Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i obrazowanie wapnia neuronów jądra nadskrzyżowaniowego

Podsumowanie

Procedury są opisane w celu jednoczesnego rejestrowania potencjału błonowego lub prądu oraz zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia. Neurony jądra nadskrzyżowaniowego są wypełnione wskaźnikiem wapnia bis-fura-2 za pomocą elektrody patch clamp w konfiguracji patch clamp całej komórki.

Streszczenie

Równoczesne metody zapisu elektrofizjologicznego i fluorescencyjnego zostały wykorzystane do zbadania roli zmian potencjału błonowego lub prądu w regulacji wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia. Zmieniające się warunki środowiskowe, takie jak cykl światło-ciemność, mogą modyfikować aktywność sieci neuronalnych i neuronowych oraz ekspresję rodziny genów zegara okołodobowego w jądrze nadskrzyżowaniowym (SCN), lokalizacji głównego zegara okołodobowego w mózgu ssaków. Pobudzająca transmisja synaptyczna prowadzi do wzrostu postsynaptycznego stężenia Ca^{2 +}, które, jak się uważa, aktywuje szlaki sygnałowe, które zmieniają rytmiczną ekspresję genów zegara okołodobowego. Plastry podwzgórza zawierające SCN zaciśnięto za pomocą mikroelektrod wypełnionych wewnętrznym roztworem zawierającym wskaźnik wapnia bis-fura-2. Po utworzeniu uszczelnienia między mikroelektrodą a błoną neuronalną SCN, błona została rozerwana za pomocą delikatnego zasysania, a sonda wapniowa dyfundowała do neuronu, wypełniając zarówno somę, jak i dendryty. Ilościowe pomiary ratiometryczne wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia rejestrowano jednocześnie z potencjałem błonowym lub prądem. Za pomocą tych metod możliwe jest zbadanie roli zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia wywołanych aktywnością synaptyczną i wypalaniem potencjału czynnościowego poszczególnych neuronów. W tej prezentacji przedstawiono metody jednoczesnego rejestrowania aktywności elektrofizjologicznej wraz z wewnątrzkomórkowym wapniem z pojedynczych neuronów SCN utrzymywanych w wycinkach mózgu.

Wprowadzenie

Wiadomo, że zmiany w ekspresji genów występują w neuronach jako konsekwencja sygnalizacji synaptycznej. Sygnalizacja przez pobudzający neuroprzekaźnik glutaminian może depolaryzować potencjał błony neuronalnej, ostatecznie prowadząc do transkrypcji i translacji genów^1,2. Aktywacja receptorów jonotropowych przez glutaminian umożliwia zewnątrzkomórkowym jonom wapnia przedostanie się do komórki, która uważa się za odgrywającą kluczową rolę jako drugi przekaźnik w aktywacji transkrypcji genów. Ocena związku między aktywnością elektryczną błony, taką jak częstotliwość wyzwalania potencjału czynnościowego, a zmianami wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia wymaga połączenia dwóch metod - zaciskania całych komórek i obrazowania ilościowego fluorescencyjnych sond wapniowych^3-5, co pozwala na zbadanie związku w poszczególnych neuronach. Technika rejestracji pojedynczej komórki pozwala na rejestrację aktywności poszczególnych neuronów w możliwych do zidentyfikowania częściach mózgu. Technika zapisu całej komórki pozwala na kontrolowanie napięcia lub prądu membrany, co pozwala na eksperymentalną manipulację określonymi prądami kanałów jonowych. Korzystanie z mikropipet wypełnionych fluorescencyjnymi sondami wapniowymi zapewnia również, że neuron jest dobrze wypełniony sondą wapniową. Technika ta ma wyraźną przewagę podczas pracy z preparatami wycinków mózgu z preparatów dla dorosłych, ponieważ neurony te są szczególnie trudne do załadowania przy użyciu bardziej powszechnych sond komórkowych i zmniejszają potencjalne problemy z fluorescencją tła^6-8.

