Identyfikacja mutacji DNA w oczyszczonych hematopoetycznych komórkach macierzystych/progenitorowych

Podsumowanie

Tutaj opisujemy test mutagenezy in vivo dla małej liczby oczyszczonych komórek krwiotwórczych przy użyciu transgenicznego modelu myszy LacI. Gen LacI może być wyizolowany w celu określenia częstotliwości, lokalizacji i rodzaju mutantów DNA spontanicznie powstałych lub po ekspozycji na genotoksyny.

Streszczenie

W ostatnich latach stało się jasne, że niestabilność genomu jest ściśle związana z wieloma zaburzeniami rozwojowymi, nowotworami i starzeniem się. Biorąc pod uwagę, że komórki macierzyste są odpowiedzialne za zapewnienie homeostazy i naprawy tkanek przez całe życie, uzasadnione jest postawienie hipotezy, że populacja komórek macierzystych ma kluczowe znaczenie dla zachowania integralności genomowej tkanek. W związku z tym pojawiło się duże zainteresowanie oceną wpływu czynników endogennych i środowiskowych na integralność genomową komórek macierzystych i ich potomstwa, mając na celu zrozumienie etiologii chorób pochodzenia komórek macierzystych.

Myszy transgeniczne LacI noszą odzyskiwalny wektor fagowy kodujący system reporterowy LacI, w którym gen LacI służy jako reporter mutacji. Wynikiem zmutowanego genu LacI jest produkcja β-galaktozydazy, która rozszczepia substrat chromogenny, zmieniając jego kolor na niebieski. System reporterowy LacI jest przenoszony we wszystkich komórkach, w tym w komórkach macierzystych/progenitorowych, i może być łatwo odzyskany i wykorzystany do późniejszego zakażenia E. coli. Po inkubacji zakażonej E. coli na agarozie, która zawiera właściwy substrat, można naciąć blaszki; niebieskie blaszki wskazują na zmutowany gen LacI, podczas gdy przezroczyste blaszki są siedliskiem typu dzikiego. Częstość występowania niebieskich (wśród przezroczystych) blaszek wskazuje na częstość mutacji w pierwotnej populacji komórek, z której wyekstrahowano DNA. Sekwencjonowanie zmutowanego genu LacI pokaże lokalizację mutacji w genie i rodzaj mutacji.

Model myszy transgenicznej LacI jest dobrze znany jako test mutagenezy in vivo. Co więcej, myszy i odczynniki do testu są dostępne w handlu. Tutaj szczegółowo opisujemy, w jaki sposób model ten można dostosować do pomiaru częstości spontanicznie występujących mutantów DNA w komórkach macierzystych wzbogaconych komórkami macierzystymi komórkami macierzystymi Lin-IL7R-Sca-1+cKit⁺⁺(LSK) i innych subpopulacjach układu krwiotwórczego.

Wprowadzenie

W większości tkanek zróżnicowane komórki mają ograniczoną długość życia. Aby zachować integralność funkcjonalną, długowieczne, specyficzne tkankowo komórki macierzyste w sposób ciągły wytwarzają komórki progenitorowe, które z kolei dają początek w pełni zróżnicowanym komórkom wymaganym do funkcjonowania tej konkretnej tkanki. Komórki macierzyste uzupełniają również swój własny przedział w procesie zwanym samoodnawianiem. W ten sposób komórki macierzyste są odpowiedzialne za utrzymanie integralności funkcjonalnej tkanki, w której się znajdują. Dlatego konieczne jest, aby były one wyposażone w solidne mechanizmy wykrywania i potencjalnej naprawy uszkodzonego DNA. Jeśli nie, mogą nabyć wiele zaburzeń genomowych (potencjalnie szkodliwych), które mogą być dziedziczone przez ich potomstwo. Zrozumienie, w jaki sposób komórki macierzyste chronią swój genom podczas życia organizmu, jest ważnym pytaniem i może pomóc nam zrozumieć, dlaczego niestabilność genomu jest powiązana z rakiem i niektórymi innymi chorobami związanymi z wiekiem (przegląd w^1,2).

Kontrolowanie integralności genomowej tkanki na poziomie komórek macierzystych lub wczesnych populacji komórek progenitorowych można osiągnąć poprzez eliminację wadliwych komórek macierzystych (lub progenitorowych) poprzez śmierć komórki, starzenie się lub różnicowanie, i/lub poprzez efektywną naprawę uszkodzonego DNA. Ostatnie badania wykazały, że możliwe jest zmierzenie niektórych rodzajów naprawy DNA bezpośrednio w tych rzadkich populacjach^3-6. Stwierdzono, że np. w układzie krwiotwórczym pęknięcia dwuniciowego DNA mogą być naprawiane przez rekombinację homologiczną (HR) lub niehomologiczne łączenie końców (NHEJ), przy czym ten ostatni jest procesem naprawczym o mniejszej wierności, a tym samym zwiększonym ryzyku popełnienia błędów. Oba są wykorzystywane w hematopoetycznych komórkach macierzystych (HSC)^4,5, jednak u myszy wydaje się, że jest to głównie NHEJ w HSC, podczas gdy wczesne komórki progenitorowe wykorzystują HR⁴. Podobną obserwację poczyniono w odniesieniu do komórek macierzystych w skórze⁶. Co ciekawe, w ludzkich HSC HR, a nie NHEJ, wydaje się być mechanizmem naprawczym z wyboru w przypadku pęknięć podwójnej nici³. Nie wiadomo jeszcze, czy ta funkcjonalna różnica między tymi dwoma gatunkami jest prawdziwa, czy też stanowi jedynie różnicę technologiczną lub eksperymentalną.

