Ustrukturyzowany protokół jest prezentowany dla testu komórkowego jako test funkcjonalny do przewidywania rokowania skoliozy idiopatycznej za pomocą komórkowej spektroskopii dielektrycznej (CDS). Test można wykonać na świeżych lub mrożonych komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC), a procedura zostaje zakończona w ciągu 4 dni.
Artykuł metodologiczny
Protokół testu komórkowego do prognozowania skoliozy idiopatycznej za pomocą komórkowej spektroskopii dielektrycznej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ten protokół szczegółowo opisuje eksperymentalną i analityczną procedurę dla testu komórkowego opracowanego w naszym laboratorium jako test funkcjonalny do przewidywania rokowania skoliozy idiopatycznej u dzieci bezobjawowych i dotkniętych chorobą. Test polega na ocenie stanu funkcjonalnego białek Gi i Gs w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) za pomocą komórkowej spektroskopii dielektrycznej (CDS), przy użyciu zautomatyzowanego instrumentu opartego na CDS, oraz klasyfikacji dzieci do trzech grup funkcyjnych (FG1, FG2, FG3) w odniesieniu do profilu nierównowagi między stopniem odpowiedzi na stymulację białkami Gi i Gs. Klasyfikacja ta jest dodatkowo potwierdzona przez zróżnicowany wpływ osteopontyny (OPN) na odpowiedź na stymulację żołądkowo-jelitową między grupami, a ciężki postęp choroby jest określany przez FG2. W przybliżeniu do ekstrakcji PBMC za pomocą gradientu Ficoll potrzebna jest objętość 10 ml krwi, a następnie komórki są przechowywane w ciekłym azocie. Odpowiednią liczbę PBMC do przeprowadzenia testu uzyskuje się po dwóch dniach hodowli komórkowej. Zasadniczo komórki są najpierw inkubowane z fitohemmaglutyniną (PHA). Po 24 godzinach inkubacji pożywkę zastępuje się pożywką hodowlaną wolną od PHA na dodatkowe 24 godziny przed wysiewem komórek i traktowaniem OPN. Komórki są następnie spektroskopowo badane pod kątem ich reakcji na somatostatynę i izoproterenol, które odpowiednio aktywują białka Gi i Gs poprzez pokrewne receptory. Zarówno somatostatyna, jak i izoproterenol są jednocześnie wstrzykiwane za pomocą zintegrowanego systemu fluidics, a odpowiedzi komórek są monitorowane przez 15 minut. Test można wykonać przy użyciu świeżych lub mrożonych PBMC, a procedura jest zakończona w ciągu 4 dni.
Wprowadzenie
Skolioza idiopatyczna to deformacja kręgosłupa o nieznanej przyczynie, ogólnie definiowana jako boczne skrzywienie większe niż 10 stopni, któremu towarzyszy rotacja kręgów1. Choroba dotyka 4% populacji pediatrycznej i jest najczęściej diagnozowana w wieku od 9 do 13 lat2,3,4. Diagnoza ma przede wszystkim charakter wykluczający i jest stawiana dopiero po wykluczeniu innych przyczyn deformacji kręgosłupa, takich jak malformacje kręgów, zaburzenia nerwowo-mięśniowe lub syndromiczne. Tradycyjnie, asymetria tułowia ujawnia się za pomocą testu zginania do przodu Adamsa i mierzy się za pomocą skoliometru podczas badania fizykalnego5. Diagnozę można następnie potwierdzić poprzez obserwację radiologiczną krzywej i pomiar kąta przy użyciu metody Cobba6.
Po zdiagnozowaniu, głównym zmartwieniem lekarzy zajmujących się leczeniem skoliotycznych dzieci jest to, czy krzywa będzie postępować. Rzeczywiście, progresja krzywej jest często nieprzewidywalna i częściej obserwuje się ją u dziewcząt niż u chłopców7. Nieleczona krzywa może gwałtownie postępować, powodując znaczną deformację fizyczną, a nawet problemy krążeniowo-oddechowe. Objawy te stają się zagrożeniem dla życia, gdy krzywa przekracza 70° 8,9. Obecne opcje leczenia mające na celu zapobieganie lub zatrzymanie progresji krzywizny obejmują usztywnienie i zabieg chirurgiczny. Ogólnie rzecz biorąc, usztywnienie jest zalecane w przypadku krzywizn w zakresie 25-40°, podczas gdy chirurgia jest zarezerwowana dla krzywizn większych niż 45° lub niereagujących na usztywnienie.
