Protokół testu komórkowego do prognozowania skoliozy idiopatycznej za pomocą komórkowej spektroskopii dielektrycznej

Podsumowanie

Ustrukturyzowany protokół jest prezentowany dla testu komórkowego jako test funkcjonalny do przewidywania rokowania skoliozy idiopatycznej za pomocą komórkowej spektroskopii dielektrycznej (CDS). Test można wykonać na świeżych lub mrożonych komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC), a procedura zostaje zakończona w ciągu 4 dni.

Streszczenie

Ten protokół szczegółowo opisuje eksperymentalną i analityczną procedurę dla testu komórkowego opracowanego w naszym laboratorium jako test funkcjonalny do przewidywania rokowania skoliozy idiopatycznej u dzieci bezobjawowych i dotkniętych chorobą. Test polega na ocenie stanu funkcjonalnego białek Gi i Gs w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) za pomocą komórkowej spektroskopii dielektrycznej (CDS), przy użyciu zautomatyzowanego instrumentu opartego na CDS, oraz klasyfikacji dzieci do trzech grup funkcyjnych (FG1, FG2, FG3) w odniesieniu do profilu nierównowagi między stopniem odpowiedzi na stymulację białkami Gi i Gs. Klasyfikacja ta jest dodatkowo potwierdzona przez zróżnicowany wpływ osteopontyny (OPN) na odpowiedź na stymulację żołądkowo-jelitową między grupami, a ciężki postęp choroby jest określany przez FG2. W przybliżeniu do ekstrakcji PBMC za pomocą gradientu Ficoll potrzebna jest objętość 10 ml krwi, a następnie komórki są przechowywane w ciekłym azocie. Odpowiednią liczbę PBMC do przeprowadzenia testu uzyskuje się po dwóch dniach hodowli komórkowej. Zasadniczo komórki są najpierw inkubowane z fitohemmaglutyniną (PHA). Po 24 godzinach inkubacji pożywkę zastępuje się pożywką hodowlaną wolną od PHA na dodatkowe 24 godziny przed wysiewem komórek i traktowaniem OPN. Komórki są następnie spektroskopowo badane pod kątem ich reakcji na somatostatynę i izoproterenol, które odpowiednio aktywują białka Gi i Gs poprzez pokrewne receptory. Zarówno somatostatyna, jak i izoproterenol są jednocześnie wstrzykiwane za pomocą zintegrowanego systemu fluidics, a odpowiedzi komórek są monitorowane przez 15 minut. Test można wykonać przy użyciu świeżych lub mrożonych PBMC, a procedura jest zakończona w ciągu 4 dni.

Wprowadzenie

Skolioza idiopatyczna to deformacja kręgosłupa o nieznanej przyczynie, ogólnie definiowana jako boczne skrzywienie większe niż 10 stopni, któremu towarzyszy rotacja kręgów¹. Choroba dotyka 4% populacji pediatrycznej i jest najczęściej diagnozowana w wieku od 9 do 13 lat^2,3,4. Diagnoza ma przede wszystkim charakter wykluczający i jest stawiana dopiero po wykluczeniu innych przyczyn deformacji kręgosłupa, takich jak malformacje kręgów, zaburzenia nerwowo-mięśniowe lub syndromiczne. Tradycyjnie, asymetria tułowia ujawnia się za pomocą testu zginania do przodu Adamsa i mierzy się za pomocą skoliometru podczas badania fizykalnego⁵. Diagnozę można następnie potwierdzić poprzez obserwację radiologiczną krzywej i pomiar kąta przy użyciu metody Cobba⁶.

Po zdiagnozowaniu, głównym zmartwieniem lekarzy zajmujących się leczeniem skoliotycznych dzieci jest to, czy krzywa będzie postępować. Rzeczywiście, progresja krzywej jest często nieprzewidywalna i częściej obserwuje się ją u dziewcząt niż u chłopców⁷. Nieleczona krzywa może gwałtownie postępować, powodując znaczną deformację fizyczną, a nawet problemy krążeniowo-oddechowe. Objawy te stają się zagrożeniem dla życia, gdy krzywa przekracza 70° ^8,9. Obecne opcje leczenia mające na celu zapobieganie lub zatrzymanie progresji krzywizny obejmują usztywnienie i zabieg chirurgiczny. Ogólnie rzecz biorąc, usztywnienie jest zalecane w przypadku krzywizn w zakresie 25-40°, podczas gdy chirurgia jest zarezerwowana dla krzywizn większych niż 45° lub niereagujących na usztywnienie.

