oceny żywotności bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych w fagocytach profesjonalnych, fagocytach nieprofesjonalnych i pierwotniakach ^15-24.

Protocol

1. Ocena żywotności bakterii za pomocą jodku propidyny i SYTO9

1. Zainfekuj komórki, które przylegają do okrągłych szklanych szkiełek nakrywkowych o średnicy 12 mm na 24-dołkowych płytkach, interesującymi Cię bakteriami. NIE mocuj komórek aldehydami ani rozpuszczalnikami organicznymi.
2. Raz delikatnie przepłukać komórki w 0,1 M kwasie 3-(N-morfolino)propanosulfonowym (MOPS), pH 7,2, zawierającym 1 mM MgCl₂ (MOPS/MgCl₂).
3. Inkubuj komórki przez 10 minut w ciemności w temperaturze pokojowej z przeciwciałem sprzężonym z Alexa Fluor 647 lub lektyną, która wiąże się z interesującymi gatunkami bakterii, w MOPS / MgCl₂, w celu wykrycia bakterii zewnętrznych.

UWAGA: Przeprowadzaj kontrole z żywymi i martwymi bakteriami, przy braku komórek gospodarza, aby pokazać, że lektyna lub przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania wiąże wszystkie bakterie niezależnie od ich żywotności (Rysunek 1).

4. Przepłucz komórki dwa razy za pomocą MOPS/MgCl₂.
5. Odessać pożywkę z komórek i dodać 0,5 ml żywego/martwego roztworu barwiącego. Żywy/martwy roztwór barwiący to 5 μM SYTO9, 30 μM jodku propidyny i 0,1% saponiny (stężenia końcowe) w MOPS/MgCl_2.
6. Inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
7. Przepłucz komórki dwa razy w MOPS/MgCl_2.
8. Odwróć szkiełka nakrywkowe stroną zadrukowaną do dołu na szkiełka podstawowe i uszczelnij przezroczystym lakierem do paznokci. Nie używaj nośników montażowych.
9. Uzyskuj obrazy w ciągu 30 minut, używając mikroskopu fluorescencyjnego z zestawami filtrów kompatybilnymi z akwizycją obrazów zielonych, czerwonych i dalekiej czerwieni.

UWAGA: Można używać zarówno konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej, jak i konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej. Po 30 minutach barwniki fluorescencyjne zaczynają wyciekać z bakterii, a uzyskane dane nie są już dokładne. Obrazy przedstawione w tym artykule zostały uzyskane pionowym mikroskopem fluorescencyjnym Nikon Eclipse E800 z aparatem cyfrowym Hamamatsu Orca-ER przy użyciu oprogramowania Openlab. Fluorescencja Alexa Fluor 647 została wykryta przy użyciu filtra o długości fali wzbudzenia 590 - 650 nm i filtra emisyjnego 663 - 735 nm, i jest fałszywie zabarwiona na niebiesko. Fluorescencję jodku propydu wykryto za pomocą filtra o długości fali wzbudzenia 540 - 580 nm i filtra emisyjnego o długości 600 - 660 nm. Fluorescencję z SYTO9 wykryto za pomocą filtra o długości fali wzbudzenia 465 - 495 nm i filtra emisyjnego o długości 515 - 555 nm.