Repertuar komórek macierzystych do naprawy uszkodzonego DNA prawdopodobnie obejmuje inne mechanizmy naprawy DNA, takie jak naprawa przez wycinanie zasady (BER), naprawa przez wycinanie nukleotydów (NER) i naprawa niedopasowania (MMR). BER i NER są odpowiedzialne za naprawę zmian jednej lub wielu par zasad w jednoniciowym DNA, podczas gdy MMR naprawia niedopasowania zasada-zasada i pętle insercji/delecji; tego typu uszkodzeń DNA nie mogą być naprawione przez NHEJ lub HR. Na poparcie tego poglądu przemawia kilka badań z zakresu układu krwiotwórczego wykazujących związek między zmianami w jednym z tych szlaków a nieprawidłowościami w przedziale^{HSC 7-9}, a także zwiększone ryzyko rozwoju zespołu mielodysplastycznego^10-16, choroby wywodzącej się z HSC i związanej z rosnącą niestabilnością genomu w miarę postępu choroby¹⁷. Jak dotąd nie zgłoszono pomiarów BER, NER i MMR bezpośrednio w HSC.

Oprócz wyjaśnienia różnych procesów kontrolujących integralność tkanek na poziomie mechanistycznym, konieczne jest możliwość zmierzenia stopnia zmutowanego DNA, aby można było przetestować konsekwencje aberracji w jednym z tych procesów, np. w normalnych kontra genetycznie modyfikowanych komórkach macierzystych lub u starych kontra młodych. Jednak opracowanie odpowiedniego testu jest trudne ze względu na niedostatek komórek macierzystych specyficznych dla tkanek i brak warunków hodowli, które zachowują "macierzystość". Co więcej, taki test powinien być przystosowany do manipulacji środowiskowych i genetycznych. Możliwym rozwiązaniem tych ograniczeń i wymagań jest wykorzystanie modeli mysich, które są specjalnie zaprojektowane do wykrywania mutacji DNA.

Opracowano wiele modeli myszy transgenicznych do wykrywania mutacji. Na przykład transgeniczne myszy LacI ¹⁸ są nosicielami odzyskiwalnego wektora fagowego λ kodującego system reporterowy LacI, w którym gen LacI koduje supresor operatora Lac i służy jako reporter mutacji. Po mutacji genu LacI aktywowany jest operator Lac i wytwarzana jest β-galaktozydaza. β-galaktozydaza rozszczepia chromogenny substrat X-gal (5-bromo-4-chloro-e-indolilo-β-D-galaktopiranozyd), który zmienia kolor na niebieski. Miejsca cos flankujące wektor LacI umożliwiają łatwe odzyskiwanie przez białka fagowe lambda i późniejsze zakażenie E. coli. Po inkubacji zakażonej E. coli na agarozie, która zawiera substrat X-gal, można ocenić płytki nazębne. Niebieskie blaszki zawierają przypuszczalnie zmutowanego faga Lac-I, podczas gdy przezroczyste blaszki są siedliskiem niemutantów. Częstotliwość występowania niebieskich blaszek (wśród tych przezroczystych) wskazuje na częstość mutacji w pierwotnej populacji komórek, z której wyekstrahowano DNA. Co więcej, λ, w którym znajduje się cel LacI, może być łatwo sekwencjonowany przy użyciu technik PCR w celu przeprowadzenia analizy o stosunkowo wysokiej przepustowości. Sekwencjonowanie wielu zmutowanych genów LacI ujawni ważne informacje na temat spektrum mutacji, co z kolei może wskazywać na możliwe braki w określonych szlakach naprawy DNA lub na określone zdarzenia genotoksyczne. System transgeniczny LacI został ustandaryzowany w wielu laboratoriach¹⁹, a odczynniki są dostępne na rynku. Jedną z głównych wad systemu LacI jest ograniczona zdolność do wykrywania dużych delecji lub rearanżacji; dlatego należy zastosować inne metody, np. wielobarwne FISH na spreadach metafazowych, aby uzupełnić ten niedobór.

W wektorze fagowym λ mysiego modelu LacI, znajduje się znacznie mniejszy gen, CII, dostępny do analizy mutacji. Jego rozmiar i fakt, że mutanty mogą być selekcjonowane, sprawiają, że jest to mniej pracochłonny i tańszy test²⁰ niż analiza genu LacI. Jednak gen LacI jest szerzej badany pod kątem mutagenezy²¹, a wrażliwość genu na mutacje została dobrze scharakteryzowana, tak aby można było jasno zrozumieć reszty aminokwasowe, które generują odpowiedź fenotypową na podłożu chromogennym^22-25.