W przybliżeniu, 10% dzieci, u których zdiagnozowano skoliozę idiopatyczną, ma progresję krzywej wymagającą operacji korekcyjnej¹⁰. Obecnie nie ma sprawdzonej metody ani testu pozwalającego zidentyfikować tę kategorię pacjentów. W związku z tym wszystkie zdiagnozowane dzieci są poddawane wielokrotnym badaniom rentgenowskim przez kilka lat, zwykle do momentu osiągnięcia dojrzałości kostnej. Szacuje się, że typowi pacjenci ze skoliozą będą mieli około 22 badań radiologicznych w okresie 3^lat11. Ze względu na potencjalne ryzyko wielokrotnych badań radiologicznych, zdecydowanie pożądane są alternatywne podejścia, które mogłyby pozwolić na wykonanie prognozy skoliozy idiopatycznej bez narażania dzieci na promieniowanie jonizujące. Mając na celu zaspokojenie tej potrzeby, opracowaliśmy wcześniej test przesiewowy oparty na komórkach jako test prognostyczny, aby szybciej zidentyfikować bezobjawowe dzieci zagrożone rozwojem skoliozy idiopatycznej. Test przewiduje wynik kliniczny zarówno u dzieci bezobjawowych, jak i dotkniętych chorobą, badając stan funkcjonalny białek Gi i klasyfikując dzieci do trzech grup funkcjonalnych (FG1, FG2 i FG3) zgodnie ze stopniem maksymalnej odpowiedzi na stymulację białkiem Gi¹² mierzonym przez system oparty na CDS. System ten jest w dużej mierze wykorzystywany do oceny transdukcji sygnału przez białka G w różnych typach komórek^13,14,15,16. Dostarcza informacji dotyczących całkowitej zintegrowanej odpowiedzi komórek na bodźce zewnętrzne poprzez pomiar zmian impedancji po aktywacji receptorów na powierzchni komórki. Komórki są umieszczane w mikropłytkach, które zawierają elektrody na dnie studzienek, a system przykłada niewielkie napięcie, które indukuje prądy zewnątrzkomórkowe i transkomórkowe. Po wstrzyknięciu związku do studni stymulowane są receptory powierzchniowe komórek i zachodzą zdarzenia transdukcji sygnału, prowadzące do zmian komórkowych, które wpływają na przepływ prądów zewnątrzkomórkowych i transkomórkowych, a tym samym wpływają na mierzoną wielkość. Dzięki takiemu podejściu pacjenci ze skoliozą i dzieci bardziej narażone na rozwój skoliozy są mniej wrażliwi na stymulację białkiem Gi w porównaniu ze zdrowymi osobami z grupy kontrolnej, a klasyfikacja opiera się na procentowym stopniu redukcji w stosunku do grupy kontrolnej. Przedziały klasyfikacyjne są ustalone na poziomie od 10 do 40% dla grupy roboczej 3, od 40 do 60% dla grupy roboczej 2 oraz od 60 do 90% dla grupy roboczej¹².

Ostatnio zmodyfikowaliśmy to podejście, pokazując, że trzy grupy funkcyjne można wyraźnie rozróżnić według profilu nierównowagi między reakcją na stymulację Gi i Gs. Rzeczywiście, stwierdziliśmy, że odpowiedź na stymulację Gi dominowała w FG3, podczas gdy nie zaobserwowano widocznej nierównowagi w FG2. W przeciwieństwie do tego, FG1 wykazywał przewagę w odpowiedzi na stymulację Gs. Ponadto dostarczyliśmy dowody na to, że pacjenci należący do FG2 są bardziej narażeni na progresję do punktu, w którym konieczna jest operacja¹⁷. Precyzja tego testu klasyfikacyjnego została dodatkowo poprawiona poprzez wykazanie zróżnicowanego wpływu osteopontyny (OPN) na odpowiedź na stymulację Gi między grupami funkcjonalnymi.

Tutaj dokumentujemy szczegółowe kroki eksperymentalnych i analitycznych procedur tego testu funkcjonalnego, który jest obecnie wykonywany w naszym laboratorium.

Protokół

Cała procedura jest przeprowadzana pod sterylnym kapturem biologicznym i wszystkie roztwory i urządzenia mające kontakt z komórkami muszą być sterylne.

