Z funkcjami efektorowymi odmiennymi od innych podzbiorów limfocytów T, komórki Th17 są centralnie zaangażowane w autoimmunizację zapalną. Ten protokół różnicowania Th17 in vitro zapewnia środki do określenia, czy naiwne limfocyty T CD4 + mogą różnicować się w komórki Th17 i dalszego badania ich roli w autoimmunizacji i odpowiedzi gospodarza.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja i różnicowanie Th17 naiwnych limfocytów T CD4
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Komórki Th17 są odrębnym podzbiorem limfocytów T, które wytwarzają interleukinę 17 (IL-17) i różnią się funkcją od innych podzbiorów limfocytów T, w tym Th1, Th2 i limfocytów T regulatorowych. Komórki Th17 okazały się głównym winowajcą nadgorliwych zapalnych odpowiedzi immunologicznych związanych z wieloma zaburzeniami autoimmunologicznymi. W tej metodzie oczyszczamy limfocyty T ze śledziony i węzłów chłonnych myszy C57BL / 6 i stymulujemy oczyszczone limfocyty T CD4 + w kontrolnych i indukujących Th17 środowiskach. Środowisko indukujące Th17 obejmuje stymulację w obecności przeciwciał anty-CD3 i anty-CD28, IL-6 i TGF-β. Po inkubacji przez co najmniej 72 godziny i przez okres do pięciu dni w temperaturze 37 °C, komórki są następnie analizowane pod kątem zdolności do wytwarzania IL-17 za pomocą cytometrii przepływowej, qPCR i ELISA. Zróżnicowane limfocyty T CD4 + CD25 Th17 można wykorzystać do dalszego wyjaśnienia roli, jaką komórki Th17 odgrywają w początku i progresji autoimmunizacji i obronie gospodarza. Co więcej, różnicowanie limfocytów CD4 + CD25 za pomocą Th17 z odrębnych mysich modeli nokautu/choroby może przyczynić się do naszego zrozumienia plastyczności losu komórki.
Wprowadzenie
Limfocyty T CD4+ (limfocyty T) odgrywają kluczową rolę w obronie układu odpornościowego przed zakaźnymi mikroorganizmami. I odwrotnie, limfocyty T są również ściśle związane z początkiem i progresją chorób autoimmunologicznych, takich jak cukrzyca typu 1, toczeń rumieniowaty układowy i reumatoidalne zapalenie stawów. Limfocyty T CD4 + ulegają aktywacji poprzez połączenie interakcji receptora limfocytów T (TCR) z cząsteczkami pokrewnego antygenu / głównego kompleksu zgodności tkankowej II (MHCII) oraz interakcji receptora CD28 z ligandami B7.1 / B7.215. Oprócz zapewnienia stymulacji TCR i kostymulacji CD28, komórki prezentujące antygen zapewniają również śro....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie zwierzęta były wykorzystywane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt.
1. Przygotowanie miksów i mediów
- Sterylne pH PBS: 7,3 (1 l)
0,23 g NaH2PO4
1,15 g na2HPO4
9,0 g NaCl
Uzupełnij objętość wodą DI. Sterylizuj w autoklawie. - Pożywka do hodowli komórkowych (100 ml)
89 ml RPMI
10 ml 10% FBS
1 ml antybiotyku przeciwgrzybiczego (ABAM) 100 μg 50 mM 2-merkaptoetanolu (3,5 μg podstawowego 2-merkaptoetanolu na 96,....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Niniejszy protokół różnicowania komórek Th17 rozpoczyna się od usunięcia śledziony oraz węzłów chłonnych pachy, ramienia, krezki, szyi i pachwiny. Przedstawienie lokalizacji każdego z nich znajduje się na rycinach 2 i 3. Ryciny 1 oraz 5 zawierają wizualną reprezentację metod opisanych w tym protokole.
