Aby wyświetlić tę treść, wymagana jest subskrypcja JoVE. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Summary

Struktura roztworu NMR peptydu modelowego metalochaperonu z Cu (I) została określona, a szczegółowy protokół od przygotowania próbki i zbierania danych 1D i 2D do struktury trójwymiarowej jest opisany.

Abstract

Wiązanie miedzi (I) przez białka transportujące metalochaperon zapobiega utlenianiu miedzi i uwalnianiu toksycznych jonów, które mogą uczestniczyć w szkodliwych reakcjach redoks. Kompleks Cu (I) peptydowego modelu białka metalochaperonu wiążącego Cu (I), który obejmuje sekwencję MTCSGCSRPG (podkreślenie jest konserwatywne), oznaczono w roztworze w warunkach obojętnych za pomocą spektroskopii NMR.

NMR jest powszechnie akceptowaną techniką określania struktur roztworów białek i peptydów. Ze względu na trudności w krystalizacji w celu uzyskania monokryształów odpowiednich do krystalografii rentgenowskiej, technika NMR jest niezwykle cenna, zwłaszcza że dostarcza informacji o stanie roztworu, a nie w stanie stałym. W tym miejscu opisujemy wszystkie kroki, które są wymagane do pełnego wyznaczenia struktury trójwymiarowej za pomocą NMR. Protokół obejmuje przygotowanie próbki w probówce NMR, gromadzenie i przetwarzanie danych 1D i 2D, przypisywanie i całkowanie pików, obliczenia mechaniki molekularnej i analizę struktury. Co ważne, analiza została najpierw przeprowadzona bez żadnych wstępnie ustawionych wiązań metal-ligand, aby zapewnić wiarygodne określenie struktury w bezstronny sposób.

Introduction

Peptydy są powszechnie używane jako modele białek, potencjalne leki prowadzące i środki terapeutyczne same w sobie. Jednak ich niewielkie rozmiary i wysoki stopień elastyczności często uniemożliwiają określenie struktury za pomocą promieniowania rentgenowskiego ze względu na trudności w krystalizacji.

Magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) może być używany do określania struktur i oddziaływań peptydowych. Metoda może dostarczyć informacji dotyczących lokalnej i ogólnej struktury, wiązań i oddziaływań o niższym powinowactwie i ma zastosowanie do trudnych próbek, ponieważ można to zrobić w stanie roztworu.

Transport miedzi w systemach biologicznych jest osiągany przez wewnątrzkomórkowe białka metalochaperonu miedzi, które specyficznie wiążą jony Cu (I) i dostarczają je do docelowych białek poprzez szereg interakcji białko-białko, aby chronić jony przed utlenianiem i zapobiec uwalnianiu toksycznej miedzi^2-5. Miejsce wiązania charakteryzuje się konserwatywną sekwencją, MXH / TCXanyXanyC, która, jak wykazano zarówno za pomocą NMR, jak i krystalografii, wiąże Cu (I) przez miękkie ligandy tiolatonowe dwóch reszt cysteiny, chociaż zaproponowano również dodatkowy ligand zewnętrzny^6-8. Zależność struktura-funkcja tych białek jest przedmiotem intensywnych badań⁹.

W prezentowanym tutaj badaniu, model peptydowy, który zawiera konserwowaną sekwencję miedzianych metalochaperonów, został zsyntetyzowany i przechodził reakcję z Cu (I) w obojętnym środowisku. Prezentowany protokół opisuje etapy wyznaczania struktury za pomocą NMR, w tym przygotowanie próbki, zbieranie danych, przetwarzanie danych, generowanie struktury i analizę statyczno-wytrzymałościową. Analizę przeprowadzono w dwóch etapach: Najpierw wygenerowano struktury bez informacji na temat sposobu wiązania peptydu z jonem miedzi. Po empirycznym ustaleniu trybu wiązania wprowadzono te ograniczenia, aby zapewnić strukturę o wysokiej rozdzielczości. Sposób wiązania jest zasadniczym punktem w modelu i dlatego został określony w sposób bezstronny.