1. Przygotowanie niezbędnych rozwiązań

1. Przygotować roztwory zgodnie z tabelą 1.
2. Przechowywać zbilansowany roztwór soli (BSS) w temperaturze pokojowej, a wszystkie inne roztwory w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
3. Podgrzej zimne podłoże do temperatury 37 °C w łaźni wodnej przez kilka minut przed użyciem.

2. Przygotowanie i przechowywanie PBMC

1. Zebrać 10 ml krwi pełnej w probówkach pobranych poddanych działaniu EDTA, aby przygotować dwie porcje PBMC, używając 5 ml na każdą podwielokrotność.
2. Przenieść 5 ml krwi pełnej z probówki pobranej poddanej działaniu EDTA do probówki o pojemności 50 ml.
3. Dodać równą objętość BSS i wymieszać próbkę, delikatnie pipetując w górę i w dół.
4. Umieścić 3 ml Ficollu w dwóch 15 ml probówkach Falcon.
5. Ostrożnie nałożyć 4,5 ml rozcieńczonej mieszaniny krwi na Ficoll w każdej probówce.
6. Pozostaw probówki na odpoczynek do 5 minut, aby sprzyjać wyraźnemu oddzieleniu krwi i figlu.
7. Odwirować probówki o masie 400 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej bez hamulca.
8. Ostrożnie wyjmij probówki z wirówki, aby nie naruszyć warstwowania. PBMC są widoczne na styku BSS/Ficoll.
9. Zebrać mętną warstwę PBMC na granicy faz obu probówek za pomocą pipety i przenieść do nowej probówki o pojemności 50 ml.
10. Dodać 20 ml kompletnej pożywki.
11. Odwirować probówkę o masie 288 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej.
12. Usunąć supernatant przez aspirację.
13. Zawiesić osad komórkowy w 500 μl pożywki uzupełniającej.
14. Dodaj równą objętość pożywki do zamrażania.
15. Przenieś zawiesinę komórek do kriowialnego.
16. Umieść kriowial w pojemniku do kriozamrażania z izopropanolem.
17. Przechowywać pojemnik do zamrażania w temperaturze -80 °C przez noc.
18. Przenieść zamrożone PBMC podwielokrotności do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.

3. Test funkcjonalny

1. Dzień 1

1. Umieścić porcję ciekłego azotu w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na minutę lub do rozmrożenia.
2. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 50 ml za pomocą sterylnej pipety.
3. Dodać 15 ml kompletnej pożywki i wirować komórki w temperaturze 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
4. Usunąć supernatant przez aspirację.
5. Delikatnie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki PHA.
6. Uzupełnić objętość do 20 ml tym samym podłożem.
7. Luźno zakryj rurkę, aby umożliwić dopływ powietrza.
8. Pozostawić probówkę na noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO₂ , aby umożliwić limfocytom w stanie spoczynku przekształcenie się w szybko proliferujące limfoblasty.

2. Dzień 2

1. Wyjmij probówkę z inkubatora, całkowicie zakręć nakrętki i obracaj komórki w temperaturze 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
2. Usunąć supernatant przez aspirację.
3. Delikatnie zawiesić osad komórkowy w 1 ml kompletnego podłoża.
4. Uzupełnić objętość do 20 ml tym samym podłożem.
5. Luźno zakryj rurkę, aby umożliwić dopływ powietrza.
6. Pozostawić probówkę na noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO_{2 w} celu zwiększenia liczby komórek.