10. Ten protokół spowoduje powstanie obrazów, na których zewnętrzne bakterie nieżywotne wydają się niebieskie + czerwone, wewnętrzne bakterie nieżywotne pojawiają się tylko na czerwono, zewnętrzne żywe bakterie są wyświetlane na niebiesko + zielono, a wewnętrzne żywe bakterie wydają się tylko na zielono. Policz na oko liczbę bakterii, które są zewnętrzne nieżywotne, wewnętrzne nieżywotne, zewnętrzne żywotne i wewnętrznie żywotne.
11. Oblicz procent bakterii żywotnych zewnętrznie, dzieląc liczbę bakterii żywotnych zewnętrznie przez całkowitą liczbę bakterii zewnętrznych (żywotnych i nieżywotnych). Oblicz procent bakterii żywotnych wewnętrznie, dzieląc liczbę bakterii żywotnych wewnętrznie przez całkowitą liczbę bakterii wewnętrznych (żywotnych i nieżywotnych) (ryc. 4).
12. Istnieją dwie podstawowe kontrole, które należy wykonać za pomocą tego protokołu. Najpierw sprawdź, czy wszystkie niezdolne do życia bakterie są dodatnie pod względem jodku propidyny, a wszystkie żywe bakterie są SYTO9-dodatnie. Średnio logarytmiczna hodowla bakterii (przy braku jakichkolwiek komórek gospodarza) powinna być >95% dodatnia pod względem SYTO9. Na rysunku 2 pokazano średniologarytmiczną hodowlę N. gonorrhoeae (w ilości 10⁸ jednostek tworzących kolonie na ml) inkubowaną z żywym/martwym roztworem barwiącym. Po drugie, sprawdź, czy zarówno jodek propidyny, jak i SYTO9 mogą dostać się do przepuszczalnych, zainfekowanych komórek gospodarza.
    1. Aby wygenerować populację martwych bakterii, zbierz 2 x 10⁸ jednostek tworzących kolonie bakteryjne w probówce o pojemności 1,5 ml, dodaj 70% izopropanolu i pozostaw na 10 minut. Umieść bakterie w mikrofugach i umyj bakterie dwukrotnie w PBS, aby usunąć resztki izopropanolu. Następnie postępuj zgodnie z krokami protokołu 1.5 - 1.7. Dodać 5 μl zawiesiny bakteryjnej do szkiełka podstawowego i nałożyć szkiełko nakrywkowe. Próbki obrazów jak w kroku 1.9 protokołu. W tych warunkach 100% populacji powinno być dodatnie pod względem jodku propidynowego (ryc. 2). U niektórych gatunków bakterii jodek propidyny może nie przytłoczyć całkowicie barwienia SYTO9, a nieżywotne bakterie mogą wydawać się żółte lub pomarańczowe.
    2. W przypadku komórek fagocytarnych, takich jak neutrofile, wystaw komórki na działanie bakterii zabitych izopropanolem i upewnij się, że 100% bakterii wewnątrzkomórkowych jest dodatnich pod względem jodku propidyny (ryc. 3). W przypadku komórek niefagocytarnych, które mogą nie internalizować martwych bakterii, wystarczające może być potraktowanie zakażonych komórek azydkiem sodu lub innymi środkami przeciwdrobnoustrojowymi przenikającymi komórkę przed dodaniem żywego/martwego roztworu barwiącego.

2. Ocena żywotności bakterii za pomocą SYTOX Green i DAPI

1. Oznacz interesujące bakterie za pomocą 10 μg/ml DAPI w pożywce Morse'a ^{Defined Medium 25} przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
2. Zainfekuj komórki, które przylegają do okrągłych szklanych szkiełek nakrywkowych o średnicy 12 mm na 24-dołkowych płytkach, bakteriami znakowanymi DAPI. NIE mocuj komórek aldehydami ani rozpuszczalnikami organicznymi.
3. Przepłucz komórki raz za pomocą MOPS/MgCl_2.
4. Inkubuj komórki przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności z przeciwciałem sprzężonym z Alexa Fluor 647 lub lektyną, która wiąże się z interesującymi gatunkami bakterii, w MOPS / MgCl₂, w celu wykrycia bakterii zewnętrznych. Patrz uwaga w kroku 1.3 protokołu, aby zapoznać się z sugerowanymi elementami sterującymi.
5. Odessać pożywkę z komórek i dodać 0,5 ml 0,4 μM SYTOX Green w MOPS/MgCl₂.
6. Inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
7. Przepłucz komórki dwa razy w MOPS/MgCl₂.
8. Umyj komórki jeden raz w MOPS/MgCl₂ przez 5 minut.
9. Uzyskuj obrazy w ciągu 30 minut za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Zobacz krok 1.9 protokołu, aby zapoznać się z opisem mikroskopu, aparatu cyfrowego i oprogramowania do akwizycji.