W przybliżeniu, 10% dzieci, u których zdiagnozowano skoliozę idiopatyczną, ma progresję krzywej wymagającą operacji korekcyjnej10. Obecnie nie ma sprawdzonej metody ani testu pozwalającego zidentyfikować tę kategorię pacjentów. W związku z tym wszystkie zdiagnozowane dzieci są poddawane wielokrotnym badaniom rentgenowskim przez kilka lat, zwykle do momentu osiągnięcia dojrzałości kostnej. Szacuje się, że typowi pacjenci ze skoliozą będą mieli około 22 badań radiologicznych w okresie 3lat11. Ze względu na potencjalne ryzyko wielokrotnych badań radiologicznych, zdecydowanie pożądane są alternatywne podejścia, które mogłyby pozwolić na wykonanie prognozy skoliozy idiopatycznej bez narażania dzieci na promieniowanie jonizujące. Mając na celu zaspokojenie tej potrzeby, opracowaliśmy wcześniej test przesiewowy oparty na komórkach jako test prognostyczny, aby szybciej zidentyfikować bezobjawowe dzieci zagrożone rozwojem skoliozy idiopatycznej. Test przewiduje wynik kliniczny zarówno u dzieci bezobjawowych, jak i dotkniętych chorobą, badając stan funkcjonalny białek Gi i klasyfikując dzieci do trzech grup funkcjonalnych (FG1, FG2 i FG3) zgodnie ze stopniem maksymalnej odpowiedzi na stymulację białkiem Gi12 mierzonym przez system oparty na CDS. System ten jest w dużej mierze wykorzystywany do oceny transdukcji sygnału przez białka G w różnych typach komórek13,14,15,16. Dostarcza informacji dotyczących całkowitej zintegrowanej odpowiedzi komórek na bodźce zewnętrzne poprzez pomiar zmian impedancji po aktywacji receptorów na powierzchni komórki. Komórki są umieszczane w mikropłytkach, które zawierają elektrody na dnie studzienek, a system przykłada niewielkie napięcie, które indukuje prądy zewnątrzkomórkowe i transkomórkowe. Po wstrzyknięciu związku do studni stymulowane są receptory powierzchniowe komórek i zachodzą zdarzenia transdukcji sygnału, prowadzące do zmian komórkowych, które wpływają na przepływ prądów zewnątrzkomórkowych i transkomórkowych, a tym samym wpływają na mierzoną wielkość. Dzięki takiemu podejściu pacjenci ze skoliozą i dzieci bardziej narażone na rozwój skoliozy są mniej wrażliwi na stymulację białkiem Gi w porównaniu ze zdrowymi osobami z grupy kontrolnej, a klasyfikacja opiera się na procentowym stopniu redukcji w stosunku do grupy kontrolnej. Przedziały klasyfikacyjne są ustalone na poziomie od 10 do 40% dla grupy roboczej 3, od 40 do 60% dla grupy roboczej 2 oraz od 60 do 90% dla grupy roboczej12.
Ostatnio zmodyfikowaliśmy to podejście, pokazując, że trzy grupy funkcyjne można wyraźnie rozróżnić według profilu nierównowagi między reakcją na stymulację Gi i Gs. Rzeczywiście, stwierdziliśmy, że odpowiedź na stymulację Gi dominowała w FG3, podczas gdy nie zaobserwowano widocznej nierównowagi w FG2. W przeciwieństwie do tego, FG1 wykazywał przewagę w odpowiedzi na stymulację Gs. Ponadto dostarczyliśmy dowody na to, że pacjenci należący do FG2 są bardziej narażeni na progresję do punktu, w którym konieczna jest operacja17. Precyzja tego testu klasyfikacyjnego została dodatkowo poprawiona poprzez wykazanie zróżnicowanego wpływu osteopontyny (OPN) na odpowiedź na stymulację Gi między grupami funkcjonalnymi.
Tutaj dokumentujemy szczegółowe kroki eksperymentalnych i analitycznych procedur tego testu funkcjonalnego, który jest obecnie wykonywany w naszym laboratorium.
Protokół
Cała procedura jest przeprowadzana pod sterylnym kapturem biologicznym i wszystkie roztwory i urządzenia mające kontakt z komórkami muszą być sterylne.
1. Przygotowanie niezbędnych rozwiązań
- Przygotować roztwory zgodnie z tabelą 1.
- Przechowywać zbilansowany roztwór soli (BSS) w temperaturze pokojowej, a wszystkie inne roztwory w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
- Podgrzej zimne podłoże do temperatury 37 °C w łaźni wodnej przez kilka minut przed użyciem.
2. Przygotowanie i przechowywanie PBMC
- Zebrać 10 ml krwi pełnej w probówkach pobranych poddanych działaniu EDTA, aby przygotować dwie porcje PBMC, używając 5 ml na każdą podwielokrotność.
- Przenieść 5 ml krwi pełnej z probówki pobranej poddanej działaniu EDTA do probówki o pojemności 50 ml.
- Dodać równą objętość BSS i wymieszać próbkę, delikatnie pipetując w górę i w dół.