Niniejszy protokół Th17 koncentruje się na różnicowaniu z populacji limfocytów T CD4+CD25-. Należy zwrócić uwagę, jak skutecznie separacja ko.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Tutaj opisaliśmy protokół umożliwiający osiągnięcie różnicowania Th17 in vitro . Badanie różnicowania Th17 jest ważne, ponieważ różnicowanie limfocytów T w podzbiór Th17 ma kluczowe znaczenie dla skutecznej eliminacji ludzkich patogenów13. I odwrotnie, produkcja IL17 jest związana z progresją choroby autoimmunologicznej13. Metoda różnicowania Th17 ma zastosowanie w wielu środowiskach badawczych, ponieważ może być stosowana do wielu różnych mysich modeli regulacji immunologicznej i autoimmun.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Brak informacji do zadeklarowania.
Podziękowania
Praca ta jest częściowo wspierana przez nagrody NIH/NCATS Clinical and Translational Science Awards dla University of Florida TL1 TR000066 i UL1 TR000064, suplement różnorodności z Parent Grant R01AI056152 z National Institute of Health, grant BD Biosciences na odczynniki oraz University of Florida.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| odczynnik/Materiał | |||
| sterylna poliestrenowa szalka Petriego | Fisher Scientific | 0875713A | 60 mm x 15 mm |
| autoMACS Bufor do biegania | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Premium Szkiełka mikroskopowe, matowe | Fisher Scientific | 12-544-3 | 3" x 1"1 mm |
| 5 ml 21G1 Strzykawka i igła bez lateksu | BD Biosciences | 309632 | |
| Corning 15 ml Probówki wirówkowe | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| Nylon 40 mikronów | Miami Aquaculture | Nylon 40/26 | |
| Mikrotest Płytka do hodowli tkankowej 96 dołków U dno | BD Biosciences | 35-3077 | |
| Corning Costar 24-dołkowe płytki do hodowli komórkowych | Sigma-Aldrich | CL3524 | |
| Probówki Eppendorf 1,5 ml | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Oczyszczony NA/LE Chomik Anty-Mysz CD3e | BD Biosciences | 553057 | |
| Oczyszczony NA/LE Chomik Anty-Mysz CD28 | BD Biosciences | 553294 | |
| Mysz IL-6 Rekombinowane białko | eBioscience | 14-8061-62 | |
| TGFbeta | R& D Systems | 240-B-002 | |
| Roztwór niebieskiego trypana 0,4 % | Sigma-Aldrich | 66H2364 | |
| Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4 | BD Biosciences | 558107 | |
| APC Rat Anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 553035 | |
| PE Sprzężony anty-mysz CD25 | eBioscience | E01155-516 | |
| Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17 | BD Biosciences | 560820 | |
| Zestaw startowy do barwienia cytokin wewnątrzkomórkowych-Mysz | BD Biosciences | 51-2041AK (559311) | |
| MACS CD4 + CD25 + zestaw do izolacji regulatorowych komórek T, mysz | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| ABAM | Cellgro | 30-004-CI | |
| RPMI | Corning, Cellgro | 10-040-CM | |
| B 2-Mercapt– tanol | MP Biomedical | 194834 | Niebezpieczny |
| 12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA) | |||
| Sól wapniowa jonomycyny | Sigma-Aldrich | 13909-1ML | Niebezpieczna |
| Brefeldin A (BFA) | MP Biomedicals | 159027 | |
| ELISA IL-17A Wychwyt mAb | BD Biosciences | 555068 | |
| ELISA IL-17A Wykrywanie mAb | BD Biosciences | 555067 | |
| Test ELISA IL-17A Standard | eBioscience | 14-8171-80 | |
| Zestaw ELISA IL-2 Zestaw | BD Biosciences | ||
| TMB | BD Biosciences | 555214 | |
| Equipment | |||
| autoMACS Pro Separator komórek | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| Wirówka Sorvall Legend RT+ | Inkubator CO2 ThermoScientific | ||
| Napco series 8000 WJ | Termocykler | ||
| PTC-200 | Biorad |
Bibliografia
- Chen, Z., Lin, F., et al. Foxp3 and RORγT: transcriptional regulation of Treg and Th17. International Immunopharmacology. 11, 536-542 (2011).
- Cua, D. J., Sherlock, J., et al. Interleukin-23 rather than interleuk....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
