Izolacja i różnicowanie Th17 naiwnych limfocytów T CD4

Limfocyty T CD4+ (limfocyty T) odgrywają kluczową rolę w obronie układu odpornościowego przed zakaźnymi mikroorganizmami. I odwrotnie, limfocyty T są również ściśle związane z początkiem i progresją chorób autoimmunologicznych, takich jak cukrzyca typu 1, toczeń rumieniowaty układowy i reumatoidalne zapalenie stawów. Limfocyty T CD4 + ulegają aktywacji poprzez połączenie interakcji receptora limfocytów T (TCR) z cząsteczkami pokrewnego antygenu / głównego kompleksu zgodności tkankowej II (MHCII) oraz interakcji receptora CD28 z ligandami B7.1 / B7.2¹⁵. Oprócz zapewnienia stymulacji TCR i kostymulacji CD28, komórki prezentujące antygen zapewniają również środowisko cytokinowe, które określa stan różnicowania limfocytów T, kierując w ten sposób odpowiedzią limfocytów T na dany antygen. Odrębne interakcje komórkowe między patogenem a antygenem tworzą odrębne środowiska cytokinowe, które przechylają limfocyty T w dół odrębnych szlaków skoncentrowanych na eliminacji patogenu inicjującego. Niestety, szlaki efektorowe limfocytów T, pierwotnie zaprojektowane do eliminowania inwazyjnych patogenów, mogą być błędnie skierowane przeciwko własnym tkankom¹⁵. Dlatego lepsze zrozumienie stanu różnicowania każdego odrębnego podzbioru limfocytów T CD4 + ma kluczowe znaczenie dla naszego zrozumienia, jak modulować równowagę między eliminacją patogenów a tolerancją na siebie.

Oprócz szlaków różnicowania limfocytów Th1, Th2 i indukowalnych regulatorowych limfocytów T, naiwne limfocyty T mogą być również napędzane przez cytokiny w dół szlaku Th17. Podczas gdy komórki Th1 zwalczają patogeny wewnątrzkomórkowe, komórki Th2 eliminują patogeny zewnątrzkomórkowe, a limfocyty T regulatorowe (Treg) minimalizują reakcje zapalne^{1, 16}; Komórki Th17 odgrywają ważną rolę w eliminacji zewnątrzkomórkowych bakterii i grzybów. Komórki Th17 są na ogół oznaczone ekspresją specyficznego dla linii czynnika transkrypcyjnego RORγT i wytwarzaniem IL-17A, który sprzyja aktywacji makrofagów i neutrofili^{1, 7}.

Komórki Th17 były zamieszane w kilka chorób autoimmunologicznych i związane z nimi modele gryzoni. Na przykład wykazano, że IL-23 (która jest wymagana do utrzymania fenotypu Th17), ale nie IL-12, była głównym winowajcą eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu (EAE), modelu choroby gryzoni dla SM. Następnie wykazano, że zmniejszenie produkcji IL-17 jest skorelowane z zapobieganiem EAE^{2, 6, 17}. Ponadto komórki Th17 są związane z innymi zaburzeniami autoimmunologicznymi, w tym zapaleniem stawów i toczniem rumieniowatym układowym (SLE)^{10, 16}. Wykazano, że myszy p19^-/- z niedoborem IL-23 mają bardzo niską liczbę komórek Th17 i są odporne na rozwój nie tylko EAE, ale także zapalenia stawów wywołanego kolagenem, modelu reumatoidalnego zapalenia stawów^{10, 18}. Ponadto stwierdzono również, że myszy leczone neutralizującymi przeciwciałami IL-17A po wystąpieniu zapalenia stawów wywołanego kolagenem mają również ustąpienie uszkodzenia stawów¹⁸. Należy zauważyć, że rola komórek Th17 w progresji choroby autoimmunologicznej pozostaje do scharakteryzowania, ponieważ ostatnie badania wykazały również ochronną rolę komórek Th17 w cukrzycy typu 1 9^{, 11} i zapaleniu jelit¹⁴. Badania te potwierdzają znaczenie różnicowania Th17 w autoimmunizacji.

