Artykuł metodologiczny

Odzyskiwanie antygenu wywołane ciepłem: skuteczna metoda wykrywania i identyfikacji typów komórek progenitorowych podczas neurogenezy dorosłego hipokampa

DOI:

10.3791/50769

⸱

30 sierpnia 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurologic Surgery, Mayo Clinic College of Medicine, 2Department of Anatomy, Korea University College of Medicine, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic College of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas neurogenezy dorosłego hipokampa, wyraźny zestaw markerów genetycznych ulega ekspresji, gdy spokojna nerwowa komórka macierzysta sekwencyjnie rozwija się i rozwija w funkcjonalnie zintegrowany neuron w obwodzie. Korzystając z indukowanego ciepłem odzyskiwania antygenu, typy komórek progenitorowych, które w innym przypadku są trudne do wykrycia, są identyfikowane z większą skutecznością.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tradycyjne metody immunohistochemii (IHC) po utrwaleniu tkanek pozwalają na wizualizację różnych typów komórek. Zazwyczaj postępują one z zastosowaniem przeciwciał w celu wiązania antygenów i identyfikacji komórek o cechach będących funkcją wrodzonej biologii i rozwoju. Neurogeneza hipokampa u dorosłych osób jest sekwencyjnym procesem, w którym spoczynkowa nerwowa komórka macierzysta może zostać aktywowana i przejść przez etapy proliferacji, różnicowania, dojrzewania i integracji funkcjonalnej. Każda faza jest odrębna z charakterystyczną morfologią i regulacją w górę genów. Identyfikacja tych faz jest ważna, aby zrozumieć mechanizmy regulacyjne i wszelkie zmiany w tym procesie, które leżą u podstaw patofizjologii wyniszczających zaburzeń. Nasze podejście do odzyskiwania antygenu indukowanego ciepłem poprawia intensywność wykrywanego sygnału i umożliwia prawidłową identyfikację typu komórki progenitorowej. Jak omówiono w tym artykule, w szczególności pozwala nam to obejść obecne problemy z wykrywaniem niektórych typów komórek progenitorowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurogeneza, czyli generowanie nowych neuronów z nerwowych komórek macierzystych, jest obecnie znana z tego, że w wieku dorosłym zachodzi w dwóch wyspecjalizowanych regionach mózgu. Należą do nich strefa podkomorowa (SVZ) opuszki węchowej i strefa subziarnista (SGZ) zakrętu zębatego w hipokampie. W ciągu ostatniej dekady w dziedzinie neurogenezy hipokampa u dorosłych przeprowadzono znaczące prace. Region ten cieszy się dużym zainteresowaniem, ponieważ nowonarodzone neurony w SGZ przyczyniają się do zwiększenia plastyczności neuronalnej, która może podtrzymywać określone funkcje mózgu1-5. Uważa się, że neurogeneza hipokampa u dorosłych odgrywa ważną rolę w regulacji nastroju, regeneracji oraz uczeniu się i pamięci. W związku z tym podjęto wspólne wysiłki, aby zrozumieć rozwój i regulację neuronów w tej bogatej niszy neurogennej.

