Artykuł metodologiczny

Elektroaktywne biofilmy mikrobiologiczne pochodzące ze ścieków: wzrost, utrzymanie i podstawowa charakterystyka

16.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50800

⸱

29 grudnia 2013

 , 
1Department of Environmental Microbiology, UFZ - Helmholtz-Centre for Environmental Research

W tym artykule

Podsumowanie

Pokazano chronoamperometryczny wzrost anodowych elektroaktywnych biofilmów mikrobiologicznych w reaktorze z zasilaniem przy użyciu układu trzech elektrod, kontrolowanego przez potencjostat. Zewnątrzkomórkowy transfer elektronów charakteryzuje się za pomocą woltamperometrii cyklicznej w obecności donora elektronów i pod nieobecność donora elektronów. Pokazano analizę danych fundamentalnych.

Streszczenie

Wzrost anodowych elektroaktywnych biofilmów mikrobiologicznych z inokulacji ścieków w reaktorze z zasilaniem partiowym jest demonstrowany przy użyciu konfiguracji trzech elektrod kontrolowanych przez potencjostat. W ten sposób zastosowanie potencjostatów pozwala na dokładną regulację potencjału elektrody i zapewnia powtarzalne warunki hodowli drobnoustrojów. W okresie wzrostu bieżąca produkcja jest monitorowana za pomocą chronoamperometrii (CA). Na podstawie tych danych omówiono maksymalną gęstość prądu (jmax) i sprawność kulombową (CE) jako miary charakterystyki wydajności bioelektrokatalitycznej. Woltamperometria cykliczna (CV), woltamperometria nieniszcząca, tj. nieinwazyjna, metoda, służy do badania zewnątrzkomórkowego transferu elektronów (EET) bakterii elektroaktywnych. Pomiary CV wykonuje się na anodowych elektrodach biofilmu w obecności substratu mikrobiologicznego, tj. warunki obrotu, a w przypadku braku substratu, tj. warunki bez obrotu, przy użyciu różnych szybkości skanowania. Następnie przedstawiono analizę danych oraz wyprowadzono i wyjaśniono podstawowe parametry termodynamiczne mikrobiologicznego EET: potencjał szczytowy (Ep), szczytową gęstość prądu (jp), potencjał formalny (Ef) i separację pików (ΔEp). Dodatkowo omówiono ograniczenia metody i najnowocześniejszą analizę danych. W związku z tym ten artykuł wideo będzie stanowił przewodnik po podstawowych krokach eksperymentalnych i podstawowej analizie danych.

Wprowadzenie

Wyjaśnienie podstaw mikrobiologicznego zewnątrzkomórkowego transferu elektronów (EET) i jego wykorzystania w systemach inżynieryjnych to ważne i szybko rozwijające się pole badań i rozwoju1-3. Badanie tych elektroaktywnych (lub bioelektrokatalitycznych lub elektrochemicznie aktywnych) mikroorganizmów, w tym czystych szczepów, a także określonych kokultur i złożonych konsorcjów, wymaga złożonego arsenału technik, metod i protokołów4. Metody te wywodzą się z różnych dyscyplin naukowych, np. elektrochemii, materiałoznawstwa, mikrobiologii, i dostarczają wglądu na różnych poziomach hierarchii, tj.: od całego biofilmu drobnoustrojów do pojedynczych cząsteczek. W związku z tym elektrochemia i metody elektrochemiczne stanowią podstawę wszystkich działań.

Tradycyjnie, zestawy typu ogniwa paliwowego były często używane do wzrostu i utrzymania elektroaktywnych kultur mikrobiologicznych w archetypie tych systemów inżynieryjnych: mikrobiologiczne ogniwa paliwowe (MFC)5. Niestety, tego typu MFC często nie pozwalały na monitorowanie lub nawet kontrolowanie potencjału pojedynczej elektrody, a co za tym idzie, możliwy był jedynie ograniczony wgląd w procesy elektrodowe – podawano tylko napięcie ogniwa. Obecnie coraz częściej uznaje się, że indywidualne monitorowanie i kontrola potencjałów pojedynczych elektrod w MFC stanowi wyraźną zaletę, nie tylko dla badań podstawowych, ale także dla inżynierii. Ponadto, wraz z dywersyfikacją zastosowań mikrobiologicznych technologii elektrochemicznych, które obecnie obejmują np. remediację, odsalanie, syntezy, a nawet biokomputery, w tak zwanych mikrobiologicznych systemach bioelektrochemicznych (BES)2,6,7 zewnętrzna kontrola potencjałów poszczególnych elektrod jest często znacząca. Sterowanie to odbywa się zwykle za pomocą zewnętrznych źródeł zasilania lub potencjostatów. W ten sposób zastosowanie potencjostatów pozwala - w przeciwieństwie do innych typów konfiguracji - na dokładną regulację potencjału poszczególnych elektrod. Ma to duże znaczenie, ponieważ elektroda reprezentuje końcowy mikrobiologiczny akceptor elektronów (dla anod) lub donor elektronów (dla katod) zewnątrzkomórkowego transferu elektronów. Rysunek 1 przedstawia obecny stan wiedzy na temat mikrobiologicznego EET na anodach – szczegóły patrz np. 2,4,6,8,9 EET na katodzie jest nadal w większości niewykorzystany10.