UWAGA: Fluorescencja z Alexa Fluor 647 została wykryta przy użyciu filtra o długości fali wzbudzenia 590 - 650 nm i filtra emisyjnego 663 - 735 nm, i jest fałszywie zabarwiona na czerwono. Fluorescencję z SYTOX Green wykryto przy użyciu filtra o długości fali wzbudzenia 465 - 495 nm i filtra emisyjnego o długości fali 515 - 555 nm. Fluorescencję z DAPI wykryto za pomocą filtra o długości fali wzbudzenia 355 - 375 nm i filtra barierowego 400 nm.

10. Protokół ten spowoduje powstanie obrazów, na których zewnętrzne bakterie niezdolne do życia będą wyświetlane na czerwono + na zielono, wewnętrzne bakterie niezdolne do życia będą wyświetlane na zielono + niebiesko, zewnętrzne żywe bakterie będą wyświetlane na czerwono + niebiesko, a wewnętrzne żywe bakterie będą wyświetlane tylko na niebiesko (ryc. 4). Określ ilościowo procent bakterii zewnętrznych i wewnętrznych zgodnie z opisem w kroku 1.11 protokołu.
11. Kontrole opisane w kroku 1.12 protokołu należy wykonywać przy użyciu kombinacji zielonego barwnika DAPI/SYTOX (rysunki 2 i 3).

3. Ocena żywotności bakterii wraz z lokalizacją subkomórkową

1. Oznacz interesujące bakterie za pomocą 10 μg/ml DAPI w pożywce zdefiniowanej przez Morse'a przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
2. Zainfekuj komórki, które przylegają do okrągłych szklanych szkiełek nakrywkowych o średnicy 12 mm na 24-dołkowych płytkach, bakteriami znakowanymi DAPI. NIE mocuj komórek aldehydami ani rozpuszczalnikami organicznymi.
3. Przepłucz komórki raz za pomocą MOPS/MgCl_2.
4. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności z przeciwciałem sprzężonym z Alexa Fluor 647 lub lektyną, która wiąże się z interesującymi gatunkami bakterii, w MOPS/MgCl₂, w celu wykrycia bakterii zewnętrznych. Patrz uwaga w kroku 1.3 protokołu, aby zapoznać się z sugerowanymi elementami sterującymi.
5. Odessać pożywkę z komórek i dwukrotnie przepłukać komórki w MOPS/MgCl_2.
6. Inkubować komórki z przeciwciałem sprzężonym z Alexa Fluor 555 przeciwko badanemu markerowi subkomórkowemu przez 20 minut, w MOPS/MgCl₂ zawierającym 0,2% saponiny.
7. Przepłucz komórki dwa razy w MOPS/MgCl₂.
8. Umyj komórki jeden raz w MOPS/MgCl₂ przez 5 minut.
9. Odessać pożywkę z komórek i dodać 0,4 μM SYTOX Green do MOPS/MgCl₂.
10. Inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
11. Przepłucz komórki dwa razy w MOPS/MgCl₂.
12. Umyj komórki jeden raz w MOPS/ MgCl₂ przez 5 minut.
13. Pozyskaj obrazy szkiełek w ciągu 30 minut pod mikroskopem fluorescencyjnym. Zobacz krok 1.9 protokołu, aby zapoznać się z opisem mikroskopu, aparatu cyfrowego i oprogramowania do akwizycji.

UWAGA: Fluorescencja z Alexa Fluor 647 została wykryta za pomocą filtra o długości fali wzbudzenia 590 - 650 nm i filtra emisyjnego 663 - 735 nm, i ma fałszywy kolor fioletowy. Fluorescencja z Alexa Fluor 555 została wykryta za pomocą filtra o długości fali wzbudzenia 540 - 580 nm i filtra emisyjnego 600 - 660 nm. Fluorescencję z SYTOX Green wykryto przy użyciu filtra o długości fali wzbudzenia 465 - 495 nm i filtra emisyjnego o długości fali 515 - 555 nm. Fluorescencję z DAPI wykryto za pomocą filtra o długości fali wzbudzenia 355 - 375 nm i filtra barierowego 400 nm.

