Identyfikacja specyficznych populacji neuronów czuciowych w celu badania ekspresji kanałów jonowych

Podsumowanie

Aferentne neurony czuciowe przekazują informacje sensoryczne z peryferii do ośrodkowego układu nerwowego. Identyfikacja konkretnych neuronów aferentnych pomoże w zrozumieniu ich fizjologii. Opisujemy metodę znakowania wstecznego w celu identyfikacji neuronów aferentnych i badania kanałów jonowych bramkowanych napięciem w tych neuronach za pomocą elektrofizjologii i immunocytochemii za pomocą elektrofizjologii i immunocytochemii.

Streszczenie

Neurony czuciowe przekazują sygnały z różnych części ciała do ośrodkowego układu nerwowego. Soma dla tych neuronów znajduje się w zwojach korzenia grzbietowego, które wyściełają kręgosłup. Zrozumienie receptorów i kanałów wyrażanych przez te neurony doprowadzające czuciowo może doprowadzić do opracowania nowych terapii chorób. Pierwszym krokiem jest zidentyfikowanie konkretnego podzbioru neuronów czuciowych będących przedmiotem zainteresowania. Tutaj opisujemy metodę identyfikacji neuronów aferentnych unerwiających mięśnie poprzez znakowanie wsteczne za pomocą barwnika fluorescencyjnego DiI (nadchloran 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny). Zrozumienie udziału kanałów jonowych w pobudzeniu mięśni aferentnych może pomóc w lepszym kontrolowaniu nadmiernej pobudliwości wywołanej niektórymi stanami chorobowymi, takimi jak choroba naczyń obwodowych lub niewydolność serca. Zastosowaliśmy dwa podejścia do identyfikacji zależnych od napięcia kanałów jonowych wyrażanych przez te neurony, elektrofizjologię klamrów łatkowych i immunocytochemię. Podczas gdy elektrofizjologia w połączeniu z farmakologicznymi blokerami może zidentyfikować funkcjonalne typy kanałów jonowych, użyliśmy immunocytochemii w celu zidentyfikowania kanałów, dla których określone blokery były niedostępne i lepszego zrozumienia wzorca dystrybucji kanałów jonowych w populacji komórek. Techniki te można zastosować do innych obszarów układu nerwowego w celu zbadania określonych grup neuronów.

Wprowadzenie

Zwoje korzenia grzbietowego (DRG) składają się z somy z neuronów doprowadzających unerwiających różne części ciała, a ważne informacje można uzyskać badając neurony czuciowe o różnych celach unerwienia¹. Do izolacji i identyfikacji neuronów aferentnych stosuje się różne metody pośrednie lub inwazyjne, np. wstrzyknięcie do nerwu markerów, takich jak fluorogold¹, wstrzyknięcie barwnika do mięśni metodą chirurgiczną². Spośród różnych barwników, które zostały z powodzeniem wykorzystane do znakowania neuronów i dróg neuronalnych, barwniki fluorescencyjne, takie jak DiI, są szeroko stosowane w śledzeniu neuroanatomicznym ze względu na ich szybkie wchłanianie przez zakończenia neuronów, długotrwałe zatrzymywanie w neuronach i brak transferu między neuronami³. Neurony aferentne oznaczone DiI można łatwo zobrazować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego w celu szczegółowego badania. Jednak jednym z ograniczeń jest to, że markery, takie jak DiI, mogą zostać utracone z komórek podczas przenikania komórek potrzebnego do immunocytochemii z wewnątrzkomórkowymi epitopami⁴. Tutaj opisujemy metodę, która wykorzystuje DiI wstrzyknięte do mięśni szkieletowych w celu identyfikacji neuronów doprowadzających do mięśni w DRG. Opisujemy również metodę przenikania komórek, która zatrzymuje DiI w neuronie, umożliwiając jednocześnie dostęp przeciwciał do epitopów wewnątrzkomórkowych. Demonstrujemy zastosowanie zarówno elektrofizjologii klamry łatowej, jak i immunocytochemii do badania tych zidentyfikowanych neuronów, a także opisujemy wyraźne zalety każdej techniki w badaniu kanałów jonowych, które kontrolują pobudliwość neuronów. Na koniec opisujemy potencjalne problemy, które mogą utrudniać interpretację danych elektrofizjologicznych. Wykorzystaliśmy te metody do identyfikacji neuronów doprowadzających mięśniowych i skórnych oraz określenia kanałów sodowych bramkowanych napięciem (NaV) wyrażonych w tych zidentyfikowanych neuronach⁸. Metody te można jednak dostosować do różnych preparatów do badania zidentyfikowanych podzbiorów neuronów unerwiających określoną tkankę docelową lub jądro mózgowe.