Tak więc kontrola potencjału elektrody umożliwia nie tylko wykorzystanie powtarzalnych warunków hodowli mikrobiologicznej, ale także dostosowanie jej do termodynamiki EET11. W artykule pokazano, w jaki sposób można wyodrębnić charakterystyczne parametry elektroaktywnych biofilmów mikrobiologicznych z eksperymentów w reaktorze z zasilaniem wsadowym przy użyciu chronoamperometrii (CA) i woltamperometrii cyklicznej (CV). Obejmuje to parametry wydajności: maksymalną gęstość prądu (jmax) i sprawność kulombowską (CE), a także charakterystykę EET. W tym przypadku nacisk zostanie położony na identyfikację potencjałów formalnych (Ef) możliwych i rzeczywistych miejsc transferu elektronów. Ekstrakcja tych parametrów jest pokazana na przykładzie biofilmów mieszanych pochodzących ze ścieków, które są zdominowane przez Geobacter spec. 12 Te biofilmy pochodzące ze ścieków są uzyskiwane za pomocą prostej procedury selekcji elektrochemicznej, jak wykazały liczne grupy badawcze na całym świecie13-16.

Dynamiczne techniki elektrochemiczne do badania zewnątrzkomórkowego transferu elektronów przez mikroorganizmy

Do termodynamicznej charakterystyki EET elektroaktywnych kultur mikrobiologicznych potrzebne są dynamiczne techniki elektrochemiczne. Ogólnie rzecz biorąc, techniki te obejmują sterowane potencjałem, tj. woltamperometryczne, oraz sterowane prądem, tj. Galwanodynamika, Techniki17. W związku z tym techniki kontrolowane potencjałem są bardziej rozpowszechnione i obejmują na przykład woltamperometrię falową prostokątną i woltamperometrię liniową18. Najpopularniejsza jest jednak woltamperometria cykliczna (CV)19,20. CV jest dobrze znana i szeroko rozpowszechniona w różnych dziedzinach elektrochemii, począwszy od badań nad bateriami, poprzez materiałoznawstwo, aż po bioelektrochemię enzymów21. Jego zastosowanie w żywych komórkach drobnoustrojów można datować dopiero na ponad dekadęwstecz 22 i znacznie wzrosło w ciągu ostatnich lat23,24. W szczególności połączenie metod CV i spektroskopowych dostarczyło bezprecedensowych spostrzeżeń na temat mechanizmów EET i jego molekularnej natury, np.25,26 Równolegle poszerzono i pogłębiono ramy teoretyczne ekstrakcji termodynamicznych i teoretycznych cech mikrobiologicznego EET27-30. Z drugiej jednak strony, niewłaściwe postępowanie z doświadczeniami lub nieodpowiednia analiza danych często utrudniają właściwe zastosowanie CV w dziedzinie bioelektrochemii drobnoustrojów. W związku z tym, oprócz warsztatów (np. podczas EU-ISMET 2012) i samouczków19, niniejszy artykuł wideo zawiera podstawowy przewodnik dotyczący przeprowadzania cyklicznych eksperymentów woltamperometrycznych na bakteriach elektroaktywnych. W związku z tym koncentruje się na podstawowych etapach eksperymentalnych i podstawowej analizie danych i nie ma na celu dostarczenia najnowszych protokołów analizy kinetycznej. Najważniejsze terminy poniższego omówienia podsumowano w ramce 1 (zaadaptowanej z Harnisch i Freguia19 i zmodyfikowanej).

Protokół

Ponieważ procedura wyboru w bioelektrochemicznym reaktorze wsadowym jest bardzo specyficzna ze względu na wybór substratu i warunków beztlenowych, praca w sterylnych warunkach nie jest konieczna dla pokazanego przykładu.

1. Przygotowanie podłoża wzrostowego

  1. Przygotować odpowiednią ilość pożywki wzrostowej, używając buforu fosforanowego zgodnie z Kimem i wsp.13 (zob. tabela 1). W tym przypadku octan sodu (10 mM) służy jako substrat. Pożywka wzrostowa użyta w tym artykule jest tylko jednym z przykładów i w zależności od celu eksperymentalnego może różnić się swoimi składnikami.
  2. Dodać 1 ml ścieków pierwotnych na 20 ml pożywki wzrostowej jako inokulum. Próbka ścieków jest pobierana z komunalnej oczyszczalni ścieków po filtracji mechanicznej (patrz np. rysunek 2) i może być przechowywana do trzech miesięcy do momentu zużycia w zamkniętym pojemniku w temperaturze 4 °C.
    (Uwaga: W zależności od celu eksperymentu dokładna początkowa liczba komórek może być ważna, a następnie powinna zostać określona. W pokazanym przykładzie początkowa liczba komórek nie jest ważna, ponieważ biofilm osiąga warunki stanu ustalonego).
  3. Przepłukiwać pożywkę, w tym inokulum, azotem przez co najmniej 30 minut, aby je odpowietrzeć, poprzez włożenie igły do pożywki i włączenie strumienia azotu. Strumień powinien być na tyle silny, aby można było zaobserwować całkowite wymieszanie pożywki.
    (Uwaga: W zależności od objętości pożywki należy nawet rozważyć wydłużenie czasu odpowietrzania. Podczas ustawiania odgazowywania reaktor zasilany (kroki 2.1-2.2))

