Artykuł metodologiczny

Profilowanie zawartości triacyloglicerydów w lipidach powłokowych nietoperzy za pomocą preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej i spektrometrii mas MALDI-TOF

23.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50757

⸱

5 września 2013

 ,  , 
1Graduate Program of Environmental Science, Arkansas State University, 2Department of Biological Sciences, Arkansas State University, 3Arkansas Biosciences Institute and College of Agriculture and Technology, Arkansas State University

W tym artykule

Podsumowanie

Powłoka ssaków zawiera lipidy ekstrahowane rozpuszczalnikiem, które mogą dostarczyć składu chemicznego charakterystycznego dla poszczególnych gatunków. W pracy przedstawiono rutynową metodę rozdzielania szerokich klas lipidów izolowanych z tkanek powłokowych za pomocą chromatografii cienkowarstwowej i oznaczania profilu triacyloglicerydów za pomocą spektrometrii mas czasu przelotu desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą.

Streszczenie

Powłoka ssaków obejmuje gruczoły łojowe, które wydzielają oleisty materiał na powierzchnię skóry. Produkcja sebum jest częścią wrodzonego układu odpornościowego, który chroni przed drobnoustrojami chorobotwórczymi. Nieprawidłowa produkcja sebum i skład chemiczny są również objawem klinicznym określonych chorób skóry. Sebum zawiera złożoną mieszaninę lipidów, w tym triacyloglicerydy, która jest specyficzna dla gatunku. Szerokie właściwości chemiczne wykazywane przez różne klasy lipidów utrudniają precyzyjne określenie składu sebum. Techniki analityczne lipidów zazwyczaj wymagają derywatyzacji chemicznej, która jest pracochłonna i zwiększa koszty przygotowania próbki. W tym artykule opisano, jak ekstrahować lipidy z powłoki ssaków, oddzielać szerokie klasy lipidów za pomocą chromatografii cienkowarstwowej i profilować zawartość triacyloglicerydów za pomocą spektrometrii mas czasu przelotu wspomaganej matrycą laserową. Ta solidna metoda umożliwia bezpośrednie określenie profili triacyloglicerydów wśród gatunków i osobników i może być łatwo zastosowana do każdej grupy taksonomicznej ssaków.

Wprowadzenie

Tkanki powłokowe ssaków obejmują naskórek, struktury rogowe (np. włosy i paznokcie) oraz gruczoły zewnątrzwydzielnicze. Gruczoły zewnątrzwydzielnicze typu łojowego są związane z mieszkami włosowymi, które są zbiorczo określane jako jednostka łojowo-łojowa1. Gruczoły łojowe uwalniają na powierzchnię skóry tłusty wysięk zwany sebum. Sebum składa się głównie z glicerolipidów (np. triacyloglicerydów [TAGs]), wolnych acylów tłuszczowych (FFA), estrów sterolu/wosku i skwalenu. Skład chemiczny sebum jest specyficzny dla gatunku2. Oprócz tego, że są częścią wrodzonego układu odpornościowego i zapewniają funkcję przeciwbakteryjną3, lipidy łojowe wpływają na ważne procesy fizjologiczne, w tym utratę wody przez parowanieprzez skórę 4, integralność komórkowąi regulację genów5 oraz wchłanianieleków6. Kompozycje lipidowe łoju mogą również służyć jako markery choroby. Zmienione proporcje i ilości szerokich klas lipidów łojowych są objawami klinicznymi chorób takich jak trądzik pospolity7, łupież8, łojotokowe zapalenie skóry8, asteatoza9 i inne10. Tkanki naskórka i włosa obejmują zmienne profile zawierające sterole i pochodne, TAGs, FFA, ceramidy, fosfolipidy i inne drobne składniki lipidowe. Ponieważ lipidy powłokowe mogą funkcjonować w procesach chorobowych, określenie różnic w składzie chemicznym TAG między osobami zdrowymi i chorymi może być przydatne w klinicznej diagnostyce choroby.

Lipidy są ogólnie definiowane jako nierozpuszczalne w wodzie związki organiczne z podstawnikami niepolarnymi lub niepolarnymi11. Struktury lipidowe mogą być długimi łańcuchami węglowodorowymi, utlenionymi alkanami (w tym estrami wosku, FFA, alkoholami, ketonami i aldehydami) lub złożonymi strukturami pierścieniowymi, takimi jak cholesterol12. Istnieje osiem głównych klas lipidów w zależności od struktury (FFA, glicerolipidy [GL], glicerofosfolipidy [GP], sfingolipidy [SP], lipidy steroli [ST], lipidy prenolowe [PR], sacharylipidy [SL] i poliketydy [PK]), które wykazują szeroki zakres właściwości chemicznych w zależności od klasy13. Ze względu na duże zróżnicowanie właściwości chemicznych klas lipidów pożądane jest bezpośrednie profilowanie bez uprzedniej derywatyzacji cząsteczek lipidów. Jedną z nowych metod w badaniach lipidów jest chromatografia cienkowarstwowa (TLC) połączona ze spektrometrią mas czasu przelotu z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-TOF MS)14.

