Identyfikacja metabolicznie aktywnych bakterii w jelicie ogólnego Spodoptera littoralis za pomocą sondowania stabilnych izotopów DNA przy użyciu 13C-glukozy

Podsumowanie

Aktywna społeczność bakteryjna związana z jelitami Spodoptera littoralis, została określona przez sondowanie stabilnymi izotopami (SIP) sprzężone z pirosekwencjonowaniem. Korzystając z tej metodologii, identyfikacja metabolicznie aktywnych gatunków bakterii w społeczności została przeprowadzona z wysoką rozdzielczością i precyzją.

Streszczenie

Wnętrzności większości owadów są zamieszkiwane przez złożone społeczności symbiotycznych bakterii niepatogennych. W takich zbiorowiskach drobnoustrojów możliwa jest identyfikacja gatunków bakterii komensalnych lub mutualistycznych. Zaobserwowano, że te ostatnie pełnią wiele funkcji dla owadów, tj. pomagają w rozmnażaniu owadów¹, wzmacniają odpowiedź immunologiczną², produkcję feromonów³, a także odżywiają, w tym syntezę niezbędnych aminokwasów⁴.    

Ze względu na znaczenie tych stowarzyszeń, podjęto wiele wysiłków, aby scharakteryzować społeczności aż do poszczególnych członków. Jednak większość tych wysiłków opierała się albo na metodach hodowli, albo opierała się na generowaniu fragmentów genu 16S rRNA, które zsekwencjonowano w celu ostatecznej identyfikacji. Niestety, metody te zidentyfikowały tylko gatunki bakterii obecne w jelitach i nie dostarczyły żadnych informacji na temat aktywności metabolicznej mikroorganizmów.

Aby scharakteryzować metabolicznie aktywne gatunki bakterii w jelitach owada, użyliśmy sondowania stabilnymi izotopami (SIP) in vivo, wykorzystując ¹³C-glukozy jako uniwersalny substrat. Jest to obiecująca technika niewymagająca hodowli, która pozwala na powiązanie filogenezy drobnoustrojów z ich szczególną aktywnością metaboliczną. Jest to możliwe dzięki śledzeniu stabilnych, znakowanych izotopowo atomów z substratów do biomarkerów mikrobiologicznych, takich jak DNA i RNA⁵. Włączenie izotopów ¹³C do DNA zwiększa gęstość znakowanego DNA w porównaniu z nieznakowanym (¹²C). Ostatecznie ¹³DNA lub RNA znakowane C jest oddzielane przez ultrawirowanie w gradiencie gęstości od ¹²C-nieznakowanych podobnych⁶. Późniejsza analiza molekularna oddzielonych izotopomerów kwasów nukleinowych zapewnia związek między aktywnością metaboliczną a tożsamością gatunku.

Tutaj prezentujemy protokół używany do scharakteryzowania metabolicznie aktywnych bakterii w jelitach ogólnego owada (nasz system modelowy), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Analizę filogenetyczną DNA przeprowadzono za pomocą pirosekwencjonowania, co pozwoliło na wysoką rozdzielczość i precyzję w identyfikacji społeczności bakterii jelitowych owadów. Jako główny substrat w eksperymentach użyto ¹³glukozy znakowanej C. Substratem podawano owadom za pomocą sztucznej diety.