Protokół

Uwaga: Wszystkie prace ze zwierzętami muszą być wykonywane zgodnie z wytycznymi instytucji i opieki nad zwierzętami.

1. Przygotowanie zwierząt i etykietowanie

1. Znieczulenie szczurów: Znieczulenie szczura (zwykle 150-400 g) za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia mieszaniny ketaminy (50 mg/kg masy ciała), ksylazyny (5 mg/kg) i acepromazyny (1 mg/kg). Sprawdź odruchy, szczypiąc stopę, poczekaj, aż nie będzie odpowiedzi. Ponieważ reakcja anestezjologiczna różni się u różnych zwierząt, najlepiej jest określić działanie środków znieczulających, testując odruchy bólowe.
2. Roztwór DiI: Zważ proszek DiI i rozpuść w sterylnym 100% DMSO, aby uzyskać 1,5% roztwór (15 mg / ml). Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej w suchej atmosferze do czasu użycia.
3. Zastrzyki DiI: ogolić włosy w okolicy łydki na obu nogach znieczulonego szczura za pomocą elektrycznej maszynki do golenia.
   1. Napełnij sterylną strzykawkę o pojemności 1 ml (igła 11/4 cala 27 G) 200 μl 1,5% roztworu DiI. Powoli włóż igłę równolegle do długiej osi każdego mięśnia brzuchatego łydki i wstrzyknij 100 μl DiI do mięśnia, powoli wycofując igłę z mięśnia (~10 sekund) bez wycofywania się z mięśnia.
   2. Przed wyjęciem igły z mięśnia należy pociągnąć do tyłu tłok strzykawki, aby upewnić się, że barwnik nie wypływa już z końcówki, odczekać 10 sekund, a następnie wyjąć igłę z mięśnia. Ten krok zapobiega wyciekowi DiI z igły na skórę, która mogłaby oznaczać aferenty skórne.
   3. Powtórz dla drugiej nogi.
   4. Odczekaj 4-5 dni, aż DiI zostanie przetransportowane z mięśnia do DRG.