Inne modele myszy do wykrywania mutacji obejmują użycie transgenów ΦX174 lub LacZ. Transgeniczny model myszy ΦX174, z oryginalnym testem mutacji rewersyjnej A:T→G:C²⁶ lub testem mutacji do przodu²⁷, który umożliwia wykrycie spektrum podstawień par zasad, reprezentuje mniej kosztowny system niż model LacI. Jednak badanie przesiewowe mutacji w teście naprzód nie jest trywialne, a spektrum mutacji transgenu ΦX174 nie jest tak dobrze scharakteryzowane jak w przypadku LacI. W modelach mysich przenoszących transgeny LacZ, reporter mutacji LacZ jest odzyskiwany przy użyciu komórek gospodarza E. coli, które są wrażliwe na galaktozę i pożywkę zawierającą galaktozę²⁸. Wadą tego systemu jest to, że odzyskiwanie celu LacZ obejmuje również trawienie endonukleazy restrykcyjnej, a następnie ligację i elektroporację gospodarzy E. coli, co utrudnia dostosowanie systemu do małej liczby komórek. Chociaż nie jest to bezwzględny wymóg do pracy z populacjami komórek macierzystych/progenitorowych (zawsze można zacząć od większej liczby myszy), jeśli wymagana jest duża liczba komórek (np. miliony lub więcej), szybko stanie się to niepraktyczne i zbyt kosztowne. Ponadto, stosunkowo duży rozmiar LacZ, choć zapewnia czuły reporter mutacji, jest kłopotliwy i bardziej kosztowny dla analizy sekwencji DNA i określania widm mutacji. Główną zaletą tego modelu jest jednak jego zdolność do wykrywania dużych delecji i insercji, a także rearanżacji chromosomów.

Ponieważ wszystkie komórki w transgenicznych modelach myszy LacI, ΦX174 i LacZ posiadają system reporterowy, każdy z tych modeli myszy może być użyty do pomiaru mutagenezy w dowolnym typie komórek, w tym w komórkach macierzystych i progenitorowych, o ile mogą być niezawodnie zebrane i w wystarczającej liczbie. Ponieważ mieliśmy duże doświadczenie z mysim modelem LacI i testem mutacji LacI, zdecydowaliśmy się kontynuować badania nad tym systemem w celu analizy mutagenezy w populacjach krwiotwórczych komórek macierzystych i progenitorowych.

Tkanka krwiotwórcza jest dobrze scharakteryzowana pod względem fenotypu powierzchni komórek poszczególnych jej składników, w tym długotrwałych komórek macierzystych, które można zidentyfikować jako niezwykle rzadką populację komórek Lin-IL7R-Sca-1⁺cKit⁺⁺(LSK)/ Flk2-CD150+CD48^- komórek²⁹. Mohrin i wsp.⁴ wykazały, że nieco większa populacja komórek LSK/Flk2^- jest nadal dobrymi przedstawicielami HSC i znacznie różni się od najbardziej prymitywnej populacji zaangażowanych przodków szpiku (CMP), jeśli chodzi o badanie naprawy DNA. Co więcej, gdy komórki LSK wzbogacone w HSC (Flk-2⁺ i Flk-2^-) porównano z Lin-IL7R-Sca-1-cKit⁺⁺ (komórki progenitorowe LS-K), nadal istniała znacząca różnica w zdolności NHEJ5 między mniej czystą, wzbogaconą w komórki macierzyste populacją LSK a komórkami progenitorowymi. W naszym badaniu używamy komórek LSK (Flk-2⁺ i Flk-2^-) wzbogaconych w HSC, ponieważ stwierdziliśmy, że co najmniej 2 x 10⁵ komórek jest wymaganych do spójnych, wiarygodnych wyników w tym teście mutagenezy; ta liczba komórek jest niezwykle trudna do uzyskania, gdy sortuje się populację LSK/Flk2-CD150⁺CD48, a nawet populację LSK/Flk2^- (pod względem myszy, kosztów i praktyczności). Protokół ten, oparty na protokole pierwotnie opracowanym przez Kohlera i wsp.¹⁸ opisuje szczegółowo, w jaki sposób można określić częstość spontanicznych mutacji DNA w komórkach LSK i zdefiniowanych populacjach zróżnicowanych komórek szpikowych, a także nierozdzielonych komórek szpiku kostnego i śledziony.

Protokół

Leukocyty od transgenicznych myszy LacI na tle C57BL/6 nie wykazują ekspresji Sca-1 (Rysunek 1). Dlatego, jeśli Sca-1 jest markerem używanym do oczyszczania komórek, myszy te muszą zostać skrzyżowane z odpowiednim szczepem, aby uzyskać ekspresję Sca-1; w tym protokole zastosowano F1 krzyżówki między zwykłymi myszami C57BL / 6 (B6) i transgenicznymi myszami LacI (C57BL / 6) (LacI) (Figura 1). Spośród populacji komórek użytych w tym protokole, LSK i CMP reprezentują najmniejsze populacje w szpiku kostnym. W celu oczyszczenia co najmniej 2 x 10⁵ każdego rodzaju, należy połączyć szpik od około dziesięciu myszy podczas pobierania szpiku tylko z tylnych nóg lub od co najmniej czterech myszy, gdy używane są również kości biodrowe, przednie, kręgosłup i mostek.