Nieuniknionym i ważnym aspektem badania neurogenezy hipokampa u dorosłych jest identyfikacja oddzielnych etapów, przez które przechodzi aktywowana nerwowa komórka macierzysta na drodze do stania się w pełni funkcjonalnym neuronem. W tym procesie aktywowana jest spoczynkowa nerwowa komórka macierzysta i przechodzi przez szereg wczesnych aktywnych i późnych aktywnych typów komórek progenitorowych (ryc. 1). Te odrębne populacje neuronalnych komórek progenitorowych można zidentyfikować na podstawie morfologii i ekspresji markerów molekularnych, takich jak MCM2, nestyna, Tbr2 i Doublecortin (DCX) oraz NeuN, które kierują konwersją RGL do odpowiednich typów komórek progenitorowych. Nestyna jest pośrednim białkiem filamentowym, które ulega ekspresji w promienistych komórkach glejowych i niektórych wczesnych typach komórek progenitorowych. Innym markerem jest Tbr2, który ulega specyficznej ekspresji w amplifikujących komórkach progenitorowych. Ekspresja transgenu Tbr2 jest początkowo wyłączona w komórkach typu 1 (podobnych do gleju promieniowego), włączana w progenitorach typu 2a, typu 2ab i typu 2b i wyłączana wśród bardziej zróżnicowanych neuronów typu 3 i niedojrzałych (ryc. 1). DCX jest markerem migracji neuronów, który ulega ekspresji w progenitorach neuronalnych typu 2ab, typu 2b i typu 3. Korzystając z tej kombinacji trzech markerów, możemy oznaczyć różne podtypy neuronalnych komórek progenitorowych. Należą do nich Typ-1 (MCM2 + nestyna + Tbr2-), Typ 2a (MCM2 + nestyna + Tbr2 +), Typ 2ab (częściowy MCM2 + nestyna-Tbr2 + i częściowy MCM2 + Tbr2 + DCX-), Typ-2b (MCM2 + Tbr2 + DCX +) i Typ 3 (MCM2 + Tbr2-DCX +). Komórki postmitotyczne, takie jak niedojrzałe i funkcjonalnie zintegrowane neurony, można zidentyfikować, wykorzystując DCX i marker dojrzałych neuronów, NeuN.

Tradycyjne metody IHC wykorzystują przeciwciała do identyfikacji antygenów dla określonych typów komórek na podstawie ekspresji ich genów. Późniejsza wizualizacja za pomocą technik obrazowania o wysokiej rozdzielczości, takich jak mikroskopia konfokalna, może być wykorzystana do ich identyfikacji. Jednak obecnie istnieją problemy z tymi metodami, które nie pozwalają na skuteczną identyfikację promienistych komórek glejowych i wczesnych typów komórek progenitorowych. Trudno jest zidentyfikować te konkretne typy komórek, ponieważ zastosowane przeciwciało nie jest w stanie przeniknąć i skutecznie związać białka gniazdowego. Nestyna jest pośrednim białkiem filamentowym, które obejmuje procesy promieniowe wytwarzane przez promienistą komórkę glejową. Nieefektywne wiązanie przeciwciała z antygenem może wynikać z wielu czynników, w tym czasu utrwalania, temperatury i zastosowanej techniki6-7. Aby pomóc w rozwiązaniu takich problemów, opracowaliśmy metodę pobierania antygenu lub "gotowania". Oprócz nestyny, ta metoda pobierania antygenu poprawia również barwienie innych markerów, takich jak Ki67, BrdU, kwaśne białko fibrylarne gleju (GFAP), Tbr2 i MCM2. Nasza metoda łączy w sobie podejście chemiczne i fizyczne. Polega ona na chemicznym utrwaleniu tkanki w paraformaldehydzie, a następnie wrzeniu w wysokiej temperaturze cienkich koronalnych odcinków hipokampa w buforze środka denaturacyjnego i chaotropowego. Zwiększa to dostępność antygenu dla przeciwciała, poprawia swoistość przeciwciał i umożliwia lepszą identyfikację typów komórek progenitorowych. Nasze podejście jest proste w użyciu, wymaga w większości narzędzi i odczynników już dostępnych w laboratorium. Wykorzystaliśmy go szeroko do badania rozwoju nerwowych komórek macierzystych i ich regulacji poprzez wewnętrzne czynniki genetyczne lub zewnętrzne czynniki środowiskowe8.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Pre-immunohistochemia: Perfuzja i histologia

