Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Hybrydyzacja in situ mikroRNA dla tkanek nerek utrwalonych formaliną

14.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50785

⸱

30 listopada 2013

 , 
1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje protokół hybrydyzacji in situ zoptymalizowany do kolormetrycznego wykrywania ekspresji mikroRNA w stałych odcinkach nerki z formaliną.

Streszczenie

W tym artykule opisujemy metodę kolorymetrycznego wykrywania miRNA w nerkach poprzez hybrydyzację in situ z sondami mikroRNA oznaczonymi digoksygeniną. Protokół ten, pierwotnie opracowany przez Kloostermana i współpracowników do szerokiego zastosowania z sondami miRNAExiqon 1, został zmodyfikowany w celu przezwyciężenia wyzwań związanych z analizą miRNA w tkankach nerkowych. Należą do nich takie kwestie, jak identyfikacja struktury i trudne do usunięcia resztki sondy i przeciwciała. Zastosowanie stosunkowo cienkich skrawków tkanek o grubości 5 mm pozwoliło na wyraźną wizualizację struktur nerkowych, przy jednoczesnym zachowaniu w komórkach silnego sygnału sondy. Ponadto zoptymalizowano koncentrację sondy i warunki inkubacji, aby ułatwić wizualizację ekspresji mikroRNA o niskim tle i niespecyficznym sygnale. W tym miejscu opisany jest zoptymalizowany protokół, obejmujący wstępne pobranie i przygotowanie tkanek poprzez montaż szkiełek na końcu zabiegu. Podstawowe składniki tego protokołu mogą być modyfikowane w celu zastosowania do innych tkanek i modeli kultur komórkowych.

Wprowadzenie

MicroRNA to małe (około 22 nukleotydy długości) niekodujące RNA, które są wytwarzane endogennie. Na ogół działają w celu tłumienia ekspresji białek poprzez represję translacyjną lub degradację mRNA. miRNA wiążą się z celami mRNA z niepełną komplementarnością, dzięki czemu pojedynczy miRNA może tłumić wiele celów.

Zrozumienie, które typy komórek i struktury wyrażają miRNA, jest ważną częścią zrozumienia mechanizmów, poprzez które zmiany w ekspresji miRNA wpływają na fenotypy komórek i tkanek. Podczas gdy metody takie jak sekwencjonowanie miRNA, qPCR i Northern blotting mogą być stosowane do wykrywania miRNA w całych tkankach, takie podejście nie pozwala na określenie, z jakiego konkretnego typu komórek pochodzą w danej tkance. Sekcja składników komórkowych i strukturalnych przed analizą przy użyciu tych metod może być bardzo trudna, a warunki potrzebne do uzyskania odpowiednich izolacji mogą prowadzić do zmian w ekspresji genów lub degradacji RNA. Hybrydyzacja mikroRNA in situ to metoda stosowana do wizualizacji lokalizacji i poziomów ekspresji mikroRNA w tkankach. Technika ta jest szczególnie cenna w tkankach złożonych z niejednorodnych struktur, takich jak nerka.

Wykazano, że mikroRNA odgrywają rolę regulacyjną w rozwoju nerek2,3 i fizjologii4. Wykazano również, że zmiany w ekspresji mikroRNA są związane z patologią nerek, taką jak zwłóknienie5-10, nefropatia cukrzycowa7, rak nerki11,12 i ostre uszkodzenie nerek13. W naszych badaniach odkryliśmy, że optymalizacja hybrydyzacji in situ mikroRNA dla tkanek nerek była cenna dla określenia dokładnych lokalizacji strukturalnych ekspresji miRNA zarówno w zdrowiu, jak i chorobie14. Określenie kanalikowatej i komórkowej ekspresji różnych mikroRNA jest ważne, ponieważ ich regulacja celów może być zależna od funkcji komórkowych. W stanach chorobowych ważne jest również określenie, w jaki sposób zmiany w ekspresji miRNA mogą wpływać na funkcję.

Celem opisanej tutaj metody było rozwinięcie istniejących metodologii ISH opracowanych przez Kloostermana i wsp. 15, inni badacze16,17 i ci sugerowani przez Exiqon1 i optymalizują metodę dla tkanek nerkowych utrwalonych w formalinie. Z powodzeniem zastosowaliśmy tę metodę do identyfikacji wyraźnych regionalnych różnic w ekspresji nerkowego mikroRNA miR-382 z jednostronną niedrożnością moczowodu18. Takie podejście można zastosować również w przypadku innych tkanek, z dodatkową optymalizacją.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Skrawki tkanki nerkowej

  1. Utrwalone formaliną (10%) skrawki nerek zatopione w parafinie są wycinane na szkiełkach mikroskopowych o grubości 5 mm za pomocą Microm HM 355 S. Preparaty mogą być przechowywane przez kilka miesięcy przed analizą.