Różnicowanie in vitro Th17 jest niezbędną metodą w badaniach nad limfocytami T, ponieważ istnieją co najmniej dwa kłopotliwe pytania, które wymagają dalszych badań: 1) Jak dokładnie IL-6 reguluje równowagę między różnicowaniem Treg i Th17, oraz 2) jakie są dokładne mechanizmy zaburzeń zapalnych wywołanych przez IL-17? Nasza metoda wykorzystuje limfocyty T CD4+CD25- ze śledziony i węzłów chłonnych myszy C57BL/6. Ważne jest, aby pamiętać, że chociaż możliwe jest wywołanie różnicowania Th17 przy użyciu zanieczyszczonej populacji, uzyskanie co najmniej 80% czystej populacji limfocytów T CD4 + CD25 neguje wszelkie obawy o zanieczyszczenie i zapewnia bardziej pomyślne wyniki różnicowania Th17. W celu uzyskania prawidłowego różnicowania Th17, limfocyty T CD4 + CD25 inkubuje się w obecności anty-CD3 i anty-CD28, które dostarczają sygnały aktywacyjne, odpowiednio 1 i 2 oraz IL-6 i TGF-β. Chociaż doniesiono, że sama IL-23 może być wykorzystana do osiągnięcia różnicowania Th17, później wykazano, że IL-23 jest niezbędna dla stabilności populacji komórek Th17, ale IL-6 i TGF-β są niezbędne do różnicowania Th17^{3, 18, 19}. Badania na myszach wykazały, że receptor IL-23 ulega ekspresji na limfocytach T CD4 + dopiero po ich stymulacji IL-6 i TGF-β^{13, 18}. Ponadto komórki Th17 będą z powodzeniem rozwijać się w obecności przeciwciał blokujących IL-23, o ile obecne są IL-6 i TGF-β^{18, 19}. W związku z tym ten protokół różnicowania Th17 zapewnia odpowiednie warunki do skutecznego indukowania różnicowania Th17. Lepsze zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw różnicowania Th17 i produkcji IL-17 stwarza szansę na opracowanie lepszych metod leczenia chorób autoimmunologicznych¹³.

Wszystkie zwierzęta były wykorzystywane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt.

1. Przygotowanie miksów i mediów

1. Sterylne pH PBS: 7,3 (1 l)
   0,23 g NaH₂PO₄
   1,15 g na₂HPO₄
   9,0 g NaCl
   Uzupełnij objętość wodą DI. Sterylizuj w autoklawie.
2. Pożywka do hodowli komórkowych (100 ml)
   89 ml RPMI
   10 ml 10% FBS
   1 ml antybiotyku przeciwgrzybiczego (ABAM) 100 μg 50 mM 2-merkaptoetanolu (3,5 μg podstawowego 2-merkaptoetanolu na 96,5 μg PBS)
3. Bufor FACS (fluorescencyjne sortowanie komórek aktywujących) (do stosowania podczas cytometrii przepływowej) 2% FBS w sterylnym PBS
4. iTh17 Mix (na podstawie liczby próbek określić objętość potrzebną dla wszystkich mieszanek i pożywek)
   1,5 μg/ml anty-CD28
   20 ng/ml IL-6
   5 ng/ml TGF-β

2. Komórki zostaną posiane w trzech egzemplarzach w następujących warunkach

1. Anty-CD3, anty-CD28 (jest to mieszanka kontrolna aktywacji).
2. iTH17: anty-CD3, anty-CD28, IL-6, TGF-β.

3. Anty-CD3 na płytce (10 μg/ml)

Zaleca się, aby przygotowanie płytek anty-CD3 z płytkami było wykonane co najmniej 4 godziny przed dodaniem komórek do płytek.