2. Konfiguracja reaktora wsadowego zasilanego

  1. Weź odpowiednie naczynie reaktora - tutaj stosuje się zmodyfikowaną kolbę okrągłodenną o pojemności 250 ml z 4 szyjkami.
    (Uwaga: Ogólnie rzecz biorąc, naczynie powinno mieć co najmniej cztery wloty. Są one niezbędne dla trzech elektrod oraz do pobierania próbek/wymiany mediów. Wytwarzane objętości gazu można pominąć, gdy reaktor jest regularnie otwierany z powodu pobierania próbek lub zmiany medium, alternatywnie należy zainstalować licznik pęcherzyków. Aby uniknąć niepożądanego wzrostu fototropowego, reaktory powinny być osłonięte przed bezpośrednim naświetleniem.)
  2. W przypadku konfiguracji z trzema elektrodami (szczegóły na rysunku 3 i w sekcji 3) należy umieścić elektrodę odniesienia (RE) (tutaj Ag/AgCl, sat. KCl, 0,197 V w porównaniu z SHE), elektrodę roboczą (WE) i przeciwelektrodę (CE) w kolbie przez indywidualne wloty za pomocą silikonowych zatyczek – szczelnie uszczelnić.
    (Uwaga: Jako WE i CE stosuje się pręty grafitowe. Drut elektrod jest przeciągany przez silikonową wtyczkę i mocowany na zewnątrz. Elektroda referencyjna jest wprowadzana przez silikonową zatyczkę przez wywiercony otwór. Aby uniknąć zwarć, upewnij się, że elektrody nie stykają się fizycznie, nawet podczas mieszania lub recyrkulacji mediów. Umieść elektrody tak, aby były całkowicie pokryte roztworem medium. W celu uszczelnienia owiń silikonową zatyczkę każdego wlotu Parafilm.)
  3. Wlać pożywkę wzrostową wraz z inokulum (w tym przypadku 250 ml) przez otwór do pobierania próbek do reaktora, przepłukując go azotem.
  4. Zamknij ostatni wlot silikonową zatyczką i szczelnie go uszczelnij. Uwaga: Śladowe ilości tlenu nie zaszkodzą biofilmom mieszanych gatunków. Są w stanie wytrzymać, a nawet zużywać niski poziom tlenu, co z kolei może obniżyć CE.

3. Chronoamperometryczny wzrost biofilmu

  1. Podłącz elektrody do odpowiednich potencjostatu. Umieść naczynie w komorze o kontrolowanej temperaturze, tutaj stosuje się 35 °C31, w celu zapewnienia stałych warunków środowiskowych.
  2. Otwórz oprogramowanie, aby sterować potencjostatem i wybierz technikę: Chronoamperometria. Ustaw parametry na przykład w następujący sposób: Stały potencjał EWE wynoszący 0,2 V (w porównaniu z Ag/AgCl) przez czas t 500 godzin (≈ 20 dni). Prąd jest rejestrowany w krokach czasowychco minutę.
    Uwaga: Wybór zastosowanego potencjału uzależniony jest od badanego układu/mikroorganizmu. Ogólnie rzecz biorąc, procesy anodowe są badane przy potencjale dodatnim, a procesy katodowe przy potencjałach ujemnych. Odpowiedni potencjał można również wywnioskować z potencjałów standardowych donora/akceptora elektronów oraz potencjału formalnego oczekiwanego miejsca transferu elektronów drobnoustrojów, tutaj jako punkt wyjścia należy zapoznać się z najnowszą literaturą.
  3. Rozpocznij chronoamperometrię. Wykres zmierzonego prądu w czasie jest wykreślany przez oprogramowanie, obserwowany maksymalny prąd (imax) jest ważnym parametrem online, jak omówiono w sekcjach 4 i 5.

4. Utrzymanie biofilmu

  1. W zależności od warunków otoczenia, np. temperatury, prąd utleniający zaczyna płynąć i osiąga plateau (patrz rysunek 4). Po ponownym osiągnięciu prądu zerowego należy przerwać pomiar chronoamperometryczny i uzupełnić roztwór pożywki. Aby uzyskać szybszy wzrost biofilmu, wymień podłoże zaraz po osiągnięciu plateau maksymalnego prądu. Otworzyć port pobierania próbek i ostrożnie, nie niszcząc cienkiego biofilmu, rozładować pożywkę. Podczas uzupełniania pożywki ponownie przepłukać azotem. Zamknąć port pobierania próbek i szczelnie uszczelnić.
  2. Powtarzaj procedurę opisaną w kroku 4.1, aż maksymalny prąd utleniający osiągnie stan ustalony (patrz rysunek 4).
    (Uwaga: Uważa się, że stała imax wskazuje na stabilne tworzenie się biofilmu w stanie ustalonym.)
  3. Pobrać 1 ml próbek świeżych i wymienianych roztworów pożywki do analizy substratu, np. za pomocą HPLC. Początkowe stężenie substratu (octanu) (c0) oraz stężenie pozostałego roztworu substratu (c1) są następnie potrzebne do obliczeń efektywności (patrz rozdział Analiza danych).
    Uwaga: Aby uzyskać niezmienione wyniki, np. z powodu dalszego zużycia substratu, należy natychmiast przeanalizować próbki substratu. Jeżeli nie jest to możliwe, próbki należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze co najmniej -18 °C nie dłużej niż miesiąc).

