Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Optyczne wykrywanie bakterii E. coli za pomocą mezoporowatych biosensorów krzemowych

16.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50805

⸱

20 listopada 2013

 ,  , 
1Department of Biotechnology and Food Engineering, Technion - Israel Institute of Technology, 2The Inter-Departmental Program of Biotechnology, Technion - Israel Institute of Technology, 3The Russell Berrie Nanotechnology Institute, Technion - Israel Institute of Technology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Wprowadzono bezetykietowy optyczny biosensor do szybkiego wykrywania bakterii. Bioczujnik oparty jest na nanostrukturalnym porowatym krzemie, który został zaprojektowany tak, aby bezpośrednio wychwytywać docelowe komórki bakteryjne na swojej powierzchni. Używamy przeciwciał monoklonalnych, unieruchomionych na porowatym przetworniku, jako sond wychwytujących. Nasze badania pokazują możliwość zastosowania tych bioczujników do wykrywania niskich stężeń bakterii w ciągu kilku minut bez wcześniejszego przetwarzania próbki (takiej jak liza komórek).

Streszczenie

Bezznacznikowy biosensor optyczny oparty na nanostrukturalnym porowatym krzemie jest przeznaczony do szybkiego wychwytywania i wykrywania bakterii Escherichia coli K12, jako mikroorganizmu modelowego. Biosensor opiera się na bezpośrednim wiązaniu docelowych komórek bakteryjnych na swojej powierzchni, przy czym nie jest wymagana żadna obróbka wstępna (np. poprzez lizę komórek) badanej próbki. Mezoporowata cienka warstwa krzemu jest używana jako element przetwornika optycznego biosensora. W oświetleniu światłem białym warstwa porowata wykazuje dobrze rozdzielone wzory prążków Fabry'ego-Pérota w swoim spektrum odbicia. Zastosowanie szybkiej transformaty Fouriera (FFT) do danych dotyczących współczynnika odbicia powoduje powstanie pojedynczego piku. Zmiany intensywności piku FFT są monitorowane. W ten sposób wychwytywanie docelowych bakterii na powierzchni biosensora, poprzez interakcje przeciwciało-antygen, indukuje mierzalne zmiany w intensywności pików FFT, umożliwiając obserwację przyczepiania się bakterii w czasie rzeczywistym.

Mezoporowaty film Si, wytwarzany w procesie anodyzacji elektrochemicznej, jest sprzężony z przeciwciałami monoklonalnymi, specyficznymi dla docelowej bakterii. Unieruchomienie, immunoaktywność i swoistość przeciwciał są potwierdzone w eksperymentach znakowania fluorescencyjnego. Gdy bioczujnik zostanie wystawiony na działanie docelowych bakterii, komórki są bezpośrednio wychwytywane na zmodyfikowanej przeciwciałami porowatej powierzchni krzemu. Te specyficzne zdarzenia przechwytywania powodują zmiany intensywności w cienkowarstwowym widmie zakłóceń optycznych biosensora. Wykazaliśmy, że te bioczujniki mogą wykrywać stosunkowo niskie stężenia bakterii (granica wykrywalności10-4 komórek/ml) w czasie krótszym niż godzina.

Wprowadzenie

Wczesna i dokładna identyfikacja bakterii chorobotwórczych jest niezwykle ważna dla bezpieczeństwa żywności i wody, monitorowania środowiska i diagnostyki w miejscu opieki nad pacjentem1. Ponieważ tradycyjne techniki mikrobiologiczne są czasochłonne, pracochłonne i nie mają możliwości wykrywania mikroorganizmów w "czasie rzeczywistym" lub poza środowiskiem laboratoryjnym, bioczujniki ewoluują, aby sprostać tym wyzwaniom2-5.

W ostatnich latach porowaty Si (PSi) okazał się obiecującą platformą do projektowania czujników i biosensorów6-20. W ciągu ostatniej dekady opublikowano liczne badania dotyczące czujników optycznych i biosensorów opartych na PSi21,22. Nanostrukturalna warstwa PSi jest zwykle wytwarzana przez elektrochemiczne trawienie anodowe z monokrystalicznej płytki krzemowej. Powstałe w ten sposób nanomateriały PSi wykazują wiele korzystnych cech, takich jak duża powierzchnia i swobodna objętość, kontrolowane rozmiary porów oraz regulowane właściwości optyczne10,16. Na właściwości optyczne warstwy PSi, takie jak fotoluminescencja8,11 i interferometria oparta na odbiciu światła białego7,19, duży wpływ mają warunki środowiskowe. Wychwycenie cząsteczek gościnnych/docelowych analitów w warstwie porowatej powoduje zmianę średniego współczynnika załamania światła folii, obserwowaną jako modulację w widmie fotoluminescencji lub jako przesunięcie długości fali w widmie odbicia10.