2. Przygotowanie roztworu

  1. Przygotuj 1 l 1x PBS w ddH2O w autoklawowalnej butelce z zakrętką. Napełnij kolejną butelkę 1 litrem ddH2O. Do każdej butelki dodaj 1 ml DEPC, przykryj i energicznie wstrząśnij. Pozostaw roztwory na noc w temperaturze pokojowej, aby zniszczyć RNA, a następnie autoklaw. Dodaj 400 ml Tween-20 do 1 l 1x PBS, aby uzyskać PBS-T.
  2. Przygotować bufor proteinazy K (50 mMTris-HCl, pH 8,0 i 1 mM CaCl2 w wodzie uzdatnionej DEPC).
  3. Przygotować roztwór 0,2% glicyny w PBS-T.

3. Przygotowanie tkanek

  1. Przygotować dużą objętość buforu hybrydyzacyjnego (50-100 ml) składającego się z 50% formamidu, 5 x SSC, 0,1% Tween, 9,2 mM kwasu cytrynowego w celu dostosowania do pH 6, 50 μg/ml heparyny i 500 μg/ml RNA drożdży w ddH2O. Podzielić na 1 ml porcji i przechowywać w temperaturze -80 ºC.
  2. Usuń parafinę z tkanki myjąc 3x w świeżym ksylenie przez 5 min każde.
  3. Uwodnić skrawki tkanek przez 5 minut inkubacji w zmniejszających się stężeniach etanolu (100%, 75%, 50% i 25%) w ddH2O.
  4. Preparaty należy potraktować wystarczającą ilością DEPC, aby całkowicie pokryć skrawki tkanek (około 0,4-0,5 ml) przez 1 minutę. Upewnij się, że chusteczki nie wysychają.
  5. Opłucz szkiełka w PBS-T poddanym działaniu DEPC dwa razy przez 5 minut, zbierając DEPC zawierające odpady w celu prawidłowej utylizacji. Od tego momentu wszystkie odczynniki powinny być poddawane działaniu DEPC w celu wyeliminowania RNAZ.
  6. Wstępnie rozgrzać bufor proteinazy K i dodać proteinazę K do końcowego stężenia 10 μg/ml. Przykryć skrawki tkanek roztworem proteinazy K i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
  7. Szybko usuń roztwór proteinazy K i dodaj 0,2% glicyny do PBS-T na 30 sekund.
  8. Przepłukać szkiełka w PBS-T poddanym działaniu DEPC dwa razy po 30 sekund każda.
  9. Utrwal skrawki w świeżo przygotowanym 4% paraformaldehydzie na 10 minut.

4. Hybrydyzacja

  1. Dodać 50 μl buforu hybrydyzacyjnego (50% formamidu, 5 x SSC, 0,1% Tween, 9,2 mM kwasu cytrynowego do dostosowania do pH 6, 50 μg/ml heparyny, 500 μg/ml RNA drożdży) na wycinek tkanki i przykryć wolnymi od RNAzy HybriSlips wyciętymi nieco większymi niż skrawki tkanki.
  2. Prehybrydyzacja skrawków w piecu do hybrydyzacji o kontrolowanej wilgotności przez 2 godziny w temperaturze hybrydyzacji określonej dla sondy znakowanej digoksygeniną 3' (zwykle DNA Tm sondy -21 °C, (tj. 54 °C dla miR-382, sondy DNA Tm = 75 °C), przy użyciu chusteczek laboratoryjnych nasączonych 50% formamidem / 50% 5x SSC w celu utrzymania wilgotności komory.
  3. Rozcieńczyć sondę miRNA, kontrolę pozytywną (U6, małe jądrowe RNA) i kontrolę ujemną (sekwencja zakodowana) do 40 nM w buforze hybrydyzacyjnym (potrzeba 75 μl buforu na sekcję).
  4. Podgrzewać sondę w buforze hybrydyzacyjnym w temperaturze 65 °C przez 5 minut.
  5. Usuń szkiełka z pieca do hybrydyzacji i usuń szkiełka nakrywkowe i nadmiar bufora hybrydyzacyjnego z prehybrydyzacji.
  6. Dodać 75 μl sondy zawierającej bufor na każdy wycinek tkanki, bezpośrednio do tkanki. Przykryj tkankę preparatem HybriSlips na tyle dużą, aby pokryć jej sekcje tkanki.
  7. Utrzymując uchwyt szkiełka poziomo, wróć do pieca do hybrydyzacji w celu inkubacji przez noc w temperaturze z kroku 4.2 (około 16 godzin).