Wprowadzenie

Symbiotyczne stowarzyszenia owadów i bakterii są znane z dużej liczby gatunków owadów⁷. W tych symbiotycznych związkach mikroorganizmy odgrywają ważną rolę we wzroście i rozwoju owadów. Wykazano, że drobnoustroje przyczyniają się do rozmnażania owadów¹, biosyntezy feromonów³, odżywiania, w tym syntezy niezbędnych aminokwasów⁴ oraz trawienia pokarmu niedostępnego dla gospodarza. Pomimo ogromnej różnorodności powiązań jelitowo-bakteryjnych, znacznie mniej wiadomo o funkcjonalnej roli, jaką odgrywają one na korzyść owada. Tylko w przypadku termitów szeroko zbadano symbiotyczne trawienie lignocelulozy przez prokariota, pierwotniaki i grzyby^8,9. W przeciwieństwie do tego, niewiele wiadomo o symbiozie obecnej w jelitach owadów ogólnych, tj. dżdżownicy bawełnianej, Spodoptera littoralis. Co więcej, ze względu na częstą zmianę gospodarzy roślinnych, owady ogólne i ich społeczności bakteryjne związane z jelitami są stale narażone na nowe wyzwania związane z ich nawykami żywieniowymi, konsumując rośliny mnóstwem fitochemikaliów. Poza tym środowisko jelitowe u Lepidoptera samo w sobie stanowi trudne środowisko dla rozwoju bakterii ze względu na wysokie pH^{jelit 10}. Szczególnie w przypadku S. littoralis waha się od 10,5 w jelicie przednim, ok. 9 w jelicie środkowym do pH prawie 7 w jelicie tylnym¹¹. Z drugiej strony, społeczność bakteryjna związana z jelitami S. littoralis jest prosta. Tang, Freitak i wsp.¹² zgłosiło maksymalnie 36 filotypów należących do łącznie 7 różnych gatunków bakterii jako jedynych członków społeczności bakteryjnej związanej z tym owadem. Poza tym do hodowli owadów w laboratorium nie jest wymagana żadna skomplikowana procedura hodowlana. Co więcej, w połączeniu z krótkim cyklem życiowym owada ułatwia to wielopokoleniowe badania, przekształcając ten gatunek w idealny system modelowy do badania interakcji jelitowo-mikrobiowych.

Wraz z pojawieniem się technologii sekwencjonowania opartych na PCR, liczba badań dotyczących bioty jelitowej kilku organizmów (np. ludzi, owadów lub organizmów morskich) wzrosła. Co więcej, wyniki są niezależne od izolacji i hodowli bakterii jelitowych, jak to miało miejsce w przeszłości. Prawie 99% bakterii nie nadaje się do hodowli, a symulacja warunków środowiskowych panujących w jelitach jest trudna¹². Za pomocą PCR fragmenty genu 16S rRNA (szeroko stosowany filogenetyczny marker genowy wśród bakterii) mogą być selektywnie amplifikowane z mieszanej matrycy DNA społeczności bakterii jelitowych, sekwencjonowane i klonowane. Dzięki tym informacjom użytkownik jest w stanie zidentyfikować gatunek bakterii po pobraniu informacji o sekwencji z publicznych baz danych^13,14. Niemniej jednak podejścia sekwencjonowania do opisu społeczności bakteryjnych pozostają niewystarczające ze względu na brak informacji na temat wewnętrznego wkładu metabolicznego poszczególnych gatunków w społeczność.

Sondowanie stabilnymi izotopami (SIP) jest obiecującą techniką bez hodowli. Jest często stosowany w mikrobiologii środowiskowej do analizy filogenezy drobnoustrojów związanych z określonymi czynnościami metabolicznymi. Osiąga się to poprzez śledzenie stabilnych, znakowanych izotopowo atomów z substratów do biomarkerów mikrobiologicznych, takich jak kwasy tłuszczowe pochodzące z fosfolipidów, DNA i RNA⁵. Jeśli chodzi o kwasy nukleinowe, metodologia opiera się na oddzieleniu ¹³znakowanych C DNA lub RNA od nieznakowanego DNA za pomocą ultrawirowania w gradiencie gęstości⁶. Ze względu na ten bezpośredni związek między etykietą DNA a aktywnością metaboliczną, dalsza analiza molekularna kwasów nukleinowych identyfikuje gatunki i dostarcza informacji na temat aktywności metabolicznej. Co więcej, połączenie DNA-SIP i pirosekwencjonowania zastosowane przez Pilloni, von Netzer i wsp.¹⁵, pozwala na szczególnie prostą i czułą identyfikację gatunków bakterii obecnych w ciężkiej frakcji DNA znakowanej ¹³C. Do tej pory technika ta była stosowana do opisu zbiorowisk bakteryjnych biorących udział w procesach biogeochemicznych w glebie w warunkach tlenowych^16,17 i beztlenowych^18,19. Oprócz zastosowania w naukach o środowisku, technika ta znalazła zastosowanie w naukach medycznych, jak donoszą Reichardt i wsp.⁵, który opisał aktywność metaboliczną różnych grup filogenetycznych ludzkiej mikrobioty jelitowej w odpowiedzi na niestrawne węglowodany.