- Umieścić 3 ml Ficollu w dwóch 15 ml probówkach Falcon.
- Ostrożnie nałożyć 4,5 ml rozcieńczonej mieszaniny krwi na Ficoll w każdej probówce.
- Pozostaw probówki na odpoczynek do 5 minut, aby sprzyjać wyraźnemu oddzieleniu krwi i figlu.
- Odwirować probówki o masie 400 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej bez hamulca.
- Ostrożnie wyjmij probówki z wirówki, aby nie naruszyć warstwowania. PBMC są widoczne na styku BSS/Ficoll.
- Zebrać mętną warstwę PBMC na granicy faz obu probówek za pomocą pipety i przenieść do nowej probówki o pojemności 50 ml.
- Dodać 20 ml kompletnej pożywki.
- Odwirować probówkę o masie 288 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej.
- Usunąć supernatant przez aspirację.
- Zawiesić osad komórkowy w 500 μl pożywki uzupełniającej.
- Dodaj równą objętość pożywki do zamrażania.
- Przenieś zawiesinę komórek do kriowialnego.
- Umieść kriowial w pojemniku do kriozamrażania z izopropanolem.
- Przechowywać pojemnik do zamrażania w temperaturze -80 °C przez noc.
- Przenieść zamrożone PBMC podwielokrotności do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.
3. Test funkcjonalny
1. Dzień 1
- Umieścić porcję ciekłego azotu w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na minutę lub do rozmrożenia.
- Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 50 ml za pomocą sterylnej pipety.
- Dodać 15 ml kompletnej pożywki i wirować komórki w temperaturze 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Usunąć supernatant przez aspirację.
- Delikatnie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki PHA.
- Uzupełnić objętość do 20 ml tym samym podłożem.
- Luźno zakryj rurkę, aby umożliwić dopływ powietrza.
- Pozostawić probówkę na noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 , aby umożliwić limfocytom w stanie spoczynku przekształcenie się w szybko proliferujące limfoblasty.
2. Dzień 2
- Wyjmij probówkę z inkubatora, całkowicie zakręć nakrętki i obracaj komórki w temperaturze 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Usunąć supernatant przez aspirację.
- Delikatnie zawiesić osad komórkowy w 1 ml kompletnego podłoża.
- Uzupełnić objętość do 20 ml tym samym podłożem.
- Luźno zakryj rurkę, aby umożliwić dopływ powietrza.
- Pozostawić probówkę na noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 w celu zwiększenia liczby komórek.
3. Dzień 3
- Wyjmij probówkę z inkubatora, całkowicie zakręć nakrętki i obracaj komórki w temperaturze 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Usunąć supernatant przez aspirację.
- Umyć komórki dwukrotnie 10 ml RPMI-1640 przez odwirowanie przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Delikatnie zawiesić osad ogniw w 600 μl RPMI-1640.
- Zmierz stężenie komórek i żywotność za pomocą automatycznego licznika komórek i analizatora żywotności.
- Dodaj odpowiednią objętość RPMI-1640, aby dostosować się do stężenia komórek 1,5 x 105 komórek/20 μl.
- Potraktuj komórki rekombinowanym OPN (rOPN) lub nośnikiem (PBS) w 1,5 ml probówek Eppendorfa.
- Przenieść 100 μl zawiesiny komórkowej do dwóch sterylnych probówek Eppendorfa o pojemności 1,5 ml.
- Dodać rOPN w jednej probówce do końcowego stężenia 0,5 μg/ml.
- Dodać równą objętość PBS do drugiej probówki.
- Delikatnie wymieszaj każdy warunek, pipetując dwukrotnie w górę i w dół za pomocą sterylnej pipety o pojemności 100 μl.
- Przygotować małą próbkę 96-dołkowej mikropłytki.
- Dodaj 5 μl RPMI-1640 do każdego dołka.
- Odwirować płytkę o masie 200 x g przez 3 minuty, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.
- Wysiewaj komórki niepoddane działaniu substancji, a także komórki potraktowane rOPN lub PBS.
- Przed przeniesieniem komórek z probówki na mikropłytkę należy delikatnie pipetować w górę i w dół, aby zapewnić równomierne zawieszenie komórek.
- Dodać 40 μl zawiesiny komórek na studzienkę czterokrotnie w przypadku komórek niepoddanych działaniu substancji, w dwóch powtórzeniach w przypadku komórek poddanych działaniu rOPN lub PBS. Patrz rysunek 1, aby zapoznać się z projektem. Taka konstrukcja pozwala na przebadanie 12 pacjentów na tej samej mikropłytce.
- Pozostaw płytkę komórkową pod sterylnym kapturem na 5 minut, aby komórki mogły odpocząć i równomiernie osiąść na dnie studzienki przed umieszczeniem w inkubatorze.