MALDI-TOF MS jest szeroko stosowany w badaniach proteomicznych do identyfikacji białek i kojarzenia ich z określonymi sekwencjami aminokwasów dzięki bardzo dokładnym "odciskom palców" masy jonów peptydowych generowanym z białek trawionych trypsyną15. MALDI-TOF MS może być również stosowany do profilowania innych klas biomolekuł, w tym lipidów, takich jak TAGs16-18. MALDI wymaga użycia matrycy, zazwyczaj związku organicznego, który zawiera aromatyczne i sprzężone struktury podwójnych wiązań. Cząsteczki matrycy służą do delikatnego przenoszenia energii lasera do analitów, wspomagania przenoszenia protonów i wytwarzania pojedynczo naładowanych jonów fazy gazowej19-21. Jony są poddawane działaniu pola wysokiego napięcia w wysokiej próżni i przyspieszane do analizatora mas TOF, gdzie jony są następnie rozdzielane przez różnice prędkości, które są proporcjonalne do ich stosunku masy do ładunku. Nawet bardzo duże biomolekuły mogą być jonizowane z niewielką fragmentacją, wytwarzając pojedynczo naładowane cząsteczki jonów w celu uproszczenia analizy widma. Możliwość bezpośredniej analizy cząsteczek lipidów bez uprzedniej derywatyzacji przyczyniła się do szybkiego przyjęcia MALDI-TOF MS w badaniach lipidomicznych18.

Ten artykuł przedstawia rutynową metodę izolowania i analizy lipidów powłokowych z włosów, wydzielin łojowych i plagiopatagium nocka czerwonego (Lasiurus borealis). Służy to do określenia międzygatunkowych zmian lipidów powłokowych nietoperzy w celu wyjaśnienia procesu chorobowego zespołu białego nosa (WNS)22. WNS jest chorobą grzybiczą nietoperzy i jest wywoływana przez nowo opisany gatunek psychrofilny Geomyces destructans23-25. WNS spowodował śmierć ponad 5 milionów nietoperzy jaskiniowych w Ameryce Północnej i grozi wyginięciem wrażliwych gatunków nietoperzy, z potencjalnymi skutkami ekonomicznymi w postaci miliardów dolarów szkód dla przemysłu rolniczego26,27. Aby zbadać etapy infekcji G. destructans, lipidy wyekstrahowano z tkanek włosów i skrzydeł wschodnich czerwonych nietoperzy i rozdzielono na szerokie klasy lipidów za pomocą TLC, aby wyizolować frakcję TAG do późniejszej analizy przez MALDI-TOF MS. TAGs zawierają krótkie łańcuchy acylowe i są łatwo wykrywalne przez MALDI-TOF MS z niewielką ingerencją macierzy.

Protokół

UWAGA: Uzyskaj z wyprzedzeniem wszystkie wymagane pozwolenia stanowe i federalne na obchodzenie się, transport i przechowywanie nietoperzy. Zgody należy również uzyskać od instytucjonalnego komitetu ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania, a także od instytucjonalnego komitetu ds. bezpieczeństwa biologicznego. W przypadku kontaktu z żywymi nietoperzami (lub tkankami układu nerwowego) osoby zajmujące się zwierzętami powinny być zaszczepione przeciwko wściekliźnie. Nietoperze użyte w obecnym badaniu zostały zebrane z Ozark St. Francis National Forest, AR, latem 2010 r. zgodnie ze standardowymi metodami (zatwierdzenie Instytucjonalnego Komitetu Bezpieczeństwa Biologicznego Uniwersytetu Stanowego Arkansas # 135349-1)28.

1. Leczenie tkanek i ekstrakcja lipidów

  1. Oczyść wszystkie narzędzia metanolem przed i między pobraniem tkanek od różnych osób. Przyciąć włosy (ok. 1,0 g) ze skóry nożyczkami i umieścić w kolbie Erlenmeyera o pojemności 125 ml. Pobrać próbkę sebum z powierzchni skrzydła, szorując skórę 4-6 wacikami zwilżonymi rozpuszczalnikiem chloroform:metanol (C:M; 3:2 v/v) i umieścić je w osobnej kolbie.
  2. Ekstrahować tkankę za pomocą 10 ml C:M (2:1 v/v) zawierającego 0,5% butylowanego hydroksytoluenu (BHT), aby zapobiec utlenianiu29. Używaj wyłącznie rozpuszczalników o jakości HPLC.
  3. Po 2 godzinach dodać około 0,5 g bezwodnego siarczanu do każdej kolby, krótko wymieszać i zebrać rozpuszczalnik, filtrując przez bibułę filtracyjną.
  4. Powtórz kroki 1.2 i 1.3 dwukrotnie. Raz z 1:1 C:M i sekwencyjnie z 1:2 C:M. Basen filtruje się razem.
  5. Odparować połączone filtraty pod strumieniemN2, oznaczyć suchą masę i rozpuścić pozostałość lipidową w stosunku 3:2 C:M (z 0,5% BHT) do stężenia 10 mg/ml. Próbkę przechowywać w szklanych fiolkach w temperaturze -20 °C. Ogólnie rzecz biorąc, najlepiej jest analizować próbki w ciągu jednego miesiąca po pobraniu próbki i zminimalizować cykle zamrażania i rozmrażania.