Strukturalne określanie modelowych peptydów metodą NMR jest niezwykle cenną techniką, często używaną przez chemików i biologów. Może być stosunkowo łatwo stosowany do różnych peptydów w różnych warunkach, a tym samym może rzucić światło na odpowiednie mechanizmy¹⁰. Zrozumienie procesu wyjaśniania struktury zapewnia lepsze zrozumienie mocnych i słabych stron proponowanych struktur.

Protocol

1. Przygotowanie próbki

1. Próbka Apo: Rozpuść około 1-2 mg peptydu w 450-500 μl deuterowanego rozpuszczalnika klasy NMR (preferowane roztwory dla próbek biologicznych to 10% D2O w wodzie lub d6-DMSO ^11-12, jeśli próbka nie rozpuszcza się w wodzie lub reaguje z nią).
2. Próbka przechodząca z miedzią: Rozpuścić około 1-2 mg peptydu w równomolowej ilości soli metalu w 450-500 μl rozpuszczalnika NMR.
3. Przefiltrować roztwór za pomocą szkła spiekanego, bibuły filtracyjnej lub innej techniki, która pasuje do badanych związków i nie adsorbuje ich. Jest to niezbędne do usunięcia wszelkich cząstek metalicznych, które wpłyną na jednorodność.
4. Przenieś roztwór do probówki NMR i zamknij ją. Upewnij się, że jakość rurki odpowiada zastosowanej sile magnesu (więcej szczegółów znajduje się w tabeli wyposażenia).
5. Jeśli próbka jest wrażliwa na tlen, czynności te należy wykonać w środowisku obojętnym, a rurkę uszczelnić, aby zapobiec utlenianiu.

2. Gromadzenie i przetwarzanie danych NMR¹³

1. Zapisać widma 1D ¹H próbek przechodzących reakcje apo i miedzi i porównać. Widmo peptydów zawierających miedź powinno wykazywać znaczącą zmianę przesunięcia chemicznego w regionie amidu, a piki ustąpiły, ponieważ apeptyd jest elastyczny i wykazuje średnią konformacji, ale po reakcji z miedzią amidy peptydów związanych mają pojedynczą strukturę (ryc. 2).
   1. Jeśli widmo nie uległo zmianie, zakłada się, że reakcja się nie powiodła.
   2. Jeśli próbka zmieni kolor na zielony, miedź utleni się w atmosferze, co może zmienić jej właściwości wiążące.
   3. W obu tych przypadkach próbka będzie musiała zostać ponownie wykonana.
2. Znajdź optymalne warunki temperaturowe dla pomiarów NMR, które zapewniają minimalne nakładanie się reszt amidowych o wąskich szerokościach linii.
3. Skonfiguruj eksperymenty COSY¹⁴, TOCSY¹⁵ i NOESY¹⁶ lub ROESY¹⁷ NMR w identycznych warunkach (temperatura, pH itp.) i uruchom w sekwencji.
   1. Eksperymenty COSY (Rysunek 3) i TOCSY (Rysunek 4) wykryją odpowiednio oddziaływania wiązań przelotowych sąsiednich i sąsiednich oddziaływań proton-proton o większym zasięgu. Widmo COSY dostarcza informacji o korelacjach HN-Hα, podczas gdy widmo TOCSY daje dodatkowo informacje o HN i innych protonach alifatycznych H skorelowanych reszt.
   2. Eksperymenty NOESY i ROESY (ryc. 5) wykrywają bliskość w przestrzeni bez zależności od wiązań w celu dostarczenia informacji strukturalnych. Wybór między nimi zależy od efektywnej wielkości związku i natężenia pola. Niektóre takie kombinacje dają teoretyczne sygnały zerowe (rysunek 6) i konieczne będzie przeprowadzenie eksperymentu ROESY w celu wykrycia oddziaływań NOE^10,18.
   3. Jeśli próbka znajduje się w wodzie, eksperymenty muszą zawierać składnik tłumienia wody. Najefektywniej osiąga się to za pomocą gradientów¹⁹. W takim przypadku korzystne jest ponowne uruchomienie próbki, po przypisaniu, w czystym D₂O w celu uzyskania interakcji z wodorami Hα i między nimi.
   4. Zoptymalizuj czas mieszania TOCSY i NOESY lub ROESY, przeprowadzając szereg krótkich eksperymentów w celu znalezienia maksymalnego narastania sygnału przy minimalnych stratach dyfuzji spinowej. Upewnij się, że jest to obszar liniowy krzywej narastania. Wartości wspólne dla peptydów w polach 600 MHz obejmują czasy mieszania wynoszące około 100 ms dla eksperymentów TOCSY i 150 ms dla eksperymentów NOESY lub ROESY.
   5. Przeprowadzaj eksperymenty 1D pomiędzy każdym eksperymentem, aby upewnić się, że skład próbki pozostaje niezmienny przez cały czas pozyskiwania danych (rysunek 7).
4. Przetwarzaj widma za pomocą odpowiednich funkcji apodyzacji, aby uzyskać maksymalną rozdzielczość przy minimalnej utracie siły sygnału, dodając zerowe wypełnienie wymiaru t1.
   1. Następnie popraw linię bazową w wymiarze F2, a następnie F1 za pomocą kwadratowej funkcji wielomianowej.
   2. Dokładnie skalibrować przesunięcie chemiczne widm zgodnie z resztkowymi pikami wody lub DMSO w odpowiednich rozpuszczalnikach zgodnie z ich przesunięciem w stosunku do znanych wzorców (odpowiednio TMSP lub TMS).