Chociaż jest to ogromna innowacja w technologii biosensorów optycznych PSi, istnieje tylko kilka doniesień na temat platform opartych na PSi do wykrywania bakterii6,8,20,23-29. Ponadto większość z tych badań potwierdzających słuszność koncepcji wykazała "pośrednie" wykrywanie bakterii. W związku z tym na ogół wymagana jest wcześniejsza liza komórek w celu ekstrakcji docelowych fragmentów białka/DNA, charakterystycznych dla badanych bakterii29. Nasze podejście polega na bezpośrednim wychwytywaniu docelowych komórek bakteryjnych do biosensora PSi. Dlatego przeciwciała monoklonalne, które są specyficzne dla bakterii docelowych, są unieruchamiane na porowatej powierzchni. Wiązanie komórek bakteryjnych, poprzez oddziaływania przeciwciało-antygen, z powierzchnią biosensora indukuje zmiany amplitudy (intensywności) widma odbicia24-26.

W tej pracy opisujemy budowę optycznego biosensora opartego na PSi i demonstrujemy jego zastosowanie jako bezetykietowej platformy biosensorycznej do wykrywania bakterii Escherichia coli (E. coli) K12 (używanej jako mikroorganizm modelowy). Monitorowany sygnał optyczny to światło odbite od nanostruktury PSi w wyniku interferencji cienkowarstwowej Fabry'ego-Pérota (ryc. 1A). Zmiany amplitudy/natężenia światła są skorelowane ze specyficznym unieruchomieniem docelowych komórek bakteryjnych na powierzchni biosensora, co pozwala na szybkie wykrycie i kwantyfikację bakterii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie utlenionego porowatego SiO2

  1. Wafle Si (jednostronnie polerowane na powierzchni <100> i mocno domieszkowane, typu p, 0,0008 Ω cm) w roztworze wodnego HF i absolutnego etanolu o proporcjach 3:1 (v/v) przez 30 sEC przy stałej gęstości prądu 385 mA/cm2. Należy pamiętać, że HF jest cieczą silnie i należy obchodzić się z nią z najwyższą ostrożnością.
  2. Kilkakrotnie spłukać powierzchnię powstałej porowatej warstwy krzemu (PSi) absolutnym etanolem; wysuszyć folie pod suchym gazowym azotem.
  3. Świeżo wytrawione próbki PSi utleniać w piecu rurowym w temperaturze 800 °C przez 1 godzinę w otaczającym powietrzu (umieścić próbkę w piecu w temperaturze pokojowej, ogrzać piec do 800 °C, pozostawić w piecu na 1 godzinę, wyłączyć piec i wyjmować próbki z pieca tylko w temperaturze pokojowej).

2. Biofunkcjonalizacja rusztowań PSiO2

  1. Inkubować utlenioną próbkę PSi (PSiO2) przez 1 godzinę w 95% (MPTS) roztworze merkaptopropylu (trimetoksysilanu-3) (108 mM w toluenie).
  2. Przepłukać próbkę PSiO2 poddaną działaniu silanu toluenem, metanolem i acetonem; wysuszyć w suchym gazowym azocie.
  3. Próbkę PSiO2 modyfikowaną silanem inkubować przez 30 minut w 1 ml 100 mM roztworu biotyny PEO-jodoacetylowej.
  4. Próbkę PSiO2 nasączoną biotyną przepłukać kilkakrotnie 0,1 M roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS).
  5. Próbkę PSiO2 modyfikowaną biotyną inkubować przez 30 minut w 1 ml roztworu streptawidyny (SA) o stężeniu 100 μg/ml.
  6. Kilkakrotnie przepłukać próbkę PSiO2 poddaną działaniu SA roztworem 0,1 M PBS.
  7. Otrzymaną próbkę PSiO2 modyfikowaną SA inkubować przez 30 minut w 1 ml roztworu 100 μg/ml biotynylowanego przeciwciała monoklonalnego E. coli (immunoglobulina G, IgG) lub w 100 μg/ml biotynylowanej króliczej IgG (jako model przeciwciała monoklonalnego).