5. Pranie surowości

  1. Dodaj 200 μl 2x SSC, podgrzane do temperatury hybrydyzacji, tuż pod jedną krawędzią szkiełek nakrywkowych, aby pomóc uwolnić szkiełko nakrywkowe z tkanki. Zdejmij szkiełko nakrywkowe, przechylając szkiełko.
  2. Umyć szkiełka w 200 μl 50% formamidu, 50% 2x SSC w temperaturze hybrydyzacji 3x przez 30 min każde.
  3. Przepłukać szkiełka 5x w PBS-T w temperaturze pokojowej przez 5 minut każda na wytrząsarce orbitalnej na niskich obrotach.

6. Wykrywanie

  1. Inkubować szkiełko w buforze blokującym (2% surowica kozia lub końska, 2 mg/ml BSA w PBS-T) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej na niskiej prędkości.
  2. Rozcieńczyć fragmenty anty-DIG-AP Fab w buforze blokującym w stosunku 1:100. Dodać 100 μl na każdy fragment tkanki i przykryć HybriSlips wyciętym na tyle dużym, aby pokryć sekcje.
  3. Inkubować przeciwciała w wilgotnej komorze w temperaturze 4 °C przez noc (około 16 godzin).
  4. Umyj szkiełka w PBS-T 7x, przez 5 minut każda na wytrząsarce orbitalnej z niską prędkością.
  5. Umyj szkiełka w buforze AP (100 mM TrisHCl pH 9,5, 50 mM MgCl 2,100 mM NaCl, 0,1% Tween 20) 3x po 5 minut każda.
  6. Dodać roztwór NBT/BCIP do buforu AP (bufor 200 μl/10 ml)
  7. Dodać 400-500 ml rozcieńczonego roztworu NBT/BCIP do każdego szkiełka, aby całkowicie pokryć wszystkie skrawki tkanki. Rozwijać w ciemnej, równej, nawilżonej komorze przez 4-5 godzin.

7. Montaż prowadnic

  1. Odwadniać sekcje w rosnących stężeniach etanolu (25%, 50%, 75%, 100%) przez 5 minut każda.
  2. Inkubować w ksylenie 5x w celu oczyszczenia skrawków.
  3. Zamontuj prowadnice w średnim roztworze montażowym Permount i wysusz przez noc.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Obszary przekroju tkanki, które wysychają podczas etapów hybrydyzacji, inkubacji lub przemywania, zazwyczaj wykazują ciemniejsze barwienie podczas procesu detekcji NBT/BCIP. Rysunek 1 przedstawia fragment przekroju nerki, w którym HybriSlip zsunął się z krawędzi tkanki, co doprowadziło do jej częściowego odwodnienia. Mimo rehydratacji i pokrycia w kolejnych etapach, sygnał w odwodnionej części jest sztucznie zawyżony.

Znaczenie kontrolowania czasu wywoływania NBT-BCIP zostało ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Celem tego artykułu było opisanie protokołu hybrydyzacji miRNA in situ , który dobrze sprawdza się w tkankach nerkowych utrwalonych w formalinie. Podczas opracowywania tego protokołu zidentyfikowano kilka ważnych źródeł artefaktów barwiących. Zwrócenie szczególnej uwagi na te punkty może pomóc uniknąć zabarwienia artefaktu i zwiększyć prawdopodobieństwo udanego przebiegu ISH.

Jedna z najłatwiejszych do uniknięcia przyczyn artefaktu barwienia może wystąpić, gdy skrawki tkanek wysychają...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie ma nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty amerykańskich Narodowych Instytutów Zdrowia HL082798 i HL111580.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ParaformaldehydSigmaP6148
PBSGibco70011044
pirowęglan dietyluSigmaD5758
Tween-20SigmaP1379
KsylenySigma534056
EtanolUltra Pure200CSPTP
Tris-HClLife Technologie15506-017
CaCl2SigmaC2536
GlicynaJ.T. Baker4059-00
Kwas cytrynowySigmaC2404
FormamidSigmaF9037
20x SSCBuffer Life Technologies15557-044
HeparynaSAGENT25021-400-30
Drożdże RNALife TechnologiesAM7118
MgCl2SigmaM8266-1004
NaClJ.T. Baker4058-01
Proteinaza KFermentasEO0491
3' DIG- sonda miRNAExiqonmiR dependent-05
3' DIG- Sonda miR z kodowaniemExiqon99004-05
3' Sonda DIG-U6 miRExiqon99002-05
Anti-Digoxigenin-Ab FabRoche11093274910
NBT/BCIPRoche11681451001
PermountFisherSP15-500
Szkiełka nakrywkoweFisherDopasowane do rozmiaru
tkanki Microtom HM 355 SThermo Scientific23-900-672
Wysuwany piec hybrydyzacyjnyBoekel241000
Zespół tacy aluminiowejBoekelC2403973
Wkładka do stojaka ze stali nierdzewnejBoekelC2403754