Tutaj używamy ¹³C-glukozy do 'oznaczania' DNA metabolicznie aktywnych gatunków bakterii w jelitach. Glukoza jest cukrem wykorzystywanym przez większość gatunków bakterii wzdłuż szeroko rozpowszechnionego szlaku Entnera-Doudoroffa (ED), chociaż znane są wyjątki²⁰. Uzasadnia to zastosowanie ¹³C-glukozy jako niezawodnej sondy metabolicznej, która zapewnia powiązanie między interesującymi metabolitami a źródłem węgla wzdłuż ustalonych szlaków. W zależności od kwestii naukowej, inne substraty, tj. ¹³C-metan, ¹³CO₂ lub rośliny hodowane w atmosferze ¹³CO₂ mogą być wykorzystywane do przeciwdziałania aktywności metabolicznej.

W tym momencie prezentujemy protokół zastosowany w metabolicznej charakterystyce społeczności bakteryjnej jelit owada ogólnego, a mianowicie S. littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Co więcej, technika ta została połączona z pirosekwencjonowaniem, co z kolei pozwala na identyfikację społeczności bakterii jelitowych owadów z wysoką rozdzielczością i precyzją. Jako główny substrat podczas eksperymentów wykorzystano ¹³glukozy znakowanej C.

Protokół

1. Hodowla owadów

1. Kup lub pozyskaj lęgi jaj Spodoptera littoralis z własnej hodowli. Trzymaj je na sterylnych szalkach Petriego w temperaturze pokojowej (RT) aż do wyklucia.
2. Przygotuj sztuczną dietę dla owadów hodowlanych w następujący sposób:
   1. Namocz 500 g zmielonej białej fasoli przez noc w 100 ml wody.
   2. Dodać 9,0 g kwasu askorbinowego i 75 g agaru do 1 000 ml destylowanego_H2O, a następnie zagotować.
   3. Pozostawić mieszaninę do ostygnięcia, a gdy stężeje (do postaci białej, woskowatej, stałej mieszaniny) przechowywać ją w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
3. Nowo wyklute larwy należy przenieść do czystego plastikowego pudełka i hodować je na sztucznej diecie w temperaturze 23–25 °C w reżimie długiego dnia z 16 godzinami oświetlenia i 8 godzinami ciemności. Zmieniaj pokarm codziennie, aż larwy przejdą przez wszystkie sześć stadiów larwalnych.

2. ¹³Znakowanie C DNA w metabolicznie aktywnych bakteriach jelitowych

1. Rozpuść 186,1 mg w pełni ¹³glukozy znakowanej C w wodzie destylowanej i dejonizowanej (ddH₂O) i dobrze wymieszaj ze 100 g sztucznej diety do eksperymentu SIP. Zapewnić końcowe stężenie ¹³C-glukozy wynoszące 10 mM w diecie sztucznej. Naśladuje to stężenie glukozy in situ w jelitach larw S. littoralis żerujących na roślinach bawełny według Shao i in. (przedłożone).
2. Przenieś 9-15 zdrowych larw drugiego stadium rozwojowego z boksu hodowlanego na sterylne plastikowe szalki Petriego (jedna larwa na szalkę Petriego) zawierające świeżą sztuczną dietę zawierającą ¹³C-glukozy. Do karmienia grupy kontrolnej należy stosować sztuczną dietę zawierającą taką samą ilość glukozy natywnej (¹²C-glukozy), jak opisano.
3. Sztuczną dietę należy często odnawiać w okresie inkubacji (1 dzień). Stosować warunki chowu jak w kroku 1.3.
4. Z każdego zabiegu należy pobrać dziewięć larw w celu późniejszego przetworzenia (ekstrakcji DNA). Każda replika składa się z trzech osobników; Wykonać co najmniej trzy powtórzenia na zabieg.

