Membrane-SPINE: narzędzie biochemiczne do identyfikacji interakcji białko-białko białek błonowych in vivo

Podsumowanie

Opisano podejście biochemiczne do identyfikacji in vivo interakcji białko-białko (PPI) białek błonowych. Metoda łączy w sobie sieciowanie białek, oczyszczanie powinowactwa i spektrometrię mas i można ją dostosować do prawie każdego typu komórki lub organizmu. Dzięki takiemu podejściu możliwa staje się nawet identyfikacja przejściowych IPP.

Streszczenie

Białka błonowe są niezbędne dla żywotności komórek i dlatego są ważnymi celami terapeutycznymi^1-3. Ponieważ funkcjonują one w kompleksach⁴, konieczne są metody identyfikacji i charakterystyki ich interakcji⁵. W tym celu opracowaliśmy eksperyment interakcji paciorkowc-białko błonowy o nazwie Membrane-SPINE⁶. Technika ta łączy sieciowanie in vivo przy użyciu odwracalnego formaldehydu sieciującego z oczyszczaniem powinowactwa białka przynęty błonowej znakowanego Strep-ami. Podczas zabiegu usieciowane białka ofiar są jednocześnie oczyszczane z białkiem przynęty błonowej, a następnie oddzielane przez gotowanie. W związku z tym podczas analizy interakcji białko-białko (PPI) białek błonowych za pomocą Membrane-SPINE można wykonać dwa główne zadania: po pierwsze, potwierdzenie proponowanego partnera interakcji za pomocą immunoblottingu, a po drugie, identyfikacja nowych partnerów interakcji za pomocą analizy spektrometrii mas. Co więcej, nawet o niskim powinowactwie, przejściowe IPP są wykrywalne za pomocą tej techniki. Wreszcie, Membrane-SPINE można dostosować do prawie każdego typu komórek, dzięki czemu można go zastosować jako potężne narzędzie przesiewowe do identyfikacji IPP białek błonowych.

Wprowadzenie

Aby zrozumieć funkcję białka, niezbędne jest poznanie jego partnerów do interakcji. Dostępnych jest kilka klasycznych technik identyfikacji partnerów interakcji rozpuszczalnych białek. Jednak techniki te nie są łatwe do przeniesienia na białka błonowe ze względu na ich hydrofobowy charakter⁴. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, opracowaliśmy eksperyment interakcji paciorkowc-białko błonowe (Membrane-SPINE)⁶. Opiera się na metodzie SPINE, która była odpowiednia tylko dla białek rozpuszczalnych⁷.

Membrana-SPINE korzysta z dwóch zalet czynnika sieciującego formaldehydu: po pierwsze, formaldehyd może łatwo przenikać przez błony i dzięki temu generuje precyzyjny obraz interaktomii żywej komórki⁸. Po drugie, wiązania krzyżowe formaldehydu można odwrócić przez gotowanie⁹. W tym przypadku te dwie zalety są wykorzystywane do identyfikacji nie tylko stałych, ale także przejściowych IPP białek błonowych⁶.

W skrócie, znacznik Strep-tag jest połączony z C-końcem integralnego białka przynęty błonowej. Komórki wyrażające białko przynęty błonowej są inkubowane z formaldehydem, który sieciuje białka żerewne z białkiem przynęty błonowej (ryc. 1). Modyfikacje białek ofiar nie są potrzebne. Następnie przygotowuje się frakcję membranową. Dlatego białka błonowe są rozpuszczane przez detergenty, a białka przynęty są oczyszczane z białkami ofiary za pomocą oczyszczania powinowactwa. Następnie usieciowanie jest odwracane przez gotowanie, a przynęta i jej spruuowane białka ofiary są rozdzielane przez SDS-PAGE. Wreszcie, białka ofiar można zidentyfikować za pomocą analizy immunoplam lub spektrometrii mas.

Protokół

Uwaga: Szczegółowe informacje dotyczące wskazanych w protokole są dostępne w Tabeli 1.