Światło jest głównym sposobem regulacji zegara dobowego ssaków, który znajduje się w jądrze nadskrzyżowaniowym podwzgórza (SCN). Informacja świetlna przekazywana w siatkówce jest przekazywana ^9-11 przez przewód siatkówkowo-podwzgórzowy (RHT), gdzie glutaminian jest uwalniany w SCN^12,13. Glutaminian otwiera receptory jonotropowe NMDA i AMPA zlokalizowane na neuronach SCN, powodując napływ wapnia i sodu oraz inicjując wewnątrzkomórkową kaskadę sygnalizacyjną, która ostatecznie prowadzi do zmiany ekspresji rodziny genów zegara^14-17 i przesunięć w fazie zegara okołodobowego^18-20. Jednak wapń może dostać się do neuronów albo bezpośrednio przez jonotropowe receptory glutaminianu, albo poprzez depolaryzację błony i aktywację kanałów wapniowych zależnych od napięcia (VDCC)²¹. W związku z tym opracowaliśmy protokół eksperymentalny w celu zbadania związku między wewnątrzkomórkowym stężeniem wapnia a aktywnością elektryczną błony w neuronach SCN, taką jak ma to miejsce w przypadku wystrzeliwania potencjału czynnościowego i z wejścia synaptycznego²².

Protokół

1. Przygotowanie wycinków mózgu z podwzgórza

1. Uzyskaj z góry zgodę Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na jakąkolwiek procedurę z udziałem zwierząt. Opisane tutaj procedury na zwierzętach są zgodne z wytycznymi AVMA dotyczącymi eutanazji zwierząt z 2013 r. i zostały wcześniej zatwierdzone przez IACUC Oregon Health & Science University.
2. Przygotować 500 ml buforu do krojenia bez MgCl₂ i CaCl₂ (Tabela 1). Bąbelkować roztwór 95%_O2 i 5% CO₂ w temperaturze pokojowej, a następnie dodać MgCl₂ i CaCl₂, kontynuując napowietrzanie. Dostosować osmolarność do 300 mOsm za pomocą sacharozy. Osmolarność mierzy się za pomocą osmometru prężności pary.
3. Przygotować 1 l nośnika zapisu bez MgCl₂ i CaCl₂ (tabela 2). Roztwór z bąbelkami z 95%_O2 i 5% CO₂ , a następnie dodać MgCl₂ i CaCl₂, kontynuując napowietrzanie. Dostosować pH do 7,2-7,4 za pomocą NaOH (10 N), a osmolarność do 300 mOsm za pomocą sacharozy. Dodanie buforu HEPES jest opcjonalne i zostało użyte do dalszej stabilizacji pH.
4. Roztwory do krojenia i nagrywania można przechowywać w lodówce przez kilka dni przed użyciem.
5. Przygotuj 3% agarozy i wlej do sterylnej szalki Petriego (głębokość 6 mm) i wstaw do lodówki.
6. Pokrój trzy kostki agarozy o wymiarach około 6 mm x 6 mm x 6 mm.
7. Głęboko znieczulij cztero- do ośmiotygodniowego szczura Sprague-Dawley izofluranem. Przetestuj głębokość znieczulenia. Głębokość znieczulenia jest uważana za odpowiednią, gdy nie ma odruchu wycofania kończyny tylnej po uszczypnięciu w poduszkę stopy. Po odpowiednim znieczuleniu szczur jest poddawany eutanazji poprzez szybkie ścięcie głowy.
8. Szybko usuń mózg, uważając, aby najpierw przeciąć nerwy wzrokowe, a następnie umieść w lodowatym roztworze do krojenia nasyconym 5% CO₂ i 95% O₂ i pozostaw do ostygnięcia na 2-3 minuty.
9. Przytnij mózg. Umieść mózg za pomocą kleszczy na zwilżonej (roztworem do krojenia) okrągłej bibule filtracyjnej ustawionej na szklanej szalce Petriego spoczywającej na lodzie.
10. Przetnij mózg koronalnie, aby usunąć pozostały móżdżek i pień mózgu, a następnie korę rostralną i boki, aby pozostawić blok mózgu zawierający podwzgórze, starannie zachowując stronę zawierającą SCN, nerwy wzrokowe i skrzyżowanie wzrokowe.
11. Rozprowadź cienką warstwę kleju cyjanoakrylowego wystarczająco dużą, aby przymocować bloki mózgu i agarozy w lodowato, ale suchej komorze do krojenia mikrotomów.
12. Przenieś lodowatą stronę ogonową bloku mózgu w dół na klej tak, aby strona zawierająca SCN była ustawiona do cięcia jako pierwsza, z nerwami wzrokowymi tworzącymi literę "V" skierowaną do góry.
13. Ułóż bloki agarozy z pozostałych 3 stron. Napełnij komorę lodowatym buforem do krojenia, w sposób ciągły bąbelkującym 5% CO₂ i 95% O_{2 .} Klej cyjanoakrylowy zestala się pod wpływem wilgoci, utrzymując bloki mózgu i agarozy na miejscu.
14. Wytnij plastry podwzgórza koronalnego (o grubości 220-250 μm) zawierające SCN za pomocą mikrotomu z wibrującymi ostrzami. Zazwyczaj wycinek wybiera się tam, gdzie skrzyżowanie wzrokowe ma około 2-4 mm średnicy, wyglądając jak biały pasek, a SCN tylko na grzbiecie pojawia się jako dwa małe "wgłębienia" w skrzyżowaniu wzrokowym po obu stronach 3. komory (ryc. 1A).
15. Umieść plastry w komorze nagrywającej (36 °C) zamontowanej na stoliku mikroskopu Leica DMLFS. Komora jest wypełniona stale przepływającym roztworem rejestrującym (2 ml/min) napowietrzonym 95%_O2 i 5% CO₂ i wstępnie podgrzanym grzałką liniową.
16. Wykonaj zapisy obrazowania całych komórek i wapnia w neuronach SCN 0,5-8 godzin po przygotowaniu plasterka.