3. Dzień 3

1. Wyjmij probówkę z inkubatora, całkowicie zakręć nakrętki i obracaj komórki w temperaturze 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
2. Usunąć supernatant przez aspirację.
3. Umyć komórki dwukrotnie 10 ml RPMI-1640 przez odwirowanie przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
4. Delikatnie zawiesić osad ogniw w 600 μl RPMI-1640.
5. Zmierz stężenie komórek i żywotność za pomocą automatycznego licznika komórek i analizatora żywotności.
6. Dodaj odpowiednią objętość RPMI-1640, aby dostosować się do stężenia komórek 1,5 x 10⁵ komórek/20 μl.
7. Potraktuj komórki rekombinowanym OPN (rOPN) lub nośnikiem (PBS) w 1,5 ml probówek Eppendorfa.
   1. Przenieść 100 μl zawiesiny komórkowej do dwóch sterylnych probówek Eppendorfa o pojemności 1,5 ml.
   2. Dodać rOPN w jednej probówce do końcowego stężenia 0,5 μg/ml.
   3. Dodać równą objętość PBS do drugiej probówki.
   4. Delikatnie wymieszaj każdy warunek, pipetując dwukrotnie w górę i w dół za pomocą sterylnej pipety o pojemności 100 μl.
8. Przygotować małą próbkę 96-dołkowej mikropłytki.
   1. Dodaj 5 μl RPMI-1640 do każdego dołka.
   2. Odwirować płytkę o masie 200 x g przez 3 minuty, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.
9. Wysiewaj komórki niepoddane działaniu substancji, a także komórki potraktowane rOPN lub PBS.
   1. Przed przeniesieniem komórek z probówki na mikropłytkę należy delikatnie pipetować w górę i w dół, aby zapewnić równomierne zawieszenie komórek.
   2. Dodać 40 μl zawiesiny komórek na studzienkę czterokrotnie w przypadku komórek niepoddanych działaniu substancji, w dwóch powtórzeniach w przypadku komórek poddanych działaniu rOPN lub PBS. Patrz rysunek 1, aby zapoznać się z projektem. Taka konstrukcja pozwala na przebadanie 12 pacjentów na tej samej mikropłytce.
   3. Pozostaw płytkę komórkową pod sterylnym kapturem na 5 minut, aby komórki mogły odpocząć i równomiernie osiąść na dnie studzienki przed umieszczeniem w inkubatorze.
10. Inkubować płytkę przez 18 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO_{2 w} celu optymalizacji działania OPN.

4. Dzień 4

1. Uruchom płytkę związkami.
   1. Wyjąć płytkę z inkubatora i pozostawić ją w temperaturze pokojowej na około 30 minut.
   2. Przygotować 1 ml 100 μM somatostatyny i izoproterenolu w RPMI-1640, dodając 10 μl roztworu podstawowego (10 mM) do 990 μl RPMI-1640.
   3. Napełnij płytkę złożoną, dozując 20 μl do odpowiednich studzienek, jak pokazano na rysunku 2.
   4. Przykryć płytkę złożoną wstępnie naciętą, przebijaną uszczelką, aby uniknąć zmiany stężenia związku spowodowanej parowaniem przed lub w trakcie inkubacji w systemie opartym na CDS.
   5. Płytka ogniwa obciążnikowego, końcówki pipet i płytka złożona do systemu opartego na CDS.
   6. Nazwij tabliczkę w oprogramowaniu instrumentu opartym na CDS.
   7. Wybierz odpowiedni protokół. Protokół zredagowany w celu klasyfikacji z PBMC nazywa się "Agonist Non-adherent cells Small Sample Plate RT 15 min". Przejdź do pola protokołu i wybierz ten protokół z listy protokołów
   8. Zainicjuj protokół, klikając "Start".
   9. Zintegrowany system fluidics jednocześnie dodaje związki do wszystkich studzienek, wstrzykując 5 μl na studzienkę, aby osiągnąć końcowe stężenie 10 μM przy całkowitej objętości 50 μl.
   10. System oparty na CDS automatycznie zbiera dane przez 15 minut po dodaniu mieszanki.
2. analiza danych
   1. Wybierz niskie i wysokie zakresy częstotliwości, które mają być używane podczas obliczania wyodrębnionych wartości dla komórek nieprzylegających.
   2. Wybierz korekcję dryftu, aby skorygować liniową zmianę pomiarów impedancji linii bazowej w czasie.
   3. Wybierz filtrowanie danych, aby zmniejszyć różnice w pomiarze odpowiedzi kinetycznej spowodowane szumem elektronicznym i dodawaniem związków.
   4. Wybierz metodę Max-Min, aby uzyskać pełny czas analizy.
   5. Eksportuj dane do Excela w opcji formatu blachy.
   6. Obliczyć delta G (ΔG), odejmując średnią wielkość odpowiedzi na stymulację Gi (RmGi) od średniej wielkości odpowiedzi na stymulację Gs (RmGs) przy użyciu następującego wzoru:
      ΔG = RmGi - RmGs
   7. Obliczyć procentowy udział efektu krotności (Fe) OPN w odpowiedzi za pośrednictwem przewodu pokarmowego, dzieląc średnią wielkość odpowiedzi na stymulację Gi w obecności OPN (RmGiOPN) przez średnią wielkość odpowiedzi na stymulację Gi w obecności PBS (RmGiPBS), korzystając z następującego wzoru:
      Fe = 100 x (RmGiOPN/RmGiPBS)
   8. Patrz Tabela 2 w celu klasyfikacji pacjentów.