1. Utrwalanie oddziaływań białko-białko przez sieciowanie formaldehydu w żywych komórkach

1. Na początek należy przygotować pożywkę wzrostową, roztwory podstawowe i bufor P1
   1. Przygotuj 500 ml pożywki: Pożywka powinna zapewniać warunki sprzyjające interakcji między białkiem przynęty błonowej a białkami ofiary. Ponadto należy przeprowadzić jedno doświadczenie w warunkach, w których nie przewiduje się interakcji (np. bez sieciowania).
      Uwaga: Porównujemy interakcje białko-białko u bakterii zestresowanych i niestresowanych. Dlatego w 2-litrowej kolbie Erlenmeyera przygotowujemy 500 ml pożywki Luria Bertani (LB) (tabela 1), którą uzupełniamy środkiem wywołującym stres (np. 0,5 M NaCl). Do kontroli używamy normalnej pożywki LB o stężeniu 0,17 M NaCl (pH 7,0).
   2. Przygotować bufor Tris (20 mM Tris-HCl; pH 8,0) i 0,1 M kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), roztwór podstawowy o pH 8,0 (Tabela 1).
   3. Przygotować bufor P1. Rozpuścić sacharozę do końcowego stężenia 0,5 M w buforze Tris. Wysterylizować bufor P1 przez filtrację i przechowywać go w temperaturze 4 °C.
2. Hoduj komórki wyrażające białko przynęty błonowej z fuzją C-końcowego znacznika Strep-Tag z wektora. Indukuj ekspresję białek przynęty błonowej przez wystarczająco długi czas.
   Uwaga: Indukujemy ekspresję białek przynęty błony bakteryjnej we wczesnej fazie logarytmicznej (A₆₀₀ = 0,3) przez dodanie 250 μl 1 M izopropylo-β-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG) do 500 ml pożywki (stężenie końcowe: 0,5 mM). Aby umożliwić wystarczającą ekspresję, inkubujemy bakterie aż do późnej fazy logarytmicznej (A₆₀₀ = 1,2).
3. Przygotować dla każdej kultury dwie zlewki wirówkowe o minimalnej objętości 300 ml każda i umieścić je na lodzie.
4. Wykonaj sieciowanie formaldehydu.
   UWAGA: Formaldehyd jest wysoce toksyczny. Zalecamy pracę pod dygestoriami.
   1. Przenieść naczynie hodowlane pod okap zabezpieczający. Podziel każdą próbkę na dwie próbki, jedną z pominięciem sieciowania (- X), a drugą z uwzględnieniem sieciowania formaldehydu (+ X). Dodać 4 ml 37% roztworu formaldehydu do 250 ml kultury, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,6%.
5. Przenieś naczynia hodowlane z powrotem i hoduj komórki przez kolejne 20 minut, tak jak poprzednio.
6. Napełnij swoje kultury bakteriami do probówek wirówkowych pod okapem ochronnym. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 3 000 x g przez 30 minut.
7. Zutylizować supernatant poprzez ostrożne pipetowanie go pod wyciągiem ochronnym. Zebrać toksyczny supernatant zawierający formaldehyd i odpowiednio go zutylizować.
8. Aby osiągnąć optymalną wydajność podczas przygotowania białka błonowego, należy najpierw przygotować sferoplasty. Tutaj przedstawiamy protokół tworzenia sferoplastów bakterii Gram-ujemnych:
   1. Przygotować bufor P2 (Tabela 1) z liofilizowanego proszku. Delikatnie rozpuścić 2 mg lizozymu w 0,1 M EDTA, pH 8, w probówce o pojemności 1,5 ml. Bufor P2 należy zawsze przygotowywać na świeżo na dzień eksperymentu.
   2. Przygotować tris-buffer z inhibitorem proteazy (bufor P3). Do 10 ml buforu Tris dodać 0,1 ml 1 M fenylometylosulfonylofluorku (PMSF) (Tabela 1) do końcowego stężenia 10 mM. Bufor należy zużyć natychmiast, aby zapewnić prawidłowe działanie PMSF jako inhibitora proteazy.
   3. Zawiesić osady komórkowe w 10 ml tris-buffera z inhibitorem proteazy i przenieść roztwór do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
   4. Dodać 1 ml buforu P2 i inkubować na lodzie przez 30 minut.
   5. Zebrać sferoplasty przez odwirowanie przy 3 000 x g przez 30 minut i ostrożnie wyrzucić supernatant.
9. Granulki sferoplastu inkubować przez noc w temperaturze -20°C.

2. Oczyszczanie białka błonowego Strep-tag (przynęta)

1. Umieść granulki sferoplastu na lodzie.
2. W czasie, gdy granulki sferoplastu rozmrażają się na lodzie, należy przygotować 10 ml buforu P3 dla każdego preparatu sferoplastowego. Delikatnie rozpuścić 1 mg DNaseI w 10 ml buforu Tris. Dodać 0,1 ml 1 M PMSF tuż przed użyciem.
3. Zawiesić osad w 6 ml świeżo przygotowanego P3. Sonikować próbkę cztery razy przez 1 minutę w sposób ciągły na lodzie z 1-minutową przerwą między każdą serią, w celu rozerwania sferoplastów.
4. Odwirować próbkę o masie 10 000 x g przez 10 minut w celu zebrania resztek komórkowych. Przenieść supernatant za pomocą pipety do probówki ultrawirówkowej.
5. Frakcję membranową osadzać w ilości 100 000 x g przez 30 min. Ostrożnie umyć osad w buforze Tris, nie rozpuszczając go. Osusz probówkę chusteczką papierową (np. Kleenex). Unikaj naruszania pelletu w dowolnym momencie.
6. Zawiesić ostrożnie osad (= membrany) w 1 ml buforu Tris. Użyć podwielokrotności 20 μl, aby oznaczyć stężenie białka, np. za pomocą testu BCA. Na tym etapie membrany można zamrozić szokowo w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Oczyszczanie białka przynęty błonowej Strep-tag i SDS-PAGE