1. Dodać 30 μl anty-CD3 do studzienek (anty-CD3 rozcieńcza się w sterylnym PBS) nowej 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej mikrotestu U z dnem i postukać w boki płytki, aby zapewnić równomierne pokrycie studzienek. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 godziny, a następnie przechowywać w lodówce do czasu dodania mieszanek i komórek do płytki.

4. Sekcja myszy

1. Protokół ten opiera się na użyciu myszy C57BL/6 w wieku 3-8 miesięcy i zakupionych w The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).
2. Ofiaruj mysz za pomocą uduszenia CO₂ i potwierdź śmierć z późniejszym zwichnięciem szyjki macicy.
3. Wysterylizuj narzędzia do preparacji myszy i obszar nacięcia 70% etanolem i rozpocznij sekcję.
4. Od strony brzusznej chwyć skórę znajdującą się przed otworem cewki moczowej i zacznij ciąć nożyczkami w górę brzusznej linii środkowej, aż dotrze do obszaru podbródka. Podejmij środki ostrożności, aby nie rozerwać ani nie wciąć się w wyściółkę ściany otrzewnej.
5. Pociągnij do tyłu skórę i przypnij w dół, aby umożliwić wygodny dostęp do węzłów chłonnych podczas usuwania.
6. Pobrane węzły chłonne i śledziony zostaną usunięte za pomocą kleszczy i umieszczone na sterylnej szalce Petriego zawierającej 5 ml buforu do biegania autoMACS zakupionego w Miltenyi Biotec (patrz rysunki 2 i 3 dla schematów usuwania węzłów chłonnych i śledziony).
   1. Usuń pachowe węzły chłonne, które znajdują się w pobliżu pachy (pachy) za mięśniami piersiowymi każdej myszy.
   2. Usuń węzły chłonne ramienne, które znajdują się w tkankach łącznych znajdujących się w pobliżu każdej pachy.
   3. Usuń powierzchowne węzły chłonne szyjki macicy znajdujące się na szyi każdej myszy.
   4. Usuń pachwinowe węzły chłonne, które znajdują się w okolicy bioder w miejscu połączenia 3 naczyń krwionośnych.
   5. Aby uzyskać dostęp do krezkowych węzłów chłonnych, przetnij otrzewną wyściełającą brzuszną linię środkową. Węzły chłonne krezkowe znajdują się w tkance łącznej, która utrzymuje jelita razem. Zwykle znajdują się w ciągu 4-8 węzłów i mogą wyglądać jak "sznur pereł". Upewnij się, że wyciągnąłeś cały sznurek.
   6. Śledziona znajduje się w okolicy brzucha, za żołądkiem i jelitami. Usuń go, ciągnąc i odłączając go od trzustki.
7. Mielenie organów pod sterylnym kapturem za pomocą 2 matowych szkiełek mikroskopowych. Umieść węzły chłonne lub śledzionę po oszronionej stronie jednego szkiełka mikroskopowego i pocieraj matową stroną drugiego szkiełka, aż się rozpadnie. Powtarzaj, aż wszystkie węzły chłonne i śledziona zostaną zmielone.

Uwaga: Zaleca się zacząć od węzłów chłonnych, a skończyć na śledzionie, ponieważ krew utrudni dostrzeżenie pozostałych węzłów chłonnych w buforze autoMAC.

9. Aby przefiltrować zmielone narządy do zawiesiny jednokomórkowej, należy zacząć od kilkukrotnego złożenia kawałka nylonu o grubości 40 μm i umieszczenia go w górnej części probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Materiał nylonowy powinien mieć wymiary około 3 x 3 cale.
10. Za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml i igły 21 G należy odessać 5 ml buforu do biegania i zmielonych organów autoMAC. Dozuj powoli do złożonego materiału nylonowego. Uważaj, aby nie przebić materiału igłą.

Uwaga: Po uzyskaniu zawiesiny pojedynczej komórki, roztwór powinien wyglądać jak blady, spójny roztwór bez widocznych kawałków tkanki stałej. Jeśli pozostaną ciała stałe, należy je ponownie zassać i dozować przez nowy złożony kawałek nylonu umieszczony w nowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.