- Inkubować płytkę przez 18 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 w celu optymalizacji działania OPN.
4. Dzień 4
- Uruchom płytkę związkami.
- Wyjąć płytkę z inkubatora i pozostawić ją w temperaturze pokojowej na około 30 minut.
- Przygotować 1 ml 100 μM somatostatyny i izoproterenolu w RPMI-1640, dodając 10 μl roztworu podstawowego (10 mM) do 990 μl RPMI-1640.
- Napełnij płytkę złożoną, dozując 20 μl do odpowiednich studzienek, jak pokazano na rysunku 2.
- Przykryć płytkę złożoną wstępnie naciętą, przebijaną uszczelką, aby uniknąć zmiany stężenia związku spowodowanej parowaniem przed lub w trakcie inkubacji w systemie opartym na CDS.
- Płytka ogniwa obciążnikowego, końcówki pipet i płytka złożona do systemu opartego na CDS.
- Nazwij tabliczkę w oprogramowaniu instrumentu opartym na CDS.
- Wybierz odpowiedni protokół. Protokół zredagowany w celu klasyfikacji z PBMC nazywa się "Agonist Non-adherent cells Small Sample Plate RT 15 min". Przejdź do pola protokołu i wybierz ten protokół z listy protokołów
- Zainicjuj protokół, klikając "Start".
- Zintegrowany system fluidics jednocześnie dodaje związki do wszystkich studzienek, wstrzykując 5 μl na studzienkę, aby osiągnąć końcowe stężenie 10 μM przy całkowitej objętości 50 μl.
- System oparty na CDS automatycznie zbiera dane przez 15 minut po dodaniu mieszanki.
- analiza danych
- Wybierz niskie i wysokie zakresy częstotliwości, które mają być używane podczas obliczania wyodrębnionych wartości dla komórek nieprzylegających.
- Wybierz korekcję dryftu, aby skorygować liniową zmianę pomiarów impedancji linii bazowej w czasie.
- Wybierz filtrowanie danych, aby zmniejszyć różnice w pomiarze odpowiedzi kinetycznej spowodowane szumem elektronicznym i dodawaniem związków.
- Wybierz metodę Max-Min, aby uzyskać pełny czas analizy.
- Eksportuj dane do Excela w opcji formatu blachy.
- Obliczyć delta G (ΔG), odejmując średnią wielkość odpowiedzi na stymulację Gi (RmGi) od średniej wielkości odpowiedzi na stymulację Gs (RmGs) przy użyciu następującego wzoru:
ΔG = RmGi - RmGs - Obliczyć procentowy udział efektu krotności (Fe) OPN w odpowiedzi za pośrednictwem przewodu pokarmowego, dzieląc średnią wielkość odpowiedzi na stymulację Gi w obecności OPN (RmGiOPN) przez średnią wielkość odpowiedzi na stymulację Gi w obecności PBS (RmGiPBS), korzystając z następującego wzoru:
Fe = 100 x (RmGiOPN/RmGiPBS) - Patrz Tabela 2 w celu klasyfikacji pacjentów.
Wyniki
Żywotność komórek była porównywalna we wszystkich próbkach, a wartości mieściły się w zakresie od 86 do 96%. W przeciwieństwie do tego, odnotowano duże różnice w liczbie komórek pomiędzy próbkami (Tabela 3). Z 32 wykorzystanych próbek dwie posiadały niewystarczającą liczbę komórek i nie zostały zaklasyfikowane. Przykład wyników klasyfikacji funkcjonalnej zgodnie ze stopniem niezrównoważenia między sygnalizacją Gi i Gs przedstawiono na Rysunku 3. Oś pionowa tego rysunku jest podzielona na trzy sekcje wyznaczające grupy funkcjonalne z zakresami dynamicznymi ustalonymi jako > +10 dla FG3, od +10 do -10 dla FG2 i wreszcie < -10 dla FG1. spośród 30 przebadanych tutaj pacjentów 14, 6 i 5 pacjentów zostało wyraźnie zaklasyfikowanych odpowiednio do grup FG3, FG2 i FG1, podczas gdy pięciu pacjentów, w szczególności 345, 353, 370, 371 i 382, znajdowało się na granicy zakresów. Ocena wpływu OPN na odpowiedź na stymulację Gi wykazała, że OPN zwiększył odpowiedź u pacjentów 353 i 371. W przeciwieństwie do tego, odpowiedź została zredukowana o więcej niż 50% u pacjentów 345 i 382 oraz o mniej niż 50% u pacjenta 370 po leczeniu rOPN. Zatem, zgodnie z naszymi kryteriami klasyfikacji (Tabela 2), byliśmy w stanie zakwalifikować pacjentów 353 i 371 do FG1, pacjentów 345 i 382 do FG2 oraz pacjenta 370 do FG3. Równolegle wszyscy pacjenci zostali przebadani pod kątem odpowiedzi na stymulację białkiem Gi i porównani z osobami z grupy kontrolnej. Zgodnie z oczekiwaniami, wszyscy pacjenci wykazywali mniejszą odpowiedź niż osoby z grupy kontrolnej, a pacjenci zaklasyfikowani do tej samej grupy funkcjonalnej za pomocą naszej nowej procedury wykazywali podobne poziomy maksymalnej odpowiedzi (Rysunek 5). Ponadto rozbieżność między pacjentami z każdej grupy funkcjonalnej była zgodna z naszym klasycznym zakresem klasyfikacji 12, co potwierdza poprawność naszej nowej procedury. Klasyfikacja dużej kohorty pacjentów ze skoliozą regularnie obserwowanych w naszej specjalistycznej klinice w szpitalu Sainte-Justine wykazała, że trzy grupy funkcjonalne były podobnie rozmieszczone w przypadkach umiarkowanych, podczas gdy FG2 przeważała w przypadkach ciężkich (Rysunek 6), co pozwala zidentyfikować pacjentów zakwalifikowanych do tej grupy funkcjonalnej jako osoby bardziej narażone na ciężki postęp choroby i wskazuje, że ten test klasyfikacyjny może być przydatny w prognozowaniu idiopatycznej skoliozy.