2. Nagrywanie z zaciskiem krosowym

1. Przygotować roztwór elektrody (wewnątrzkomórkowy) w połowie całkowitej końcowej objętości wody.
2. Doprowadzić roztwór do pH 7,3 za pomocą KOH (1 N).
3. Dodaj pozostałą wodę. Ostateczna osmolarność roztworu powinna mieścić się w zakresie 280-290 mOsm.
4. Przepuścić roztwór elektrody przez filtr 0,2 μm, podwielokrotność (0,5 ml) do probówek do mikrofuge i przechowywać w temperaturze -20 °C.
5. Przygotować sondę wapniową Bis-fura-2 roztwór podstawowy soli heksapotasowej bis-fura-2 (10 mM), mieszając 1 mg soli sześciopotasowej bis-fura-2 z 99,29 μl przefiltrowanej wody o stężeniu 0,2 μm.
6. Podzielić na osobne probówki (po 2-5 μl każda) i zamrozić (-20 °C).
7. Rozmrozić podwielokrotność roztworu wewnętrznego i sondę Ca²⁺ na krótko przed użyciem. Dodać 2 μl roztworu podstawowego bis-fura-2 do 400 μl roztworu wewnętrznego, aby uzyskać końcowe stężenie 50 μM w sondie wapniowej. Krótko rozcierać, aby wymieszać roztwory. Stężenie w sondzie wapniowej (10-250 μM) różni się w zależności od projektu eksperymentu i systemu obrazowania. Należy zauważyć, że bis-fura-2 składa się z dwóch połączonych cząsteczek fura-2.
8. Wyciągnąć elektrody krosowe z całokomórkowymi ogniwami, w dwóch etapach, do zewnętrznej średnicy końcówki około 1 μm i rezystancji 7-10 MΩ po napełnieniu roztworem wewnątrzkomórkowym.
9. Wypełnić elektrodę kilkoma μl roztworu wewnętrznego zawierającego sondę wapniową przefiltrowaną filtrem strzykawkowym 4 mm (0,2 μm) dla próbek o małej objętości za pomocą probówki Microfil.
10. Zastosuj niewielką ilość nadciśnienia do elektrody, gdy jest ona wprowadzana do komory nagrywania przy czerwonym oświetleniu podczas oglądania na monitorze wideo.
11. Umieść mikroelektrodę nad SCN za pomocą obiektywu o małej mocy (4X). SCN identyfikuje się jako dwa półprzezroczyste obszary po obu stronach trzeciej komory i grzbietowo do skrzyżowania wzrokowego (ryc. 1A).
12. Przełącz mikroskop na powiększenie o dużej mocy (40X lub 63X). Podregiony SCN i poszczególne neurony SCN mogą być ukierunkowane na zapis w większym powiększeniu.
13. Zastosuj delikatny dodatni nacisk na mikroelektrodę, gdy jest ona przesuwana na powierzchnię neuronu.
14. Zastosuj delikatne podciśnienie do mikroelektrody, aby utworzyć uszczelnienie o rezystancji 3-10 GΩ.
15. Dostosuj napięcie membrany do -60 mV przy wzmacniaczu sterowanym za pomocą oprogramowania do akwizycji.
16. Zastosuj dodatkowe podciśnienie do elektrody, aby rozerwać błonę komórkową w trybie całego ogniwa.
17. Po wejściu w tryb całej komórki neuron SCN, soma i dendryty wypełniają się sondą fluorescencyjną.
18. Napięcie membrany jest mierzone w trybie cęgowym prądowym lub prądu w trybie cęgowym napięciem, podczas gdy dane obrazu sondy wapniowej są monitorowane i przechowywane (opisane poniżej). Przeglądaj uzyskane obrazy wraz z wykresem danych fluorescencyjnych o stosunku 340 nm/380 nm podczas eksperymentu.