2. Separacja lipidów metodą preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej

  1. Przygotuj wcześniej przemyte rozpuszczalnikiem probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, napełniając je roztworem o temperaturze 3:2 C:M, spłukując acetonem i susząc na powietrzu. Ma to na celu usunięcie plastyfikatorów, które mogą zakłócać późniejszą analizę spektrometrii mas. Probówki z próbkami należy przechowywać w pojemniku bezpyłowym i obchodzić się z nimi wyłącznie w rękawiczkach, aby zapobiec zanieczyszczeniu olejkami skórnymi.
  2. Aktywuj płytkę TLC, najpierw wstępnie ją rozwijając w stosunku 3:2 C:M. Dodaj wystarczającą ilość rozpuszczalnika do komory TLC na głębokość 1 cm, a następnie umieść płytkę w komorze (zamknij szklaną pokrywką) i pozwól, aby rozpuszczalnik całkowicie spłynął do górnej części płytki. Trwa to około 45 minut.
  3. Wyjąć płytkę i wysuszyć w dygestorium do momentu odparowania rozpuszczalnika (około 15 min), a następnie umieścić w piekarniku na co najmniej 10 minut w temperaturze 120 °C. Umieścić ołówek na górze płytki, aby zachować orientację podczas nakładania próbek. Umieść prostą linię ołówkiem, 1,5 cm od dolnej krawędzi płytki, aby zaznaczyć linię bazową, w której zostanie umieszczona próbka i wzorce.
  4. Przygotuj komorę TLC, wycinając kawałek bibuły filtracyjnej wystarczająco duży, aby wyłożyć dwie krótkie ścianki i jedną długą ścianę. Umieść wkładkę z bibuły filtracyjnej w komorze. Całkowicie zwilży się po dodaniu rozpuszczalnika do komory.
  5. Przygotować 100 ml rozpuszczalnika fazy ruchomej, którym jest heksan: eter dietylowy: kwas octowy (H:E:A; 80:20:2 v/v/v). Wlej rozpuszczalnik do komory, aby uzyskać głębokość około 1 cm. Przykryj szklaną pokrywą, używając silikonowej uszczelki smarowej wzdłuż górnej krawędzi komory. Pozwól komorze zrównoważyć się przez noc przed użyciem.
  6. Próbkę nanieść ręcznie na przygotowaną płytkę za pomocą rurki kapilarnej lub pipety w postaci ciągłej smugi od około 1,5 cm od jednej krawędzi do 1,5 cm do drugiej krawędzi. Preferowany jest automatyczny aplikator próbki, ponieważ ładuje on próbkę w bardziej jednorodnej smugi. Użyj zewnętrznych pasów płytki TLC, aby wykryć około 20 μl mieszaniny sterolu, FFA, TAG i wzorców estrów steroli (stosować w stężeniu 10 mg/ml; można uzyskać gotowe mieszanki).
  7. Umieścić załadowaną płytkę TLC w zrównoważonej komorze, zamknąć pokrywką i rozwijać płytkę, aż rozpuszczalnik dotrze do górnej krawędzi. Trwa to około 45 minut z opisaną tutaj fazą ruchomą. Wyjąć płytkę z komory i pozostawić nadmiar rozpuszczalnika do odparowania z płytki w dygestoriach przez około 1 minutę.
  8. Spryskaj 0,05% rodaminą 6G w 95% etanolu. Wizualizuj pasma lipidowe pod lampą ultrafioletową o dużej długości fali. Zaznaczyć ołówkiem położenie Rf dla pasm fluorescencyjnych rozwiązanych w próbce i wzorcach. W tym momencie można wykonać dokumentację fotograficzną.
  9. Zidentyfikuj pasmo odpowiadające wzorcowi TAG i usuń je z płytki, zeskrobując krzemionkę szpatułką na duży kawałek papieru do ważenia szkła. Przenieść krzemionkę do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej przemytej rozpuszczalnikiem.
  10. Dodać 1,0 ml rozpuszczalnika 3:2 C:M do probówki z próbką, sonikować przez 1 minutę, osadzać krzemionkę przez odwirowanie, a następnie przenieść rozpuszczalnik do nowej, wstępnie zważonej probówki. Powtórzyć poprzedni krok, zebrać filtraty i odparować rozpuszczalnik pod strumieniemN2.
  11. Wysuszoną pozostałość zawierającą TAG należy przechowywać w ciemności podN2 w temperaturze 4 °C, podczas gdy dodatkowe próbki tkanek są rozdzielane metodą TLC. Rodamina 6G jest obecna w próbkach, ale jest nierozpuszczalna w heksanie i jest usuwana podczas rozpuszczania próbki bezpośrednio przed analizą MS.