5. Zastosowanie woltamperometrii cyklicznej do badania EET

  1. Wykonać woltamperometrię cykliczną przy maksimach i minimach przepływu prądu, jak pokazano (rysunek 4). W zależności od interesującego nas pytania, CV jest zwykle wykonywane, gdy system osiągnął stan ustalony, aby uzyskać porównywalne wyniki. (Uwaga: Wytwarzanie prądu jest określane jako warunki obrotu i jest związane z mikrobiologicznym utlenianiem substratu i późniejszym przenoszeniem elektronów: bioelektrokataliza mikrobiologiczna; podczas gdy nieobrotowe CV są wykonywane przy (prawie) zerowym przepływie prądu w CA.)
  2. W oprogramowaniu sterującym potencjostatem wybierz technikę: Woltamperometria cykliczna i ustaw odpowiednie parametry, na przykład: Potencjał początkowy EWE do Ei -0,5 V w porównaniu z RE z szybkością skanowania v=dE/dt wynoszącą 1 mV/s do potencjału wierzchołkowego E1 wynoszącego 0,3 V w porównaniu z RE i z powrotem do potencjału początkowego E2 = Ei wynoszącego -0,5 V.
    Uwaga: W przypadku stosowania woltamperometrii cyklicznej napięcie przyłożone do WE jest zmieniane liniowo w czasie przez potencjostat (patrz rysunek 5) – ramka 2 zawiera podstawowe zasady wyboru parametrów eksperymentu i rozwiązywania problemów).
  3. Rozpocznij cykliczną woltamperometrię i zapisz tyle cykli, ile jest potrzebne do wykonania powtarzalnego CV. Zwykle potrzebne są co najmniej 3 cykle. Otrzymany wykres nazywa się cyklicznym woltammogogramem (patrz również rysunek 7). Uwaga: W zależności od warunków pomiaru można uzyskać różne informacje, jak pokazano w następnym rozdziale.

6. Wykres danych

Tutaj omawiane jest tylko wykreślanie danych. Bardziej szczegółowy traktat znajduje się w następnej sekcji.

  1. Użyj odpowiedniego oprogramowania do analizy danych, tutaj wszystkie dane są eksportowane jako tekst i importowane jako plik ASCII.
  2. Obliczaj i używaj preferencyjnych gęstości prądu (j), a nie prądów bezwzględnych (i).
    (Uwaga: Ponieważ jednak istnieją różne protokoły obliczania j, należy wyjaśnić, który z nich został użyty. Tutaj gęstość prądu na geometrię, tj. rzutowana, wykorzystywana jest powierzchnia elektrody.)
  3. Chronoamperometria: Wykreśl zmierzoną gęstość prądu w funkcji czasu.
  4. Woltamperometria cykliczna: Wykreśl zmierzoną gęstość prądu w funkcji potencjału WE Ewe.

Wyniki

1. Chronoamperometria

Z pomiarów chronoamperometrycznych można obliczyć dwie charakterystyki operacyjne: maksymalną gęstość prądu (jmax), t.j. maksymalny przepływ elektronów na sekundę, oraz wydajność kulombową (CE), t.j. całkowity przepływ prądu w stosunku do zużytego substratu. Rysunek 4 przedstawia typową krzywą wzrostu biofilmu w pomiarze chronoamperometrycznym dla kilku cykli wzrostu z wykorzystaniem reaktora fed-batch. Po początkowej fazie lag następuje pierwsze maksimum gęstości prądu. Następnie prąd ponownie spada z powodu wyczerpania substratu. Przy (niemal) zerowym przepływie prądu następuje wymiana medium, zgodnie z oznaczeniem. Po tym uzupełnieniu substratu gęstość prądu ponownie wzrasta, a kolejne maksimum gęstości prądu jest wyższe od pierwszego. Po kilku cyklach wzrostu jmax staje się stałe, co wskazuje na formowanie się biofilmu w stanie stacjonarnym14. Ponieważ wartość jmax w stanie stacjonarnym zależy od kilku parametrów, np. materiału elektrody, temperatury reaktora i składu biofilmu, jest ona często uznawana za charakterystykę określonego systemu biofilmu mikrobowego elektroaktywnego/elektrody. (W przypadku reaktorów przepływowych stosuje się stałą gęstość prądu w stanie stacjonarnym zamiast jmax.) Drugą charakterystyką operacyjną jest wydajność kulombowa (CE) (Równanie 1). Jest to liczba elektronów zarejestrowanych jako przepływ prądu elektrycznego, Qp, w jednym cyklu fed-batch w odniesieniu do teoretycznej maksymalnej liczby elektronów Qth, obliczonej na podstawie zużycia substratu podczas tego cyklu.

Wzór na równowagę statyczną CE=QP/Qth×100; obliczanie wydajności na schemacie procesu.

(Równanie 1)

Całkowity ładunek przeniesiony można uzyskać poprzez całkowanie krzywej CA (patrz również Rysunek 6):

Obliczanie ładunku elektrycznego, równanie, \( Q_P = \int_0^t i \, dt \), metoda całkowania.

(Równanie 2)

Teoretycznie możliwy ładunek elektryczny oblicza się zgodnie z prawem Faradaya:

Równanie termodynamiczne Qth=ΔcVzF, analiza potencjału chemicznego, użytek edukacyjny.

(Równanie 3)

Gdzie V to objętość pożywki, F to stała Faradaya (F = 96,485.34 C/mol), z to liczba elektronów uwalnianych podczas utleniania substratu (w przypadku octanu podczas utleniania do CO2 uwalnianych jest 8 elektronów), a Δc = c0-c1 oznacza zużycie substratu (wyznaczane metodami analizy chemicznej, np. za pomocą HPLC).

2. Woltamperometria cykliczna:

Woltamperogramy cykliczne rejestruje się dla warunków bezobrotowych (nonturnover) oraz dla warunków obrotowych (turnover) (jak wskazano na Rysunku 4). W obu przypadkach można uzyskać różne rodzaje informacji. Poniżej omówiono, w jaki sposób można zidentyfikować potencjalne oraz faktyczne miejsca EET.