| Roztwór A | Bezwodna D-glukoza | 0.1% |
| CaCl22 2H2O | 0,05 mM | |
| MgCl₂2 | 0,98 mM | |
| KCl | 5,4 mM | |
| Tris | 145 mM | |
| Roztwór B | NaCl | 140 mM |
| Zrównoważony roztwór soli (BSS) | Roztwór A | 1 objętość |
| Roztwór B | wolumen 9 | |
| Pożywka kompletna | RPMI-1640 | 500 ml |
| Antybiotyk-antymykotyk | 1% | |
| płócowka wołowa (FBS) | 10% | |
| Materiały uzupełniające | RPMI-1640 | 50 ml |
| Antybiotyk-przeciwdrobnoustrojowy (antybiotyk-przeciwygrzybkowy) | 1% | |
| FBS (płytki surowica bydlęca) | 40% | |
| Podłoża do mrożenia | RPMI-1640 | 50 ml |
| Antybiotyk-przeciwgrzybiczy | 1% | |
| płodowa surowica bydlęca | 40% | |
| DMSO | 20% | |
| pożywka PHA | RPMI-1640 | 500 ml |
| Antybiotyk-lekarstwo przeciwgrzybicze | 1% | |
| płucalna surowica wołowa | 10% | |
| Fitohemaglutynina | 1% |
Tabela 1. Niezbędne roztwory.
| Zakresy dynamiczne z ΔG | Grupy funkcyjne | Zakresy dynamiczne z Fe |
| ΔG< -10 | FG1 | Fe>100% |
| -10 <ΔG< +10 | FG2 | Fe<50% |
| ΔG> +10 | FG3 | 50% |
Tabela 2. Kategoryzacja grup funkcyjnych zgodnie z zakresami dynamicznymi ustalonymi dla ΔG i Fe.
| Pacjenci | Żywotność (%) | Stężenie komórek (×106/ml) | Komentarze |
| 343 | 88.7 | 11.64 | |
| 344 | 90.5 | 13.6 | |
| 345 | 94.4 | 8.54 | |
| 346 | 94.3 | 25.79 | |
| 347 | 94.2 | 27.36 | |
| 348 | 94.6 | 8.52 | |
| 349 | 91.2 | 0.82 | Niewystarczająca liczba komórek |
| 350 | 90.3 | 8.92 | |
| 352 | 92.6 | 8.28 | |
| 353 | 91.3 | 12.75 | |
| 354 | 86.9 | 7.62 | |
| 355 | 91.2 | 7.51 | |
| 356 | 90.3 | 9.36 | |
| 358 | 95.1 | 16.94 | |
| 359 | 92.3 | 13.89 | |
| 360 | 89.4 | 7.67 | |
| 361 | 93.5 | 7.84 | |
| 365 | 86.5 | 2.2 | Niewystarczająca liczba komórek |
| 368 | 92.6 | 15.69 | |
| 369 | 93.4 | 10.9 | |
| 370 | 92.5 | 19.93 | |
| 371 | 88.8 | 10.68 | |
| 374 | 93.9 | 16.86 | |
| 376 | 92.9 | 15.67 | |
| 377 | 93.1 | 9.99 | |
| 378 | 93.6 | 13.57 | |
| 379 | 92.6 | 19.86 | |
| 380 | 91.1 | 8.46 | |
| 381 | 93.9 | 14.82 | |
| 382 | 92.1 | 23.06 | |
| 383 | 92.9 | 11.82 | |
| 384 | 89.1 | 7.73 |
Tabela 3. Procent żywotności i stężenie komórek określone za pomocą automatycznego licznika komórek i analizatora żywotności.