Wyniki

Żywotność komórek była porównywalna między wszystkimi próbkami z wartościami spójnymi w zakresie 86 i 96%. Natomiast duże różnice odnotowano w liczbie komórek między próbkami (Tabela 3). Spośród 32 wykorzystanych próbek, dwie miały niewystarczającą liczbę komórek i nie zostały sklasyfikowane. Przykładowe wyniki klasyfikacji funkcjonalnej ze względu na stopień nierównowagi między sygnalizacją Gi i Gs przedstawiono na rysunku 3. Oś pionowa tego rysunku jest podzielona na trzy sekcje wyznaczające grupy funkcyjne z zakresami dynamicznymi ustalonymi jako > +10 dla FG3, między +10 a -10 dla FG2 i na końcu < -10 dla FG1. Spośród 30 badanych tutaj pacjentów, 14, 6 i 5 pacjentów zostało wyraźnie sklasyfikowanych odpowiednio do FG3, FG2 i FG1, podczas gdy pięciu pacjentów, w szczególności 345, 353, 370, 371 i 382, znajdowało się na granicy zakresów. Ocena wpływu OPN na odpowiedź na stymulację przewodu pokarmowego wykazała, że OPN zwiększał odpowiedź u pacjentów 353 i 371. Natomiast odpowiedź na leczenie była zmniejszona o ponad 50% u pacjentów 345 i 382 oraz o mniej niż 50% u pacjentów 370 po leczeniu rOPN. Tak więc, zgodnie z naszymi kryteriami klasyfikacyjnymi (Tabela 2), byliśmy w stanie sklasyfikować pacjentów 353 i 371 w FG1, pacjentów 345 i 382 w FG2 oraz pacjentów 370 w FG3. Równolegle wszyscy pacjenci zostali przebadani pod kątem odpowiedzi na stymulację białkiem Gi i porównani z osobami z grupy kontrolnej. Zgodnie z oczekiwaniami, wszyscy pacjenci reagowali słabiej niż osoby z grupy kontrolnej, a pacjenci sklasyfikowani w tej samej grupie funkcjonalnej przez naszą nową procedurę wykazywali podobny poziom maksymalnej odpowiedzi (ryc. 5). Co więcej, rozbieżność między pacjentami z każdej grupy funkcjonalnej była zgodna z naszym klasycznym zakresem klasyfikacji ¹², co potwierdza naszą nową procedurę. Klasyfikacja dużej kohorty pacjentów ze skoliotami regularnie obserwowanych w naszej specjalnej klinice w szpitalu Sainte-Justine ujawniła, że trzy grupy funkcjonalne były podobnie rozmieszczone wśród umiarkowanych przypadków, podczas gdy FG2 dominowała wśród ciężkich przypadków (Figura 6), identyfikując pacjentów sklasyfikowanych w tej grupie funkcjonalnej jako bardziej narażonych na ciężką progresję choroby i wskazując, że ten test klasyfikacyjny może być przydatny w prognozowaniu skolioza idiopatyczna.

Rozwiązanie A Bezwodna D-glukoza 0,1 % CaCl₂ 2H₂O 0,05 mM MgCl₂ 0,98 mM Kcl 5,4 mln Tris 145 mM Rozwiązanie B Zawartość NaCl 140 mM Zrównoważony roztwór soli (BSS) Rozwiązanie A 1 tom Rozwiązanie B 9 Objętość Kompletny nośnik Przekaźnik RPMI-1640 Pojemność 500 ml Antybiotyk-antybiotyk 1 proc. FBS (Sieć Usługowa 10% Dodatkowe media Przekaźnik RPMI-1640 Pojemność 50 ml Antybiotyk-antybiotyk 1 proc. FBS (Sieć Usługowa 40 proc. Zamrażanie nośników Przekaźnik RPMI-1640 Pojemność 50 ml Antybiotyk-antybiotyk 1 proc. FBS (Sieć Usługowa 40 proc. Dmso 20% Nośnik PHA Przekaźnik RPMI-1640 Pojemność 500 ml Antybiotyk-antybiotyk 1 proc. FBS (Sieć Usługowa 10% Fitohemaglutyninina 1 proc.