3. Analiza TAG przez MALDI-TOF MS

  1. Przygotować świeży roztwór matrycy kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego (CHCA), rozpuszczając 10 mg CHCA w 1 ml rozpuszczalnika (49,5% etanolu, 49,5% acetonitrylu i 1% wodnego 0,1% TFA).
  2. Przygotować hormon adnerczynikotropowy (ACTH; 18-39 clip, 2465.1989 Da) do badania rozdzielczości i czułości instrumentu, mieszając 1 μl ACTH (1 mg/ml) z 39,5 μl 0,1% kwasu trifluorooctowego (TFA) w celu otrzymania roztworu podstawowego o stężeniu 10 pmol/μl. Można go przechowywać w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.
  3. Przygotować świeży roboczy roztwór ACTH (1 pmol/μl), pobierając 1 μl roztworu podstawowego o stężeniu 10 pmol/μl, mieszając z 9 μl 0,1% TFA, a następnie mieszając (1:1) z 10 μl roztworu matrycy CHCA w celu uzyskania stężenia 500 fmol/μl.
  4. Przygotować wzorce TAG w stężeniu 10 mg/ml w proporcji 3:2 C:M do kalibracji przyrządu MALDI (np. trikapryna [470,361 Da], trikaprylina [554,455 Da], trilauryna [638,549 Da], tripalmityna [722,642 Da], tripalmityna [800,689 Da], trimyrystyna [806,736 Da], trioleina [884,783 Da], tri-11-eikozenoina [968,877 Da] i trierucyna [1052,971 Da]).
  5. Przygotować trioleinę w stężeniu 10 mg/ml w proporcji 3:2 C:M do zewnętrznej kalibracji wzorca TAG do kalibracji masy zamka.
  6. Przechowywane próbki TAG rozpuścić w heksanie do roztworu o stężeniu 10 mg/ml.
  7. Przygotować 0,5 M (77,06 mg/1,0 ml) roztwór podstawowy kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego (DHB) z 90% metanolem do użycia jako próbka i matryca wzorcowa. Przygotuj również 1,0 M (2,0 g/50,0 ml) roztwór NaOH. Przykryj rurkę roztworem DHB za pomocą folii aluminiowej w celu ochrony przed światłem.
  8. Wymieszać (we wstępnie umytych probówkach) 10,0 μl matrycy DHB, 10,0 μl próbki lub wzorca i 5,0 μl 1,0 M NaOH. Wymieszaj i krótko odwiruj probówkę, aby doprowadzić mieszaninę do dna.
  9. Umieścić 1,0 μl wzorca, próbki lub ACTH na płytce celowniczej MALDI ze stali nierdzewnej i umieścić w eksykatorze do wyschnięcia. Umieść tabliczkę celowniczą w przyrządzie w celu uzyskania danych.
  10. Wykonaj analizy MALDI-TOF MS w trybie dodatniego reflektronu. Nastroić i skalibrować przyrząd zgodnie z opisem producenta przyrządu przy użyciu standardowych roztworów ACTH i TAG.
  11. Zdobądź widma dla każdej próbki dostrzeżonej na płycie celowniczej (zgodnie ze specyfikacją instrumentu; parametry dla tej pracy to szybkostrzelność lasera 5 Hz, ~100 strzałów na plamkę, aby uzyskać średnie widmo). Po wygładzeniu i odjęciu tła od widm MALDI, przetwarzaj piki jonów ręcznie za pomocą wyszukiwarki internetowej MAPY LIPIDOWE (www.lipidmaps.org/tools/ms/glycerolipids_batch).
  12. Skopiuj i wklej widma listy do pola lista jonów prekursorowych i intensywności. Ogranicz wyszukiwanie do pożądanego składu acylowego. Zidentyfikuj TAG na podstawie stosunku masy/ładunku (m/z) od jonów obecnych w widmie dla każdej próbki. Jeśli zawartość procentowa estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME) jest dostępna z oddzielnej analizy GC/MS, dodaj te dane, aby uzyskać prawdopodobieństwo obecności TAG.

INSTRUMENT: Spektrometr masowy używany w tym badaniu to Waters MALDI Micro MX (wyposażony w laser 337 nm 20 Hz N2). Można użyć dowolnego przyrządu MALDI z możliwością dodatniego trybu odbicia. Ogólne ustawienia to napięcie impulsu, 2 000 V; reflektor, 5 200 V; źródło, 15 000 V, z akwizycją danych za pomocą oprogramowania MassLynx (wer. 4.0). Takie warunki pracy zapewniają rozdzielczość masową większą niż 12 000.

Wyniki

Metoda ekstrakcji służąca do izolacji całkowitych lipidów z tkanki opisana przez Folcha30 jest prostą procedurą, która została tutaj zaadoptowana. Po ekstrakcji tkanki i odparowaniu rozpuszczalnika lipidy często występują w postaci żółtawej warstwy. Żółty kolor wynika najprawdopodobniej z zanieczyszczeń białkowych, które można usunąć poprzez przeprowadzenie ekstrakcji ciecz-ciecz. To dodatkowe przetwarzanie próbki nie jest wymagane w niniejszej procedurze, ponieważ preparatywna TLC oddziela frakcję TAG od takich zanieczyszczeń. Dodawanie świeżego bezwodnego siarczanu sodu na wszystkich etapach filtrowania pomaga zmniejszyć zanieczyszczenie wodą, co wpływa na dokładne oznaczenie masy lipidów.

Analizy lipidów powłoki skórnej ssaków za pomocą preparatywnej TLC z fazą ruchomą H:E:A zazwyczaj pozwalają na rozdzielenie czterech wyraźnych prążków odpowiadających (począwszy od linii startu) sterolom, wolnym kwasom tłuszczowym (FFA), triacyloglicerolom (TAG) oraz estrom steroli/estrom woskowym/skwalenowi (Rycina 1). W niektórych przypadkach podczas stosowania analitycznej wysokorozdzielczej (HP) TLC z fazą ruchomą H:E:A, estry steroli, estry woskowe i skwalen rozdzielają się i pojawiają się jako trzy osobne prążki. W warunkach zastosowanych w niniejszym badaniu estry steroli/woskowe nie uległy rozdzieleniu. Jeśli prążki te są przedmiotem zainteresowania, fazę ruchomą można zmienić na izooktan:eter etylowy (95:5 v/v), a płytkę HPTLC można przeanalizować za pomocą densytometrii skanującej. Inne czynniki mogą powodować słabą separację. W celu uzyskania powtarzalnej jakości rozdzielania TLC i wiarygodnych danych, zazwyczaj eliminuje się je poprzez umieszczenie papieru filtracyjnego w komorze, zastosowanie smaru dla zapewnienia szczelności pokrywy, równoważenie komory przez noc oraz utrzymywanie czystości komór TLC.