3. Szczytowe przypisywanie i integracja za pomocą SPARKY²⁰

1. Przygotuj zestaw widm COSY i TOCSY nałożonych na widmo NOESY lub ROESY (ryc. 8).
2. Przypisz wszystkie piki NOE w widmie zgodnie z metodologią sekwencyjnego przypisywania opracowaną przez Wüthrich²¹.
   1. Zacznij od przypisania pików, które nakładają się na sygnały TOCSY w obszarze odcisku palca, ponieważ ułatwi to późniejsze przypisywanie pików za pomocą programu SPARKY (ilustracja 9). Zarejestruj przypisanie przesunięcia chemicznego (rysunek 10) i wartości ³JHNHα (rysunek 11).
3. Przekształć szczyty w wiązania odległości, a wartości ³JHNHα w kąty dwuścienne.
   1. Można to osiągnąć, całkując piki z poziomu programu i przekształcając je w ograniczenia odległości za pomocą interakcji znanej odległości (takiej jak odległość między dwoma protonami grupy metylenowej lub aromatycznymi atomami wodoru aminokwasu aromatycznego).
   2. Jeśli piki nakładają się na siebie i nie można zastosować metod całkowania, można je oznaczyć jako silne-średnie-słabe-bardzo słabe za pomocą oszacowania wizualnego, a oznaczenia te można przetłumaczyć na odległości odpowiednio do 2,5, 3,5, 4,5 i 5,5 A. Ma to być najbardziej skuteczne w pracy z peptydami.
   3. ³JWartości HNHα wskazują na kąty dwuścienne zgodnie z równaniem Karplusa, gdzie większość podanych wartości sprzężenia może wynikać z więcej niż jednego kąta dwuściennego. Mogą one wskazywać na strukturę drugorzędową (helisy lub arkusze), losowe zwoje lub ich średnie konformacyjne. Dlatego ważne jest, aby ostrożnie korzystać z ograniczeń lub używać ich jako potwierdzenia wyników konformacyjnych.