3. Sekcja owadów

1. Oczyść i zdezynfekuj narzędzia preparacyjne na początku pracy etanolem 70% (Narzędzia = nożyczki, kleszcze i skalpel Vannas z drobnymi jednorazowymi ostrzami).
2. Weź owady miękkimi kleszczami i umyj ich skórę powierzchownie wodą destylowaną. Umieść je na lodzie na co najmniej 30 minut, aby je znieczulić.
3. Będąc nadal znieczulonymi, umieść je w temperaturze 0 °C na 1 godzinę, aby je zabić. Zdezynfekuj martwe owady powierzchownie, zanurzając je w etanolu (70%) na kilka minut.
4. Przeprowadzić sekcję owadów na objętość około 15 ml 1x PBS osadzonego na sterylnej szalce Petriego (1XPBS = 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na₂HPO₄, 1,47 mM KH₂PO₄, dostosować pH do 7,4 , autoklaw). Upewnij się, że całe ciało owada jest całkowicie zanurzone w roztworze przez cały okres preparacji.
5. Rozpocznij sekcję od wykonania nacięcia w skórze wzdłuż prawej i lewej strony owada, rozpocznij na głowie i zakończ na odbycie. Usuń całą skórę, kanaliki Malpighiego i ciało tłuszczowe. Zmień na świeży bufor przed rozcięciem jelita. W razie potrzeby należy podzielić jelito na jelito przednie, środkowe i tylne. Przechowywać tkankę w zamrażarce (w temperaturze od -80 do -20 °C) do czasu ekstrakcji DNA

4. Ekstrakcja i amplifikacja DNA

1. Umieścić tkankę owada w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml i wysuszyć wszystkie próbki w temperaturze 45 °C w koncentratorze próżniowym. Zmiażdż wysuszoną tkankę sterylnym plastikowym tłuczkiem.
2. Wyodrębnij genomowe DNA za pomocą odpowiedniego zestawu do ekstrakcji DNA z gleby. Przenieś suchą chusteczkę do probówki reakcyjnej zestawu i postępuj zgodnie z instrukcjami wskazanymi przez producenta.
3. Określić stężenie końcowego eluowanego DNA za pomocą spektrofotometru.
4. Zweryfikować pomyślną ekstrakcję metagenomicznego DNA drobnoustrojów z jelita owada, przygotowując diagnostyczny test PCR przy użyciu eubakteryjnych starterów ogólnych 27f (5- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3) i 1492r (5- GGTTACCTTGTTACGACTT -3). Ustaw reakcję PCR w następujący sposób:
   1. Ustawić 50 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 1x bufor, 1,5 mM MgCl₂, 10 mM czterech trifosforanów deoksynukleozydów (dNTP), 2,5 U polimerazy DNA Taq, 0,5 mM każdego startera i 60 ng wyekstrahowanego DNA jako matrycy.
   2. Przeprowadzić reakcje PCR przy użyciu termocyklera w następujący sposób: wstępna denaturacja w temperaturze 94 °C przez 3 minuty, a następnie 35 cykli: 94 °C przez 45 sekund, wyżarzanie w temperaturze 55 °C przez 30 sekund i przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 1 minutę. Zastosować ostatni etap przedłużania w temperaturze 72 °C przez 10 minut.
   3. Sprawdź pomyślną amplifikację PCR w 1% żelu barwionym bromkiem etydyny (EB) do elektroforezy agarozowej (EB) (rozpuść 1 g agarozy w 100 ml buforu 1x TAE i zabarwij 1 μl EB). Włóż 5 μl produktu PCR + 1 μl 6x ładującego barwnika do kieszeni żelowych. (1x TAE = 40 mM Tris-Base, 20 mM lodowaty kwas octowy, 1 mM EDTA, dostosować do pH 8).
   4. Uruchomić żel za pomocą bufora 1xTAE przy napięciu 300 V, 115 mA przez ok. 20 min w komorze elektroforetycznej. Korzystając z komory dokumentacyjnej żelu (transiluminator UV podłączony do aparatu cyfrowego i komputera), obserwuj żel i porównaj wielkość produktu końcowego z również załadowanym markerem genetycznym; Prawidłowy rozmiar amplikonów musi wynosić około 1,5 kB.
5. Produkty PCR należy przechowywać w warunkach głębokiego zamrażania, najlepiej w temperaturze -80 °C, aż do użycia.