Zrób zawiesiny jednokomórkowe ze szpiku kostnego i śledziony. Niewielka część szpiku kostnego jest wykorzystywana w niezmienionej postaci, większość jest wykorzystywana do oczyszczania LSK i zróżnicowanych mieloidalnych komórek progenitorowych, tj. CMP i granulocytarnych/monocytowych komórek progenitorowych (GMP) poprzez sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Izolacja komórek szpiku kostnego i oczyszczanie tych populacji metodą FACS jest opisane w innym miejscu^30-32. Potrzeba około sześciu niezależnych sortów, aby zidentyfikować znaczące różnice w częstości mutacji między populacjami.

Poniższy protokół pomiaru częstości spontanicznych mutacji in vivo w oczyszczonych subpopulacjach krwiotwórczych jest zaadaptowany z kilku instrukcji obsługi Stratagene^33-35, opartych na oryginalnej pracy Kohlera i wsp.^{Rozdział 18} Najbardziej krytyczne różnice między istniejącymi protokołami^33-35 a tym protokołem, wymagane przy użyciu stosunkowo niewielkiej liczby komórek, obejmują różnice w objętościach odczynników oraz czasie i temperaturach stosowanych do inkubacji proteinazy K.

1. Przechowywanie próbek

Po zebraniu pożądanych populacji komórek, podziel komórki na 1-mililitrowe probówki wirówkowe (liczba komórek na podwielokrotność, patrz Tabela 1). Wirować przy 266 x g przez 7 minut, w temperaturze 4 °C. Ostrożnie zassać supernatant. Umieść probówki w ciekłym azocie na 5 minut, a następnie przenieś je do zamrażarki o temperaturze -80 °C w celu dalszego użycia. Próbki mogą być przechowywane przez co najmniej 6 miesięcy.

2. Izolacja genomowego DNA

1. Próbki pobiera się z zamrażarki w temperaturze -80 °C. Dodać 500 μl lodowatego buforu do lizy DNA (Tabela 3) do probówki z próbką. Wiruj rurki przez 3-5 sekund na średniej prędkości i umieść rurki na lodzie na 10 minut.
2. Odwirowywać probówki przez 12 minut, 4 000 x g, 4 °C. Ostrożnie wyrzucić ~450 μl supernatantu. Obracaj rurkę przez 3-5 sekund. Użyj szklanej rurki kapilarnej, aby ostrożnie usunąć pozostałą część supernatantu. Wysusz wewnętrzne ścianki rurki na powietrzu, aż nie będą już widoczne kropelki (~2 min).
3. Dodać 2 μl koktajlu rybonukleazy RNace-It i 10 μl 1 M DTT do 100 μl buforu do trawienia DNA (Tabela 3). Dostosuj objętości w zależności od liczby próbek, które będą przetwarzane; Wymagane jest 20 μl tego roztworu do wytrawiania DNA na próbkę. Po dodaniu 20 μl tego do osadu komórkowego postaraj się, aby osad odczepił się od dna, delikatnie stukając palcem lub długopisem w rurkę.
   Uwaga: może być trudno zobaczyć pastylkę ze względu na małą liczbę komórek.
4. Dodać 20 μl roztworu proteinazy K* (Tabela 3) do każdej próbki, bardzo delikatnie ponownie postukać w probówkę.
   *Uwaga: roztwór proteinazy K należy podgrzać w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C, 2 minuty przed użyciem w celu aktywacji enzymu.
5. Natychmiast umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C. Strawić próbkę zgodnie z wytycznymi zawartymi w tabeli 1. Postukaj w rurkę bardzo delikatnie co 10 minut.
   Uwaga: Przy tak małej liczbie komórek, temperatura łaźni wodnej i czas trawienia są absolutnie krytyczne dla pomyślnego uzyskania wysokiej jakości genomowego DNA.
6. Przygotować system dializy DNA w chłodni (ryc. 2). Wlać 600 ml buforu TE (Tabela 3) do szklanej zlewki o pojemności 600 ml, dodać małe mieszadło magnetyczne, tak aby bufor mógł być mieszany podczas dializy i pozwolić membranom (o wielkości porów 0,025 mM) unosić się na powierzchni buforu. Jedna membrana na próbkę; W jednej zlewce do dializy można zastosować 1-4 membrany. Na brzegu membrany należy zaznaczyć nożyczkami w celu identyfikacji każdej próbki.
7. Po odpowiednim czasie trawienia, ostrożnie dodaj teraz bardzo lepkie genomowe DNA* do środka pływającej błony (ryc. 2). Natychmiast przykryj zlewkę folią aluminiową. Dializować genomowe DNA w temperaturze 4 °C przez ~16-20 godzin, delikatnie wymieszać bufor.
   *Uwaga: Podczas pracy z lepkimi roztworami DNA należy używać końcówek do pipet z szerokim otworem.
8. Następnego dnia wlać 600 ml świeżo przygotowanego buforu TE (tabela 3) do czystej szklanej zlewki i bardzo ostrożnie przenieść membrany do nowej zlewki łyżką, a następnie przykryć zlewkę folią. Dializuj przez kolejne 2 godziny.
9. Usunąć membranę dializacyjną ze zlewki z buforem TE za pomocą łyżki i przenieść tylko najbardziej lepką "grudkę" roztworu DNA do nowej, sterylnej probówki o pojemności 1 ml. Przechowywać próbkę w temperaturze 4 °C. Kontynuować test mutagenezy następnego dnia lub do 1,5 miesiąca później. W przypadku oczyszczonych populacji odczekaj co najmniej 1 tydzień.