11. Zawsze trzymaj ogniwa na lodzie, gdy nie są używane.

5. Separacja komórek

1. Aby uzyskać optymalne wyniki, uzyskaj co najmniej 80% czystą populację komórek CD4 + CD25- za pomocą separatora komórek autoMACS Pro przy użyciu zestawu do izolacji regulatorowych komórek T MACS CD4 + CD25 +, myszy. Protokół ujemnej retencji populacji komórek CD4 + CD25- uzyskuje się za pośrednictwem Miltenyi Biotec.

6. Zróżnicowanie Th17

1. Zbierz populację komórek CD4 + CD25- po oddzieleniu za pomocą separatora komórek autoMACS Pro.
2. Policz komórki rozcieńczone w stosunku 1:1000 błękitem trypanowym za pomocą hemocytometru.
3. Po ustaleniu stężenia na podstawie liczby komórek, zawiesinę komórek rozcieńczyć do 1 x 10⁶ komórek/ml w pożywce do hodowli komórkowych.
4. Po 4 godzinach wyjąć 96-dołkowe płytki z anty-CD3 związanym płytkami.
5. Studzienki pokryte powłoką anty-CD3 przemyć 200 μl PBS. Powtórz 2 razy.
   1. Aby przepłukać, dodaj 200 μl sterylnego PBS do studzienek pokrytych anty-CD3 i wyjmij PBS do pojemnika na odpady.
6. Dodać 100 μl mieszaniny iTh17 lub mieszaniny kontrolnej aktywacji (patrz punkt #2) do studzienek w trzech egzemplarzach.
7. Dodać 100 μl komórek do każdej studzienki, w której umieszczono mieszaninę Th17 lub mieszankę kontrolną aktywacji.
8. Inkubuj komórki przez co najmniej 72 godziny lub do 5 dni (różnicowanie Th17 można uzyskać po 72 godzinach lub po 5 dniach).
9. Różnicowanie Th17 można ocenić za pomocą barwienia wewnątrzkomórkowego i analizy cytometrii przepływowej, ELISA lub qPCR

7. Aktywacja komórek (konieczna tylko do barwienia wewnątrzkomórkowego)

1. Wyjąć 96-dołkowe płytki z inkubatorów po upływie 72 godzin lub 5 dni
   1. Przypomnijmy, że różnicowanie Th17 można osiągnąć po 72 godzinach lub 5 dniach.
2. Dla każdego warunku (np. kontrola aktywacji lub iTh17) przenieś komórki, które są w trzech egzemplarzach, do jednego dołka na 24-dołkowej płytce do hodowli komórek. Komórki dla jednego warunku zostały teraz zebrane w jednym dołku na 24-dołkowej płytce hodowlanej, w przeciwieństwie do trzech razy w 96-dołkowej dolnej płytce hodowlanej.
3. Całkowita objętość każdej studzienki na 24-dołkowej płytce do hodowli komórkowej wynosi teraz 600 μl. Zwiększ objętość każdej studzienki do 1 ml za pomocą pożywki do hodowli komórkowych.
4. Dodać PMA (octan mirystynianu forbolu) (50 ng/ml), jonomycynę (1 μM) i BFA (Brefeldin-A) (10 μg/ml) do każdego dołka na 24-dołkowej płytce do hodowli komórkowej w podanych stężeniach.
5. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.