5. Separacja DNA - ultrawirowanie gradientowe CsCl

1. Przygotować odczynniki dla gradientów do ultrawirowania w następujący sposób:
   1. Przygotować 7,163 M roztwór chlorku cezu (CsCl), stopniowo rozpuszczając 603,0 g CsCl w_ddH2O i uzupełnić do końcowej objętości 500 ml.
   2. Dokładnie określić gęstość przygotowanego roztworu CsCl, ważąc 1,0 ml podwielokrotności na trzycyfrowej wadze w trzech powtórzeniach. Zwykle waha się to od 1,88 do 1,89 g/ml w RT.
   3. Przygotować bufor gradientowy (100 mM Tris, 100 mM KCl i 1 mM EDTA) przez połączenie 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 8,0), 1 ml 0,5 M EDTA (pH 8) i 3,75 g KCl w końcowej objętości 500 ml przy użyciu ddH₂O. Przefiltrować (0,22 μm), wysterylizować i autoklawować ten roztwór.
2. Separacja DNA
   1. Po ustaleniu indywidualnego stężenia DNA owadów poddanych działaniu substancji, mierzonego zgodnie z ppkt 4.3, należy połączyć ze sobą owady odpowiadające powtórzeniu i znormalizować ich stężenie DNA, aby zapewnić, że każdy z nich w równym stopniu przyczynia się do powstania próbki zbiorczej. Końcowe stężenie 500-5 000 ng DNA (ponownie zmierz stężenie końcowe) jest odpowiednie dla procesu ultrawirowania²¹.
   2. Aby utworzyć pożywkę gradientową, należy połączyć ilościowo oznaczone DNA, bufor gradientowy i 4,8 ml roztworu 7,163 M CsCl razem do mieszanej objętości 6,0 ml w sterylnej probówce z nakrętką o pojemności 15 ml (wytwarzanie mieszaniny pożywki gradientowej i DNA).
   3. Ostrożnie umieścić przygotowaną gradientową mieszaninę pożywki z DNA w probówce ultrawirówki o pojemności 5,1 ml (napełnić do podstawy szyjki probówki) za pomocą strzykawki i igły. Unikaj pompowania lub tworzenia pęcherzyków powietrza. Uwzględnić co najmniej jeden ślepą próbę gradientu (przy użyciu ddH₂O zamiast DNA) w każdym przebiegu wirówki jako gradient odniesienia.
   4. Wyrównać pary probówek z dokładnością do 10 mg masy po napełnieniu każdej wymaganej pożywki gradientowej do odpowiedniej probówki ultrawirówkowej. Uszczelnij rurkę za pomocą "Nakładki na rurkę" i upewnij się, że uszczelka jest szczelna, odwracając rurkę i wywierając umiarkowany nacisk ręcznie.
   5. Użyj prawie pionowego wirnika z ośmioma dołkami do przechowywania 5,1 ml probówek do ultrawirowania do ultrawirowania. Ostrożnie uszczelnij studzienki wirnika i załaduj wirnik do ultrawirówki zgodnie z instrukcjami producenta. Ustaw warunki ultrawirowania: wirowanie z prędkością 50 000 obr./min (około 177 000 x g), temperatura 20 °C i czas pracy ultrawirowania przez 40 godzin z próżnią. Wybierz maksymalne przyspieszenie i opóźnienie bez hamulca.
   6. Po zakończeniu ostrożnie wyjmij probówki z wirnika wirówki za pomocą kleszczy. Umieść je w stojaku, nie naruszając utworzonych gradientów w rurach. Próbki frakcjonowania gradientowego należy przetwarzać tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować dyfuzję.