2. Sekcja i izolacja neuronów

1. Rozwiązania:
   1. Przygotować Zbilansowany Roztwór Soli Hanka (HBSS) i Zrównoważony Roztwór Soli Earle'a (EBSS) zgodnie z instrukcjami producenta, przefiltrować, wysterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   2. Pożywki hodowlane (MEM Plus): Wymieszać 89 ml minimalnej ilości pożywek niezbędnych (MEM), 10 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1 ml roztworu penicyliny i streptomycyny, przefiltrować, wysterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   3. Roztwór polilizyny: rozpuścić sproszkowany bromowodorek poli-L-lizyny (10 mg/100 ml) w 0,1 M roztworze boranu sodu o pH 8,4, przefiltrować, wysterylizować i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
2. Powlekanie szkiełek nakrywkowych
   1. Wyczyść szklane szkiełka nakrywkowe (okrągłe 12 mm) w 70% etanolu przez 3-4 godziny i wysusz na powietrzu w sterylnym kapturze hodowlanym.
   2. Umieścić wysuszone szkiełka nakrywkowe w roztworze polilizyny O/N.
   3. Wyjąć z roztworu polilizyny i umyć w sterylnej wodzie destylowanej 2x przez 5 minut każdy, aby usunąć nadmiar polilizyny.
   4. Oddzielić szkiełka nakrywkowe, wysuszyć w kapturze hodowlanym i przechowywać w temperaturze 4 ^oC.
3. Przygotowanie do sekcji
   1. Umieścić na lodzie zlewkę z 10 ml HBSS, szalkę Petriego o średnicy 35 mm i szalkę Petriego o średnicy 100 mm.
   2. Odważ enzymy: 7 mg kolagenazy, 1 mg DNAzy i 10 mg trypsyny.
   3. Podgrzej łaźnię wodną z wytrząsaniem do temperatury 37 ^°C i umieść w łaźni 15 ml probówki wirówkowej zawierającej 10 ml EBSS do ogrzania.
4. Rozwarstwienie:
   1. Ofiara ze szczura zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IACUC. Do eutanazji szczura użyto klasy Cdwutlenek arbonu.
   2. Szybko usuń plecy, rozcinając skórę na plecach, usuń tkankę łączną i mięśniową wzdłuż kręgosłupa dla lepszej ekspozycji i usuń odcinek lędźwiowy kręgosłupa (koniec klatki piersiowej do kości biodrowej; Rysunek 1).
   3. Umieścić izolowany kręgosłup na szalce Petriego o średnicy 100 mm i za pomocą sterylnej pipety Pasteura nanieść schłodzony roztwór HBSS, aby preparat był wilgotny i zimny.
   4. Wytnij mięśnie z boków kręgosłupa. Wykonaj laminektomię grzbietową za pomocą rongeurów lub nożyczek i delikatnie usuń kość otaczającą wgłębienia zawierające DRG.
   5. Podczas tej procedury kilkakrotnie stosuj lodowaty HBSS (~1 ml).
   6. Odizoluj DRG, przecinając nerwy obwodowe i ośrodkowe (pozostawiając 1-2 mm nerwu, aby ułatwić obsługę zwojów)
   7. Umieścić wyizolowany DRG na szalce Petriego o średnicy 35 mm zawierającej lodowaty bufor HBSS.
   8. Powtarzaj tę czynność, aż wszystkie L-4 i L-5 DRG zostaną odizolowane. DRG klatki piersiowej można wyizolować i przetworzyć oddzielnie jako kontrolę ujemną do znakowania DiI.
   9. Umieść naczynie z wyizolowanym DRG pod mikroskopem preparacyjnym i usuń nadmiar nerwów i naczyń krwionośnych za pomocą mikronożyczek i kleszczy.
   10. Rozciąć DRG, aby uzyskać lepszą ekspozycję na enzymy, ale nie wyjmuj DRG z pochwy.
5. Dysocjacja neuronów DRG:
   1. Dodaj enzymy do ciepłej pożywki EBSS (przechowywanej w łaźni wodnej). Wstrząśnij krótko do rozpuszczenia i wysterylizuj filtr.
   2. Za pomocą sterylnej pipety Pasteura umieść całe DRG w roztworze enzymu. Zminimalizuj objętość HBSS dodawanego za pomocą DRG, ponieważ HBSS rozcieńczy mieszaninę enzymów. Spryskaj kolbę 95%_O2 i 5% CO₂ przez 60 sekund przed szczelnym zamknięciem kolby.
   3. Inkubować kolbę w wytrząsającej łaźni wodnej nastawionej na 37 °C przez 60 minut przy 240 obr./min.
   4. Pod koniec inkubacji energicznie wstrząsnąć kolbą 50 razy, aby oddzielić DRG⁵.
   5. W sterylnych warunkach dodać 5 ml MEM Plus do kolby w celu zatrzymania enzymów.
   6. Przenieść zawartość kolby do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować przy 16 x g przez 6 minut.
   7. Usunąć i odrzucić sklarowany osad, dodać 5 ml MEM Plus do próbki. Delikatnie rozetrzeć pipetą, aby rozbić osad.
   8. Powtórzyć etap wirowania, usunąć i wyrzucić supernatant i dodać 500 μl MEM Plus. Delikatnie rozetrzeć końcówką pipety o pojemności 1 ml na pipecie, aby uzyskać zawiesinę komórek.
   9. Umieść jedno szkiełko nakrywkowe ze szkła pokrytego polilizyną w pustym sterylnym naczyniu o średnicy 35 mm. Dodać kroplę (~50 μl) zawiesiny komórek do środka szkiełka nakrywkowego.
   10. Powtarzaj, aż roztwór komórkowy zostanie wyczerpany.
   11. Umieścić szalki o średnicy 35 mm w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO₂ na 1 godzinę, aby neurony mogły przylgnąć do szkiełek nakrywkowych.
   12. Dodaj dodatkowe 2 ml pożywki do każdego naczynia i wróć do inkubatora.

3. Nagrywanie z zaciskiem krosowym

1. Rozwiązania do nagrywania: te rozwiązania służą do rejestrowania prądów NaV. Przykłady rozwiązań o różnym składzie można znaleźć w tych piśmiennictwie^5-7.
   1. Roztwór zewnętrzny: (w mM) 45 NaCl, 100 N-metylo-d-glukaminy (NMG)•Cl, 4 MnCl₂, 10 Na•HEPES i 10 glukozy, o pH = 7,4 i osmolarności = 320 mOsm.
   2. Roztwór wewnętrzny: (w mM) 104 NMG•Cl, 14 Kreatyna•PO₄, 6 MgCl₂, 10 NMG•HEPES, 5 Tris•ATP, 10 NMG₂•EGTA i 0,3 Tris₂•GTP o pH 7,4 i osmolarności = 300 mOsm.
2. Pomiar prądów jonowych:
   1. Wyciągnij elektrody rejestrujące ze szklanych kapilar na ściągacz elektrod i wypoleruj końcówki na gorąco za pomocą mikrokuźni. Rezystancja elektrod wynosi zwykle 2-3 MΩ
   2. Zidentyfikuj neurony DRG oznaczone DiI za pomocą mikroskopu z epifluorescencją i kostki TRITC. DiI ma długość fali wzbudzenia 550 nm i długość fali emisji 570 nm.
   3. Napełnij szklaną elektrodę roztworem wewnętrznym (wypełniając tylko ~ 1 cm końcówki elektrody) i delikatnie postukaj, aby usunąć wszelkie uwięzione pęcherzyki. Umieść w uchwycie elektrody i przenieś do ogniwa za pomocą mikromanipulatora.
   4. Gdy elektroda dotknie ogniwa, zastosuj delikatne ssanie przez rurkę ssącą, aż do uzyskania szczelnego uszczelnienia (określonego przez wzrost rezystancji elektrody).
   5. Zacisk napięcie membrany na żądanym potencjale podtrzymania (zwykle od -60 do -120 mV).
   6. Uzyskaj konfigurację zacisku krosowego dla całego ogniwa, stosując silniejsze ssanie w celu usunięcia łaty membranowej na końcu elektrody. Przejście do konfiguracji całoogniwowej obserwuje się elektrycznie jako wzrost prądu pojemnościowego^8-10.
   7. Skompensuj rezystancję szeregową za pomocą obwodu kompensacyjnego wzmacniacza patch clamp (użyj co najmniej 80% kompensacji)^8,10.

