Wprowadzono poprawkę do publikacji Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. Protokół barwienia metodą Nissla został zmieniony z:
2. Przygotowanie preparatów: barwienie Nissla
- Myszy podaje się głęboką narkozę za pomocą ketaminy i ksylazyny wstrzykiwanych dootrzewnowo, a następnie przeprowadza perfuzję transkardialną przy użyciu 50 mL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (pH 7.4) w temperaturze pokojowej, następnie 250 mL 10% neutralnego buforowanego formaliny (pH 7.4) w temperaturze pokojowej, a na koniec 3.0 cc nierozcieńczonego tuszu indyjskiego.
- Perfuzja całego organizmu solą fizjologiczną i utrwalaczem jest niezbędna do usunięcia krwi z układu sercowo-naczyniowego i utrwalenia tkanek. Perfuzja tuszem indyjskim jest konieczna do całkowitego wypełnienia naczyń krwionośnych układu sercowo-naczyniowego.
- Otrzymany mózg jest następnie odwadniany w szeregu roztworów alkoholu etylowego o rosnącym stężeniu (25%{}-100%), a następnie zatapiany w plastiku araldite zgodnie z protokołem opisanym w punktach 1.8-1.9 powyżej. W przypadku zastosowania medium LR white należy postępować zgodnie z protokołem w punkcie 1.10 powyżej.
- Myszy podaje się głęboką narkozę za pomocą ketaminy i ksylazyny wstrzykiwanych dootrzewnowo, a następnie przeprowadza perfuzję transkardialną przy użyciu 50 mL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (pH 7.4) w temperaturze pokojowej, następnie 250 mL 10% neutralnego buforowanego formaliny (pH 7.4) w temperaturze pokojowej, a na koniec 3.0 cc nierozcieńczonego tuszu indyjskiego.
- Perfuzja całego organizmu solą fizjologiczną i utrwalaczem jest niezbędna do usunięcia krwi z układu sercowo-naczyniowego i utrwalenia tkanek. Perfuzja tuszem indyjskim jest konieczna do całkowitego wypełnienia naczyń krwionośnych układu sercowo-naczyniowego.
- Otrzymany mózg jest następnie odwadniany w szeregu roztworów alkoholu etylowego o rosnącym stężeniu (25%{}-100%), a następnie zatapiany w plastiku araldite zgodnie z protokołem opisanym w punktach 1.8-1.9 powyżej. W przypadku zastosowania medium LR white należy postępować zgodnie z protokołem w punkcie 1.10 powyżej.
- Myszy podaje się głęboką narkozę za pomocą ketaminy i ksylazyny wstrzykiwanych dootrzewnowo, a następnie przeprowadza perfuzję transkardialną przy użyciu 50 mL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (pH 7.4) w temperaturze pokojowej, następnie 250 mL 10% neutralnego buforowanego formaliny (pH 7.4) w temperaturze pokojowej, a na koniec 3.0 cc nierozcieńczonego tuszu indyjskiego.
- Perfuzja całego organizmu solą fizjologiczną i utrwalaczem jest niezbędna do usunięcia krwi z układu sercowo-naczyniowego i utrwalenia tkanek. Perfuzja tuszem indyjskim jest konieczna do całkowitego wypełnienia naczyń krwionośnych układu sercowo-naczyniowego.
- Otrzymany mózg jest następnie odwadniany w szeregu roztworów alkoholu etylowego o rosnącym stężeniu (25%{}-100%), a następnie zatapiany w plastiku araldite zgodnie z protokołem opisanym w punktach 1.8-1.9 powyżej. W przypadku zastosowania medium LR white należy postępować zgodnie z protokołem w punkcie 1.10 powyżej.
do:
2. Przygotowanie preparatów: metoda Nissla
- Niniejszy protokół ściśle naśladuje protokół opracowany przez Mayerich i wsp.7
- Myszy podaje się głęboką narkozę za pomocą ketaminy i ksylazyny wstrzykiwanych dootrzewnowo, a następnie przeprowadza perfuzję transkardialną przy użyciu 50 mL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (pH 7.4) w temperaturze pokojowej, a następnie 250 mL zimnej 4% paraformaldehydu w buforze fosforanowym (pH 7.4).
- Następnie mysz poddaje się perfuzji 100 mL roztworu 0,1% barwnika tioniny w wodzie dejonizowanej, a ciało umieszcza się w lodówce (4 °C) na 24 godziny.
- Po 24 godzinach mózg zostaje wyjęty z czaszki i umieszczony w świeżym roztworze 0,1% tioniny, gdzie pozostaje w temperaturze 4 °C przez 7 dni. Długi czas trwania tej procedury miał na celu zapewnienie pełnej infiltracji tioniny do preparatu en bloc.
- Następnie mózg poddaje się odbarwieniu i odwodnieniu w szeregu stężeń etanolu, zaczynając od 50% etanolu i wody, a kończąc na 100% etanolu w okresie 6 tygodni. Próbki w stężeniach etanolu od 50% do 70% przechowuje się w lodówce (4 °C), natomiast wszystkie stężenia powyżej 70% przechowuje się w temperaturze pokojowej.
- Po trzech zmianach acetonu (od 2 do 4 dni w każdym roztworze w temperaturze pokojowej), mózg zostaje zatopiony w plastiku araldite zgodnie z protokołem opisanym w punktach 1.8-1.9 powyżej. W przypadku zastosowania medium zatapiającego LR white, należy postępować zgodnie z protokołem w punkcie 1.10 powyżej.