Bibliografia

  1. Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney. Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).
  2. Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A. The pro-apoptotic protein Bim is a MicroRNA target in kidney progenitors. J. Am. Soc. Neph. 22 (6), 1053-1063 (2011).
  3. Tian, Z., Greene, A. S., Pietrusz, J. L., Matus, I. R., Liang, M. MicroRNA-target pairs in the rat kidney identified by microRNA microarray, proteomic, and bioinformaticanalysis. Genome Res. 18 (3), 404-411 (2008).
  4. Mladinov, D., Liu, Y., Mattson, D. L., Liang, M. MicroRNAs contribute to the maintenance of cell-type-specific physiological characteristics: miR-192 targets Na+/K+-ATPase β1. Nucleic Acids Res. 41 (2), 1273-1283 (2013).
  5. Liu, Y., Taylor, N. E., Lu, L., Usa, K., Cowley, A. W., Ferreri, N. R., Yeo, N. C., Liang, M. Renal medullary microRNAs in Dahl salt-sensitive rats: miR-29b regulates several collagens and related genes. Hypertension. 55 (4), 974-982 (2010).
  6. Kato, M., Zhang, J., Wang, M., Lanting, L., Yuan, H., Rossi, J. J., Natarajan, R. MicroRNA-192 in diabetic kidney glomeruliand its function in TGF-b-induced collagen expression via inhibition of E-box repressors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (4), 3432-3437 (2007).
  7. Krupa, A., Jenkins, R., Luo, D. D., Lewis, A., Phillips, A., Fraser, D. Loss of microRNA-192 promotes fibrogenesis in diabetic nephropathy. J. Am. Soc. Neph. 21 (3), 438-447 (2010).
  8. Wang, B., Herman-Edelstein, M., Koh, P., Burns, W., Jandeleit-Dahm, K., Watson, A., Saleem, M., Goodall, G. J., Twigg, S. M., Cooper, M. E., Kantharidis, P. E-cadherin expression is regulated by miR-192/215 by a mechanism that is independent of the profibrotic effects of transforming growth factor-β. Diabetes. 59 (7), 1794-1802 (2010).
  9. Kato, M., Arce, L., Wang, M., Putta, S., Lanting, L., Natarajan, R. A microRNA circuit mediates transforming growth factor-β1 autoregulation in renal glomerular mesangial cells. Kidney Int. 80 (4), 358-368 (2011).
  10. Gottardo, F., Liu, C. G., Ferracin, M., Calin, G. A., Fassan, M., Bassi, P., Sevignani, C., Byrne, D., Negrini, M., Pagano, F., Gomella, L. G., Croce, C. M., Baffa, R. Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers. Urol. Oncol. 25 (5), 387-392 (2007).
  11. Juan, D., Alexe, G., Antes, T., Liu, H., Madabhushi, A., Delisi, C., Ganesan, S., Bhanot, G., Liou, L. S. Identification of a microRNA panel for clear-cell kidney cancer. Urol. 75 (4), 835-841 (2010).
  12. Xu, X., Kriegel, A. J., Liu, Y., Usa, K., Mladinov, D., Liu, H., Fang, Y., Ding, X., Liang, M. Delayed ischemic preconditioning contributes to renal protection by upregulation of miR-21. Kidney Int. 82 (11), 1167-1175 (2012).
  13. Kriegel, A. J., Mladinov, D., Liang, M. Translational study of microRNAs and its application in kidney disease and hypertension. 122 (10), 439-447 (2012).
  14. Kloosterman, W. P., Wienholds, E., de Bruijn, E., Kauppinen, S., Plasterk, R. H. In situ detection of miRNAs in animal embryos using LNA-moidified oligonucleotide probes. Nat. Methods. 3 (1), 27-29 (2006).
  15. Nelson, P. T., Baldwin, D. A., Kloosterman, W. P., Kauppinen, S., Plasterk, R. H., Mourelatos, Z. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain tissue. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
  16. Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections. Nat. Protocols. 2 (6), 1508-1514 (2007).
  17. Kriegel, A. J., Liu, Y., Cohen, B., Usa, K., Liu, Y., Liang, M. MiR-382 targeting of kallikrein 5 contributes to renal inner medullary interstitial fibrosis. Physiol. Genomics. 44 (4), 259-267 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza tkanki nerekutrwalonej w formalinie i zatopionej w parafiniesondy znakowane digoksygeninątrawienie proteinazą Kwywoływanie substratu NBT/BCIPprzeciwciało przeciwko fosfatazie alkalicznejoptymalizacja buforu do hybrydyzacjiprzygotowanie przekrojów tkankowychdetekcja ekspresji mikroRNA
Hybrydyzacja in situ mikroRNA dla tkanek nerek utrwalonych formaliną
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.