8. Barwienie wewnątrzkomórkowe

1. Wybarwić komórki pożądanymi markerami zewnątrzkomórkowymi i wewnątrzkomórkowymi do analizy cytometrii przepływowej. Aby wykryć obecność IL-17, barwienie wewnątrzkomórkowe wykonuje się za pomocą przeciwciał anty-IL-17A. Zalecane markery powierzchni zewnątrzkomórkowej to CD4, CD8 i CD25.
   1. Użyj zestawu startowego do barwienia cytokin wewnątrzkomórkowych - myszy firmy BD Bioscience do barwienia wewnątrzkomórkowego IL-17.
   2. Dla każdej próbki komórki osadkowe usuwają supernatant i ponownie zawisają osad komórek w 200 μl buforze FACS (2% FBS w PBS).
   3. Przenieś zawieszone komórki na płytkę cytometrii przepływowej 96 komórek.
   4. Obracaj komórki w dół przez 5 minut z prędkością 1,200 obr./min i odrzuć supernatant.
   5. Dodać 200 μl buforu PBS FACS, odwirować przez 5 minut przy 1 200 obr./min i odrzucić supernatant.
   6. Zawiesić komórki w 100 μl buforu FACS i zastosować 100 μl mieszaniny przeciwciał zewnątrzkomórkowych (Ab) (zewnątrzkomórkowa mieszanina Ab jest wytwarzana w buforze FACS). Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, przykryć folią.
   7. Powtórz krok 8.1.4.
   8. Powtórz krok 8.1.5 2x.
   9. Zawiesić komórki w 100 μl buforu BD Cytofix/Cytoperm. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej, przykryć folią.
   10. Dodać 100 μl 1x buforu BD Perm/Wash, odwirować przez 5 minut przy 1 200 obr./min i odrzucić supernatant. Powtórzyć.
   11. Dodać 50 μl wewnątrzkomórkowej mieszaniny Ab. (Wewnątrzkomórkowa mieszanina Ab jest wytwarzana w 1x BD Perm / Wash) Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, przykryć folią.
   12. Powtórz krok 8.1.10.
   13. Zawieś komórki w 200 μl buforu barwiącego BD.
   14. Zawieszone komórki umieścić w probówkach do cytometrii przepływowej zawierających 200 μl buforu barwiącego BD (końcowa objętość to 400 μl).
   15. Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu, gdy próbki będą gotowe do odczytu.

9. Analiza cytometryczna przepływowa

1. Populacja żywych komórek bramki.
2. Z populacji żywych komórek, brama na populacji CD4 + CD8-.
3. Z populacji CD4+CD8- brama na populacji IL-17A+.
   1. Opierając się na naszych poprzednich wynikach eksperymentalnych, 100% populacji IL-17A+ będzie miało CD25+.

*Całkowita bezwzględna liczba komórek została uzyskana po trzykrotnym połączeniu próbki
**Bezwzględną liczbę komórek CD4 + CD25 + IL-17A + określono przez pomnożenie całkowitej liczby komórek przez procent żywej bramki i procent całkowitej liczby komórek zawierających markery specyficzne dla linii, CD4, CD25 i IL-17A, określone za pomocą cytometrii przepływowej.

10. qPCR i ELISA

1. Umieść komórki nieużywane do analizy cytometrycznej przepływowej w probówce Eppendorfa o pojemności 1,5 ml i odwiruj z prędkością 13 000 obr./min przez 5-10 minut. Komórki znajdujące się w osadzie komórkowej po odwirowaniu zostaną wykorzystane do analizy qPCR. Analizę qPCR przeprowadzono przy użyciu termocyklera Peltiera PTC-200 (Biorad).
2. Pobrać supernatant z probówek odwirowanych do testu ELISA. Test ELISA IL-17A przeprowadzono przy użyciu pary przeciwciał TC11-18H10 (wychwyt, numer katalogowy 555068) i biotyny TC11-8H4 (wykrycie, numer katalogowy 555067) zakupionej w BD Biosciences. Wzorce ELISA IL-17A uzyskano z eBioscience (numer katalogowy 14-8171-80).
3. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić pozostałe komórki do wykorzystania do qPCR w 175 μl buforze do lizy RNA (użyć natychmiast do ekstrakcji RNA, syntezy cDNA i qPCR lub przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania).
   1. Patrz Tabela II, aby zapoznać się z sekwencjami starterów dla IL-17A i aktyny (gen utrzymania domu)

Ten protokół różnicowania Th17 rozpoczyna się od usunięcia śledziony oraz węzłów chłonnych pachowych, ramiennych, krezkowych, szyjnych i pachwinowych. Reprezentację lokalizacji każdego z nich można znaleźć na rysunkach 2 i 3. Rysunki 1 i 5 przedstawiają wizualną reprezentację metod opisanych w niniejszym protokole.