  1. Perfuzja myszy zgodnie z ogólnym protokołem transsercowym dostosowanym do myszy i ekstrakcja mózgów do 4% paraformaldehydu (PFA)9.
  2. Pozostawić mózgi w PFA na noc w temperaturze 4 °C (np. stożkowa probówka o pojemności 10 ml wypełniona PFA). Przechowywać w PFA przez co najmniej 12-24 godziny, nie dłużej niż 36 godzin dla pełnego utrwalenia. Po całonocnym utrwaleniu opróżnij PFA ze stożkowej rurki, ale pozostaw mózgi w środku. Wlej 30% sacharozy do probówki i myj mózgi przez krótkie 5 sekund, aby usunąć wszelkie pozostałości PFA. Na koniec ponownie napełnij probówkę zawierającą mózgi 30% sacharozy. Utrzymuj mózgi w sacharozie w temperaturze 4 °C, aż mózg opadnie na dno rurki.
  3. Wytnij skrawki mózgu o grubości 40 μm na mikrotomie. Skonsultuj się z atlasem mózgu myszy, aby rozpocząć zbieranie skrawków od początku zakrętu zębatego do jego końca. Zachowaj skrawki w roztworze niezamarzającym (prosty przepis to 300 g sacharozy w 500 ml 0,1 M PBS i 300 ml glikolu etylenowego) do momentu, gdy będą gotowe do immunohistochemii.
  4. Zamontuj przeciętą tkankę na szkiełkach mikroskopowych specjalnie zaprojektowanych tak, aby silnie przylegały do tkanki. Szkiełka te zapewniają mocne trzymanie tkanki na etapie gotowania. Po zamontowaniu chusteczki należy pozostawić szkiełko do wyschnięcia na 10 minut lub do całkowitego wyschnięcia. Suszenie można przyspieszyć, jeśli szkiełko opiera się o pionową powierzchnię, a dolna krawędź szkiełka opiera się na ręczniku papierowym. Jeśli montowana jest więcej niż jedna prowadnica, pozostałe prowadnice można w tym czasie pozostawić suche (1-2 godziny), aż będą gotowe do przejścia do następnego kroku.
  5. Po wyschnięciu szkiełka przemyć PBS trzy razy przez 5 minut każdy i ponownie wysuszyć (bufor PBS = 0,137 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,0119 M Na2PO4). Gwarantuje to, że wszelkie wcześniejsze substancje chemiczne (takie jak glicerol z roztworu do przechowywania zapobiegającego zamarzaniu) są wystarczająco usuwane i nie mogą pogorszyć przylegania tkanki do szkiełka.

2. Przygotowanie odczynników i drobnego sprzętu

  1. Przygotować roztwór A (0,1 M lub 19,21 g/l kwasu cytrynowego) i roztwór B (0,1 M lub 24,9 g/l cytrynianu tris-sodu), w których zostaną zagotowane skrawki tkanki.
  2. W cylindrze miarowym połączyć 9 ml roztworu A i 41 ml roztworu B. Dodać 450 ml ddH2O do tej mieszaniny.
  3. Wlej tę mieszaninę do pustego pojemnika (np. pustego pudełka po końcówkach do pipet), który można używać w kuchence mikrofalowej.

3. Pobieranie antygenu pod wpływem ciepła

  1. Gotuj roztwór przygotowany w kroku 2 przez 5 minut przy standardowym ustawieniu w standardowej kuchence mikrofalowej. Roztwór zacznie wrzeć w temperaturze 100 °C lub wyższej.
  2. Po zakończeniu gotowania ostrożnie wyjmij pojemnik z kuchenki mikrofalowej i umieść w nim wysuszone szkiełka, upewniając się, że powierzchnia szkiełka z sekcjami hipokampa jest skierowana w dół i jest całkowicie wystawiona na działanie płynu. Jeśli to możliwe, umieść slajdy pod kątem przy ściankach pudełka i ułóż wokół nich inne slajdy. Upewnij się, że ich "dopasowanie" do pudełka jest szczelne, aby prowadnice nie miały miejsca na przesuwanie się jedna na drugiej.
  3. Gotuj tę mieszaninę ze szkiełkami przez 7 minut przy standardowych ustawieniach w kuchence mikrofalowej. W tym czasie roztwór zagotuje się w temperaturze 100 °C lub wyższej.
  4. Podczas tego etapu gotowania napełnij dwa wiadra lodu do połowy lodem.
  5. Po zakończeniu gotowania w kroku 3.3 wyjmij pojemnik z kuchenki mikrofalowej i umieść go w jednym z wiader na lód. Wlej resztę lodu z drugiego wiadra dookoła pojemnika i całkowicie go przykryj. Pozostaw na 1 godzinę.