Reprezentatywne widma mas MALDI-TOF uzyskane dla TAG wyizolowanych z rudego nietoperza wschodniego przedstawiono na Rysunkach 2 i 3. Widma te zawierają piki jonów TAG w zakresie mas między m/z 850 - 910, co jest typowe dla TAG izolowanych z ssaków nienadwodnych. Dodatek 1,0 M NaOH sprzyja powstawaniu jednokrotnie naładowanych jonów Na+, które są bardziej stabilne niż jony H+. Poza stabilnością, brak jonów H+ i K+ ułatwia analizę widma. Piki jonowe w zakresie m/z 850 - 910 odpowiadają resztom FA 16:0, 18:0, 18:1 oraz 18:2, będącym dominującymi składnikami acylowymi w TAG (Tabela 1). Możliwe reszty FA w TAG mogą być wstępnie określone na podstawie całkowitego m/z jonów obecnych w widmach MALDI-TOF MS, co pozwala na wyciągnięcie wniosków dotyczących różnic między gatunkami i osobnikami. Jeśli jednak wymagane są dokładne proporcje zawartości acylowej, należy zastosować MS/MS lub chromatografię gazową (GC/MS). Dalsze informacje na temat proporcji acylowych można uzyskać, obserwując piki w obszarze diacyloglicerydów na widmie (Rysunek 4). Diacyloglicerydy powstają w wyniku fragmentacji TAG w źródle MALDI i można je znaleźć w regionie m/z 590 - 650. Fragmentację TAG można zwiększyć, pomijając dodatek 1,0 M NaOH16. Tkanka skrzydła rudego nietoperza wschodniego charakteryzuje się dominującym pikiem przy m/z 879,7, natomiast tkanka włosa dominującym pikiem przy m/z 881,8 (odpowiednio Rysunek 2 i 3). Piki przy m/z 907,8, 879,7 i 855,7 (POP, PPoS) mają w tkance włosa zbliżoną intensywność (~50%), przy czym pik przy 853,7 wynosi ~40%.

SkładSkład pierwiastkowyMasa obserwowana
Na+TAGs Na+TAGs
SSOC57H108O6911.8
OOS, LSSC57H106O6909.8
OOO, LnSS, LSOC57H104O6907.8
LOO, LLSC57H102O6905.8
LLO, OOLnC57H100O6903.7
LLLC57H98O6901.7
LLLnC57H96O6899.7
LLnLnC57H94O6897.7
LnLnLnC57H92O6895.7
OSPC55H104O6883.8
LSP, OOP, SOPoC55H102O6881.8
LOP, LnSP, LSPoC55H100O6879.7
LLP, LnOP, LOPoC55H98O6877.7
LnLP, LLPo, LnOPoC55H96O6875.7
LnLnP, LnLPoC55H94O6873.7
LnLnPoC55H92O6871.7
PPSC53H102O6857.8
POP, PPoSC53H100O6855.7
OOM, PPL, PoPoS, POPoC53H98O6853.7
PPLn, PPoL, PoPoO, MyOOC53H96O6851.7
LLM, LnOMC53H94O6849.7
PPP, SSLaC51H98O6829.7
PPPo, OSLaC51H96O6827.7
PPoPo, PMyOC51H94O6825.7
LnLnLaC51H86O6817.6
MMS, SLaP, PPMC49H94O6801.7
SLaPo, PPoM, PPMyC49H92O6799.7
PoPoM, OOCaC49H90O6797.7
MMPC47H90O6773.7
MMPo, OCaPC47H88O6771.7
OCaPoC47H86O6769.6
MMM, PPCa, PMLaC45H86O6745.6
PoPCa, PoMLaC45H84O6743.6
PoPoCaC45H82O6741.6
LaLaP, MMLa, MCaPC43H82O6717.6
LaLaPoC43H80O6715.6
OOC39H72O5643.5
OLC39H70O5641.5
LLC39H68O5639.5
SPC37H72O5619.5
OPC37H70O5617.5
LPC37H68O5615.5

Tabela 1. Skład kwasów tłuszczowych, skład pierwiastkowy i masa izotopowa adduktów sodowych triacylogliceroli i diacylogliceroli. Ln=kwas linolenowy (18:3), L=kwas linolowy (18:2), O=kwas oleinowy (18:1), S=kwas stearynowy (18:0), P=kwas palmitynowy (16:0), Po=kwas palmitoleinowy (16:1), M=kwas mirystynowy (14:0), My=kwas mirystoleinowy (14:1), La=kwas laurowy (12:0), Ca=kwas kaprylowy (10:0).