4. Immunocytochemia

1. Utrwal neurony na szkiełkach nakrywkowych za pomocą 4% paraformaldehydu przez 1 godzinę, a następnie przepuszczaj za pomocą 2% Tween 20 w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez 10 minut.
2. Inkubować utrwalone komórki O/N w roztworze blokującym (normalna surowica lub albumina surowicy bydlęcej) plus przeciwciało pierwszorzędowe, które jest przeciwciałem opracowanym w celu wiązania się ze specyficznym antygenem będącym przedmiotem zainteresowania.
3. Inkubuj kontrolny zestaw neuronów O / N w roztworze blokującym, który nie ma pierwszorzędowych przeciwciał.
4. Przemyć szkiełka nakrywkowe buforem PBS 3x przez 5 minut, a następnie 2 płukania po 5 minut każde 1% Tween 20 w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała pierwszorzędowego.
5. Inkubować szkiełka nakrywkowe, testowe i kontrolne z odpowiednim fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem drugorzędowym, które wiąże się z przeciwciałem pierwszorzędowym, aby umożliwić wizualizację.
6. Przemyj szkiełka nakrywkowe PBS 3x przez 5 minut, aby usunąć nadmiar przeciwciał drugorzędowych.
7. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na czystym szkiełku podstawowym za pomocą nośnika montażowego.
8. Nałóż bezbarwny lakier do paznokci na krawędź szkiełka nakrywkowego, aby go zamocować. Po wyschnięciu zwizualizuj neurony i rejestruj obrazy za pomocą oprogramowania dołączonego do mikroskopu fluorescencyjnego.
   Uwaga: W tej pracy użyto mikroskopu firmy Nikon z oprogramowaniem NIS ELEMENTS BR 3.2. Czas naświetlania został zoptymalizowany i pozostał taki sam dla szkiełek kontrolnych i testowych.
9. Mierz intensywność fluorescencji i wielkość komórek z poszczególnych neuronów za pomocą oprogramowania do obrazowania, takiego jak ImageJ (rsbweb.nih.gov/ij/index.html).

Wyniki

Korzystając z opisanej tutaj metody, zidentyfikowaliśmy neurony doprowadzające do mięśni w DRG i przeszliśmy do określenia kanałów sodowych bramkowanych napięciem (NaV) wyrażanych przez te neurony. Neurony doprowadzające do mięśni znakowane DiI (ryc. 1C) stanowiły niewielki ułamek całkowitej populacji neuronów w DRG, przy czym średnio 16% neuronów (167/1047) było znakowanych. Kwantyfikacja została przeprowadzona, najpierw mierząc fluorescencję za pomocą ImageJ i wykreślając histogramy danych o intensywno...

Dyskusja

Mięśnie aferentne pochodzące z mięśni trójgłowych łydki (np. mięśnia brzuchatego łydki) były wykorzystywane w wielu badaniach w celu zbadania odruchu presyjnego wysiłku fizycznego (EPR)¹³. Biorąc pod uwagę zainteresowanie badaniem neuronów czuciowych pośredniczących w EPR, mięśnie brzuchatego łydki wybrano do wstrzyknięcia barwnika. DiI został wybrany ze względu na jego lipofilowy charakter i dlatego, że nie jest tracony z neuronu przez dyfuzję przez nienaruszoną błonę plazmatyczną^3,14. Kor...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
NaV 1.8	Abcam	Ab93616
NaV 1.1 / 1.6/ 1.7 i 1.9	Alamone Labs, Jerozolima, Izrael	ASC- 001/ 009 /008 /017
Alexa Fluor Przeciwciała drugorzędowe	Invitrogen
Normalna surowica
Fluoro-żelowa	mikroskopia elektronowa Nauki	17985