Programowanie komórek macierzystych do angiogenezy terapeutycznej z wykorzystaniem biodegradowalnych nanocząstek polimerowych

Summary

Opisujemy metodę programowania komórek macierzystych do nadekspresji czynników terapeutycznych dla angiogenezy za pomocą biodegradowalnych nanocząsteczek polimerowych. Opisane procesy obejmują syntezę polimerów, transfekcję komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej in vitro oraz walidację skuteczności zaprogramowanych komórek macierzystych w promowaniu angiogenezy w mysim modelu niedokrwienia kończyn tylnych.

Abstract

Kontrolowany wzrost naczyń krwionośnych jest niezbędny do skutecznej regeneracji tkanek i gojenia się ran, a także do leczenia chorób niedokrwiennych, takich jak udar, zawał serca czy choroby tętnic obwodowych. Bezpośrednie dostarczanie angiogennych czynników wzrostu może stymulować wzrost nowych naczyń krwionośnych, ale często wiąże się z ograniczeniami, takimi jak brak celowania i krótki okres półtrwania in vivo. Terapia genowa oferuje alternatywne podejście polegające na dostarczaniu genów kodujących czynniki angiogenne, ale często wymaga użycia wirusa i jest ograniczona ze względu na obawy dotyczące bezpieczeństwa. W tym miejscu opisujemy niedawno opracowaną strategię stymulowania wzrostu naczyń krwionośnych poprzez programowanie komórek macierzystych do nadekspresji czynników angiogennych in situ przy użyciu biodegradowalnych nanocząstek polimerowych. W szczególności nasza strategia wykorzystała komórki macierzyste jako nośniki, wykorzystując ich zdolność do migracji w kierunku niedokrwionych tkanek in vivo. Korzystając ze zoptymalizowanych wektorów polimerowych, komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej zmodyfikowano w celu nadekspresji angiogennego genu kodującego czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF). Opisaliśmy procesy syntezy polimerów, tworzenia nanocząstek, transfekcji komórek macierzystych in vitro, a także metody walidacji skuteczności komórek macierzystych eksprymujących VEGF w promowaniu angiogenezy w mysim modelu niedokrwienia kończyn tylnych.

Introduction

Ogólnym celem tej techniki jest promowanie angiogenezy terapeutycznej przy użyciu niewirusowo zaprogramowanych komórek macierzystych powodujących nadekspresję czynników terapeutycznych w miejscu niedokrwienia. Komórki macierzyste zmodyfikowano ex vivo najpierw przy użyciu biodegradowalnych nanocząstek zsyntetyzowanych w laboratorium, a następnie przeszczepiono do mysiego modelu niedokrwienia kończyn tylnych, aby potwierdzić ich potencjał w zakresie zwiększania angiogenezy i ratowania tkanek.

Kontrolowany wzrost naczyń krwionośnych jest ważnym elementem skutecznej regeneracji tkanek, a także w leczeniu różnych chorób niedokrwiennych, takich jak udar, niedokrwienie kończyn i zawał mięśnia sercowego. Opracowano kilka strategii promujących wzrost naczyń krwionośnych, w tym dostarczanie czynnika wzrostu i terapię komórkową. ¹ Pomimo skuteczności zaobserwowanej w modelach chorób zwierzęcych, metody te nadal napotykają ograniczenia, takie jak konieczność stosowania dawek suprafizjologicznych w celu dostarczania czynnika wzrostu lub niewystarczające uwalnianie parakrynne przez same komórki. Jedną z potencjalnych strategii przezwyciężenia powyższych ograniczeń jest połączenie terapii komórkami macierzystymi i terapii genowej, w której komórki macierzyste są genetycznie programowane ex vivo przed przeszczepem w celu nadekspresji pożądanych czynników terapeutycznych. Podejście to zostało zademonstrowane w różnych modelach chorób, w tym niedokrwienie kończyn tylnych², choroby serca³, gojenie się kości⁴ i uszkodzenie neuronów⁵ itp. Jednak większość technik terapii genowej opiera się na wektorach wirusowych, które wiążą się z obawami dotyczącymi bezpieczeństwa, takimi jak potencjalna immunogenność i mutageneza insercyjna. Dostarczanie genów za pośrednictwem biomateriałów może przezwyciężyć te ograniczenia, ale często cierpi z powodu niskiej wydajności transfekcji. Aby przyspieszyć odkrywanie nowych biomateriałów do skutecznego dostarczania genów niewirusowych, w ostatnich badaniach wykorzystano chemię kombinatoryczną i wysokoprzepustowe badania przesiewowe. Opracowano i przebadano biodegradowalne biblioteki polimerów, takie jak estry poli(β-aminowe) (PBAE), co doprowadziło do odkrycia wiodących polimerów o znacznie zwiększonej wydajności transfekcji w porównaniu z konwencjonalnymi polimerowymi odpowiednikami wektorowymi. ^6-7