4. Obliczenia mechaniki molekularnej do generowania zespołu strukturalnego za pomocą XPLOR22

1. Zaimportuj wiązania odległości i kąty dwuścienne w formacie odpowiednim dla XPLOR. (Rysunek 12, tylko ograniczenia międzyrezydualne). XPLOR przeszuka przestrzeń konformacyjną w celu znalezienia struktur, które przestrzegają kanonicznych geometrycznych ograniczeń chemicznych, takich jak długości wiązań, kąty, chiralność itp., oprócz eksperymentalnie znalezionych ograniczeń odległości, aby wygenerować zespół, w którym żaden z powyższych parametrów nie jest naruszony. Będzie to zespół wyjściowy.
2. Pierwszy przebieg określania struktury będzie przebiegał bez użycia żadnych ograniczeń dla metalu. Pokaże to, które pozostałości uczestniczą w wiązaniu metalu bez żadnych odchyleń. Przejdź do kroku 4.4.
3. Oprócz ograniczeń odległości wyprowadzonych przez NMR, należy dodać wiązania metali do wyznaczonych pozostałości.
   1. Dodaj odpowiednie parametry, aby opisać jon metalu i jego topologię.
   2. Odpowiednie informacje fizyczne (masa, długości wiązań z innymi atomami, kąty i parametry odpychania bez wiązania) muszą być umieszczone w pliku parametrów.
   3. Dodaj informacje o powiązaniu do pliku topologii: Które wiązania są tworzone i zrywane oraz które ładunki formalne są zmieniane w wyniku wiązania.
4. Stwórz mały zespół składający się zwykle z 10 członków.
   1. Wprowadzaj ograniczenia stopniowo, zaczynając od interakcji między szkieletem a szkieletem, następnie od szkieletu do łańcucha bocznego, a następnie od interakcji łańcucha bocznego do łańcucha bocznego i przechodząc od interakcji wewnątrzresztkowych, sekwencyjnych do interakcji o coraz większym zasięgu. Ułatwia to identyfikację błędów w przyporządkowaniu.
   2. Wprowadzić energię NOE jako potencjał kwadratowo-studzienkowy o stałej stałej siły 50 kcal/mol•Å². Symulowane wyżarzanie powinno być wykonywane w krokach co 1 500 stóp i 3 sekundy w temperaturze 1 500 K i 3 000 w krokach co 1 sekundę podczas chłodzenia do 500 K. Na koniec zminimalizuj struktury za pomocą sprzężonej minimalizacji energii gradientu dla 4,000 iteracji; są to zmienne, które można zmieniać w XPLOR.
5. Stwórz ostateczny zespół składający się zwykle z 50 członków. Wykonaj kroki z kroku 4.4 na całym zespole.
   1. Należy podać liczbę każdego rodzaju interakcji NOE, które zostały znalezione, jak pokazano na rysunku 13.
6. Utwórz zestaw struktur, które są zgodne z kanoniczną geometrią chemiczną i empirycznymi ograniczeniami pochodzącymi z NMR.
   1. Proszę podać łączną liczbę konformacji, liczbę tych, które naruszają ograniczenia pochodzące z NMR, oraz wartość RMSD całego zespołu, zarówno szkieletu, jak i wszystkich wartości RMSD ciężkich atomów.