Chromatografia cienkowarstwowa lipidów; rozdzielanie steroli; schemat profilu lipidowego; analiza biochemiczna.
Rycina 1. Chromatogram cienkowarstwowy rozdzielania głównych klas lipidów z zastosowaniem układu heksan:eter dietylowy:kwas octowy (80:20:2 v/v/v) jako fazy ruchomej. Prążka między sterolami a FFA nie zidentyfikowano za pomocą wzorca, lecz może on reprezentować alkohol tłusty lub woskowy diester.

Wykres spektrometrii masowej pokazujący analizę pików dla mas cząsteczkowych.
Rycina 2. Powiększony obszar TAG widma masowego MALDI-TOF dla sodowanych TAG (m/z 700 - 950) z tkanki skrzydła rudego nietoperza wschodniego (L. borealis). Piki zidentyfikowane przy m/z 853,7 (OOM, PPL, PoPoS, POPo) oraz m/z 879,7 (LOP, LnSP, LSPo). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinię.

Wynik spektrometrii mas; analiza widma, intensywność piku, identyfikacja molekularna, analiza chemiczna.
Rysunek 3. Powiększony region TAG widma masowego MALDI-TOF sodowanych TAG (m/z 700 - 950) z tkanki włosów rudego nietoperza wschodniego (L. borealis). Piki zidentyfikowane przy m/z 905,8 (LOO, LLS) oraz m/z 907,8 (OOO, LnSS, LSO). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Wykres spektrometrii mas, wartości m/z ilustrujące piki jonów molekularnych, analiza białek.
Rycina 4. Obszar DAG widma mas MALDI-TOF sodowanych fragmentów DAG (m/z 530 - 730) z tkanki skrzydła nietoperza czerwonego (L. borealis). Piki zidentyfikowane przy m/z 643,5 (OO) oraz m/z 615,5 (LP). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Dyskusja

W pracy przedstawiono prostą i solidną metodę rozdzielania szerokich klas lipidów wyizolowanych z powłoki ssaków za pomocą preparatywnego TLC i określania profili TAG za pomocą MALDI-TOF MS, bez czasochłonnej derywatyzacji cząsteczek lipidów. Krytyczne etapy tworzenia wysokiej jakości widm TAG za pomocą MALDI-TOF MS obejmują: 1) Pomyślną ekstrakcję związku przy minimalnym zanieczyszczeniu lub utlenianiu; 2) wystarczające rozdzielenie i wyizolowanie metodą chromatografii; oraz 3) Wysoka rozdzielczość i dokładność masy przez MALDI-TOF MS.

W artykule przedstawiono metodę polegającą na ekstrakcji i oddzieleniu obojętnej frakcji lipidowej z plagiopatagium nocka czerwonego w celu uzyskania profili TAG MS. Podczas gdy w niniejszym badaniu wykorzystano gatunek nietoperzy (Mammalia: Chiroptera), metody te można rozszerzyć o badanie lipidów powłokowych dowolnego gatunku ssaków. Powłoka nietoperzy charakteryzuje się tym, że zawiera głównie cholesterol, z mniejszą ilością TAG, FFA, skwalenu i estrów sterolu/wosku. Stosunek lipidów w sebum u nietoperzy różni się od ludzi tym, że skwalen występuje w małych ilościach (w przeciwieństwie do 16% u ludzi), podczas gdy cholesterol występuje w większych proporcjach (1 - 7% u ludzi, ale 26 - 62% u nietoperzy)22,31. Ludzkie włosy zawierają około 3% TAGs, podczas gdy proporcje do 28% znajdują się we włosach nietoperza rudego. Ekstrakcja próbek lipidów od nietoperzy jest podobna dla innych gatunków. Podczas gdy w tym badaniu waciki nasączone rozpuszczalnikiem są używane do usuwania sebum, można również wielokrotnie odwrócić fiolkę lub probówkę z próbką zawierającą rozpuszczalnik na powierzchnię powłoki. Specjalistyczne produkty taśmowe stanowią również alternatywne sposoby ekstrakcji lipidówpowierzchniowych 32. Kluczowym elementem prawidłowej ekstrakcji lipidów jest zminimalizowanie zanieczyszczenia olejami skórnymi. Można to łatwo osiągnąć, trzymając wyciśniętą butelkę z metanolem i spryskując wszystkie szklane naczynia i przybory, wycierając przybory chusteczką między wszystkimi próbkami i nosząc rękawiczki do badań. Utlenianiu wielonienasyconych acyli zapobiega się poprzez dodanie BHT i należy go stosować niezależnie od temperatury, w jakiej przechowywane są próbki.

Analiza biomolekuł zwykle wymaga kroku chromatograficznego w celu oddzielenia interesujących cząsteczek od zanieczyszczeń. W tej metodzie stosuje się TLC, która pozwala uniknąć wymagań dotyczących oprzyrządowania do chromatografii gazowej lub cieczowej i wymaga mniejszego doświadczenia technicznego w celu uzyskania solidnych i powtarzalnych wyników. W zależności od klasy lipidów, które nas interesują, można włączyć wiele różnych faz ruchomych. Ponadto w celu uzyskania wyników ilościowych można wykorzystać płytki HPTLC i densytometrię skaningową. Chociaż odmiany metod TLC są zbyt liczne, aby je tutaj wymienić, niektóre typowe fazy ruchome stosowane w TLC lipidów obejmują chloroform:metanol:wodę do separacji fosfolipidów i glikolipidów lub izooktan:eter etylowy do separacji lipidów niepolarnych28. Jeśli chodzi o oddzielanie TAG od innych klas lipidów, system rozpuszczalników H:E:A działa konsekwentnie i zapewnia porównywalne wyniki.