3. Przygotowanie tacek do hodowli E. coli/fagów (Dzień 1)

Każda taca będzie zawierała dwie różne warstwy; warstwę agaru na dole i warstwę agarozy na górze, która zawiera X-gal. Roztwór E. coli/faga zostanie dodany do tego ostatniego. Liczba i rodzaj izolowanych komórek określi, ile tac będzie wymaganych. Zapoznaj się z Tabelą 1, aby obliczyć liczbę potrzebnych tacek i wynikające z nich ilości roztworów dla tej części protokołu. Poniższe wygeneruje ~60 tacek, które jedna doświadczona osoba może łatwo przetworzyć.

1. Przygotuj następujące nośniki:
   1. na dolną warstwę przygotować 6 kolb o pojemności 2 l, z których każda zawiera 1 600 ml ddH₂O. Dodać proszek NZY (21 g/l) i agar (15 g/l); dobrze wymieszać.
   2. Na wierzchnią warstwę przygotować 4 kolby o pojemności 1 l, z których każda zawiera 800 ml ddH₂O. Dodać proszek NZY (21 g/l) i agarozę (7,2 g/l); dobrze wymieszać.
   3. do hodowli E. coli dodać 2,5 g proszku NZY do każdej z kolb o pojemności 250 ml i doprowadzić objętość do 100 ml za pomocą ddH₂O;
   4. w przypadku tacek potwierdzających używanych w kroku 8 dodać 8,4 g proszku NZY i 6 g agaru do kolby o pojemności 1 l i doprowadzić objętość do 400 ml za pomocą ddH₂O.
2. Przykryj otwór kolb folią aluminiową. Dobrze wymieszaj i sterylizuj je w autoklawie w temperaturze 121 °C, 15 psi przez 30 min.
3. Wyjąć kolby (BARDZO GORĄCE!) z autoklawu. Ostrożnie zamieszać kolby, aby wymieszać agar i agarozę, a następnie umieścić je w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C. Gdy łaźnia wodna ponownie osiągnie temperaturę 50 °C, wlać z kolb o pojemności 2 litrów (krok 3.1.1) ~150 ml agaru NZY do każdej tacki (dolna warstwa).
4. Pozostaw agar do zastygnięcia w temperaturze pokojowej przez co najmniej 2 godziny, a następnie odwróć i otwórz tace. Umieść spód tac na pokrywie, 45° od środka (Rysunek 3) i pozostaw do wyschnięcia na 30 minut. Zamknij tace i pozostaw O/N w pozycji RT.
5. W międzyczasie przygotuj kulturę SCS-8 E. coli na następny dzień. Z jednej z dwóch kolb o pojemności 250 ml* (krok 3.1.3) pobrać 5 ml bulionu NZY (Tabela 3) i przenieść do sterylnej probówki o pojemności 14 ml. Uzupełnij 62,5 μl roztworu maltozy/_MgSO4 i dodaj 10 μl bulionu SCS-8 E. coli glicerolu. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3-4 godziny, wstrząsając z prędkością 250-300 obr./min. Użyj 15 μl tej kultury do zaszczepienia 95 ml bulionu NZY (w kolbie bocznej o pojemności 250 ml), hodowli O/N w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem (250-300 obr./min).
   *Uwaga: druga kolba o pojemności 250 ml może być użyta później do dostosowania średnicy zewnętrznej hodowli, jeśli to konieczne (krok 4.1)
6. Weź 1 litrową kolbę z agarem (krok 3.1.4) i wlej ~6-7 ml agaru NZY do szalek o średnicy 60 mm (to wystarczy na ~50 szalek, potrzebnych do kroku 8). Pozwól agarowi stwardnieć (~10 min), a następnie odwróć i zawiń w folię. Naczynia te można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do miesiąca.

4. Przygotowanie tacek do hodowli E. coli/fagów (Dzień 2)

1. Sprawdź średnicę zewnętrzną kultury SCS-8 E. coli (krok 3.5) na spektrofotometrze. Wyreguluj OD₆₀₀ do 0,6 za pomocą bulionu NZY (Tabela 3) (krok 3.1.3) i umieść kolbę na lodzie, aby zatrzymać wzrost i trzymaj na lodzie, aż będzie gotowa do użycia. Zostanie to użyte w krokach 6.3 i 8.2. Kultura ta może być przechowywana przez 5 dni w temperaturze 4 °C.
2. Wysuszyć na powietrzu wszystkie tacki testowe (wylane dzień wcześniej) przez ~5 godzin (ryc. 3).