Tabela 1. Niezbędne rozwiązania.

Zakresy dynamiczne z ΔG Grupy funkcjonalne Zakresy dynamiki z Fe ΔG< -10 FG1 Fe>100% -10 <ΔG< +10 FG2 Fe<50% ΔG> +10 Grupa robocza FG3 50%

Tabela 2. Kategoryzacja grup funkcyjnych według zakresów dynamicznych ustalonych za pomocą ΔG i Fe.

Pacjentów Rentowność (%) Stężenie komórek (×10⁶/ml) Komentarze 343 Rozdział 88,7 pkt. Godzina 11,64 Okręg wyborczy 344 TGL 90,5 pkt. Rozdział 13,6 345 szt. 94,4 pkt. Godzina 8,54 Rozdział 346 94,3 pkt. Godzina 25,79 347 OSÓB 94,2 pkt. O godz. 27.36 348 Rozdział 94,6 pkt. 8,52 pkt. Okręg wyborczy 349 TGL 91,2 pkt. 0,82 pkt. Niewystarczająca liczba komórek 350 szt. Nr 90,3 pkt. 8,92 pkt. Okręg wyborczy 352 TGL 92,6 pkt. Godzina 8,28 Rozdział 353 91,3 pkt. Godzina 12,75 Okręg wyborczy 354 TGL 86,9 pkt. 7,62 pkt. Okręg wyborczy 355 JEZDNYCH 91,2 pkt. Godzina 7,51 Okręg wyborczy 356 TGL Nr 90,3 pkt. Godzina 9,36 Okręg wyborczy 358 TGL Pytanie 95,1 16,94 pkt. Okręg wyborczy 359 TGL Nr 92,3 pkt. godz. 13.89 360 pkt. 89,4 pkt. 7,67 pkt. 361 SZT. 93,5 pkt. 7,84 pkt. 365 SZT. 86,5 pkt. 2.2 Niewystarczająca liczba komórek Okręg wyborczy 368 TGL 92,6 pkt. godz. 15.69 369 SZT. 93,4 pkt. Rozdział 10,9 Okręg wyborczy 370 TGL 92,5 pkt. 19,93 pkt. Lokal mieszkalny 371 TGL 88,8 pkt. Godzina 10,68 374 Rozdział 93,9 pkt. godz. 16.86 Okręg wyborczy 376 TGL 92,9 pkt. 15,67 pkt. 377 SZT. 93,1 pkt. 9,99 pkt. Okręg wyborczy 378 TGL 93,6 pkt. godz. 13.57 Okręg wyborczy 379 TGL 92,6 pkt. 19,86 pkt. 380 szt. Nr 91,1 Godzina 8,46 Rozdział 381 93,9 pkt. Godzina 14,82 Okręg wyborczy 382 TGL 92,1 pkt. Godzina 23.06 Rozdział 383 92,9 pkt. Godzina 11,82 Rozdział 384 Nr 89,1 pkt. 7,73 pkt.

Tabela 3. Procentowa żywotność i stężenie komórek określone za pomocą automatycznego licznika komórek i analizatora żywotności.

Rysunek 1. Konstrukcja do wysiewu komórek.

Rysunek 2. Konstrukcja do dozowania związków.

Rysunek 3. Zakres dynamiczny klasyfikacji funkcjonalnej z wykorzystaniem systemu opartego na CDS. Wykres ilustruje wartości stopnia nierównowagi między odpowiedziami na stymulację Gi i Gs uzyskanymi w PBMC od pacjentów ze skoliozą idiopatyczną. Wartości mierzono za pomocą systemu opartego na CDS w odpowiedzi na 10 μM somatostatyny i izoproterenolu. Każdy punkt reprezentuje ΔG obu odpowiedzi w dwóch egzemplarzach.

Rysunek 4. Wpływ rOPN na odpowiedź na stymulację Gi w PBMCs. Komórki były głodzone surowicą przez 18 godzin w obecności lub bez 0,5 μg/ml rOPN, a następnie stymulowane 10 μM somatostatyny w celu zainicjowania odpowiedzi komórkowej za pośrednictwem przewodu pokarmowego. Dane na wykresie zostały wygenerowane z impedancji maksymalnej-minimalnej i odpowiadają średniej odpowiedzi w dwóch egzemplarzach.