Rysunek 1. Projekt wysiewu komórek.
Rysunek 2. Schemat dozowania związków.
Rycina 3. Zakres dynamiczny klasyfikacji funkcjonalnej z wykorzystaniem systemu opartego na CDS. Wykres przedstawia wartości stopnia niezrównoważenia między odpowiedziami na stymulację Gi i Gs uzyskanymi w PBMC od pacjentów z idiopatyczną skoliozą. Wartości zmierzono systemem opartym na CDS w odpowiedzi na 10 μM somatostatyny i izoproterenolu. Każdy punkt reprezentuje ΔG obu odpowiedzi wykonanych w duplikacie.
Rysunek 4. Wpływ rOPN na odpowiedź PBMC na stymulację Gi. Komórki poddano głodzeniu seryjnemu przez 18 hr w obecności lub w nieobecności 0,5 μg/ml rOPN, a następnie stymulowano 10 μM somatostatyną w celu zainicjowania komórkowej odpowiedzi zapśredniczonej przez Gi. Dane na wykresie zostały wygenerowane z maksymalnej i minimalnej impedancji i odpowiadają średniej z odpowiedzi w dwóch powtórzeniach.
![Krzywe odpowiedź-dawka dla somatostatyny; analiza farmakologiczna; wykres log[Mol] w funkcji znormalizowanej odpowiedzi.](/files/ftp_upload/50768/50768fig5.jpg "figure-results-5")
Rysunek 5. Status funkcjonalny białka Gi w PBMC osób z grupy kontrolnej i osób z kifozą/skoliozą. PBMC od osób z grupy kontrolnej oraz pacjentów z kifozą/skoliozą poddano działaniu rosnących stężeń somatostatyny w celu stymulacji białek Gi poprzez endogenny receptor somatastatyny. Odpowiedź komórkową zmierzono za pomocą systemu opartego na CDS, zgodnie z opisem w sekcji procedury. Krzywe wygenerowano na podstawie maksymalnej i minimalnej impedancji. Każda krzywa reprezentuje regresję nieliniową. Dane znormalizowano do maksymalnej odpowiedzi w komórkach od osób z grupy kontrolnej, a każdy punkt odpowiada średniej z odpowiedzi w dubletach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.
Rysunek 6. Rozkład grup funkcyjnych w różnych fazach skoliozy. Duża kohorta pacjentów ze skoliozą, obejmująca 794 przypadki umiarkowane (krzywizny od 10-44°) oraz 162 przypadki ciężkie (krzywizna powyżej 45°), regularnie monitorowanych w szpitalu Sainte-Justine, została sklasyfikowana według stopnia braku równowagi między odpowiedzią na stymulację Gi i Gs. Odpowiedzi mierzono za pomocą systemu opartego na CDS w odpowiedzi na 10 μM somatostatyny i izoproterenolu.
Dyskusja
Opisaliśmy szczegółową procedurę komórkowego testu prognostycznego na skoliozę idiopatyczną, który ma zastosowanie do komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) świeżo wyizolowanych lub zakonserwowanych zamrożonych przez okres do jednego roku w ciekłym azocie. Ponieważ stosowanie świeżo wyizolowanych PBMC jest kłopotliwe w przypadku testowania dużej liczby osób, procedura została przedstawiona z wykorzystaniem zamrożonych PBMC, które stanowią bardziej praktyczną alternatywę w warunkach klinicznych. Jednak problemy z zlepianiem się komórek po rozmrożeniu wystąpiły, gdy początkowo zastosowano zamrożone PBMC, co czasami prowadziło do zmienności między testami. Aby zmaksymalizować odtwarzalność testu, zalecamy unikanie cyklu zamrażania i rozmrażania oraz użycie zamrożonej próbki tylko raz. Procedura jest bardzo prosta, pozwala na dokładne wykrycie wadliwej funkcji białka Gi w krótkim czasie. Korzystając z tej procedury, dzieci bezobjawowe i skoliotyczne można łatwo sklasyfikować, aby lepiej przewidzieć ich wynik kliniczny bez żadnego zagrożenia dla ich zdrowia. Jednak przy dokonywaniu klasyfikacji według stopnia maksymalnej odpowiedzi na stymulację żołądkowo-jelitową w stosunku do zdrowych osób z grupy kontrolnej 12, powinno być spełnionych kilka wymagań dla osób kontrolnych. Rzeczywiście, aby mieć właściwą kohortę porównawczą, osoby kontrolne muszą być dopasowane pod względem wieku i płci, nie przyjmować żadnych leków i dostarczać prywatnych informacji, takich jak wcześniejsza indywidualna/rodzinna historia medyczna. Wymogi te mogą stanowić poważną przeszkodę w rekrutacji osób kontrolnych. Dlatego przeprowadzenie klasyfikacji poprzez zbadanie stopnia nierównowagi między odpowiedzią na stymulację białkiem Gi i Gs u tej samej osoby jest idealne do wyeliminowania konieczności korzystania z usług osób kontrolnych.