5. Pakowanie genomowego DNA (Dzień 2; Ciąg dalszy)

1. Wyjąć wymaganą liczbę pomarańczowych probówek do transpakowania z zamrażarki o temperaturze -80 °C i umieścić je na suchym lodzie, aż będą gotowe do użycia; pobrać jedną pomarańczową probówkę do transpakowania na każdą reakcję pakowania, która ma zostać przeprowadzona. Oznacz odpowiednio każdą tubę. Przygotuj próbki genomowego DNA (krok 2.9) na lodzie.
2. Ten krok należy wykonywać po jednej probówce na raz. Zakończ cały krok, zanim przejdziesz do następnej próbki DNA. Rozmrozić jedną pomarańczową rurkę*^Uwaga1 szybko: użyj palców, aż większość z niej się rozmrozi, a następnie połóż na lodzie. Pobrać odpowiednią próbkę genomowego DNA i natychmiast przenieść próbkę o objętości 8-12 μl *^{uwaga 2,3} do pomarańczowej probówki. Wymieszaj zawartość, delikatnie pipetując 3 razy w górę i w dół, a także delikatnie stukając palcem w probówkę. Staraj się nie wprowadzać bąbelków podczas mieszania. Umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 30 °C na 90 min.
   *Uwaga 1: może być konieczne szybkie odwirowanie w mikrowirówce, aby zebrać całą zawartość z wewnętrznych ścianek i nakrętki.
   *Uwaga 2: objętość dodanej próbki zależy od liczby komórek użytych do wytworzenia tej próbki: 11-12 μl próbek przygotowanych z komórek 2,0-5,0 x 10⁵; 10 μl próbek^{6-komórkowych} 1,0 x 10 i 8 μl próbek 1,5 x 10^{6-komórkowych}.
   *Uwaga 3: DNA jest nadal bardzo lepkie; Aby wyjąć DNA, dociśnij końcówkę pipety do dna probówki z próbką i ostrożnie przekręć końcówkę o wewnętrzną ściankę probówki.
3. Wyjmij 1 lub 2 niebieskie probówki Transpack* z zamrażarki o temperaturze -80 °C i umieść je na suchym lodzie do dalszego użycia. Szybko je rozmrozić i przenieść 12 μl do każdej z pomarańczowych probówek. Wymieszaj roztwór, delikatnie pipetując go 3 razy w górę i w dół. Obracaj probówkę w dół przez 2-3 sekundy, a następnie postukaj w probówkę palcem w celu dalszego mieszania i natychmiast włóż ją z powrotem do łaźni wodnej o temperaturze 30 °C na kolejne 90 minut
   *Uwaga: Użyj 1 niebieskiej probówki na 5-6 reakcji i 2 niebieskich probówek na 10-12 reakcji.
4. Po 90 minutach każdą reakcję rozcieńczyć 970 μl buforu SM* (Tabela 3), aby zatrzymać reakcję i wirować ze średnią prędkością przez 5 sekund. Umieścić probówki na lodzie do dalszego użycia.
   *Uwaga: jeśli liczba komórek wynosi ≤ 5 x 10⁵, należy użyć 500 μl buforu SM (Tabela 3), aby zatrzymać reakcję; 2 probówki (z tej samej próbki) można następnie połączyć (krok 6.4).

6. Posiewanie upakowanego genomowego DNA (Dzień 2; Ciąg dalszy)

1. Zamknij odwrócone tacki na agar, które zostały otwarte do suszenia rano. Oznacz tacki dla każdej próbki.
2. Rozpuścić 4,8 g X-gal w 16,8 ml N, N-dimetyloformamidu (potrzebne dla kroku 6.5). Natychmiast wymieszaj i umieść na platformie do wytrząsania. Chronić przed światłem. Roztwór powinien być klarowny w ciągu 20-30 minut.
3. Podwielokrotnić komórki SCS-8 E. coli. Do każdego zestawu tacek* użyj jednej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Oznacz probówkę nazwą zapakowanej próbki DNA. Dodać 2 ml zawiesiny E. coli na każdą tackę.
   * Uwaga: Na przykład 3 x 10⁵ GMP wymaga zestawu 8 tac (patrz Tabela 1). Tak więc dwie porcje wymagają 8 x 2 = 16 tac. Przechowywać podwielokrotności oddzielnie i w ten sposób przygotować dwie probówki o pojemności 50 ml, z których każda zawiera 8 x 2 = 16 ml zawiesiny E. coli.
4. Dodać 1 ml* zapakowanej próbki DNA (z kroku 5.4) do odpowiedniej probówki o pojemności 50 ml zawierającej podwielokrotność SCS-8 E. coli i dobrze wymieszać. Mieszaninę E. coli/inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem (250-300 obr./min), w temperaturze 37 °C przez 23 min.
   *Uwaga: Jeśli DNA zostało wyekstrahowane z ≤ 5 x 10⁵ komórek, do zatrzymania reakcji użyto 500 μl buforu SM (krok 5.4). Na tym etapie probówki można połączyć i dodać do jednej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
5. Gdy mieszanina E. coli / faga jest w inkubacji, rozpocznij przygotowania do wierzchniej warstwy agarozy. Dodać 5 ml roztworu X-gal/N, N-dimetyloformamidu (etap 6.2) do każdej kolby o pojemności 800 ml roztworu agarozy warstwy wierzchniej (z etapu 3.1.2; utrzymywanego w temperaturze 50 °C). Końcowe stężenie X-gal wyniesie 1,5 mg/ml. X-gal może się trochę wytrącić po dodaniu do agarozy. Zamieszać, aby rozpuścić X-gal i włożyć butelkę z powrotem do łaźni wodnej o temperaturze 50 °C.
6. Wyjąć mieszaninę E. coli/z inkubatora (krok 6.4). Każda próbka wymaga wielu tacek; każda taca wymaga 50 ml roztworu X-gal/agarozy (krok 6.5). Wlać wymaganą objętość X-gal/agarozy dla każdej próbki (tj. 50 ml x liczba tacek) do większej sterylnej plastikowej butelki i dodać odpowiednią mieszaninę E. coli/. Zakręć butelką, aby wymieszać. Podzielić mieszaninę na porcje po 45-50 ml w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Liczba probówek powinna być taka sama, jak liczba tacek wymaganych dla danej próbki.
   Uwaga: Pozostały roztwór X-gal/agarozy zostanie użyty w kroku 8.3. Roztwór można przechowywać w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C do czasu dalszego użycia.
7. Wlać 50 ml górnej mieszaniny agarozy na dolną połowę tacki do oznaczania. Szybko rozprowadź agarozę, lekko przechylając tackę testową w jednym kierunku.
   Uwaga: agaroza bardzo szybko ostygnie i nie będzie można jej rozłożyć na tacy. Dlatego ten etap musi być wykonany stosunkowo szybko i z agarozą, która była utrzymywana w temperaturze 50 °C.
8. Pozwól górnej części agarozy stwardnieć przez co najmniej 15 minut. Następnie odwróć i otwórz tacki testowe, aby pozostawić je do wyschnięcia na powietrzu przez 30 minut (Rysunek 3).
9. Zamknij tace, inkubuj tacki testowe odwrócone (dolna warstwa agaru na górze) w temperaturze 37 °C przez 15-16 godzin. Nie układaj więcej niż 5 tacek.