Kolejną zaletą stosowania TLC jest to, że pasma zainteresowania można szybko profilować za pomocą MALDI-TOF MS bez uprzedniej derywatyzacji analitów. W tym badaniu krzemionka jest usuwana z płytki TLC, a analit jest z niej eluowany przez sonikację w rozpuszczalniku, a następnie odwirowanie w celu oddzielenia adsorbentu i odparowania rozpuszczalnika elującego. Alternatywnie, matryca może być nakładana bezpośrednio na pasma analitu oddzielone na płytkach TLC, a następnie bezpośrednio analizowana przez MALDI-TOF MS33. Skuteczne profilowanie przez MALDI-TOF MS zależy od wystarczającego przygotowania próbki i biegłości operatora w strojeniu i kalibracji przyrządu. Przyrząd powinien być codziennie kalibrowany za pomocą wzorców obejmujących zakres masy cząsteczkowej odpowiedni dla interesujących nas cząsteczek. Odpowiednia czułość i rozdzielczość (np. 10 000 ≥) sprzętu powinna być również codziennie potwierdzana za pomocą ACTH.

Składniki lipidowe łoju znajdujące się na powierzchni powłoki ssaków mogą odgrywać rolę w kolonizacji przez patogeny bakteryjne / grzybicze. W związku z tym wiedza na temat składu chemicznego gatunków i osobników może dostarczyć wskazówek na temat procesów zachodzących w chorobach ludzi i dzikich zwierząt. Różnice wewnątrzgatunkowe między osobami chorymi i zdrowymi mogą stanowić objawy kliniczne, które pomagają w wykrywaniu i diagnozowaniu choroby. Ponadto, jeśli obecne są określone związki, które hamują rozwój drobnoustrojów, można je zidentyfikować do stosowania w leczeniu i profilaktyce chorób.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Pomoc została udzielona przez Scotta Treece'a, Katelyn Arter, Jeremy'ego Ragsdella, Tony'ego LaMarka Jamesa, Amy Fischer, Hannah Blair i Cheyenne Gerdes podczas rozwoju metod laboratoryjnych. Serdecznie dziękujemy Laboratorium Medina-Bolivar (Luis H. Nopo-Olazabal; Arkansas Biosciences Institute) w celu uzyskania pomocy w densytometrii skaningowej TLC. MALDI-TOF MS wykorzystany w tym projekcie został dostarczony za pośrednictwem NSF EPSCoR, RII: Arkansas ASSET Initiative P3 Center (EPS-0701890) w Instytucie Nauk Biologicznych w Arkansas. Finansowanie zostało zapewnione przez U.S. Fisheries and Wildlife Service/Arkansas State Wildlife Grant, National Speleological Society oraz The Center for North American Bat Research and Conservation na Indiana State University.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Butylowany hydroksytoluenMP Biomedicals, LLC101162www.mpbio.com
TLC Elastyczne płytkiWhatman4410-222www.whatman.com
ACTHSigma-Aldrich Chem. Co.A8346-5X1VLwww.sigmaaldrich.com
TrioleinSigma-Aldrich Chem. Co.44895-U 
TLC Lipid StandardTLC 18-1www.nu-chekprep.com
MALDI TAG StandardNu-Check Prep., Inc.Kod NIH 53B 
MALDI TAG StandardSigma-Aldrich Chem. Co.17810-1AMP-S 
Szklane fiolki z teflonową nakrętkąU.S. National Scientific Co.B7800-2www.nationalscientific.com/
DHBSigma-Aldrich Chem. Co.50862-1G-F 
CHCASigma-Aldrich Chem. Co.C8982-10X10 mg 
SebutapeCuDermS100 