Rysunek 5. Stan funkcjonalny białka Gi w PBMC u osób z grupy kontrolnej i skoliozy. PBMC od osób kontrolnych i pacjentów ze skoliozą byli narażeni na rosnące stężenia somatostatyny w celu stymulacji białek Gi poprzez endogenny receptor somatostatyny. Odpowiedź komórkową mierzono za pomocą systemu opartego na CDS, jak opisano w sekcji procedury. Krzywe zostały wygenerowane na podstawie impedancji maksymalnej-minimalnej. Każda krzywa reprezentuje regresję nieliniową. Dane znormalizowano do maksymalnej odpowiedzi w komórkach od osób kontrolnych, a każdy punkt odpowiadał średniej odpowiedzi w dwóch egzemplarzach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 6. Rozkład grup funkcyjnych w różnych fazach skoliozy. Duża kohorta pacjentów ze skoliotami z 794 umiarkowanymi (krzywiznami między 10-44°) i 162 ciężkimi (krzywizna większa niż 45°) przypadkami regularnie obserwowanymi w szpitalu Sainte-Justine została sklasyfikowana według stopnia nierównowagi między odpowiedzią na stymulację Gi i Gs. Odpowiedzi mierzono za pomocą systemu opartego na CDS w odpowiedzi na 10 μM somatostatyny i izoproterenolu.

Dyskusja

Opisaliśmy szczegółową procedurę komórkowego testu prognostycznego na skoliozę idiopatyczną, który ma zastosowanie do komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) świeżo wyizolowanych lub zakonserwowanych zamrożonych przez okres do jednego roku w ciekłym azocie. Ponieważ stosowanie świeżo wyizolowanych PBMC jest kłopotliwe w przypadku testowania dużej liczby osób, procedura została przedstawiona z wykorzystaniem zamrożonych PBMC, które stanowią bardziej praktyczną alternatywę w warunkach klinicznych. Jednak problemy z zlepianiem się komórek po rozmrożeniu wystąpiły, gdy początkowo zastosowano zamrożone PBMC, co czasami prowadziło do zmienności między testami. Aby zmaksymalizować odtwarzalność testu, zalecamy unikanie cyklu zamrażania i rozmrażania oraz użycie zamrożonej próbki tylko raz. Procedura jest bardzo prosta, pozwala na dokładne wykrycie wadliwej funkcji białka Gi w krótkim czasie. Korzystając z tej procedury, dzieci bezobjawowe i skoliotyczne można łatwo sklasyfikować, aby lepiej przewidzieć ich wynik kliniczny bez żadnego zagrożenia dla ich zdrowia. Jednak przy dokonywaniu klasyfikacji według stopnia maksymalnej odpowiedzi na stymulację żołądkowo-jelitową w stosunku do zdrowych osób z grupy kontrolnej ¹², powinno być spełnionych kilka wymagań dla osób kontrolnych. Rzeczywiście, aby mieć właściwą kohortę porównawczą, osoby kontrolne muszą być dopasowane pod względem wieku i płci, nie przyjmować żadnych leków i dostarczać prywatnych informacji, takich jak wcześniejsza indywidualna/rodzinna historia medyczna. Wymogi te mogą stanowić poważną przeszkodę w rekrutacji osób kontrolnych. Dlatego przeprowadzenie klasyfikacji poprzez zbadanie stopnia nierównowagi między odpowiedzią na stymulację białkiem Gi i Gs u tej samej osoby jest idealne do wyeliminowania konieczności korzystania z usług osób kontrolnych.

Zastosowanie systemu opartego na CDS do wykonania tego testu prognostycznego jest istotne pod względem jednoczesnego dostarczania odpowiedzi komórkowych za pośrednictwem Gi i Gs w tym samym teście. Chociaż wielu pacjentów można sklasyfikować bez żadnych niejasności przy użyciu zakresu dynamicznego ustalonego dla tego testu, niewielka liczba pacjentów będzie wykazywać wartości na granicy zakresów, jak pokazano w niniejszym raporcie. Aby rozróżnić te osoby, wprowadziliśmy ocenę wpływu OPN na odpowiedź na stymulację Gi, wykazując, że OPN indukuje zróżnicowany wpływ na odpowiedź komórkową za pośrednictwem Gi między trzema grupami funkcjonalnymi. Rzeczywiście, stwierdziliśmy, że w obecności OPN odpowiedź na stymulację Gi wzrasta w FG1, podczas gdy zmniejsza się w FG2 i FG3, w większym stopniu w FG2. Pomimo wysokich kosztów OPN, zastosowanie tej chemokiny jest niezbędne do rozróżnienia niejednoznacznych przypadków, a tym samym poprawy dokładności naszego testu klasyfikacyjnego. Jednak ten test ma wadę polegającą na tym, że do zaobserwowania odpowiedzi komórkowej za pomocą systemu opartego na CDS w naszych warunkach eksperymentalnych wymagane jest co najmniej 1,5 x^{10 5} komórek na studzienkę. Niektóre próbki pacjentów nie będą miały wystarczającej liczby komórek do przetestowania. W takim przypadku konieczne jest wezwanie pacjentów w celu dodatkowego pobrania krwi, co może być niepokojące dla rodzin i frustrujące dla personelu medycznego i laboratoryjnego. W naszym laboratorium planowane są badania prospektywne mające na celu rozwiązanie tego problemu.