3. Pobieranie DNA z gradientów oddzielonych izopikami przez frakcjonowanie
   1. Użyj dokładnego systemu pomp HPLC do przeprowadzenia frakcjonowania gradientowego, który równomiernie oddziela utworzone gradienty od metody przemieszczenia górnej rurki ultrawirówki. Podłączyć pompę HPLC (100% gradient przepływu) do butelki wypełnionej 1 l wypornością ddH₂O i szczelnie przymocować do otwartego przewodu pompy za pomocą igły strzykawkowej 23 G 1 cala. Dodaj wystarczającą ilość niebieskiego barwnika bromofenolowego do ddH₂O, aby nadać mu ciemnoniebieski kolor. Ułatwia to wizualizację granicy faz między ośrodkiem gradientowym a przemieszczeniem ddH₂O.
   2. Ustawić pompę na natężenie przepływu 850 μl/min i zrównoważyć system, aż z igły strzykawki wydobędzie się pojedyncza kropla niebieskiego ddH₂O.
   3. Ostrożnie przymocuj probówkę ultrawirówki do stojaka zaciskowego i przebij spód probówki strzykawką 23 G 1 w długiej igle. Podłącz pompę do probówki ultrawirówki, wkładając igłę dołączoną do rurki pompy do górnej części probówki i zbieraj krople od dołu bezpośrednio do sterylnych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Zbieraj frakcję co 30 sekund, co daje około 425 μl na frakcję i łącznie 12 frakcji na gradient. Należy pamiętać, że ostatnia frakcja (frakcja 12) zwykle zawiera przemieszczenie ddH₂O i należy ją wyrzucić.
   4. Po frakcjonowaniu zmierzyć gęstość wszystkich oddzielonych frakcji za pomocą wagi analitycznej, jak wspomniano w kroku 5.1.2.
   5. Wytrącić DNA z każdej frakcji (około 425 μl), dodając najpierw 1 μl glikogenu (20 μg/μl w ddH₂O, autoklawowany) jako nośnik do wytrącania niewielkiej ilości DNA. Dobrze wymieszaj przez odwrócenie.
   6. Dodać dwie objętości (850 μl) roztworu glikolu polietylenowego (PEG) (rozpuścić 150 g glikolu polietylenowego 6000 i 46,8 g NaCl w ddH₂O do całkowitej objętości 500 ml. Przefiltrować, wysterylizować i przelać w autoklawie. Roztwór PEG to 30% PEG 6000 i 1,6 M NaCl) i ponownie wymieszać, odwracając dziesięć razy.
   7. Pozostaw probówki w temperaturze pokojowej na co najmniej dwie godziny (jeśli to konieczne, na noc), aby wytrącić DNA.
   8. Odwirować osady przy 13 000 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Powinna powstać widoczna osadka.
   9. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety i przemyć osad 500 μl 70% etanolu. Ponownie odwirować w tych samych warunkach przez 10 minut.
   10. Ostrożnie wyrzucić supernatant i wysuszyć osad na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
   11. Ponownie rozpuść wysuszoną osadkę DNA w 30 μl ddH₂O i dobrze wymieszaj, delikatnie stukając w probówkę. Określić ilościowo DNA w każdej frakcji gradientowej, jak w kroku 4.3 Przechowywać próbki w temperaturze poniżej -20 lub -80 °C, jeżeli wymagane jest długotrwałe przechowywanie.

