Artykuł metodologiczny

Test ściółki nasiennej do genetycznego zbadania in vitro, w jaki sposób bielmo kontroluje kiełkowanie nasion u Arabidopsis thaliana

13.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50732

⸱

9 listopada 2013

 , 
1Département de Botanique et de Biologie Végétale, Université de Genève

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy procedurę składania testu na ściółkę nasienną (SCBA) z nasion Arabidopsis thaliana. Wykazano, że aparat oddechowy jest potężnym narzędziem do genetycznego i in vitro, w jaki sposób bielmo kontroluje kiełkowanie nasion w uśpionych nasionach i w odpowiedzi na sygnały świetlne. Aparat oddechowy ma zasadniczo zastosowanie w każdej sytuacji, w której podejrzewa się, że bielmo wpływa na wzrost zarodka.

Streszczenie

Bielmo Arabidopsis składa się z pojedynczej warstwy komórkowej otaczającej dojrzały zarodek i odgrywającej istotną rolę w zapobieganiu kiełkowaniu uśpionych nasion lub nasion nieuśpionych napromieniowanych przez impuls światła o barwie czerwonej (FR). Aby uzyskać więcej informacji na temat molekularnych mechanizmów genetycznych leżących u podstaw represyjnej aktywności kiełkowania wywieranej przez bielmo, opracowano test "okrywy nasiennej" (SCBA). Aparat oddechowy to procedura preparacji polegająca na fizycznym oddzieleniu okrywy nasiennej i zarodków od nasion, co umożliwia monitorowanie wzrostu zarodków na spodniej warstwie okrywy nasiennej. Co ciekawe, SCBA odtwarza represyjne działania okrywy nasiennej podczas kiełkowania w kontekście spoczynku nasion i zależnej od FR kontroli kiełkowania nasion. Ponieważ aparat oddechowy pozwala na kombinatoryczne wykorzystanie uśpionych, nieuśpionych i genetycznie zmodyfikowanych okrywy nasiennej i materiałów embrionalnych, można przeanalizować szlaki genetyczne kontrolujące kiełkowanie i specyficznie działające w bielmie i zarodku. Tutaj szczegółowo opisujemy procedurę montażu aparatu oddechowego.

Wprowadzenie

W dojrzałych nasionach rzodkiewnika okrywa nasienna składa się z testa, zewnętrznej warstwy martwej tkanki pochodzenia matczynego, oraz bielma, pojedynczej warstwy żywej tkanki bezpośrednio otaczającej zarodek1. Bielmo i zarodek pochodzą z oddzielnych zdarzeń zapłodnienia: bielmo jest tkanką triploidalną z dwoma genomami matczynymi i jednym ojcowskim, podczas gdy zarodek jest tkanką diploidalną z jednym genomem matczynym i jednym ojcowskim2.

Główną funkcją tradycyjnie przypisywaną bielmo jest funkcja tkanki odżywczej. Jednak staje się coraz bardziej oczywiste, że bielmo odgrywa również kluczową rolę w kontrolowaniu kiełkowania nasion. Pojęcie to po raz pierwszy pojawiło się w przypadku spoczynku, cechy wykazywanej przez nowo wyprodukowane nasiona. Uśpione nasiona nie kiełkują pomimo obecności sprzyjających warunków kiełkowania. Nasiona tracą spoczynek po okresie dojrzewania i stają się nieuśpione, tj. wykiełkują pod wpływem sprzyjających warunków kiełkowania. U wielu gatunków roślin, w tym u rośliny modelowej Arabidopsis, okrywa nasienna jest absolutnie niezbędna, aby zapobiec kiełkowaniu uśpionych nasion, ponieważ usunięcie okrywy nasiennej powoduje wzrost zarodkowy i zazielenienie3,4. U Arabidopsis Bethke i in. zaobserwowali, że kiełkowanie pozostawało stłumione po usunięciu testa, przy jednoczesnym zachowaniu bielma otaczającego bielmo5. Obserwacje te silnie wskazały, że bielmo jest tkanką w okrywie nasiennej wywierającą działanie represyjne na zarodek. Jednak eksperymenty z usuwaniem okrywy nasiennej niekoniecznie pomagają w wyjaśnieniu natury represyjnej aktywności kiełkowania zapewnianej przez okrywę nasienną ani w identyfikacji genów, które ją implementują.