14. Protokół ten spowoduje powstanie obrazów, w których zewnętrzne bakterie nieżywotne wydają się fioletowe + zielone, wewnętrzne bakterie nieżywotne pojawiają się na zielono + niebieskie, zewnętrzne żywe bakterie pojawiają się na fioletowo + niebiesko, wewnętrzne żywe bakterie pojawiają się tylko na niebiesko, a białko subkomórkowe wydaje się czerwone (ryc. 4). Określ ilościowo zawartość zewnętrznych i wewnętrznych żywotnych bakterii, jak opisano w krokach protokołu 1.11.
15. Kontrole opisane w kroku 1.12 protokołu należy wykonywać przy użyciu kombinacji zielonego barwnika DAPI/SYTOX (rysunki 2 i 3).
16. Oprócz liczenia bakterii żywotnych i nieżywotnych, sklasyfikuj każdą bakterię jako dodatnią lub ujemną pod kątem kolokalizacji z interesującym markerem subkomórkowym.
17. Oblicz procent żywotnych bakterii kolokalizowanych z markerem subkomórkowym, dzieląc liczbę kolokalizowanych żywych bakterii przez całkowitą liczbę żywotnych bakterii. Oblicz procent niezdolnych do życia bakterii kolokalizowanych z markerem subkomórkowym, dzieląc liczbę nieżywotnych bakterii kolokalizowanych przez całkowitą liczbę nieżywotnych bakterii.

Results

Przedstawione protokoły zostały wykorzystane do zbadania przeżywalności N. gonorrhoeae po ekspozycji na pierwotne ludzkie neutrofile ^5,26. Neutrofile zostały zakażone N. gonorrhoeae i przetworzone za pomocą protokołu 1, przy użyciu barwnika żywotności o zielonej fluorescencji SYTO9 i jodku propydyny o czerwonej fluorescencji (Figura 4A). Barwniki dodawano w obecności saponiny, która sekwestruje cholesterol, aby preferencyjnie przenikać błony plazmatyczne komórek gospodarza, a...

Discussion

Przedstawiono tutaj dwa protokoły, które wykorzystują barwniki wiązania DNA i żywotności w połączeniu z fluorescencyjną lektyną do identyfikacji żywych i martwych bakterii przyczepionych do i wewnątrz komórek ludzkich. Ponieważ oba protokoły skutecznie odróżniają żywe bakterie od martwych, wybór protokołu zależy od celu eksperymentu. Pierwszy protokół wykorzystuje jodek propidyny do wykrywania bakterii niezdolnych do życia i SYTO9 do wykrywania nienaruszonych bakterii. Na rycinie 4A przedstawiono repreze...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Igły motylkowe 21 G 3/4 do pobierania krwi	Becton Dickinson	367251
Probówki do pobierania krwi z heparyną sodową 10 ml	Becton Dickinson	366480
Sterylna woda do irygacji	Baxter	07-09-64-070
Dekstran 500	Sigma	31392
Chlorek sodu	Fisher Scientific	S641
Dekstroza	Ricca Chemical Company	RDCD0200
PBS firmy Dulbecco no Ca2+ lub Mg2+	Thermo Scientific	SH3002802
Rozwiązanie Ficoll	GE Healthcare	17-1440-03
Kwas octowy	Fisher Scientific	BP2401
Szkiełka nakrywkowe okrągłe szklane 12 mm	Fisher Scientific	12-545-80 12CIR-1
Płytki 24-dołkowe	Corning Incorporated	3524
Zbiorcze serum ludzkie	Sigma	S7023
RPMI	Mediatech	15-040-CV&	nbsp;
Surowica bydlęca płodu	Thermo Scientific	SH3007103
Ludzka interleukina-8	R& D Systems	208-IL/CF&	nbsp;
MOPS	Sigma	M3183
MgCl2	Fisher Scientific	BP214
Technologie życia	jodku propidyny	L7007 lub L7012
SYTO9	Life Technologies	L7007 lub L7012
Saponina	Fluka Analityczna	47036
Alexa Fluor 647-sprzężona lektyna sojowa	Life Technologies	L-32463
DAPI	Sigma	D8417
SYTOX Green	Life Technologies	S7020
myszy anty-CD63	Hybridoma Bank	H5C6
Zestaw do znakowania przeciwciał Alexa Fluor 555 Life Technologies		A20187
Hemacytometr Jasna Linia	Hausser Scientific	1492
Kleszcze	EMS	78320
Wirówka Sorvall Legend RT +	Thermo Scientific	75004377