7. Określenie przypuszczalnej częstości występowania mutacji (Dzień 3)

1. Wyjąć tacki z inkubatora w temperaturze 37 °C i pozostawić do ostygnięcia. Policz półprzezroczyste jednostki tworzące płytkę nazębną (PFU) na każdej tacy; losowo wybierz 2 miejsca na tacach, narysuj kwadrat* o wymiarach 2,5 x 2,5 cm² lub 5 x 5 cm² i policz wszystkie PFU w każdym kwadracie za pomocą licznika komórek oznaczających (Rysunek 4A, B).
   *Uwaga: Aby narysować kwadrat, użyj urządzenia, jak pokazano na rysunku 5. Jeśli liczba zliczonych PFU wynosi ≥40, użyj mniejszego kwadratu, w przeciwnym razie użyj większego.
2. Weź średnią z policzonych kwadratów i pomnóż przez 96, jeśli liczysz z mniejszym kwadratem; lub pomnóż tę liczbę przez 24, jeśli liczysz z dużym. Dodać liczbę PFU zliczonych dla wszystkich tacek z tej samej próbki. Jest to łączna liczba PFU wygenerowanych dla tej próbki.
3. Następnie policz zmutowane blaszki na każdej tacy. Tace już ostygły, co pomoże zlokalizować zmutowane blaszki. Aby jeszcze bardziej ułatwić dostrzeżenie niebieskich tabliczek, przesuń tacę po czerwonej i/lub białej powierzchni; Dobrze sprawdzają się arkusze czerwonego i białego papieru. Zakreśl dowolną niebieską tabliczkę markerem. Zapisz kształt i intensywność niebieskiego koloru każdego mutanta (np. pełny, okrąg, sektor; Rysunek 4C)^{Lokal mieszkalny 36,37}.
4. Określić przypuszczalną częstość występowania mutacji dla każdej próbki, dzieląc liczbę zmutowanych PFU (krok 7.3) przez całkowitą liczbę PFU (krok 7.2).