Niemniej jednak obecny protokół opiera się na prostych i sprawdzonych metodach przygotowania komórek, podczas gdy testowanie jest zautomatyzowane przy użyciu zwalidowanego systemu bez etykiet ^{13, 14} do monitorowania odpowiedzi komórek. Platforma testowa jest stosunkowo niedroga w porównaniu z platformą genetyczną dostępną do prognozowania innych chorób. Ponadto koszt wszystkich materiałów jednorazowego użytku, w tym probówek do pobierania krwi, końcówek, specjalnych mikropłytek elektrod oraz stożkowych i probówek Eppendorfa, nie jest bardzo wysoki i szacuje się go na mniej niż 3000 USD za wykonanie testu dla około tysiąca pacjentów. Chociaż szacunki te nie obejmują kosztów pracy związanych z przygotowaniem próbek i wykonaniem testu, test ten pozostaje znacznie tańszy niż platformy sekwencjonowania nowej generacji. Na uwagę zasługuje nie tylko porównanie kosztów z platformami genetycznymi, ale bardziej szczegółowo związane z dziedziną AIS, koszty związane z obrazowaniem radiologicznym. Obecnie u ponad miliona dzieci w USA i około 100 000 dzieci w Kanadzie diagnozuje się skoliozę idiopatyczną, a całkowity koszt diagnozy i monitorowania skoliozy dzieci za pomocą promieniowania rentgenowskiego wynosi ponad 2,5 miliarda dolarów rocznie w Ameryce Północnej. W związku z tym oczekuje się, że nasza procedura testu komórkowego będzie odpowiednia do rutynowych badań przesiewowych i monitorowania dzieci ze skoliozą idiopatyczną bez ryzyka dla zdrowia i przy niższych kosztach.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Materials
RPMI	Bisent, Inc	350-005-CL
FBS	Therno Scientific Hyclone	SH3007103
DMSO	Sigma Aldrich	D2650
Ficoll-Plaque Plus	GE Healthcare	17144003
Antybiotykowo-przeciwgrzybiczy	Invitrogen	15240-062
Fitohemaglutynina	Invitrogen (Gibco)	10576-015
Rekombinowana ludzka osteopontyna	R& D Systems, Inc	1433-OP/CF
Somatostatyna	Tocris	1157
Izoproterenol	Tocris	1743
PBS	Żubel, Inc	311-010-CL
Sterylne końcówki do pipet	Axygen Scientific	301-06-451
Sterylne probówki Eppendorf	Ultident	24-MCT-150-C
50 ml stożkowe rurki	VWR International	89039-658
Mała próbka Cellkey Mikropłytka 96 W	Urządzenia molekularne	1026496
Końcówki Cellkey	Cybio	OL3800-25-559N
Wstępnie wycięte uszczelki przebijane	Excel Scientific, Inc	XP-100
Equipment
Vicell XR	Beckman Coulter	731050	Automatyczny licznik komórek
Kaptur do hodowli komórkowych	Forma Scientific	1284	Klasa II
Magazynowanie ciekłego azotu	Thermo Scientific	CY5093570
Łaźnia wodna	VWR International	89032-204
Standardowy mikroskop świetlny	Leica Microsystems	DMIL LED
Inkubator do hodowli komórkowych	Thermo Scientific	51019557	5% CO2 przy 37 stopniach; C
Wirówka wolnoobrotowa	Thermo Scientific	75004364
System Cellkey	Urządzenia molekularne	1019185	Przyrząd oparty na CDS