Tutaj opisujemy syntezę PBAE i weryfikację ich zdolności do transfekcji komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) in vitro, a następnie przeszczepienie genetycznie zmodyfikowanych ADSC z nadekspresją czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) w mysim modelu niedokrwienia kończyn tylnych. Wyniki oceniano, śledząc los komórki za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego, oceniając reperfuzję tkanek za pomocą laserowego obrazowania perfuzji dopplerowskiej (LDPI) oraz określając angiogenezę i ratowanie tkanek za pomocą histologii.

Protocol

1. Synteza polimerów

1. W dygestorium odważyć 3,523 mg dikrylanu butanodiolu (C) i przenieść do szklanej fiolki scyntylacyjnej zawierającej mieszadło.
2. Podgrzać 5-amino-1-pentanol (32) do temperatury 90 °C w celu rozpuszczenia soli, a następnie w dygestorium odważyć 1,533 mg 32 i dodać do fiolki scyntylacyjnej zawierającej C. Ta metoda da stosunek molowy C:32 = 1:1,2.
3. Fiolkę zawierającą oba roztwory należy natychmiast umieścić na płytce do mieszania. Ustaw prędkość mieszania na 600 obr./min.
4. Przenieść fiolkę scyntylacyjną do piekarnika nastawionego na 90 °C. Ustawić prędkość mieszania na 1 000 obr./min na 4 godziny. Jeśli mieszadło utknie, zmniejsz prędkość. Po 4 godzinach zmniejsz prędkość do 300 obr./min i utrzymuj temperaturę 90 °C przez kolejne 12-16 godzin.
5. Dodać 5 g C32 do 10 ml bezwodnego tetrahydrofuranu (THF) do szklanej fiolki scyntylacyjnej zawierającej mieszadło. Zawiń w folię i wiruj na wysokich obrotach, aż do całkowitego rozpuszczenia.
6. Do oddzielnej szklanej fiolki scyntylacyjnej zawierającej mieszadło dodać 10 mM tetraetylenglicoldiaminy (122). Dodać 40 ml THF.
7. Umieścić obie fiolki (C32 i 122) na płytce mieszającej na 5 minut, a następnie połączyć razem. Przykryj folią i pozostaw w temperaturze pokojowej, mieszając z prędkością 400 obr./min przez 24 godziny. Produkt końcowy jest określany jako C32-122.
8. Odważyć 5 probówek Falcon po 50 ml na każdą 5 g partię C32-122. Zanotuj masę każdej probówki w zeszycie.
9. Przenieść 30 ml bezwodnego eteru dietylowego do każdej probówki Falcon o pojemności 50 ml.
10. Przenieść 10 ml C32-122 do każdej probówki Falcon o pojemności 50 ml.
11. Energicznie wiruj probówki Falcon, a następnie wiruj z prędkością 2,500 obr./min przez 2 minuty. Uwaga: Wyekstrahowany polimer zbierze się u podstawy probówki.
12. Odrzucić górny roztwór i powtórzyć kroki 1.9 i 1.11 jeszcze dwa razy.
13. Umieścić otwarte probówki zawierające wyekstrahowany C32-122 w eksykatorze i odkurzyć przez noc. Upewnij się, że wszystkie rurki są chronione przed światłem.
14. Zważyć wszystkie probówki zawierające C32-122 w celu określenia końcowej masy wyekstrahowanego polimeru.
15. Rozpuścić wyekstrahowany polimer w bezwodnym DMSO o stężeniu 100 mg/ml.
16. Rozpuszczony polimer należy przechowywać w temperaturze -20 °C, chronić przed światłem i wilgocią.