Bibliografia

  1. Pappas, A., Anthonavage, M., Gordon, J. S. Metabolic fate and selective utilization of major FAs in human sebaceous gland. Journal of Investigative Dermatology. 118 (1), 164-171 (2002).
  2. Nicolaides, N., Hwei, H. C., Rice, G. R. The skin surface lipids of man compared with those of eighteen species of animals. Journal of Investigative Dermatology. 51 (2), 83-89 (1968).
  3. Desbois, A. P., Smith, V. J. Antibacterial free fatty acids: activities, mechanisms of action and biotechnological potential. Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (6), 1629-1642 (2010).
  4. Munoz-Garcia, A., Williams, J. B. Cutaneous water loss and lipids of the stratum corneum in Dusky Antbirds, a lowland tropical bird. Condor. 109 (1), 59-66 (2007).
  5. Catala, A. The function of very long chain polyunsaturated fatty acids in the pineal gland. Biochimica et Biophysica Acta. 1801, 95-99 (2010).
  6. Stahl, J., Niedorf, F., Kietzmann, M. Characterization of epidermal lipid composition and skin morphology of animal skin ex vivo. European Journal of Pharmacology. 72 (2), 310-316 (2009).
  7. Picardo, M., Ottaviani, M., Camera, E., Mastrofrancesco, A. Sebaceous gland lipids. Dermato-Endocrinology. 1 (2), 68-71 (2009).
  8. Ro, B. I., Dawson, T. L. The role of sebaceous gland activity and scalp microfloral metabolism in the etiology of seborrheic dermatitis and dandruff. Journal of Investigative Dermatology. 10, 194-197 (2005).
  9. Davoudi, S. M., Sadr, B., et al. Comparative study of skin sebum and elasticity level in patients with sulfur mustard-induced dermatitis and healthy controls. Skin Research and Technology. 16 (2), 237-242 (2010).
  10. Zampeli, V. A., Makrantonaki, E., Tzellos, T., Zouboulis, C. C. New pharmaceutical concepts for sebaceous gland diseases: implementing today's pre-clinical data into tomorrow's daily clinical practice. Current Pharmaceutical Biotechnology. 13 (10), 1898-1913 (2012).
  11. Horton, H. R., Moran, L. A., et al. Principles of Biochemistry. , Prentice Hall. Englewood Cliffs, NJ. (1993).
  12. Fahy, E., Subramaniam, S., et al. A comprehensive classification system for lipids. European Journal of Lipid Science and Technology. 107 (5), 337-364 (2005).
  13. Fahy, E., Subramaniam, S., et al. Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids. Journal of Lipid Research. 50 (5), S9-S14 (2009).
  14. Fuchs, B., Süß, R., Nimptsch, A., Schiller, J. MALDI-TOF-MS directly combined with TLC: A review of the current state. Chromotagraphia. 69, S95-S105 (2009).
  15. Savary, B. J., Vasu, P. Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols. Lorence, A. , 3rd, Humana Press. New York, NY. (2011).
  16. Gidden, J., Liyanage, R., Durham, B., Lay, J. O. Reducing fragmentation observed in the matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometric analysis of triacylglycerols in vegetable oils. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21, 1951-1957 (2007).
  17. Fuchs, B., Schiller, J. Application of MALDI-TOF mass spectrometry in lipidomics. European Journal of Lipid Science and Technology. 111 (1), 83-98 (2009).
  18. Fuchs, B., Sϋβ, R., Schiller, J. An update of MALDI-TOF mass spectrometry in lipid research. Progress in Lipid Research. 49 (4), 450-475 (2010).
  19. Karas, M., Bachmann, D., Hillenkamp, F. Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet laser desorption mass spectrometry of organic molecules. Analytical Chemistry. 57 (14), 2935-2939 (1985).
  20. Hillenkamp, F., Karas, M., Holtkamp, D., Klusener, P. Energy deposition in ultraviolet laser desorption mass spectrometry of biomolecules. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 69 (3), 265-276 (1986).
  21. Knochenmuss, R. Electrospray and MALDI Mass Spectrometry: Fundamentals, Instrumentation, Practicalities, and Biological Applications. Cole, R. B. , 2nd, John Wiley and Sons. NJ. 149-262 (2010).
  22. Pannkuk, E. L., Gilmore, D., Savary, B. J., Risch, T. S. Triacylglyceride (TAG) profiles of integumentary lipids isolated from three bat species determined by matrix-assisted laser desorption - ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI - TOF MS). Canadian Journal of Zoology. 90 (9), 1117-1127 (2012).
  23. Blehert, D., Hicks, A. C., et al. Bat white-nose syndrome: An emerging fungal pathogen. Science. 323 (5911), 227-228 (2009).
  24. Gargas, A., Trest, M. T., et al. Geomyces destructans sp. nov. associated with bat white-nose syndrome. Mycotaxon. 108, 147-154 (2009).
  25. Lorch, J. M., Meteyer, C. U., et al. Experimental infection of bats with Geomyces destructans causes white-nose syndrome. Nature. 480 (7377), 376-378 (2011).
  26. Frick, W. F., Pollock, J. F., et al. An emerging disease causes regional population collapse of a common North American bat species. Science. 329 (5992), 679-682 (2010).
  27. Boyles, J. G., Cryan, P. M., McCracken, G. F., Kunz, T. H. The economic importance of bats in agriculture. Science. 332 (6025), 41-42 (2011).
  28. Sikes, R. S., Gannon, W. L., et al. Guidelines of the American Society of Mammalogists on the use of wild mammals in research. Journal of Mammalogy. 92 (1), 235-253 (2011).
  29. Law, S., Wertz, P. W., Swartzendruber, D. C., Squier, C. A. Regional variation in content, composition, and organization of porcine epithelial barrier lipids revealed by thin layer chromatography and transmission electron microscopy. Archives of Oral Biology. 40 (12), 1085-1091 (1995).
  30. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  31. Nicolaides, N. Skin lipids: Their biochemical uniqueness. Science. 186 (4158), 19-24 (1974).
  32. Camera, E., Ludovici, M., et al. Comprehensive analysis of the major lipid classes in sebum by rapid resolution high-performance liquid chromatography and electrospray mass spectrometry. Journal of Lipid Research. 51, 3377-3388 (2011).
  33. Fuchs, B., Süß, R., et al. Lipid analysis by thin-layer chromatography- A review of the current state. Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Profilowanie triacylogliceryd wwydzieliny gruczo w ojowych nietoperzaekstrakcja lipid wanaliza spektrometrycznaanaliza sk adu sebumrozdzia klas lipid wpow oka sk rna ssak w
Profilowanie zawartości triacyloglicerydów w lipidach powłokowych nietoperzy za pomocą preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej i spektrometrii mas MALDI-TOF
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.