Niedawno wprowadziliśmy test na ściółkę nasienną (SCBA), gdzie okrywy nasienne i zarodki są fizycznie oddzielone, ale trzymane w bliskiej odległości, aby utrzymać aktywność represyjną kiełkowania zapewnianą przez bielmo6. Aparat oddechowy pozwala na kombinatoryczne wykorzystanie uśpionych, nieuśpionych i genetycznie zmodyfikowanych materiałów nasiennych i embrionalnych. W rezultacie można przeanalizować szlaki genetyczne kontrolujące kiełkowanie, a w szczególności działające w bielmie i zarodku. Aparat oddechowy został użyty w kontekście spoczynku, aby pokazać, że bielmo uwalnia fitohormon kwas abscysynowy (ABA) w kierunku zarodka, aby zahamować jego wzrost6. Co więcej, możemy użyć SCBA do identyfikacji szlaków sygnałowych działających w bielmie i tkankach embrionalnych w celu promowania uśpienia.

Rola bielma w kontrolowaniu kiełkowania została dodatkowo wzmocniona przez rozważenie przypadku nieuśpionych nasion wystawionych na działanie impulsu światła dalekiej czerwieni (FR). Wiadomo, że wcześnie po wchłonięciu nasion impuls światła FR hamuje kiełkowanie7,8. Kiedy okrywy nasienne zostały usunięte z nasion, impuls światła FR nie był w stanie zahamować kiełkowania, co silnie sugeruje, że bielmo może również hamować kiełkowanie nieuśpionych nasion 9. Co ciekawe, SCBA może być również używany do rekapitulacji zależnego od FR hamowania kiełkowania. Pozwoliło to wykazać, że to zależne od FR hamowanie kiełkowania nasion jest również procesem polegającym na uwalnianiu ABA z bielma9. Co więcej, aparat oddechowy pozwolił na zidentyfikowanie różnych szlaków sygnalizacji świetlnej działających w bielmie i zarodku w celu kontrolowania kiełkowania nasion w stanie nieuśpienia w odpowiedzi na sygnały świetlne9,10.

wydaje się być zatem niezawodną techniką do badania funkcji bielma w kontekście kontroli kiełkowania nasion. Jest to również potężne narzędzie do oceny in vitro, czy geny podejrzewane o kontrolowanie kiełkowania działają w bielmie, zarodku lub w obu tkankach. W tym miejscu szczegółowo opisujemy różne kroki wymagane do montażu aparatu oddechowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Po złożeniu aparatu oddechowego, wzrost zarodków jest monitorowany przez kilka dni. Dlatego przed zabiegiem rozbioru nasion i montażem aparatu oddechowego należy wysterylizować nasiona, aby uniknąć przyszłych zanieczyszczeń, które mogłyby uniemożliwić prawidłową ocenę wpływu materiału okrywy nasiennej na wzrost zarodka.