2. Sadzenie komórek

1. Wstępnie pokryć podstawę kolby do hodowli tkankowych T-150 0,1% (wag./obj.) żelatyną. Żelatyna powinna pozostać w kolbie przez 30-45 minut. Powłoka żelatynowa wspomaga adhezję ADSC.
2. Odessać żelatynę z wstępnie powlekanej kolby T-150.
3. Dodać 4 x 10⁶ ADSC (≤ przejście 3) do kolby w 20 ml DMEM zawierającej 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i 10 ng/ml bFGF.
4. Umieścić kolbę T-150 w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez noc.
5. Procedurę transfekcji należy rozpocząć następnego dnia.

3. Przygotowanie i transfekcja nanocząstek

1. Poniższa procedura służy do przygotowania nanocząstek zawierających 16,1 μg plazmidowego DNA na 1,0 x^{10 6} komórek przy stosunku masy polimeru do plazmidu wynoszącym 30:1.
2. Rozcieńczyć plazmidowy DNA (1 mg/ml, pVEGF165, Aldevron, ND, USA) do końcowego stężenia 120 μg/ml w octanie sodu (25 mM) w 15 ml probówce Falcon.
3. Rozcieńczyć C32-122 (100 mg/ml) do końcowego stężenia 3,6 mg/ml w octanie sodu (25 mM) w drugiej probówce Falcon o pojemności 15 ml.
4. Połącz zawartość każdej probówki Falcon w jedną probówkę Falcon o pojemności 15 ml i natychmiast wiruj na wysokich obrotach przez 10 sekund.
5. Pozostaw probówkę w temperaturze pokojowej na 10 minut, aby doszło do powstania nanocząstek.
6. Podczas inkubacji zastąpić pożywkę w kolbie do hodowli tkankowej 7,8 ml w pełni uzupełnionego DMEM na 1,0 x 10 6 transfekowanych komórek.
7. Przenieś roztwór nanocząstek do kolby do hodowli tkankowej i przechylaj do przodu i do tyłu, aby równomiernie rozprowadzić.
8. Umieścić kolbę do hodowli tkankowych w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 4 godziny.
9. Po 2 godzinach zastąp pożywkę zawierającą nanocząstki DMEM.
10. Po kolejnych 2 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ komórki są gotowe do wstrzyknięcia in vivo.

4. Procedura niedokrwienia kończyn tylnych

1. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Stanforda oraz zatwierdzonymi protokołami APLAC. Generowanie mysiego modelu niedokrwienia kończyn tylnych odbywa się zgodnie z wcześniejszym opisem. ⁸ Szczegółowe instrukcje można znaleźć w odnośniku. Krótki opis znajduje się poniżej.
2. Umieść mysz w znieczuleniu z 1-3% dawką izofluranu przez wdychanie i szybkość przepływu tlenu 1 l/min. Zapewnij głębokość znieczulenia przez uszczypnięcie palca, zmniejszenie częstości oddechów i letarg.
3. Usuń włosy z okolicy brzucha i obu tylnych kończyn myszy za pomocą kremu do golenia.
4. Wykonaj nacięcie na środku przyśrodkowej części uda w kierunku linii środkowej, a następnie przetnij leżącą poduszeczkę tłuszczową, aby odsłonić tętnicę udową.
5. Podwiązaj tętnicę w dwóch miejscach: dystalnej (blisko kolana) i bliższej (tylko dystalnie do więzadła pachwinowego).
6. Aby utworzyć podwiązania, oddziel tętnicę od żyły i nawlecz jedwabny szew 5-0 wokół tętnicy. Zwiąż tętnicę dwoma węzłami, aby wykonać podwiązanie.
7. Usuń tętnicę między dwoma punktami podwiązania.
8. Umyj obszar operacyjny PBS, a następnie zszyj nacięcie zamknięte.
9. Znieczulenie można teraz usunąć. Utrzymuj mysz w cieple aż do ponownego przebudzenia. W przypadku opieki pooperacyjnej 2-4 mg/kg lidokainy można wstrzyknąć podskórnie w miejsce nacięcia przed ponownym przebudzeniem. Dalsze leczenie bólu może obejmować podskórne podawanie 0,05-0,1 mg/kg buprenorfiny po 12 i 24 godzinach. Monitoruj stan zdrowia myszy raz dziennie przez siedem dni, obserwując zmiany we wzorcu oddychania, jawnym bólu lub niepokoju oraz kolorze skóry.
10. Potwierdź niedokrwienie kończyn tylnych za pomocą laserowego obrazowania perfuzyjnego Dopplera.