4. Barwienie przeciwciał pierwotnych i wtórnych

  1. Pod koniec 1 godzinnego okresu oczekiwania wyjmij szkiełka z pojemnika i umyj buforem TBS-T 3x przez 5 min każda. Do wykonywania tych podstawowych myć można używać dowolnej aparatury. (Bufor TBS = 50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, TBS-T = 0,05% bufor Triton X-100 TBS, TBS-TT = 4% bufor TBS-T surowicy osła).
  2. Po umyciu pozostaw szkiełka do wyschnięcia w ciemnym miejscu (np. w szufladzie ławki, włóż ręcznik papierowy do szuflady i przechyl suwak w stosunku do niego) przez 5-10 min lub do całkowitego wyschnięcia. W tym okresie należy przygotować komorę do nocnego barwienia przeciwciałami pierwotnymi. Prosta komora barwienia może składać się z pojemnika o dużej powierzchni wypełnionegoddH2Ooraz stolika wewnątrz pojemnika, na którym szkiełko może być oparte powyżejddH2O.
  3. Po wyschnięciu szkiełka narysuj kontur wokół odcinków tkanki za pomocą wodoodpornego pisaka. W kroku 4.5 ten kontur działa jak bariera zapobiegająca przepływaniu mieszaniny przeciwciał.
  4. Przygotować pierwszorzędową mieszaninę przeciwciał w TBS-TT. Do pokrycia jednego całego szkiełka wymagane jest co najmniej 500 μl, na przykład, jeśli zapas przeciwciał jest w stężeniu 1:500, dodać 1 μl danego przeciwciała do 500 μl TBS-TT). Wykorzystaj przeciwciała pierwszorzędowe, jak wspomniano w tabeli odczynników.
  5. Umieść wysuszone szkiełko na stoliku w komorze barwienia. Powoli dodawać 500 μl przeciwciał pierwszorzędowych i pokryć całą powierzchnię. Przykryj całe urządzenie i zawiń w folię aluminiową, aby zablokować światło zewnętrzne. Pozostaw na noc w temperaturze pokojowej.
  6. Następnego dnia umyj szkiełko trzy razy po 5 minut buforem TBS-T. Pozostaw do wyschnięcia w ciemnym miejscu, jak opisano w kroku 4.2.
  7. Przygotować drugorzędową mieszaninę przeciwciał podobną do kroku 4.4. Zapoznaj się z tabelą odczynników dla przeciwciał drugorzędowych.
  8. Umieścić wysuszone szkiełko w komorze barwienia zgodnie z opisem w krokach 4.2 i 4.5. Powoli dodawać 500 μl przeciwciał drugorzędowych i pokryć całą powierzchnię. Owiń komorę barwienia folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem zewnętrznym. Pozostaw pod przykryciem i chroń przed światłem zewnętrznym przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  9. Po zakończeniu wtórnego barwienia umyj szkiełko trzykrotnie po 5 minut buforem TBS-T. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia w ciemnym miejscu. Po wyschnięciu nałożyć roztwór montażowy i przykryć szkiełko szkiełkiem nakrywkowym, ostrożnie zapobiegając wprowadzeniu pęcherzyków. Pozostaw szkiełko w ciemnym miejscu na co najmniej 2 godziny przed dalszą analizą.
  10. Wykonaj analizę poklatkową lub konfokalną na barwionej tkance.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurogeneza hipokampa u osobników dorosłych jest procesem sekwencyjnym, w którym reprezentatywny typ komórek progenitorowych na każdym etapie można zidentyfikować za pomocą kombinacji markerów. Staranna fiksacja chemiczna oraz odmaskowanie antygenów zwiększają skuteczność i dostępność markerów, które w przeciwnym razie są trudne do wykrycia. Jednym z nich jest nestyna, która wykazuje ekspresję w komórkach macierzystych neuronów przypominających glej promienisty oraz w niektórych wczesnych aktywnych typach komórek progeni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najważniejszymi etapami skutecznego pobierania antygenu i barwienia typów komórek progenitorowych są: 1) wykorzystanie dobrze perfundowanej i utrwalonej tkanki o optymalnej grubości koronalnej; 2) pozostawienie wystarczającej ilości czasu na wrzenie, a następnie schłodzenie podczas pobierania antygenu; 3) manualna zręczność w montażu stałych odcinków koronowych i zapobieganiu przy tym ich uszkodzeniom.