2.1 Warunki bez obrotu – identyfikacja potencjalnych miejsc EET:

Rycina 7 przedstawia typowe woltamperogramy (CV) dla warunków bez obrotu, t.j. w obecności substratu. Rycina 7A pokazuje CV biofilmu dla wysokich prędkości skanowania (tutaj 50 mV/sec), gdzie można zidentyfikować tylko jedną parę pików, a tym samym jeden potencjał formalny Ef. Generalnie potencjał formalny pary redoks można obliczyć z potencjału piku utleniania EpA i piku redukcji odpowiedniego związku EpC, wyznaczając średnią arytmetyczną (patrz również Rycina 7C):

Równanie elektrochemiczne: Ej = (EpA + Epc)/2, analiza potencjału redoks w badaniach woltamperometrycznych.

(Równanie 4)

Przy zastosowaniu wystarczająco niskiej szybkości skanowania dla tego samego biofilmu (tutaj 1 mV/sec) można zidentyfikować do czterech par redoks (odpowiednie potencjały formalne wskazano na Rysunku 7B). Wynika to z faktu, że przy niższych szybkościach skanowania prąd tła pojemnościowego ulega zmniejszeniu, szczegóły patrz również w Ramce 1 oraz np.17,21. Jednakże CV bez obrotu (nonturnover CV) pokazuje jedynie wszystkie związki aktywnych redoks na elektrodzie, a tym samym Ef potencjalnych miejsc EET. Dopiero analiza CV z obrotem (turnover CV) pozwala wyznaczyć Ef rzeczywistych miejsc transferu EET (patrz krok 2.2.).

Podczas dalszej analizy woltamperogramów cyklicznych (CV) bez obrotu można analizować inne charakterystyczne parametry, takie jak rozdzielczość pików ΔEp (Równanie 5) lub maksymalny prąd szczytowy ipA i minimalny prąd szczytowy ipC (patrz Rysunek 7C).

Równanie równowagi statycznej ΔEP=EpA-EpC; schemat wzoru do celów edukacyjnych.

(Równanie 5)

Parametry te, zwłaszcza gdy są rejestrowane dla różnych prędkości skanowania, mogą być wykorzystane do analizy mechanistycznej i kinetycznej procesów przeniesienia elektronów na elektrodach. Jednakże analiza kinetyczna, która jest dobrze ugruntowana dla układów chemicznych, nie jest jednoznaczna w przypadku elektroaktywnych biofilmów mikrobiologicznych, patrz np.19,30

  1. Warunki obrotu – identyfikacja faktycznych miejsc EET:

Podczas przeprowadzania pomiaru CV w obecności substratu uzyskuje się CV obrotowe (patrz Rycina 8A). Po naniesieniu danych na wykres można zaobserwować typową krzywą w kształcie litery S, tzw. krzywą bioelektrokatalityczną17-19Podczas dalszej analizy danych, maksimum pierwszej pochodnej, t. j.punkt przegięcia krzywej CV pozwala wyznaczyć potencjał formalny Ef z rzeczywisty miejsce(a) EET (patrz Rysunek 8B). W przypadku młodego, t. j.cienki, Geobacteraceaebiofilmu z dominacją [insert species/organism], tutaj 168 h po rozpoczęciu CA, można zaobserwować dwa punkty przegięcia. Następnie pochodna wykazuje dwa maksima odpowiadające potencjałom formalnym bioelektrokatalitycznie aktywnych miejsc EET: -0,376 V oraz -0,295 V względem Ag/AgCl (sat. KCl, 0,197 V względem SHE). W Rycina 7B miejsca te określa się jako Ef,2 i Ef,3odpowiednio. Wynik ten wykazuje również, że procesy redoks związane z potencjałami formalnymi Ef,1 i Ef,4 (w przypadku CV bez obrotu) nie są związane z bioelektrokatalizą. W miarę wzrostu i pogrubiania się biofilmu, CV wykazuje tylko jeden punkt przegięcia, t. j.oznaczające jedno maksimum na krzywej pochodnej. Ten potencjał formalny Efgdzie wartość ta wynosi -0,32 V względem Ag/AgCl (sat. KCl) i jest (w przybliżeniu) równa średniej arytmetycznej dwóch potencjałów formalnych przypisanych do EET cienkiego biofilmu (np. Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. Ef,2 i Ef,3) – patrz Rycina 9Wykazuje to, że ta podstawowa analiza CV rzeczywiście dostarcza informacji na temat termodynamiki EET w sposób szybki i nieinwazyjny, jednak należy zaznaczyć, że nie pozwala ona na wyciąganie dalszych wniosków mechanistycznych lub kinetycznych.

Warto zauważyć, że biofilmy uzyskane w specyficznych warunkach opisanych w niniejszym protokole są w przeważającej mierze zdominowane przez gatunki Geobacter (nieprzedstawione tutaj)12,15. Zmiana wybranych parametrów, np. podłoża, temperatury itp., wpłynie również na skład mikrobiologiczny, a tym samym na właściwości elektrochemiczne.

Tabela 1. Pożywka wzrostowa według Kim et al.32

Komponent(mg/L) / (ml/L)   
NaH2PO4•H2O2,690.00
Na2HPO44,330.00
NH4Cl310.00
KCl130.00
octan sodu820.00
roztwór metalu12.50
roztwór witaminy12.50
Tabela 2. Składniki roztworu metali i witamin33.
roztwór pierwiastków śladowychjon:Roztwór witaminy:
Komponentmg/l   Komponentmg/l   
Kwas nitrilooctowy1,500.0Biotyna2.0
MgSO44•7H2O         3,000.0Kwas foliowy2.0
MnSO₄4•2H2O         500.0Chlorowodorek pyridoxyny10.0
NaCl  1,000.0Chlorowodorek tiaminy5.0
FeSO₄4•7H2O          100.0Ryboflawina5.0
CoSO4 lub CoCl22     100.0Kwas nikotynowy5.0
CaCl₂2•2h2O            100.0DL-pantenotranian wapnia5.0
ZnSO₄4   130.0Witamina B120.1
CuSO44•H2O10.0Kwas p-aminobenzoesowy5.0
AlK(SO₄)4)2               10.0Kwas liponowy5.0
H3BO3 10.0
Na2MoO4•2h2O     10.0
Uwaga: Kwas nitrylooctowy należy rozpuścić w KOH do pH 6,5, a następnie dodać minerały.