5. Analiza struktury

1. Rozwiązany zespół reprezentuje przestrzeń konformacyjną przyjętą przez peptyd podczas pomiaru NMR. Elastyczność lokalna może się zmieniać w różnych regionach cząsteczki i można to przypisać przyczynom strukturalnym lub funkcjonalnym (celem analizy strukturalnej jest określenie strukturalnych podstaw stabilności i mechanizmu działania).
   1. Zaimportuj wszystkie konformacje struktury do programu MolMol23, aby utworzyć zespół początkowy (Rysunek 14) .
2. Zbadaj zespół, aby określić lokalną stabilność cząsteczki.
   1. Określ wartości RMSD szkieletu i łańcucha bocznego, wybierając kolejne regiony z czterema resztami wzdłuż sekwencji i prosząc program o obliczenie RMSD do najniższej struktury energetycznej lub średniej.
   2. Określ, które regiony cząsteczki wykazują stabilność lokalną (ryc. 15), wykreślając lokalną wartość RMSD w funkcji sekwencji.
   3. Nałóż zespół wzdłuż tego obszaru cząsteczki i użyj tego zespołu do dalszej analizy (ryc. 16).
3. Wybierz konformacje o niskiej energii, które są zgodne z ograniczeniami pochodzącymi z NMR (nienaruszone). Będą one tworzyć “zespół niskoenergetyczny”.
   1. Należy podać liczbę zgodności w zestawie, kryteria ich wyboru oraz wartości RMSD zdefiniowane w kroku 4.6.1.
   2. Jeśli tryb wiązania metalu został już określony, przejdź do następnego kroku. W przeciwnym razie: Przeanalizuj zespół o niskiej energii i określ, które łańcuchy boczne reszt znajdują się w odpowiedniej odległości od siebie, aby móc związać jon metalu. Po ich ustaleniu wróć do kroku 3.3 i ponownie wykonaj analizę, w tym dane dotyczące wiązania miedzi (rysunek 17 dla zespołu i rysunek 18 dla konformisty o niskiej energii).
4. Zbadaj zespół i określ lokalną strukturę drugorzędową w cząsteczce, korzystając z domyślnych parametrów wyszukiwania programu MolMol. Struktury drugorzędowe są utrzymywane przez wiązania wodorowe i wskazują stabilne regiony cząsteczki.
   1. Określ strukturę drugorzędową każdego konformera (rysunek 19).
      1. Utwórz tabelę z procentem konformerów zespołu, które pokazują każdą strukturę drugorzędną.
      2. Określ, czy regiony o strukturze drugorzędowej nakładają się na regiony, które zostały określone jako regiony stabilne przez local-RMSD. Dzieje się tak często.
5. Określ odległości i wiązania wodorowe w cząsteczce.
   1. Zaimportuj zespół do Chimera²⁴.
   2. Użyj Chimery do określenia odległości wewnątrzcząsteczkowych między atomami, co do których istnieje podejrzenie, że wiążą się z metalami. Oblicz średnie odległości w zespole.
   3. Użyj Chimery, aby określić wewnątrzcząsteczkowe wiązania wodorowe w każdym konformerze zespołu (rysunek 20), używając domyślnych parametrów zrelaksowanych wiązań wodorowych (o 20%) programu.
   4. Utwórz tabelę z procentem konformerów zespołu, które pokazują każde wiązanie wodorowe. Wiązania wodorowe, które powtarzają się w większości konformacji, wskazują na stabilne wiązanie, które zwiększa stabilność struktury.
6. Określ oddziaływania elektrostatyczne w cząsteczce.
   1. Zidentyfikuj interakcje między naładowanymi łańcuchami bocznymi.
   2. Utwórz tabelę z procentem konformerów zespołu, które pokazują każdą interakcję elektrostatyczną.
7. Oblicz rozkład potencjału elektrostatycznego za pomocą pola siłowego Amber²⁵ w programie Delphi²⁶.
   1. Z zespołu należy wybrać pojedynczą reprezentatywną konformację, na której zostaną przeprowadzone obliczenia potencjału elektrostatycznego.
   2. Wyprowadź potencjał elektrostatyczny za pomocą równania Poissona-Boltzmana i pełnych obliczeń kulombowskich. Wymagane parametry obejmują siłę jonową roztworu, wartości dielektryczne roztworu (80 dla wody; 40 dla DMSO); peptyd wewnętrzny (zwykle około 5,0); wielkość siatki (zwykle 65’65’65 punktów); oraz minimalna odległość między peptydem a krawędzią siatki (10 A). Wyniki są zwykle dość solidne w odniesieniu do tych wartości, ponieważ główny wynik jest regulowany przez sam peptyd (Rysunek 21).
   3. Zbadaj potencjał elektrostatyczny odwzorowany na powierzchni peptydu Van der Waalsa (rysunek 22).
   4. Zbadaj izopowierzchnie potencjału elektrostatycznego, które opisują pozycje o tym samym potencjale. Znajdź powierzchnie izo, które sugerują znaczenie biologiczne, takie jak rozszerzone powierzchnie dodatnie lub ujemne, które mogą przyciągać lub odpychać inne białka lub ligandy, lub rozkłady, które wskazują na istotność, takie jak dystrybucja amfipatyczna lub plamy o różnych właściwościach (ryc. 23).
8. Zsumuj wszystkie ustalenia strukturalne, aby zobaczyć, jak wzajemnie się wzmacniają.
9. W stosownych przypadkach powtórzyć kroki 4.3–5.7.4.