3. Znakowanie fluorescencyjne i mikroskopia fluorescencyjna

  1. Inkubować powierzchnie zmodyfikowane IgG z 15 μg/ml fluoresceiny (FITC) znakowanej anty króliczą IgG przez 40 minut i z 15 μg/ml fluoresceiny (FITC) znakowanej anty mysią IgG jako kontrolą.
  2. Przepłukać zmodyfikowane próbki kilkakrotnie roztworem 0,1 M PBS.
  3. Zbadaj próbki pod mikroskopem fluorescencyjnym.

4. Kultura bakterii

  1. Hoduj bakterie E. coli K12 w probówce o pojemności 10 ml z 5 ml pożywki Luria Bertani (LB) (skład pożywki w 1 l wody dejonizowanej: 5 g NaCl, 5 g ekstraktu drożdżowego i 10 g tryptonu). Inkubować bakterie przez noc, wstrząsając w temperaturze 37 °C.
  2. Monitoruj stężenie bakterii, odczytując gęstość optyczną (OD) przy długości fali 600 nm. Po całonocnym wzroście w pożywce LB odczytaj OD600 za pomocą spektrofotometru, aby określić stężenie bakterii. Liczba komórek jest wprost proporcjonalna do pomiarów OD600 (1 OD600 = 108 komórek/ml).

5. Wykrywanie bakterii

  1. Umieść zmodyfikowane IgG próbki PSiO2 i schludne PSiO2 (jako kontrolne) w specjalnie wykonanej komorze przepływowej z pleksiglasu. Zamocuj celę przepływową, aby upewnić się, że współczynnik odbicia próbki jest mierzony w tym samym miejscu podczas wszystkich pomiarów.
  2. Próbki inkubować z zawiesiną E. coli K12 (10-4 komórki/ml) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie usuń zawiesinę bakterii, przepłukując komórkę 0,85% w/v roztworem soli fizjologicznej przez 30 minut.
  3. Monitoruj zmiany w danych dotyczących współczynnika odbicia przez cały czas trwania eksperymentu. Wszystkie pomiary optyczne należy przeprowadzać w otoczeniu wodnym. Widma należy zbierać za pomocą spektrometru CCD i analizować za pomocą szybkiej transformaty Fouriera (FFT), jak opisano wcześniej25,26 .
  4. Potwierdź obecność bakterii na powierzchni biosensora, obserwując próbki pod pionowym mikroskopem świetlnym natychmiast po eksperymencie z biodetekcją.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Utlenione filmy PSi (PSiO2) są przygotowywane zgodnie z opisem w sekcji Tekst Protokołu. Rysunek 1B przedstawia wysokorozdzielczą mikrografię z wykorzystaniem skaningowego mikroskopu elektronowego otrzymanego filmu PSi po utlenianiu termicznym. Warstwa PSiO2 charakteryzuje się wyraźnie zdefiniowanymi porami cylindrycznymi o średnicy w zakresie 30-80 nm.

Cząsteczki przeciwciał monoklonalnych (IgG) są szczepione na powierzchnie PSiO2 przy użyciu ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wytwarzany jest bezznacznikowy optyczny czujnik immunologiczny, oparty na nanostrukturze PSiO2 (cienkiej warstwie Fabry'ego-Pérota), który potwierdza jego potencjalną przydatność jako bioczujnika do wykrywania bakterii.

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów

Jednym z głównych problemów podczas projektowania immunosensora jest podatność przeciwciał na niepożądane zmiany konformacji podczas osadzania i modelowania na podłożu stałym, co może prowadzić do zmniejs...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Izraelską Fundację Naukową (grant nr 1118/08 i grant nr 1146/12) oraz Minna Kroll Memorial Research Fund. E.S z wdzięcznością dziękuje za wsparcie finansowe Instytutu Nanotechnologii Russell Berrie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Si wafelSiltronix Corp.Wysoce domieszkowany B, typ p, rezystywność 0,0008 Ω-cm, < 100> zorientowany
wodny HF (48%)Merck101513
absolutny roztwór buforowyetanolu Merck818760
PBS (pH 7,4)przygotowany przez rozpuszczenie 50 mM Na2HPO4, 17 mM NaH2PO4 i 68 mM NaCl w wodzie Milli-Q (18,2 MΩ)
Sól fizjologiczna 0,85% w/vprzygotowana przez rozpuszczenie 0,85 g NaCl w 100 ml wody Milli-Q (18,2 MΩ)
95% (3-merkaptopropylo)trimetoksysilan (MPTS)Sigma Aldrich Chemicals175617
PEO-jodoacetylobiotynaSigma Aldrich ChemicalsB2059
Streptawidyna (SA)Jackson ImmunoResearch Labs Inc.016-000-114
Fluoresceina (DTAF)-streptawidynaJackson ImmunoResearch Labs Inc.016-010-084
Biotynylowany królik IgGJackson ImmunoResearch Labs Inc.011-060-003
Fluorescencyjnie oznakowany anty-króliczy IgGJackson ImmunoResearch Labs Inc.111-095-003
Fluorescencyjnie oznakowany anty-mysi IgGJackson ImmunoResearch Labs Inc.115-095-003
Biotynylowane przeciwciało E. coliJackson ImmunoResearch Labs Inc.1007
E. coli (K-12)został hojnie dostarczony przez prof. Simę Yaron, Technion