Schemat terminologii bioelektrochemicznej; zawiera równania i wzory z elektrochemii.
Ustawienia parametrów woltamperometrii cyklicznej i przewodnik rozwiązywania problemów, skupiający się na dostosowaniu okna potencjałów i prędkości skanowania dla optymalnych eksperymentów CV.

Schemat mikrobiologicznego transferu elektronów; ścieżki MET, DET, MIET, DIET; analiza transportu elektronów.
Rysunek 1. Schemat możliwych mechanizmów mikrobiologicznego pozakomórkowego transferu elektronów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Proces pobierania próbek wody; czerpak pobierający próbki z przepływu ścieków w oczyszczalni.
Rycina 2. Pobieranie próbek w oczyszczalni ścieków za kratą rzęsową (oczyszczalnia ścieków, Niemcy). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Schemat i zdjęcie ogniwa elektrochemicznego z potencjostatem oraz konfiguracją elektrod; oznaczenia CE, RE, WE.
Rysunek 3. Konfiguracja trójelektrodowa. (A) Schemat, (B) rzeczywisty reaktor; CE = elektroda pomocnicza, RE = elektroda odniesienia, WE = elektroda robocza z elektroaktywnym biofilmem mikrobiologicznym, SP = port próbkowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Wykres elektrochemiczny; analiza CV; prąd względem czasu; podejście stanu stacjonarnego; dane w mikroamperach i godzinach.
Rycina 4. Wykres wzrostu biofilmu opartego na inokulum ze ścieków w systemie fed-batch w analizie chronoamperometrycznej. Prąd utleniania osiąga stan stacjonarny po trzech cyklach wymiany medium. Oznaczone są faza lag oraz punkty czasowe wymiany medium oraz przeprowadzenia woltaperometrii cyklicznej (CV) w warunkach obrotu oraz CV bez obrotu dla warunków stacjonarnych biofilmu (surowe dane z Liu14). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Analiza elektrochemiczna, wykres E-t, woltametria cykliczna, potencjał względem czasu, chemia analityczna.
Rycina 5. Zasadniczy przebieg potencjału w czasie podczas jednego cyklu woltametrii cyklicznej. CV rozpoczyna się od potencjału początkowego Ei. Przyłożone napięcie zmienia się następnie liniowo w czasie z szybkością skanowania v. Po osiągnięciu wybranego potencjału wierzchołkowego E1, napięcie powraca do potencjału końcowego E2, gdzie w tym przypadku E2 = Ei. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Wykres analizy elektrochemicznej z gęstością prądu j w funkcji czasu t, ilustrujący szczyt jmax.
Rysunek 6. Typowy chronoamperogram jednego cyklu wzrostu biofilmu pochodzącego ze ścieków; tutaj zaznaczono maksymalną gęstość prądu jmax, przepływający (praktyczny) ładunek elektryczny Qp, pobranie próbki początkowego stężenia substratu c0 oraz stężenie substratu po jednym cyklu wzrostu c1 . Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Wykres analizy elektrochemicznej; diagramy woltamerometrii cyklicznej przedstawiające wyniki natężenia prądu w funkcji napięcia.
Rycina 7. Woltamerogramy cykliczne bez obrotu dla biofilmu G. sulfurreducens. Prędkość skanowania: (A) 50 mV/sec, (B) 1 mV/sec 23; (C) fragment B, obrazujący gęstość prądu szczytowego (jpA) oraz odpowiadający jej potencjał szczytowy (EpA) anody w maksimach. Analogicznie w minimach przedstawiono gęstość prądu szczytowego (jpC) oraz odpowiadający jej potencjał szczytowy (EpC) katody. Potencjał formalny Ef oraz rozdzielczość szczytów ΔEp wynikają odpowiednio z Równania 4 oraz Równania 5 (szczegóły w poniższym tekście). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Analiza elektrochemiczna; wykres woltamperometryczny; prąd względem potencjału; detekcja piku; analiza danych.
Rycina 8. (A) Woltamperegram cykliczny obrotu metabolizującego biofilmu G. sulfurreducens. Szybkość skanowania wynosiła 5 mV/sec. (B) Pierwsze pochodne krzywej woltamperometrycznej23. Oznaczone są potencjały formalne rzeczywistych miejsc EET: Ef,2 oraz Ef,3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Cyclic voltammetry graph; current vs. potential; electrochemical analysis; data results.
Rycina 9. (A) Woltomperogram cykliczny obrotu oraz (B) pierwsze pochodne grubszej warstwy metabolizującej G. sulfurreducens biofilm. Szybkość skanowania wynosiła 5 mV/s (porównaj Rycina 8). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Dyskusja