Representative Results

Discussion

The contribution of structural information to understand binding mechanisms is well-accepted. Peptides are useful as models for protein binding and interactions; however they are not amenable to the main method for structure determination, X-ray crystallography. NMR is particularly useful for these systems, since the structures can be readily solved in solution. This is especially for the case of metallochaperone-mimetics that additionally require structure determination under an inert environment to prevent oxidation of the metal ion.

The MTCSGCSRPG peptide, containing the conserved MT/HCXXC motif, bound Cu (I) as was evident by the significant change of spectrum from the apo-form to the peptide reacted with copper. The need for a ROESY experiment at the field of 600 MHz, due to a spectrum with null interactions in the NOESY spectrum, indicates a compact peptide, since our experience shows that smaller peptides of 6-7 residues fall in the null signal of the NOESY regime, but peptides of this size usually give adequate signal. In the ROESY spectrum 81 cross-peaks were observed, N of these were inter-residue cross-peaks and (81-N) were intra-residue cross-peaks. This is a small number of peaks compared to proteins, but is expected in small peptides; Particularly cyclic peptides, which tend to give a small number of interactions since all the sidechains point outward and undergo little interaction with one another.

As the metal itself cannot be detected directly by the ¹H NMR measurements, one must conclude on the metal binding residues from the distances obtained between suspected donor atoms. To assure a reliable structure, no metal-ligand binding constraints should be added to the initial calculations. Previous studies have shown that forcing metal binding in an incorrect form may still lead to reasonable structural factors even if the structure is incorrect¹⁰.

The experiments gave highly nonviolated conformations in an ensemble of low RMSD. The low RMSD of a potentially flexible peptide lends further support for copper binding, which would reduce the conformational flexibility of the molecule. The RMSD values of the binding region were reduced to values around 0.05 Å, which shows tremendous stabilization as expected by the ring closure. The secondary bend and hydrogen-bonding found in the 3-7 region, also indicated binding in this region.

The negative charge obtained when two thiols bind the copper (I) peptide is offset by the N-terminal amine that was held proximate to the bound copper.

When inspecting the resulting distances between potential donor atoms, including the two cysteine residues and the methionine group, the ones located at positions most probable to bind metal were the sidechains of Cys3 and Cys6. Therefore, binding constraints were added between these residues and the metal center, and the resulting structure was evaluated. To further support the resulting structure, various additional control measurements that include preset bonds to other residues may be performed and the structural factors compared. This is especially important where the result of the model is unexpected. In previous studies using similar measurements using protein-mimetic peptides, unusual binding modes were observed, including methionine instead of cysteine⁷.

Excess copper is toxic to biological systems and copper transport is very tightly controlled. Therefore, it is interesting and mechanistically important to understand how copper is transferred from one protein to another. The transport cannot depend on simple release and acquire mechanism, but must somehow include both stronger and weaker modes of binding, much like how one would transfer an object carefully from the fingers of one hand to another. This type of study provides much information regarding the mechanism of copper binding in biological systems and can be used to further investigate many different aspects of metallochaperone activity in nature. The systems may be easily mutated and manipulated to mimic many different aspects of copper-binding in nature, and may be analyzed without using prior assumptions of the binding mode.

Materials

Avance DMX 600 MHz Spectrometer	Bruker
NMR sample tubes 	Wilmad	535-PP
Glove box	MBraun	LM05-019
Lyophilizer  	VirTis	benchtopK
Peptide	BioChemia	Custom made	>95% purity
Copper (1) chloride	Aldrich	224332
Hydrochloric acid	BioLab	231-595-7
Sodium hydroxide	Gadot	1310-73-2
d<sub>6</sub>-Dimethylsulfoxide	Aldrich	236926
Deuterium oxide	Aldrich	151882