5. Iniekcje komórkowe

1. Kiedy transfekowane komórki i myszy są gotowe, umyj transfekowane komórki PBS, trypsynizuj, odwiruj, a następnie policz.
2. Zawiesić komórki o gęstości 10 x 10⁶ komórek na ml w PBS.
3. Zawiesiny komórek należy rozdzielić do oddzielnych probówek Eppendorfa o objętości 110 μl. Zapewni to, że każda mysz otrzyma równą liczbę komórek.
4. Umieść każdą mysz pod narkozą (2,5% izofluranu, natężenie przepływu tlenu 1 l/min).
5. Oczyścić miejsce wstrzyknięcia chusteczkami nasączonymi alkoholem.
6. Używając strzykawki tuberkulinowej 27 G, wciągnij komórki w górę i w dół do strzykawki, aby zapewnić uzyskanie jednorodnej zawiesiny. Pobrać 100 μl objętości zawiesiny komórek do strzykawki.
7. Wstrzyknąć połowę zawiesiny komórkowej do obszaru mięśnia przywodziciela, a następnie wstrzyknąć drugą połowę w obszar mięśnia łydki. Po wstrzyknięciu należy pozostawić strzykawkę na miejscu na co najmniej 15-30 sekund, aby zapobiec wyciekowi zawiesiny komórek.
8. Właściwe kontrole w badaniu na zwierzętach obejmują: 1) komórki transfekowane plazmidem niekodującym (np. plazmidem bez aktywności biologicznej); 2) same komórki; oraz 3) PBS.
9. Po zakończeniu wstrzyknięć wyjmij mysz ze znieczulenia i trzymaj ją w cieple, aż mysz ponownie się obudzi.

6. Obrazowanie bioluminescencyjne

1. Aby rozpocząć obrazowanie bioluminescencyjne (BLI), znieczul myszy zgodnie z powyższym opisem.
2. Oczyścić miejsce wstrzyknięcia chusteczkami nasączonymi alkoholem.
3. Używając strzykawki insulinowej, załaduj 100 μl 15 mg/ml D-lucyferyny (substratu dla lucyferazy świetlika). Trzymaj podłoże z dala od światła.
4. Aby wykonać wstrzyknięcia dootrzewnowe, trzymaj myszy za skórę grzbietu, aby naciągnąć ich przednią część skóry. Wprowadzić igłę dootrzewnowo w okolicę brzucha i wstrzyknąć 100 μl substratu.
5. Umieść mysz w komorze obrazowania lucyferazy IVIS pod narkozą.
6. Zobrazuj myszy z czasem naświetlania 1,0 min. Po ustawieniu parametrów rozpocznij pobieranie obrazów.
7. Po uzyskaniu obrazu zaznacz obszar zainteresowania, aby zmierzyć sygnał lucyferazy. W takim przypadku należy oznaczyć niedokrwioną kończynę w miejscu wstrzyknięcia komórki.
8. Kontynuuj pomiar sygnału lucyferazy co 3-5 minut, aż sygnał osiągnie szczyt i zacznie spadać. Jest to wartość wykorzystywana do porównania między myszami i w kilku punktach czasowych.
9. Po zakończeniu wyjmij myszy z komory i znieczul. Utrzymuj myszy w cieple aż do ponownego przebudzenia.

7. Laserowe obrazowanie perfuzji dopplerowskiej

1. Laserowe obrazowanie perfuzji dopplerowskiej wykonuje się zgodnie z wcześniejszym opisem. ⁸ Procedura ta została pokrótce opisana poniżej.
2. Przed obrazowaniem dopplerowskim mysz powinna być gładko ogolona w obszarach pokrywających zarówno tylne kończyny, jak i okolicę brzucha, aby zapobiec artefaktom spowodowanym włosami.
3. Po przygotowaniu do obrazu dopplerowskiego mysz powinna zostać znieczulona w sposób opisany powyżej.
4. Rozgrzej mysz do 36 °C na gorącej płycie, monitorując temperaturę ciała za pomocą termometru doodbytniczego.
5. Umieść mysz na nieodblaskowej czarnej powierzchni i utrzymuj znieczulenie za pomocą stożka nosowego. Mysz należy ułożyć na powierzchni grzbietowej z równomiernie odsłoniętymi kończynami.
6. Umieść laserowy czujnik Dopplera około 15 cm nad myszą i kierując wskaźnik laserowy z czujnika w kierunku pachwiny myszy.
7. Gdy mysz i czujnik Dopplera znajdują się w odpowiedniej pozycji, zdjęcia można robić za pomocą oprogramowania LDPIwin, naciskając przycisk Start.
8. Pomiary perfuzji względnej można wykonać, wskazując obie kończyny tylne (niedokrwienną i nieniedokrwienną) jako obszar zainteresowania (ROI). Stosunek średniej perfuzji niedokrwiennej kończyny tylnej do nieniedokrwiennej będzie wskazywał na względną perfuzję.