Przedstawiony protokół pokazuje łatwy i prosty sposób hodowli elektroaktywnych biofilmów mikrobiologicznych z inokulacji ścieków przy użyciu układu trzech elektrod w reaktorze zasilanym wsadowo. Chronoamperometria umożliwia wzrost i selekcję elektroaktywnych biofilmów mikrobiologicznych z różnych inokulantów, a także podstawową charakterystykę biofilmów pod względem maksymalnej gęstości prądu i wydajności kulombowskiej. Woltamperometria cykliczna, jako technika nieinwazyjna, pozwala na wykonywanie podstawowych badań nad termodynamiką EET biofilmu drobnoustrojów, a tym samym na identyfikację możliwych i rzeczywistych miejsc transferu EET. Łącznie parametry te pozwalają i) scharakteryzować i porównać różne biofilmy mikrobiologiczne w identycznych warunkach, a także ii) zbadać wpływ różnych warunków pracy na identyczne elektroaktywne biofilmy mikrobiologiczne. Jednak te eksperymenty mogą być tylko punktem wyjścia. Z jednej strony wieloaspektowa dziedzina bioelektrochemii drobnoustrojów wymaga dalszego i dogłębnego wykorzystania metod i protokołów elektrochemicznych. Obejmuje to na przykład modele do ekstrakcji danych kinetycznych i mechanistycznych, a także inne metody, takie jak elektrochemiczna spektroskopia impedancyjna34,35. Z drugiej strony metody elektrochemiczne nie mogą dostarczyć żadnych informacji na temat natury molekularnej, składu mikrobiologicznego, przestrzennej organizacji drobnoustrojów itp. W tym przypadku potrzebne są dalsze techniki, które są albo nieinwazyjne i sprzężone z elektrochemią, albo inwazyjne4. Ramka 2 zawiera krótkie omówienie krytycznych etapów przeprowadzania eksperymentów, jak również wstępnego rozwiązywania problemów.

Z inżynierskiego punktu widzenia należy wziąć pod uwagę, że elektroaktywna anoda biofilmu jest tylko jednym ze składników obecnych mikrobiologicznych systemów bioelektrochemicznych, a dla pełnych systemów należy przeanalizować wiele innych czynników36. Mamy jednak nadzieję, że ten artykuł wideo pomoże w przyszłości zrozumieć i dostosować podstawowe elementy BES, tj. elektrody mikrobiologiczne.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

F.H. dziękuje za wsparcie ze strony BMBF (Nagroda Badawcza "Procesy biotechnologiczne nowej generacji - Biotechnologia 2020+") oraz Helmholtz-Association (Young Investigators Group).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ścieki pierwotneOczyszczalniaPobrane po filtracji mechanicznej
250 ml Kolby okrągłodenne z trzema dodatkowymi wlotamiTh.Geyer Berlin GmbH, Niemcy9.011 845Dodatkowe wloty zostały zamontowane przez naszą własną dmuchawę do szkła
Elektroda referencyjna Ag/AgCl (sat. KCl, 0,195 V vs. SHE) z membraną ceramicznąSensortechnik Meinsberg, NiemcySE 11
Pręty grafitowe (Ø=1 cm, l=3 i 5 cm)CP-Handels-GmbH, Wachtberg, NiemcyUżywany jako materiał elektrody
Stal nierdzewna, nr 1.4301, Drut Fe/Cr18/Ni10Goodfellow GmbH, Bad Nauheim, Niemcy155-923-05
Zatyczki silikonoweTh.Geyer Berlin GmbH, Niemcy9.230 512 i
ParafilmneoLab, Heidelberg, Niemcy3-1011Do uszczelniania w celu utrzymania warunków beztlenowych
Potencjostat/ Galwanostat Model MPG2BioLogic Science Instruments, Francja
EC-LabBioLogic Science Instruments, FrancjaOprogramowanie do wykonywania pomiarów elektrochemicznych
Origin 8.6Oprogramowanie do analizy danychOriginLab
ścieków