6. Charakterystyka DNA metodą pirosekwencjonowania

1. Upewnij się, że nieznakowane natywne (¹²C) DNA zajmuje zakres gęstości od 1,705 g / ml do 1,720 g / ml, podczas gdy ¹³DNA znakowane C ma gęstość około 1,720-1,735 g / ml. Należy pamiętać, że zarówno natywne, jak i ¹³znakowane C DNA wyekstrahowane z próbek środowiskowych mogą obejmować kilka frakcji gradientowych. Spodziewaj się, że lekkie DNA będzie związane z frakcjami 9-11, a ciężkie DNA będzie związane z frakcjami 4-6.
2. Połącz kluczowe frakcje, aby utworzyć pojedynczą "skompilowaną" frakcję reprezentatywną zgodnie z właściwą alokacją pików DNA o rozdzielczości gęstości. Alternatywnie, inne sposoby badania oddzielonych frakcji za pomocą spektrometrii mas ze stosunkiem izotopowym (IRMS)²² lub metody odcisków palców, takie jak elektroforeza żelowa z gradientem denaturacji (DGGE)²³, mogą pomóc w wyborze odpowiednich frakcji przed sekwencjonowaniem.
3. Wykonaj pirosekwencjonowanie genów bakteryjnych 16S rRNA amplifikowanych PCR ze skompilowanych ciężkich, średnich i lekkich frakcji każdego pojedynczego gradientu. Za pomocą tej metody możliwa jest identyfikacja linii i względnej liczebności metabolicznie aktywnych gatunków bakterii w próbkach inkubowanych SIP. Sekwencjonowanie pirologiczne należy wykonać w następujący sposób:
   1. Wykonaj pirosekwencjonowanie amplikonów za pomocą instrumentu Roche 454 FLX z odczynnikami tytanowymi.
   2. Przygotuj amplikony z kodami kreskowymi do multipleksowania za pomocą zestawu starterów fuzyjnych Gray28F (5- GAGTTTGATCNTGGCTCAG -3) i Gray519r (5- GTNTTACNGCGGCKGCTG -3)^24,25 rozszerzonych o odpowiedni adapter startera A/B i identyfikatory multipleksu specyficzne dla próbki (MID).
   3. Zastosuj jednoetapowy PCR z 30 cyklami, używając polimerazy Hot Start Taq, aby wygenerować bibliotekę sekwencjonowania.
   4. Sekwencjonuj amplikony w oparciu o protokół dostawcy i rozszerz odczyty z kierunku do przodu (Gray28F) zgodnie z opisem w http://www.researchandtesting.com/.