Zastosowanie systemu opartego na CDS do wykonania tego testu prognostycznego jest istotne pod względem jednoczesnego dostarczania odpowiedzi komórkowych za pośrednictwem Gi i Gs w tym samym teście. Chociaż wielu pacjentów można sklasyfikować bez żadnych niejasności przy użyciu zakresu dynamicznego ustalonego dla tego testu, niewielka liczba pacjentów będzie wykazywać wartości na granicy zakresów, jak pokazano w niniejszym raporcie. Aby rozróżnić te osoby, wprowadziliśmy ocenę wpływu OPN na odpowiedź na stymulację Gi, wykazując, że OPN indukuje zróżnicowany wpływ na odpowiedź komórkową za pośrednictwem Gi między trzema grupami funkcjonalnymi. Rzeczywiście, stwierdziliśmy, że w obecności OPN odpowiedź na stymulację Gi wzrasta w FG1, podczas gdy zmniejsza się w FG2 i FG3, w większym stopniu w FG2. Pomimo wysokich kosztów OPN, zastosowanie tej chemokiny jest niezbędne do rozróżnienia niejednoznacznych przypadków, a tym samym poprawy dokładności naszego testu klasyfikacyjnego. Jednak ten test ma wadę polegającą na tym, że do zaobserwowania odpowiedzi komórkowej za pomocą systemu opartego na CDS w naszych warunkach eksperymentalnych wymagane jest co najmniej 1,5 x10 5 komórek na studzienkę. Niektóre próbki pacjentów nie będą miały wystarczającej liczby komórek do przetestowania. W takim przypadku konieczne jest wezwanie pacjentów w celu dodatkowego pobrania krwi, co może być niepokojące dla rodzin i frustrujące dla personelu medycznego i laboratoryjnego. W naszym laboratorium planowane są badania prospektywne mające na celu rozwiązanie tego problemu.
Niemniej jednak obecny protokół opiera się na prostych i sprawdzonych metodach przygotowania komórek, podczas gdy testowanie jest zautomatyzowane przy użyciu zwalidowanego systemu bez etykiet 13, 14 do monitorowania odpowiedzi komórek. Platforma testowa jest stosunkowo niedroga w porównaniu z platformą genetyczną dostępną do prognozowania innych chorób. Ponadto koszt wszystkich materiałów jednorazowego użytku, w tym probówek do pobierania krwi, końcówek, specjalnych mikropłytek elektrod oraz stożkowych i probówek Eppendorfa, nie jest bardzo wysoki i szacuje się go na mniej niż 3000 USD za wykonanie testu dla około tysiąca pacjentów. Chociaż szacunki te nie obejmują kosztów pracy związanych z przygotowaniem próbek i wykonaniem testu, test ten pozostaje znacznie tańszy niż platformy sekwencjonowania nowej generacji. Na uwagę zasługuje nie tylko porównanie kosztów z platformami genetycznymi, ale bardziej szczegółowo związane z dziedziną AIS, koszty związane z obrazowaniem radiologicznym. Obecnie u ponad miliona dzieci w USA i około 100 000 dzieci w Kanadzie diagnozuje się skoliozę idiopatyczną, a całkowity koszt diagnozy i monitorowania skoliozy dzieci za pomocą promieniowania rentgenowskiego wynosi ponad 2,5 miliarda dolarów rocznie w Ameryce Północnej. W związku z tym oczekuje się, że nasza procedura testu komórkowego będzie odpowiednia do rutynowych badań przesiewowych i monitorowania dzieci ze skoliozą idiopatyczną bez ryzyka dla zdrowia i przy niższych kosztach.