8. Weryfikacja domniemanych tabliczek mutantów (Dzień 3-5)

1. Za pomocą pipety Pasteura wydrążyć każdy zmutowany (niebieski) PFU i przenieść zatyczkę do 250 μl sterylnego buforu SM (Tabela 3). Dodać 25 μl chloroformu, wirować przez 5 sekund i przechowywać w temperaturze 4 °C, aby kontynuować następnego dnia lub pozostawić na 2 godziny w temperaturze pokojowej przed kontynuacją następnego kroku, aby sprawdzić, czy zmutowany PFU jest rzeczywiście mutantem. Próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 1 rok.
2. Oznaczyć jedną sterylną probówkę o pojemności 1 ml i jedną 4 ml dla każdego mutanta, który został podłączony. W nowej probówce o pojemności 1 ml rozcieńczyć zawieszony uwolniony z korka agarowego (krok 8.1) w stosunku 1:50 w sterylnym buforze SM (2 μl próbki do 100 μl buforu SM (Tabela 3)), krótko odwirować, odstawić na bok. Do sterylnej probówki o pojemności 4 ml dodać 200 μl kultury E. coli SCS-8 (z kroku 4.1) i 2 μl rozcieńczonego faga z odpowiedniej probówki o pojemności 1 ml, inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-10 min.
3. Dodać 2,5 ml górnej agarozy zawierającej X-gal (pozostałość z kroku 6.6) do każdej probówki o pojemności 4 ml, zakręcić probówkę do wymieszania i wylać na 60-milimetrową płytkę agarową NZY, która została wcześniej wylana (krok 3.6). Pozostawić na 10 minut (aby górna część agarozy zastygła), odwrócić naczynie i inkubować O/N w temperaturze 37 °C.
4. Następnego ranka wyjmij szalkę z inkubatora i określ proporcję niebieskich PFU na każdej szalce (ryc. 6). Gdy 70% lub więcej PFU jest niebieskich, mutant jest uważany za potwierdzony^38,39. Wydrążyć zmutowaną płytkę nazębną z naczynia i umieścić w 1,5 ml zakręcanej probówce, zawierającej 250 μl buforu SM (tabela 3) i 25 μl chloroformu; Jest teraz gotowy do sekwencjonowania.
5. Gdy 50% lub mniej PFU jest niebieskie, nie jest uważane za prawdziwego mutanta^38,39. Gdy częstotliwość występowania niebieskich PFU wynosi od 60 do 70%, sprawdź ponownie w uwagach dotyczących kształtu płytki; jeśli kształt PFU był "pełny", przystąp do sekwencjonowania.

9. Sekwencjonowanie mutacji w LacI Genenie

1. Ustaw reakcje PCR w objętości reakcyjnej 25 μl, w tym 1,5 μl supernatantu płytki nazębnej (matryca, krok 8.4), starter do przodu SF1 (5'-GGAAACGCCTGGTATCTT-3') i starter odwrotny SR2 (5'-GCCAGTGAATCCGTAATCA-3'). Użyj zestawu polimerazy Taq z przedłużaczem PCR zgodnie z instrukcjami producenta. Warunki cyklu są następujące: 94 °C przez 2 minuty, następnie 35 cykli po 94 °C przez 20 sekund, 60 °C przez 20 sekund, 72 °C przez 2 minuty, a następnie końcowy krok 72 °C przez 5 minut.
2. Weź 5 μl podwielokrotności każdej reakcji i uruchom na 0,8% żelu agarozowym, aby potwierdzić amplifikację.
3. Oczyść reakcje PCR za pomocą zestawu czyszczącego Augencourt zgodnie z instrukcjami producenta.
4. Określ ilościowo matrycę DNA.
5. Użyj ~ 100 ng produktu PCR jako matrycy DNA do sekwencjonowania. Sekwencjonuj amplikony w obu kierunkach przy użyciu tych samych starterów PCR, co startery sekwencjonowania (patrz wyżej).
6. Zbierz sekwencje i dopasuj je do sekwencji referencyjnej^{LacI 40}, aby wykryć mutacje.

Wyniki

Test mutagenezy in vivo mierzy rzadkie zdarzenie (zmutowane PFU) wśród wielu zdarzeń (wszystkie PFU). Wykonując test na małej liczbie komórek, możliwe jest, że wynik fałszywie dodatni i fałszywie ujemny ma znaczący wpływ na wynik. Aby rozwiązać ten problem, przeprowadziliśmy eksperyment z seryjnym rozcieńczaniem niefrakcjonowanych komórek szpiku kostnego, pobranych od trzech różnych zwierząt. Zmierzyliśmy częstość mutacji w szpiku kostnym tych zwierząt za pomocą komórek 1,4 x 10⁶, 7,0 x 10⁵...

Dyskusja

Test mutagenezy in vivo opisany w niniejszym dokumencie opiera się na transgenicznym modelu myszy LacI , pierwotnie wygenerowanym przez Kohlera i wsp.¹⁸ Model ten wykorzystuje wektor fagowy λ przenoszący gen reporterowy lacI . Dwa miejsca cos otaczające wektor pozwalają na stosunkowo proste odzyskanie, a następnie upakowanie w zakaźne cząstki fagowe, używane do infekowania E. coli. Niebieska blaszka zostanie wygenerowana przez zakażone fagami E. coli

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
LacI myszy transgeniczne	DNA BioReliance Corporation
RecoverEase, w tym koktajl rybonukleazy RNace-It	Agilent Technologies (Stratagene)	720202
Ekstrakt opakowaniowy Transpack, w tym pomarańczowe i niebieskie probówki transpack oraz SCS-8 E. coli	Agilent Technologies (Stratagene)	200221
Standardy wielkości DNA – drabinka lambda	Bio Rad	170-3635
0,025 mM Membrany o wielkości porów	Fisher (Millipore)	VSWP 025 00
245 mm2 Naczynia do testów biologicznych (tace)	Fisher (Corning)	07-200-600
Bulion NZY (proszek)	Fisher (Teknova)	N1144
Agar	Fisher	BP1423-500
Agaroza	Fisher	E-3120-500
N,N-dimetyloformamid	Fisher	AC34843-5000
X-gal	Research Products Intl Corp (RPI)	B71800-10.0
Proteinaza K	Roche	3-115-852
Przedłużacz PCR Zestaw polimerazy Taq	5 PRIME	2200500
Zestaw do czyszczenia Agencourt AMPure XP	Beckman/Coulter	A63880