W IHC bardzo ważne jest, aby używać perfundowanej tkanki, która została poddana wystarczając...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metodologia została pierwotnie opracowana w laboratorium dr Hongjun Songa w Instytucie Inżynierii Komórkowej, Wydziale Neurologii, Johns Hopkins School of Medicine. Praca ta została sfinansowana przez NIMH (R00MH090115), NARSAD, Bratni Zakon Orłów' Mayo Cancer Research Fund oraz pakiet startowy od fundacji Mayo przyznany M.H.J. i Basic Science Research Program za pośrednictwem National Research Foundation of Korea (NRF) finansowany przez Ministerstwo Edukacji, Nauki i Technologii (A3014385) przyznany W.R.K.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Prowadnica SuperFrost PlusFisherbrand12-550-15Zapewnia silne przyleganie do tkanki hipokampa podczas gotowania
PVA/DABCO Media montażoweSigma Aldrich10981-100 ml
Nestin (kurczak) Aves LabNESMarker nerwowych komórek macierzystych
GFAP (królik)Dako Ameryka PółnocnaZ033401-2Marker astrocytów i nerwowych komórek macierzystych
MCM2 (mysz)Laboratorium transdukcji BD610701Marker proliferacji
DCX (koza)Santa Cruz BiotechnologySC8066Marker niedojrzałego neuronu
Tbr2 (królik)AbcamAb23345Amplifikujący marker progenitorowy
NeuN (mysz)MilliporeMAB377Marker dojrzałego neuronu
Cy2 (anty-królik)Jackson Immunoresearch111-226-047
Cy2 (anty-kurczak)Jackson Immunoresearch303-165-006
Cy5 (anty-mysz)Jackson Immunoresearch315-175-047
Cy5 (anty-koza)Jackson Immunoresearch305-165-047
DAPILife Technologies CorporationD1306
Dako PenS2002DakoWodoodporny długopis

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annual Reviews of Neuroscience. 28, 223-250 (2005).
  2. Santarelli, L., Saxe, M., et al. Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants. Science. 301 (5634), 805-809 (2003).
  3. Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-4670 (2011).
  4. Clelland, C. D., Choi, M., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325 (5937), 210-213 (2009).
  5. Wang, J. W., David, D. J., et al. Chronic fluoxetine stimulates maturation and synaptic plasticity of adult-born hippocampal granule cells. Journal of Neuroscience. 28 (6), 1374-1384 (2008).
  6. D'Amico, F., Skarmoutsou, E., Stivala, F. State of the art in antigen retrieval for immunohistochemistry. Journal of Immunological Methods. 341 (1-2), 1-18 (2009).
  7. Daneshtalab, N., et al. Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 61 (2), 127-135 (2010).
  8. Jang, M. H., Bonaguidi, M. A., et al. Secreted frizzled-related protein 3 regulates activity-dependent adult hippocampal neurogenesis. Cell Stem Cell. 12 (2), 215-223 (2013).
  9. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).
  10. Porcelli, M., Cacciapuoti, G., et al. Non-thermal effects of microwaves on proteins: Thermophilic enzymes as model system. FEBS Letters. 402 (2-3), 102-106 (1997).
  11. Stone, J. R., Walker, S. A., Povlishock, J. T. The visualization of a new class of traumatically injured axons through the use of a modified method of microwave antigen retrieval. Acta Neuropathologica. 97 (4), 335-346 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Immunohistochemiamikroskopia konfokalnafiksacja tkanekbarwienie przeciwcia em pierwszorz dowymbarwienie przeciwcia em drugorz dowymkrojenie tkanek m zgugotowanie w mikrofal wce

Powiązane artykuły