7. Analiza danych pirosekwencjonowania

1. Przeanalizuj surowe odczyty sekwencji generowane przez pirosekwencjonowanie 454 za pomocą "ilościowego wglądu w ekologię drobnoustrojów", potok oprogramowania QIIME²⁶. Wykonaj przetwarzanie w następujący sposób:
   1. Najpierw przekonwertuj plik sff wygenerowany przez maszynę 454 na pliki FASTA, QUAL i Flowgram za pomocą skryptu process_sff.py.
   2. Zweryfikuj plik mapowania (na podstawie check_id_map.py) i przypisz odczyty multipleksowane do próbek biologicznych za pomocą skryptu split_libraries.py. Przytnij końcówki o niskiej jakości za pomocą rozmiaru okna przesuwnego 50 i średniego parametru odcięcia jakości 25, wyeliminuj również krótkie niejednoznaczne sekwencje (długość <200 pz) ze zbioru danych.
   3. Odszumianie danych 454 za pomocą denoise_wrapper.py.
   4. Następnie zgrupuj wysokiej jakości odczyty w operacyjnych jednostkach taksonomicznych (OTU) przy użyciu metody wybierania wielu OTU (pick_otus.py z 97% odcięciami podobieństwa sekwencji).
   5. Wybierz reprezentatywną sekwencję z każdego OTU za pomocą pick_rep_set.py.
   6. Przypisz taksonomię do reprezentatywnego zestawu sekwencji na podstawie assign_taxonomy.py. Użyj klasyfikatora projektu bazy danych rybosomalnej (RDP) z minimalnym poziomem ufności do rekordu przypisanym na wartość 0,80.
   7. Dopasuj reprezentatywny zestaw sekwencji do wstępnie wyrównanych sekwencji rdzenia Greengenes 16S przy użyciu algorytmu PyNast (align_seqs.py z minimalnym procentem tożsamości sekwencji ustawionym na 75).
   8. Dodatkowo zuboż chimery z dalszej analizy, uruchamiając identify_chimeric_seqs.py.
   9. Usuń wszystkie pozycje luk (nieprzydatne do wnioskowania filogenetycznego) za pomocą szablonu maski pasa ruchu (filter_alignment.py) przed zbudowaniem drzewa filogenetycznego (make_phylogeny.py).
   10. Na koniec wygeneruj tabele OTU z make_otu_table.py, opisujące występowanie filotypów bakteryjnych w każdej próbce. Użyj tabeli OTU, aby skonstruować mapę cieplną w celu porównania liczebności i aktywności bakterii.
   11. W razie potrzeby oblicz różnorodność alfa i beta odpowiednio w próbkach i między nimi. W ten sam sposób można również przygotować krzywe rozrzedzenia (wykresy różnorodności w funkcji głębokości sekwencjonowania) oraz wykresy analizy głównych współrzędnych (PCoA) reprezentujące relacje między zbiorowiskami drobnoustrojów.

Wyniki

Aby osiągnąć wystarczające oznakowanie metabolicznie aktywnych bakterii obecnych w jelicie owada, owad musi być wystawiony na działanie substratu bogatego w ¹³C przez wcześniej zoptymalizowany okres wystarczający, aby umożliwić łatwe oddzielenie oznaczonej cięższej frakcji od nieoznakowanej lżejszej. W naszym przypadku ¹³C-glukozy uzupełniono w sztucznej diecie w końcowym stężeniu 10 mM przez 1 dzień (ryc. 1A). Ta sama ilość normalnej glukozy (ryc. 1B) została dosta...

Dyskusja

Jelita większości owadów są siedliskiem bogatej i złożonej społeczności drobnoustrojów; Zazwyczaj zagnieżdża się tam 10^{7-10 9} komórek prokariotycznych, w większości przypadków przewyższając liczebnie własne komórki gospodarza. W ten sposób jelito owadów jest "gorącym punktem" dla różnych działań mikrobiologicznych, reprezentujących wiele aspektów relacji mikrobiologicznych, od patogenezy po obligatoryjny mutualizm²⁷. Chociaż w wielu badaniach opisano zdumiewającą różnorodność społeczności...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dumont #5 Kleszcze do lustrzanego wykończenia	Narzędzia do nauki	11251-23
Vannas Nożyczki sprężynowe	Narzędzia do nauki	15000-00
Szybki koncentrator próżni 5301	Eppendorf Niemcy	5305 000.304
Tłuczek plastikowy	Carl Roth GmbH Co. Niemcy	P986.1
Spektrofotometr NanoVue	GE HealthCare, Wielka Brytania	28-9569-58
Mastercycler pro/thermocycler	Eppendorf Niemcy	6321 000.515
Agagel Standardowa pozioma komora do elektroforezy żelowej	Biometra Wycofane	sprzedaży
Ultrawirówka (Optima L-90K)	Beckman	A20684
Wirnik ultrawirówkowy (NVT 90)	Beckman	362752
Pompa HPLC	Agilent	1100
Szybkozłączka, rurka polialomerowa	Beckman	342412
Oświetlacz UVstar 15	Biometria