Bibliografia

  1. Velusamy, V., et al. An overview of foodborne pathogen detection: In the perspective of biosensors. Biotechnol. Adv. 28 (2), 232-23 (2010).
  2. Food Microbiol.: Fundamentals and Front. Doyle, M. P., Beuchat, L. R., Montville, T. J. 2, ASM Press. Washington. (2001).
  3. Radke, S. M., Alocilja, E. C. A microfabricated biosensor for detecting foodborne bioterrorism agents. IEEE Sens. J. 5 (4), 744(2005).
  4. Glynn, B., et al. Current and emerging molecular diagnostic technologies applicable to bacterial food safety. Int. J. of Dairy Technol. 59 (2), 126(2006).
  5. Leonard, P., et al. Advances in biosensors for detection of pathogens in food and water. Enzyme Microb. Technol. 32 (1), 3(2003).
  6. Alvarez, S. D., et al. Using a porous silicon photonic crystal for bacterial cell-based biosensing. Physica Status Solidi a-Applications and Materials Science. 204 (5), 1439(2007).
  7. Archer, M., et al. Electrical porous silicon microarray for DNA hybridization detection. Micro- and Nanosystems. 782, 385(2004).
  8. Chan, S., Horner, S. R., Fauchet, P. M., Miller, B. L. Identification of Gram Negative Bacteria Using Nanoscale Silicon Microcavities. J. Am. Chem. Soc. 123, 11797(2001).
  9. Dancil, K. -P. S., Greiner, D. P., Sailor, M. J. Development of a Porous Silicon Based Biosensor. Canham, L. T., Sailor, M. J., Tanaka, K., Tsai, C. C. Proceedings of the Mat. Res. Soc. Symp, Boston, MA, 536, 557-562 (1999).
  10. D'Auria, S., et al. Nanostructured silicon-based biosensors for the selective identification of analytes of social interest. J Phys - Condens Matter. 18 (33), S2019(2006).
  11. de Leon, S. B., et al. Neurons culturing and biophotonic sensing using porous silicon. Appl Phys Lett. 84 (22), 4361(2004).
  12. Janshoff, A., et al. Macroporous p-type silicon Fabry-Perot layers. Fabrication, characterization, and applications in biosensing. J. Am. Chem. Soc. 120 (46), 12108(1998).
  13. Orosco, M. M., Pacholski, C., Miskelly, G. M., Sailor, M. J. Protein-coated porous silicon photonic crystals for amplified optical detection of protease activity. Adv. Mater. 18, 1393(2006).
  14. Pacholski, C., et al. Biosensing using porous silicon double-layer interferometers: reflective interferometric Fourier transform spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 127 (33), 11636(2005).
  15. Pacholski, C., et al. Reflective Interferometric Fourier Transform Spectroscopy: A Self-Compensating Label-Free Immunosensor Using Double-layers of Porous SiO2. J. Am. Chem. Soc. 128, 4250(2006).
  16. Sailor, M. J., Link, J. R. Smart Dust: nanostructured devices in a grain of sand. Chem. Comm. , 1375(2005).
  17. Schwartz, M. P., Alvarez, S. D., Sailor, M. J. Porous SiO2 interferometric biosensor for quantitative determination of protein interactions: Binding of protein a to immunoglobulins derived from different species. Anal. Chem. 79 (1), 327(2007).
  18. Schwartz, M. ichaelP., et al. The smart petri dish: A nanostructured photonic crystal for real-time monitoring of living cells. Langmuir. 22, 7084(2006).
  19. Stewart, M. P., Buriak, J. M. Chemical and biological applications of porous silicon technology. Adv. Mater. 12 (12), 859(2000).
  20. Zhang, D., Alocilja, E. C. Characterization of nanoporous silicon-based DNA biosensor for the detection of Salmonella enteritidis. IEEE Sens J. 8 (5-6), 775(2008).
  21. Bonanno, L. M., Segal, E. Nanostructured porous silicon-polymer-based hybrids: from biosensing to drug delivery. Nanomedicine. 6 (10), 1755(2011).