1. Sterylizacja nasion

  1. Wlej 50-60 μl dojrzałych i suchych nasion rzodkiewnika do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej i przygotuj 70% roztwór etanolu.
  2. Dodać 1 ml 70% roztworu etanolu do probówki mikrowirówki zawierającej nasiona i wstrząsać w temperaturze pokojowej przez 10 minut z prędkością 1 200 obr./min w wirówce.
  3. Wirować probówkę do mikrowirówki przez 3 sekundy przy 4 000 x g, aby zagęścić nasiona na dnie probówki.
  4. Zassać 70% roztwór etanolu za pomocą próżniowej końcówki ssącej, ostrożnie pozostawiając nasiona na dnie probówki mikrowirówki.
  5. Dodać 1 ml sterylnej wody destylowanej do probówki mikrowirówki, w której nadal znajdują się nasiona.
  6. Wstrząsać w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy 1 200 obr./min.
  7. Wirować probówkę do mikrowirówki przez 3 sekundy przy 4 000 x g, aby zagęścić nasiona na dnie probówki. Zassać supernatant wodny za pomocą próżniowej końcówki ssącej, ostrożnie pozostawiając nasiona na dnie probówki.
  8. Dodać 1 ml sterylnej wody destylowanej do probówki mikrowirówki, która nadal zawiera nasiona. Upewnij się, że przepływ wody jednorodnie zawiesza nasiona wewnątrz rurki. Celem jest uniknięcie dalszego wstrząsania, aby zachować integralność nasion.
  9. Pozwól nasionom osiąść grawitacyjnie na dnie probówki, pozostawiając probówkę nieruchomą na 30 sekund. Odessać supernatant wodny za pomocą próżniowej końcówki ssącej, ostrożnie pozostawiając nasiona na dnie probówki.
  10. Powtórz kroki cztery razy 1,8 - 1,9. Cała procedura sterylizacji trwa około 30 minut.

2. Powlekanie nasion

Wszystkie kolejne kroki są wykonywane w komorze z przepływem laminarnym, aby zachować sterylne warunki.

  1. Przygotować płytkę Petriego (średnica 100 mm, wysokość 20 mm) zawierającą 30 ml pożywki do kiełkowania przygotowanej przez autoklawowanie roztworu zawierającego 4,3 g/l pożywki Murashige i Skooga w 2,5 mM kwasie 2-(N-morfolino)etanosulfonowym (MES-KOH; pH 5,7) i 0,8 g/l agaru. Pozostawić roztwór do ostygnięcia w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C przed wylaniem go na szalkę Petriego.
  2. Dodać 200 μl sterylnej wody destylowanej do probówki zawierającej nasiona. Ponownie zawiesić nasiona i przenieść je na powierzchnię pożywki do kiełkowania za pomocą standardowej pipety z końcówką o pojemności 1 ml.
  3. Usuń wodę otaczającą nasiona z powierzchni pożywki do kiełkowania za pomocą próżniowej końcówki ssącej.
  4. Pozostaw szalkę Petriego zawierającą nasiona bez pokrywki w komorze laminarnej na 2 godziny w celu dalszego suszenia. Zamknąć szalkę Petriego pokrywką i pozostawić ją pod komorą przepływu laminarnego na około 90 minut, tak aby upłynęły około 4 godziny od rozpoczęcia procedury sterylizacji nasion (krok 1.2).

3. Sekcja nasion

Następujące kroki wymagają pracy z mikroskopem stereoskopowym umieszczonym w szafie okapu z przepływem laminarnym. Kleszczyki Dumont #5 ze ściętymi (tj.) końcówkami znacznie ułatwiają manipulowanie nasionami (Rysunek 1A).

  1. Przygotować nową płytkę na płytkę Petriego zawierającą 30 ml pożywki do kiełkowania. Umieść na powierzchni podłoża dwie zestawione ze sobą prostokątne sterylne papiery Whatman 3MM (1,5 cm x 1,0 cm; Rysunek 1B, krok 1). Papier Whatman 3MM jest sterylizowany w autoklawie.
  2. Przenieś nasiona na papierach Whatman 3MM za pomocą sterylnych kleszczy (Rysunek 1B, krok 2).
  3. Przytrzymaj pojedyncze ziarno przy papierze Whatman 3MM, delikatnie dociskając ziarno za pomocą ustawionych obok końcówek ściętych kleszczy (Rysunek 1B, krok 3).
  4. Odciąć okrywę nasienną (jądro i bielmo) nasion za pomocą igły strzykawki (np. strzykawka insulinowa U100 + strzykawka 1 ml, 0,33 mm (29 G) x 12,7 mm) (Rysunek 1B, krok 4). Kształt nasion Arabidopsis jest elipsoidalny i zaleca się przecięcie okrywy nasiennej wzdłuż najdłuższej półosi głównej jak najbliżej miejsca, w którym liścienie są połączone z korzonkiem (tj. z dala od radykalnego końca). Pomaga to w bezpiecznym uwolnieniu zarodka w kolejnym etapie procedury preparacji.
  5. Dociśnij ziarno do papieru Whatman 3MM za pomocą ustawionych obok siebie końcówek ściętych kleszczy (Rysunek 1B, krok 5). Ten krok uwalnia zarodek z okrywy nasiennej przez otwór utworzony w kroku 3.4 (Rysunek 1B, krok 6). Zaleca się dociśnięcie nasion w miejscu, w którym końcówka liścieni znajduje się najbliżej wierzchołka korzonka (tj. z dala od otworu).