3. Pomiar wewnątrzkomórkowego Ca²⁺

1. Ilościowe pomiary Ca²⁺ uzyskuje się poprzez zarejestrowanie pary obrazów poprzez szybkie wzbudzenie tkanki światłem UV o długości fali 340 nm i 380 nm za pomocą monochronometru o szerokości pasma 10 nm i przepuszczenie przez filtr optyczny UG11 w celu ograniczenia długości fal harmonicznych powyżej 400 nm, dichroicznego DCLP 400 nm i wyemitowane światło przez filtr emisyjny 510±40 nm.
2. Obrazy są rejestrowane za pomocą chłodzonej kamery CCD z czasem akwizycji i binningiem dostosowanym w celu zminimalizowania fotowybielania i maksymalizacji prędkości nagrywania.
3. Oprogramowanie do obrazowania ilościowego służy do pozyskiwania i wyświetlania obrazów.
4. Wybierz obszary zainteresowania z początkowego obrazu, które mają zostać przekonwertowane na dane jednostki względnej intensywności fluorescencji (np. soma, dendryt itp.). Wybierz również obszar do pomiaru fluorescencji tła (rysunek 1B).
5. Surowe obrazy i ilościowe dane optyczne są stale zapisywane podczas eksperymentu. Po eksperymencie zapisane obrazy są zazwyczaj ponownie analizowane, gdy można poświęcić więcej czasu na dokładniejsze wybranie obszarów zainteresowania do ilościowego określenia.
6. Dane można przedstawić jako szacowane wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia (Est[Ca²⁺]i). Do^{obliczenia stężenia} wapnia stosuje się stosunek (R) światła emitowanego po wzbudzeniu i odjęciu tła przy 340 nm podzielony przez 380 nm wraz z maksymalną i minimalną fluorescencją przy 340 nm i 380 nm 4. Odejmowanie tła i inne obliczenia są wykonywane za pomocą oprogramowania do analizy danych.
7. Oznaczenie in vitro maksymalnej i minimalnej fluorescencji bis-fury-2 można przeprowadzić przy użyciu 10 mM CaCl₂ dla Ca²⁺ związanego i 10 mM EGTA dla warunków wolnych od Ca²⁺. Przyjmuje się, że stała dysocjacji Ca²⁺, Kd sondy wynosi 370 nM dla bis-fury-2 (Invitrogen).