Oświadczenia
Prace te doprowadziły do uzyskania kilku patentów przez Szpital Uniwersytecki Sainte-Justine, a wiele innych oczekuje na opatentowanie w kilku krajach. Fourth Dimension Spine LLC jest wyłącznym licencjobiorcą Szpitala Uniwersyteckiego Sainte-Justine.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty z La Fondation Yves Cotrel de l'Institut de France, Paryż, Francja (dla Dr. Moreau), The Canadian Institutes of Health Research (grant PP2-99466 dla Dr. Moreau) oraz z Fourth Dimension Spine LLC, Nowy Jork, USA (grant badawczy dla Dr. Moreau).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Materials | |||
| RPMI | Bisent, Inc | 350-005-CL | |
| FBS | Therno Scientific Hyclone | SH3007103 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17144003 | |
| Antybiotykowo-przeciwgrzybiczy | Invitrogen | 15240-062 | |
| Fitohemaglutynina | Invitrogen (Gibco) | 10576-015 | |
| Rekombinowana ludzka osteopontyna | R& D Systems, Inc | 1433-OP/CF | |
| Somatostatyna | Tocris | 1157 | |
| Izoproterenol | Tocris | 1743 | |
| PBS | Żubel, Inc | 311-010-CL | |
| Sterylne końcówki do pipet | Axygen Scientific | 301-06-451 | |
| Sterylne probówki Eppendorf | Ultident | 24-MCT-150-C | |
| 50 ml stożkowe rurki | VWR International | 89039-658 | |
| Mała próbka Cellkey Mikropłytka 96 W | Urządzenia molekularne | 1026496 | |
| Końcówki Cellkey | Cybio | OL3800-25-559N | |
| Wstępnie wycięte uszczelki przebijane | Excel Scientific, Inc | XP-100 | |
| Equipment | |||
| Vicell XR | Beckman Coulter | 731050 | Automatyczny licznik komórek |
| Kaptur do hodowli komórkowych | Forma Scientific | 1284 | Klasa II |
| Magazynowanie ciekłego azotu | Thermo Scientific | CY5093570 | |
| Łaźnia wodna | VWR International | 89032-204 | |
| Standardowy mikroskop świetlny | Leica Microsystems | DMIL LED | |
| Inkubator do hodowli komórkowych | Thermo Scientific | 51019557 | 5% CO2 przy 37 stopniach; C |
| Wirówka wolnoobrotowa | Thermo Scientific | 75004364 | |
| System Cellkey | Urządzenia molekularne | 1019185 | Przyrząd oparty na CDS |
Bibliografia
- Kane, W. J. Prevalence: a call for a statement of terms. Clin Orthop. Relat Res. 126, 43-46 (1977).
- Bunnell, W. P. Selective screening for scoliosis. Clin Orthop Relat Res. 434, 40-45 (2005).
- Asher, M. A., Burton, D. C. Adolescent idiopathic scoliosis: natural history and long term treatment effects. Scoliosis. 1 (1), 2(2006).
- Fong, D. Y., et al. A meta-analysis of the clinical effectiveness of school scoliosis screening. Spine (Phila Pa 1976). 35 (10), 1061-1071 (2010).
- Chowanska, J., Kotwicki, T., Rosadzinski, K., Sliwinski, Z. School screening for scoliosis: can surface topography replace examination with scoliometer? Scoliosis. 7 (9), 1748-7161 (2012).
- Kim, H., et al. Scoliosis imaging: what radiologists should know. Radiographics. 30 (7), 1823-1842 (2010).
- Wong, H. K., Hui, J. H., Rajan, U., Chia, H. P. Idiopathic scoliosis in Singapore schoolchildren: a prevalence study 15 years into the screening program. Spine. 30 (10), 1188-1196 (2005).
- Nachemson, A. A long term follow-up study of non-treated scoliosis. Acta Scand. 39 (4), 466-476 (1968).
- Enneking, W. F., Harrington, P. Pathological changes in scoliosis. J. Joint Surg. 51 (1), 165-184 (1969).
- Miller, N. H. Cause and natural history of adolescent idiopathic scoliosis. Orthop. Clin. North Am. 30 (3), 343-3452 (1999).
- Nash, C. L. Jr, Gregg, E. C., Brown, R. H., Pillai, K. Risks of exposure to X-rays in patients undergoing long-term treatment for scoliosis. J. Bone Joint Surg. Am. 61 (3), 371-400 (1979).
- Akoume, M. Y., et al. Cell-based screening test for idiopathic scoliosis using cellular dielectric spectroscopy. Spine. 35 (13), 601-608 (2010).
- Verdonk, E., et al. Cellular dielectric spectroscopy: a label-free comprehensive platform for functional evaluation of endogenous receptors. Assay Drug Dev. Technol. 4 (5), 609-6019 (2006).
- Peters, M. F., et al. Evaluation of cellular dielectric spectroscopy, a whole-cell, label-free technology for drug discovery on Gi-coupled GPCRs. J. Biomol. Screen. 12 (3), 312-319 (2007).
- Peters, M. F., Scott, C. W. Evaluating cellular impedance assays for detection of GPCR pleiotropic signaling and functional selectivity. J. Biomol. Screen. 14 (3), 246-255 (2009).
- Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays. Assay Drug Dev. Technol. 8 (2), 219-227 (2010).
- Akoume, M. Y., et al. Disrupted Gi-coupled receptor signaling occurs in adolescent idiopathic scoliosis. J. Clin. Invest. , Submitted (2013).
Przedruki i uprawnienia