4. Montaż testu ściółki nasiennej (SCBA)

Zobacz dyskusję, aby dowiedzieć się, jak prawidłowo wybrać liczbę okrywów nasiennych i zarodków.

  1. Przygotować nową płytkę na płytkę Petriego zawierającą 30 ml pożywki do kiełkowania. Umieść na powierzchni podłoża sterylny prostokątny kawałek (3.5 cm x 5.0 cm) siatki nylonowej (Rysunek 2, krok 1).
  2. Aby uniknąć uszkodzeń, zarodki i okrywy nasienne można przesunąć na powierzchnię metalowych krawędzi kleszczy, delikatnie popychając je za pomocą igły strzykawki (ryc. 2, krok 2). Przenieś zarodki i okrywy nasienne na siatkę nylonową (Rysunek 2, krok 3).
  3. Złóż okrągłą i pojedynczą warstwę okrywy nasiennej za pomocą kleszczy i igły, upewniając się, że okrywy nasienne znajdują się jak najbliżej siebie (Rysunek 2, krok 4). Staraj się w jak największym stopniu odsłonić otwór okrywy nasiennej generowany przez igłę do góry. Ten krok nie był systematycznie testowany. Może to jednak zwiększyć skuteczność aparatu oddechowego, ponieważ oczekuje się, że substancje dyfuzyjne hamujące wzrost zarodka będą bezpośrednio dyfundować w kierunku zarodka, a nie od niego.
  4. Umieść zarodki jako okrągłą pojedynczą warstwę na środku łoża okrywy nasiennej zmontowanej w kroku 4.3 (Rysunek 2, krok 5). Upewnij się, że zarodki znajdują się jak najbliżej siebie.
  5. Inkubować aparaty oddechowe w świetle ciągłym (40 μmol/m2sec) w temperaturze 20-21 °C. W przypadku, gdy impuls FR jest używany do zatrzymania kiełkowania, zmontuj aparat oddechowy w normalnym świetle, zastosuj impuls FR zgodnie z opisem9 i pozostaw szalkę Petriego w ciemności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wcześniejsze prace wykazały, że nasiona mutantów niezdolnych do syntezy GA nie były w stanie kiełkować w wyniku wysokiej akumulacji ABA w nasionach 11,12. Jednakże brak zdolności do kiełkowania wymaga obecności łupiny nasiennej, ponieważ jej usunięcie stymuluje wzrost embrionalny13. Silnie sugerowało to, że endosperm nasion niezdolnych do syntezy GA uwalnia ABA, aby zablokować wzrost embrionu. Oczekujemy zatem, że łupiny nasienne niezdolne do syntezy GA będą blokować wzrost embrionów w układzie SCBA...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana tutaj procedura oznaczania okrywy nasiennej (SCBA) ma w zasadzie zastosowanie w każdej sytuacji, w której kiełkowanie nasion Arabidopsis jest zablokowane (lub opóźnione) i gdy podejrzewa się, że bielmo dokonuje tego zatrzymania. To ostatnie można udowodnić, usuwając okrywę nasienną (jądro i bielmo) i obserwując, że wzrost embrionalny przebiega szybciej w porównaniu z obserwowanym, gdy zarodki są otoczone okrywą nasienną. Kiełkowanie może być zablokowane w odpowiedzi na określone parametry fizyczne środow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty ze Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki i przez Państwo Genewskie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Thermomixer ComfortEppendorf AG5355 000.011Eppendorf AG, Hamburg, Niemcy
Vacusafe ComfortINTEGRA Biosciences AG158 310Integra Biosciences AG, Zizers, Szwajcaria
Talerz Petriego (100 mm x 20 mm)Greiner Bio-One GmbH664 102Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Niemcy
Murashige i SkoogSigma-AldrichM5524Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA
MESSigma-AldrichM3671Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA
Agar (agar roślinny)Duchefa Biochemie B.V.P1001Duchefa Biochemie, Haarlem, Holandia
Kleszcze Dumonta #5Fine Science Tools GmbH11251-10Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Niemcy,
Igła strzykawkowaBD Micro-Fine324827BD, Franklin Lakes, NJ USA
Siatka nylonowa (SEFAR NYTEX)SEFAR AG03-50/31Sefar AG, Heiden, Szwajcaria
Komora wzrostuCLF Klimatyzacja roślinPercival I-30BLLXCLF plant Climatics, Wertingen, Niemcy
PaclobutrazolSigma-Aldrich46046Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA

Bibliografia

  1. Debeaujon, I., Leon-Kloosterziel, K. M., Koornneef, M. Influence of the testa on seed dormancy, germination, and longevity in Arabidopsis. Plant Physiol. 122, 403-414 (2000).
  2. Baroux, C., Spillane, C., Grossniklaus, U. Evolutionary origins of the endosperm in flowering plants. Genome Biol. 3, reviews1026(2002).
  3. Debeaujon, I., Lepiniec, L., Pourcel, L., Routaboul, J. -M. Seed development, dormancy and germination. , Blackwell Publishing. 25-43 (2007).
  4. Finch-Savage, W. E., Leubner-Metzger, G. Seed dormancy and the control of germination. New Phytol. 171, 501-523 (2006).
  5. Bethke, P. C., et al. The Arabidopsis aleurone layer responds to nitric oxide, gibberellin, and abscisic acid and is sufficient and necessary for seed dormancy. Plant Physiol. 143, 1173-1188 (2007).
  6. Lee, K. P., Piskurewicz, U., Tureckova, V., Strnad, M., Lopez-Molina, L. A seed coat bedding assay shows that RGL2-dependent release of abscisic acid by the endosperm controls embryo growth in Arabidopsis dormant seeds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19108-19113 (2010).
  7. Reed, J. W., Nagatani, A., Elich, T. D., Fagan, M., Chory, J. Phytochrome A and Phytochrome B Have Overlapping but Distinct Functions in Arabidopsis Development. Plant Physiol. 104, 1139-1149 (1994).
  8. Shinomura, T., et al. Action spectra for phytochrome A- and B-specific photoinduction of seed germination in Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 8129-8133 (1996).
  9. Lee, K. P., et al. Spatially and genetically distinct control of seed germination by phytochromes A and B. Genes Dev. 26, 1984-1996 (2012).
  10. Lee, K. P., Lopez-Molina, L. Control of seed germination in the shade. Cell Cycle. 11, 4489-4490 (2012).
  11. Piskurewicz, U., et al. The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity. Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).
  12. Piskurewicz, U., Tureckova, V., Lacombe, E., Lopez-Molina, L. Far-red light inhibits germination through DELLA-dependent stimulation of ABA synthesis and ABI3 activity. EMBO J. 28, 2259-2271 (2009).
  13. Debeaujon, I., Koornneef, M. Gibberellin requirement for Arabidopsis seed germination is determined both by testa characteristics and embryonic abscisic acid. Plant Physiol. 122, 415-424 (2000).
  14. Sun, T. P., Kamiya, Y. The Arabidopsis GA1 locus encodes the cyclase ent-kaurene synthetase A of gibberellin biosynthesis. Plant Cell. 6, 1509-1518 (1994).
  15. Alonso, J. M., et al. Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana. Science. 301, 653-657 (2003).
  16. Rook, F., et al. Impaired sucrose-induction mutants reveal the modulation of sugar-induced starch biosynthetic gene expression by abscisic acid signalling. Plant J. 26, 421-433 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kontrola endospermusekcja zarodkapo ywka do kie kowaniamutanty z niedoborem GAizolacja upiny nasiennejmonta warstwy kolistejinkubacja w ci g ym wietle

Powiązane artykuły