Ten protokół Th17 skupia się na różnicowaniu od populacji limfocytów T CD4+CD25-. Ważne jest, aby zwrócić uwagę na to, jak skutecznie autoMACS Pro Cell separation wzbogaca naszą pożądaną populację CD4 + CD25- z połączonego całkowitego węzła chłonnego i śledziony (ryc. 4). Niefrakcjonowane, połączone węzły chłonne i splenocyty oraz frakcje oddzielone autoMAC wybarwiono przeciwciałami antyCD4 i antyCD25, a następnie przeprowadzono analizę cytometryczną przepływową (ryc. 4). Rycina 4A przedstawia reprezentatywny profil procentowy limfocytów CD4 + CD25 + i CD4 + CD25- obecnych w niefrakcjonowanych, zbitych węzłach chłonnych i śledzionie za pomocą cytometrii przepływowej. Procedura izolacji zapewnia również wzbogaconą populację Treg CD4 + CD25 + od myszy C57BL / 6, którą można wykorzystać w dodatkowych eksperymentach (Figura 4B). Rysunek 4C pokazuje nasze pożądane wzbogacenie komórek w populacji, która składa się w 84% z limfocytów T CD4 + CD25, z usuniętą zdecydowaną większością limfocytów Treg CD4 + CD25 +. Konsekwentnie mamy małą populację komórek nielimfatycznych, która jest obecna we wzbogaconym CD4 + CD25-, ale nie zakłóca procesu różnicowania (Figura 4C). Nasza wzbogacona populacja limfocytów T CD4 + CD25 pomaga zapewnić skuteczniejsze różnicowanie Th17.

Rysunek 5 pokazuje schemat naszej procedury różnicowania Th17. Nasza wzbogacona populacja CD4 + CD25- jest inkubowana w warunkach różnicowania Th17 (anty-CD3, anty-CD28, IL-6 i TGF-β) lub kontrolnych (anty-CD3, anty-CD28). Na rycinie 6 widać, że podczas gdy inkubacja limfocytów T CD4 + CD25 z anty-CD3, anty-CD28 przez 5 dni dała limfocyty T CD25 +, inkubacja w warunkach indukujących Th17 dała podzbiór limfocytów IL17 wytwarzających CD4 + CD25 +. Proszę zapoznać się z tabelą 1, aby zapoznać się z przykładami bezwzględnej liczby komórek CD4 + CD25 + IL-17A + po 5 dniach inkubacji w warunkach iTh17.

Status różnicowania Th17 można dodatkowo ocenić za pomocą ilościowego PCR i ELISA. Rycina 7 przedstawia dane ze wzbogaconych limfocytów T CD4 + CD25 inkubowanych w warunkach kontrolnych lub indukujących Th17. Limfocyty T CD4 + CD25 inkubowane w warunkach Th17 regulują w górę IL17A, co można ustalić za pomocą qPCR (Figura 7A) i ELISA (Figura 7B). Czynnik transkrypcyjny specyficzny dla Th17 RORγT jest również regulowany w górę przez limfocyty T CD4 + CD25 inkubowane w warunkach indukujących Th17 i można go ustalić za pomocą qPCR (Figura 7A).