Wyniki

Korzystając z podwzgórzowych wycinków mózgu, jednocześnie zarejestrowaliśmy zmiany w wewnątrzkomórkowym wapniu w trybie całej komórki, zarówno w warunkach zacisku napięcia, jak i prądu. Mikroelektroda pokazana na rysunku 1A jest opuszczana na miejsce pod dużym powiększeniem (obiektywy UV 40X lub 63X) przy niewielkim przyłożonym nadciśnieniu. Po dotknięciu neuronu tworzy się pieczęć gigaomowa z delikatnym odsysaniem. W trybie napięciowo-cęgowym po ustawieniu potencjału błony komórkowej na -60 mV, dodatkow...

Dyskusja

Opisane powyżej metody stanowią potężne narzędzie do jednoczesnego rejestrowania związku między aktywnością elektryczną błony neuronalnej a wewnątrzkomórkowym stężeniem wapnia. Metoda ma szereg zalet w tym, że łączy w sobie dwie bardzo dobrze scharakteryzowane metody - rejestrację kropek krosowych całych komórek oraz pomiar wewnątrzkomórkowego wapnia za pomocą barwników fluorescencyjnych. Nasze podejście jest podobne do tych opisanych przez innych badaczy^_6,23.

Podczas kor...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
NaCl	Fisher Scientific Co.	S271-3
KCl	Fisher Scientific Co.	P217-500
NaH2PO4• H2O	Sigma Chemical Co.	S-9638
MgCl2• 6H2O	Fisher Scientific Co.	M33-500
CaCl2• 2H2O	Fisher Scientific Co.	C79-500
D-glukoza	Fisher Scientific Co.	D16-500
NaHCO3	Fisher Scientific Co.	S233-500
Sacharoza	Fisher Scientific Co.	S5-500
D-glukonian potasu	Sigma-Aldrich	G4500
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Sól dipotasowa 5&-trifosforanu adenozyny dwuwodna	Sigma-Aldrich	A8937
Sól trisowa 5&trifosforanu guanozyny	Sigma-Aldrich	G9002
Agaroza (ultraczysta)	Życie Technologie	15510-027	Żel porowany w sterylną szalkę Petriego Warstwa o grubości 6 mm
KOH	Sigma-Aldrich	P-6310
NaOH	Sigma-Aldrich	S-5881
Bis-fura-2, sól heksapotasowa	Invitrogen	B6810	Nieprzepuszczalna
komórka Nazwa	firmy	Sprzęt Numer katalogowy	Komentarze
Mikrotom	Leica	VT1000S
Klej cyjanoakrylowy do krojenia tkanek (Roti-Coll1)	Carl Roth GmbH+Co	Art-Nr. 0258.1
Ściągacz do mikroelektrod	Narshige International USA	PP-83
Rurki kapilarne z mikroelektrodami	World Precision Instruments	1B150F-4
Microfil 34 g	World Precision Instruments	MF34G-5
Filtr strzykawkowy	Mikroskop Corning	#431212
	Leica	DM LFS	z obiektywami UV 4X, 40X i UV 63X oraz kamerą CCD z epifluorescencją
	Hamamatsu	ORCA ER	12-bitowa
kostka filtra CCD Fura-2 Chroma	71500A	Zestaw z filtrem UG11
Monochronometr
Okulary ochronne blokujące promieniowanie ultrafioletowe			ultrafioletowe
Wzmacniacz EPC-9	HEKA Eletronik
Metafluor	Urządzenia		Oprogramowanie do obrazowania
Patchmaster	HEKA Eletronik		Oprogramowanie do akwizycji danych
Igor wersja 6	Wavemetrics		Elektrofizjologia i Ca2+ Analiza danych
VAPRO 5520	Westcor		Osmometr ciśnienia pary