  22. Jane, A., Dronov, R., Hodges, A., Voelcker, N. H. Porous silicon biosensors on the advance. Trends Biotechnol. 27 (4), 230(2009).
  23. Li, S., Huang, J., Cai, L. A porous silicon optical microcavity for sensitive bacteria detection. Nanotechnology. 22 (42), 425502(2011).
  24. Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Segal, E. Nano Bio-Technology for Biomedical and Diagnostics Research. Zahavy, E., Ordentlich, A., Yitzhaki, S., Shafferman, A. 733, Springer. Netherlands. (2012).
  25. Massad-Ivanir, N., et al. Engineering Nanostructured Porous SiO2 Surfaces for Bacteria Detection via "Direct Cell Capture". Anal. Chem. 83 (9), 3282-32 (2011).
  26. Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Zeidman, T., Segal, E. Construction and characterization of porous SiO2/hydrogel hybrids as optical biosensors for rapid detection of bacteria. Adv Funct Mater. 20 (14), 2269-22 (2010).
  27. Mathew, F. P., Alocilja, E. C. Porous silicon-based biosensor for pathogen detection. Biosens. Bioelectron. 20 (8), 1656(2005).
  28. Ouyang, H., Archer, M., Fauchet, P. M. Frontiers in Surface Nanophotonics. 133, 49(2007).
  29. Ouyang, H., DeLouise, L. A., Miller, B. L., Fauchet, P. M. Label-free quantitative detection of protein using macroporous silicon photonic bandgap biosensors. Anal. Chem. 79 (4), 1502-15 (2007).
  30. Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , 1st, Academic Press. (1996).
  31. Piervincenzi, R. T., Reichert, W. M., Hellinga, H. W. Genetic engineering of a single-chain antibody fragment for surface immobilization in an optical biosensor. Biosensors and Bioelectronics. 13 (3-4), 305(1998).
  32. Saerens, D., Huang, L., Bonroy, K., Muyldermans, S. Antibody Fragments as Probe in Biosensor Development. Sensors. 8 (8), 4669(2008).
  33. Shtenberg, G., et al. Picking up the Pieces: A Generic Porous Si Biosensor for Probing the Proteolytic Products of Enzymes. Anal. Chem. 85 (3), 1951(2013).
  34. Bonanno, L. M., DeLouise, L. A. Steric Crowding Effects on Target Detection in an Affinity Biosensor. Langmuir. 23 (10), 5817(2007).
  35. Banada, P. P., Bhunia, A. K. Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. Mohammed, E., Zourob, S., Turner, A. P. F. , Springer. 567(2008).
  36. Poma, A., Whitcombe, M., Piletsky, S. Designing receptores for the next generation of biosensors. Whitcombe, M. J., Piletsky, S. A. , Springer. 105(2013).
  37. Dudak, F. C., Boyaci, I. H. Development of an immunosensor based on surface plasmon resonance for enumeration of Escherichia coli in water samples. Food Res. Int. 40 (7), 803(2007).
  38. Dudak, F. C., Boyaci, I. H. Rapid and label-free bacteria detection by surface plasmon resonance (SPR) biosensors. Biotechn J. 4 (7), 1003(2009).
  39. Skottrup, P. D., Nicolaisen, M., Justesen, A. F. Towards on-site pathogen detection using antibody-based sensors. Biosens. Bioelectron. 24 (3), 339(2008).
  40. Taylor, A. D., Ladd, J., Homola, J., Jiang, S. Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. , Springer. 83(2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mezoporowaty biosensor krzemowybiosensor optycznydetekcja E. colibiosensor bez znakowaniaporowaty film krzemowyimmobilizacja przeciwciałszybka transformata Fourierawidmo odbiciowościwychwytywanie bakteriiznakowanie fluorescencyjne
Optyczne wykrywanie bakterii E. coli za pomocą mezoporowatych biosensorów krzemowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.