Bibliografia

  1. Rabaey, K., Angenent, L., Schröder, U., Keller, J. Integrated Environmental Technology Series. Lens, P. , IWA Publishing. London, New York. (2010).
  2. Logan, B. E., Rabaey, K. Conversion of wastes into bioelectricity and chemicals using microbial electrochemical technologies. Science. 337, 686-690 (2012).
  3. Rabaey, K., Rozendal, R. A. Microbial electrosynthesis - revisiting the electrical route for microbial production. Nat. Rev. Microbiol. 8, 706-716 (2010).
  4. Harnisch, F., Rabaey, K. The Diversity of Techniques to Study Electrochemically Active Biofilms Highlights the Need for Standardization. ChemSusChem. 5, 1027-1038 (2012).
  5. Logan, B. E., et al. Microbial Fuel Cells: Methodology and Technology. Environ. Sci. Technol. 40, 5181-5192 (2006).
  6. Harnisch, F., Schröder, U. From MFC to MXC: chemical and biological cathodes and their potential for microbial bioelectrochemical systems. Chem. Soc. Rev. 39, 4433-4448 (2010).
  7. TerAvest, M. A., Li, Z., Angenent, L. T. Bacteria-based biocomputing with Cellular Computing Circuits to sense, decide, signal, and act. Energy Environ Sci. 4, 4907-4916 (2011).
  8. Lovley, D. R. Bug juice: harvesting electricity with microorganisms. Nat. Rev. Microbiol. 4, 12 (2006).
  9. Lovley, D. R. Reach out and touch someone: potential impact of DIET (direct interspecies energy transfer) on anaerobic biogeochemistry, bioremediation, and bioenergy. Rev. Environ. Sci. Biotechnol. 10, 101-105 (2011).
  10. Rosenbaum, M., Aulenta, F., Villano, M., Angenent, L. T. Cathodes as electron donors for microbial metabolism: Which extracellular electron transfer mechanisms are involved. Bioresource Technol. 102, 324-333 (2011).
  11. Schröder, U. Anodic electron transfer mechanisms in microbial fuel cells and their energy efficiency. Phys. Chem. Chem. Phys. 9, 2619-2629 (2007).
  12. Harnisch, F., et al. Revealing the electrochemically driven selection in natural community derived microbial biofilms using flow-cytometry. Energy Environ. Sci. 4, 1265 (2011).
  13. Kim, J. R., Min, B., Logan, B. E. Evaluation of procedures to acclimate a microbial fuel cell for electricity production. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 23-30 (2005).
  14. Liu, Y., Harnisch, F., Fricke, K., Sietmann, R., Schröder, U. Improvement of the anodic bioelectrocatalytic activity of mixed culture biofilms by a simple consecutive electrochemical selection procedure. Biosens. Bioelectron. 24, 1006-1011 (2008).
  15. Torres, C. sI., et al. Selecting Anode-Respiring Bacteria Based on Anode Potential Phylogenetic, Electrochemical, and Microscopic Characterization. Environ. Sci. Technol. 43, 9519-9524 (2009).
  16. Virdis, B., Harnisch, F., Batstone, D. J., Rabaey, K., Donose, B. C. Non-invasive characterization of electrochemically active microbial biofilms using confocal Raman microscopy. Energy Environ. Sci. 5, 7017-7024 (2012).
  17. Scholz, F., Bond, A. M. Electroanalytical Methods: Guide to experiments and applications. 2, edn,(2010).
  18. Marsili, E., Rollefson, J. B., Baron, D. B., Hozalski, R. M., Bond, D. R. Microbial biofilm voltammetry: direct electrochemical characterization of catalytic electrode-attached biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 74, 7329-7337 (2008).
  19. Harnisch, F., Freguia, S. A Basic Tutorial on Cyclic Voltammetry for the Investigation of Electroactive Microbial Biofilms. Chemistry. 7, 466-475 (2012).
  20. Marsili, E., et al. Shewanella secretes flavins that mediate extracellular electron transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3968-3973 (2008).
  21. Bard, A. J., Inzelt, G., Scholz, F. Electrochemical Dictionary. , Springer. (2008).
  22. Kim, B. H., et al. Electrochemical activity of an Fe(III)-reducing bacterium, Shewanella putrefaciens IR-1, in the presence of alternative electron acceptors. Biotechnol. Tech. 13, 475-478 (1999).
  23. Fricke, K., Harnisch, F., Schröder, U. On the use of cyclic voltammetry for the study of anodic electron transfer in microbial fuel cells. Energy Environ. Sci. 1, 144 (2008).
  24. Marsili, E., Sun, J., Bond, D. R. Voltammetry and Growth Physiology of Geobacter sulfurreducens Biofilms as a Function of Growth Stage and Imposed Electrode Potential. Electroanalysis. 22, 865-874 (2010).
  25. Busalmen, J. P., Esteve-Núñez, A., Berná, A., Feliu, J. M. C-Type Cytochromes Wire Electricity-Producing Bacteria to Electrodes. Angew. Chem. 120, 4952-4955 (2008).
  26. Millo, D., et al. In Situ Spectroelectrochemical Investigation of Electrocatalytic Microbial Biofilms by Surface-Enhanced Resonance Raman Spectroscopy. Angew. Chem. Int. Edn. Engl. 50, 2625-2627 (2011).
  27. Hamelers, H. V., et al. New applications and performance of bioelectrochemical systems. Applied Microbiol. Biotechnol. 85, 1673-1685 (2010).
  28. Richter, H., et al. Cyclic voltammetry of biofilms of wild type and mutant Geobacter sulfurreducens on fuel cell anodes indicates possible roles of OmcB, OmcZ, type IV pili, and protons in extracellular electron transfer. Energy Environ. Sci.. 2, 506 (2009).
  29. Torres, C. I., Kato Marcus, A., Rittmann, B. E. Proton transport inside the biofilm limits electrical current generation by anode-respiring bacteria. Biotechnol. Bioeng. 100, 872-881 (2008).
  30. Torres, C. I., et al. A kinetic perspective on extracellular electron transfer by anode-respiring bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 34, 3-17 (2010).
  31. Patil, S. A., Harnisch, F., Kapadnis, B., Schröder, U. Electroactive mixed culture biofilms in microbial bioelectrochemical systems: The role of temperature for biofilm formation and performance. Biosens. Bioelectron. 26, 803-808 (2010).
  32. Kim, J. R., Min, B., Logan, B. E. Evaluation of procedures to acclimate a microbial fuel cell for electricity production. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 23-30 (2005).
  33. Balch, W. E., Fox, G. E., Magrum, L. J., Woese, C. R., Wolfe, R. S. Methanogens: Reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43, 260-296 (1979).
  34. He, Z., Mansfeld, F. Exploring the use of electrochemical impedance spectroscopy (EIS) in microbial fuel cell studies. Energy Environ. Sci. 2, 215-219 (2009).
  35. Ter Heijne, A., et al. Identifying charge and mass transfer resistances of an oxygen reducing biocathode. Energy Environ. Sci. 4, 5035-5043 (2011).
  36. Logan, B. Scaling up microbial fuel cells and other bioelectrochemical systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 85, 1665-1671 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Inokulum ze ciek wwoltametria cyklicznachronoamperometriazewn trzkom rkowy transport elektron wreaktor okresowo dope nianyuk ad tr jelektrodowymaksymalna g sto pr duwydajno kulombowskapotencja formalny

Powiązane artykuły