8. Procedura pobierania tkanek

1. Po przygotowaniu do pobrania tkanki myszy do badań histologicznych i/lub biochemicznych, mysz powinna zostać poddana eutanazji. W tym przypadku mysz jest poddawana eutanazji poprzez wystawienie na działanie 5% izofluranu przez 3-5 minut, a następnie eutanazja myszy przez zwichnięcie szyjki macicy.
2. Przetnij leżącą nad nią skórę otaczającą tylną kończynę obwodowo w dystalnej okolicy brzucha i proksymalnie do kończyny tylnej. Skóra jest cięta od powierzchni brzusznej do grzbietowej, tak aby skóra mogła zostać przeciągnięta z powrotem przez kończynę tylną do stopy.
3. Po odciągnięciu skóry do tyłu, kończyna może zostać amputowana za pomocą nożyczek preparacyjnych do cięcia w stawie miednicy i kości udowej.
4. Do analizy pobierane są dwie główne tkanki: przyśrodkowe mięśnie przywodzicieli i mięśnie brzuchate łydki.
5. W przypadku histologii należy zanurzyć jedną lub obie tkanki w optymalnej temperaturze cięcia (OCT) do kriosekcji.
6. W celu analizy biochemicznej należy zebrać jedną lub obie tkanki do 1,5 ml Eppendorfa i zanurzyć w kąpieli z ciekłym azotem na co najmniej 2 minuty. Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C do przyszłego przetwarzania.

Results

Po zmieszaniu się ze sobą, dodatnio naładowany polimer (C32-122) i ujemnie naładowany plazmid DNA samoorganizują się w nanocząsteczki. Powstawanie nanocząstek można potwierdzić za pomocą analizy elektroforetycznej, tj. kompleksowanie między C32-122 a plazmidowym DNA uniemożliwi mobilizację DNA podczas elektroforezy. Polimer służy jako odczynnik do transfekcji, aby ułatwić zwiększony wychwyt DNA do komórek docelowych i późniejszą ekspresję białek kodujących (ryc. 2). Komórki mogą być transfekowan...

Discussion

W tym artykule przedstawiamy metodę programowania dorosłych komórek macierzystych do nadekspresji czynników terapeutycznych przy użyciu niewirusowych, biodegradowalnych nanocząstek. Platforma ta jest szczególnie przydatna w leczeniu chorób, w których komórki macierzyste mogą naturalnie domowić się, takich jak niedokrwienie i rak. ^9-10 Co więcej, niewirusowa platforma dostarczania genów pozwala na przejściową nadekspresję czynników terapeutycznych, co jest odpowiednie dla większości procesów regeneracji tkanek ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11965
Surowica bydlęca	Invitrogen	10082
Penicylina/Streptomycyna	Invitrogen	15070
Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów	Peprotech	100-18B
Diakrylan 1,4-butanodiolu (90 %)	Sigma Aldrich	411744	Akronim: C
5- amino-1-pentanol (97 %)	Alfa Aesar	2508-29-4	Akronim: 32
Tetraetyleloglicoldiamina > 99 %)	Molecular Biosciences	17774	Akronim: 122
Octan sodu	G-Biosciences	R010
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem	Invitrogen	14190-144
Tetrahyofuran bezwodny (> 99,9 %)	Sigma Aldrich	401757
Eter dietylowy bezwodny (> 99 %)	Fisher Scientific	E138-4
DMSO bezwodny (> 99,9 %)	Sigma Aldrich	276855
Gelatin	Sigma Aldrich	G9391
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200
D-lucyferin	GoldBio
Optymalna temperatura cięcia (OCT)	Tissue-Tek	4583
Szczur anty-mysz CD31	BD Pharmingen	550274
Alexa Fluor 594 przeciw szczurom IgG	Invitrogen	A11007