Rysunek 1. Th17 Schemat różnicowania. 1. Pokryć studzienki z 96-dołkową płytką z dnem w kształcie litery U anty-CD3 (10 μg/ml) rozcieńczonym w PBS. 2. Umieścić płytkę w inkubatorze na 4 godziny w temperaturze 37 °C. Podczas inkubacji płytki wypreparuj węzły chłonne (LN) i śledzionę od myszy. Zmiel narządy i przefiltruj, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Wyizoluj limfocyty T CD4 + CD25 za pomocą zestawu do izolacji regulatorowych komórek T CD4 + CD25 + i separatora Miltenyi autoMACS Pro. Komórki CD4 + CD25- należy rozcieńczyć do 1 x 106 komórek/ml. 3. Po zakończeniu 4-godzinnej inkubacji płytki 96-dołkowej, przemyć studzienki PBS (200 μl/studzienkę) 3x4. Dodać 100 μl limfocytów T CD4 + CD25 do studzienek pokrytych płytką (PB) anty-CD3. 5. Dodaj 100 μl anty-CD28 lub 100 μl koktajlu iTh17 (antyCD28, TGF-β i IL-6). 6. Inkubować płytkę przez 3 lub 5 dni w temperaturze 37 °C. Po inkubacji ocenić różnicowanie za pomocą barwienia wewnątrzkomórkowego, qPCR i/lub ELISA.

Rysunek 2. Przewodnik po sekcji LN. A) 1 węzeł chłonny ramienny można znaleźć w tkance łącznej znajdującej się w pobliżu każdej pachy (pachy) myszy. B) 1 pachowy węzeł chłonny znajduje się w każdej pachy, za mięśniami piersiowymi. C) Węzły chłonne krezkowe znajdują się w tkance łącznej jelit. Przypominają sznur pereł. D) 4 powierzchowne węzły chłonne szyjne znajdują się na szyi myszy. E) 2 pachwinowe węzły chłonne (po 1 z każdej strony) mogą znajdować się w okolicy bioder w miejscu, w którym spotykają się 3 naczynia krwionośne.

Rysunek 3. Przewodnik po sekcji śledziony. Śledziony myszy znajdują się po lewej stronie ciała za żołądkiem i jelitami. Po prostu usuń, ciągnąc i oddzielając kleszczami.

Rysunek 4. Frakcje komórkowe z połączonych komórek LN i śledziony przed i po separacji autoMACS Pro. A) LN i komórki śledziony barwiono ex vivo w celu ustalenia wyjściowych populacji komórek przed separacją. Po rozdzieleniu frakcje CD4+CD25+(B) i CD4+CD25- (C) barwiono w celu oceny czystości odpowiednio populacji limfocytów T CD4+CD25+ i CD4+CD25-. Wszystkie próbki barwiono przeciwciałami CD4+ i CD25+ i analizowano za pomocą cytometrii przepływowej.

Rysunek 5. Zróżnicowanie Th17. Inkubuj komórki do 5 dni. Pobieranie komórek do barwienia wewnątrzkomórkowego i qPCR; zebrać supernatanty do testu ELISA.

Rysunek 6. Różnicowanie Th17 oceniane za pomocą cytometrii przepływowej. Limfocyty T CD4 + CD25 inkubowano w obecności płytki anty-CD3, anty-CD28, IL-6 i TGF-β (iTh17) lub samych anty-CD3 i anty-CD28 związanych z płytką (kontrola) przez 5 dni. Komórki były następnie aktywowane PMA i jonomycyną przez 4 godziny w temperaturze 37 °C. Po aktywacji komórki wybarwiono przeciwciałami anty-CD4, anty-CD8, anty-CD25 i anty-IL-17A do analizy cytometrii przepływowej w celu oceny różnicowania Th17. iTh17 = warunki indukujące Th17.

Rysunek 7. Różnicowanie Th17 oceniane za pomocą qPCR i ELISA. Limfocyty myszy C57BL / 6 posortowano, a limfocyty T CD4 + CD25 inkubowano w obecności związanych z płytką anty-CD3 (10 μg / ml), anty-CD28 (1,5 μg / ml), IL-6 (20 ng / ml) i TGF-β (5 ng / ml) lub samych anty-CD3 i anty-CD28 związanych z płytką (kontrola) przez 5 dni. A) Komórki zostały następnie pobrane w celu oceny ekspresji wiadomości RORγT i IL-17A za pomocą qPCR. B) Supernatanty zebrano w celu oceny ekspresji białka IL-17A metodą ELISA.

Brak informacji do zadeklarowania.