1. Znormalizować stężenie białka we frakcji błonowej do 5 mg/ml za pomocą Tris-buffer. Pobrać 2,5 ml frakcji błonowej (5 mg/ml) do probówki ultrawirówkowej i dodać 0,25 ml 20% Triton X-100, aby osiągnąć końcowe stężenie 2%, w celu rozpuszczenia białek błonowych. Dodaj pręt mikromagnetyczny i mieszaj na lodzie przez 1 godz.
   Uwaga: Chociaż ogólnie rzecz biorąc, osiągamy dobre wyniki przy użyciu Triton X-100 jako detergentu, przydatna może być zmiana detergentu w celu optymalizacji. Pod tym względem najlepsze wyniki osiągamy z detergentami stosowanymi do funkcjonalnego oczyszczania danego białka przynęty membranowej.
2. Wykonując krok 3.1, przygotować 50 ml buforu W i 5 ml buforu E z (Tabela 1). Napełnić 10 ml koncentratu 5x bufor W do 50 ml i dodać 150 μl 20% Triton X-100.
   1. Napełnić 1 ml 5x koncentratu buforu E do 10 ml i dodać 30 μl 20% Triton X-100. Zrównoważyć 1 ml kolumny przepływowej Strep-Tactin z 8 ml buforem W.
      Uwaga: Niezbędne jest dodanie detergentu używanego do solubilizacji w stężeniu 10-krotnie wyższym od krytycznego stężenia miceli (cmc) w dowolnym buforze podczas procedury oczyszczania.
3. Usunąć pręt mikromagnetyczny z próbki solubilizacyjnej i ultrawirować przy 100 000 x g przez 30 minut, aby osadzać nierozpuszczalną frakcję membranową. Usunąć supernatant za pomocą pipety w celu dalszego oczyszczania.
4. Załaduj supernatant do kolumny. Uruchom kolumnę tylko z przepływem grawitacyjnym. Przemyć kolumnę 5 ml buforu W. Powtórzyć ten etap płukania 5 razy.
5. Eluować błonowe białka przynęty za pomocą 1 ml buforu E. Powtórz ten etap elucji 4 razy.
6. Zagęścić frakcje elucyjne 2, 3 i 4 do 300 μl za pomocą filtra odśrodkowego.
7. Zmieszaj 200 μl każdej próbki z 50 μl 5x barwnika ładującego SDS-PAGE. Podzielić każdy preparat na 125 μl porcji. Gotować jedną porcję każdego preparatu przez 20 minut w temperaturze 95 °C, aby odwrócić wiązania krzyżowe formaldehydu. Pozostawić próbki do ostygnięcia do temperatury suchej temperatury przez co najmniej 10 minut na stole laboratoryjnym.
8. Załadować 30 μl z każdej próbki do pojedynczego pasa żelu poliakrylamidowego odpowiedniego do immunoblottingu. Użyj wstępnie wybarwionego markera masy cząsteczkowej, aby uzyskać najlepszą orientację i uruchom SDS-PAGE¹⁰.

4. Analiza immunoblot w celu potwierdzenia partnerów interakcji

1. Po zakończeniu kroku 3.8 przenieś białka do membrany nitrocelulozowej, np. półsucho.
2. Zablokuj membranę, aby zapobiec niespecyficznemu etykietowaniu. Przygotować bufor blokujący, ważąc albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w celu uzyskania 3% wagowych na objętość w soli fizjologicznej buforowanej tris, uzupełnionej końcowym stężeniem 0,05% Tween-20 (TBS-T). Użyj wystarczającej objętości bufora blokującego, aby przykryć membranę. Zablokuj membranę na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
3. Rozcieńczyć i inkubować pierwsze przeciwciało specyficzne dla białka ofiary, jak zwykle. Użyj przeciwciała sprzężonego z HRP jako drugiego przeciwciała.
4. Opracuj immunoblot za pomocą zestawu do wykrywania chemiluminescencyjnego o wysokiej czułości. Monitoruj sygnał za pomocą klasycznej procedury przetwarzania filmu lub cyfrowego sprzętu do obrazowania.

5. Eksperymenty NanoLC-ESI-MS/MS w wysokiej rozdzielczości w celu identyfikacji partnerów interakcji

1. W przypadku, gdy nie jest dostępne żadne specyficzne przeciwciało dla białka ofiary lub należy zidentyfikować nieznanych partnerów interakcji, do identyfikacji należy użyć spektrometrii mas (MS). Aby zapobiec zanieczyszczeniu keratyną, należy używać prefabrykowanych żeli do separacji białek.
2. Srebrną bejcę SDS-PAGE za pomocą zestawu do barwienia kompatybilnego z MS zgodnie z protokołem producenta. Wykonaj wszystkie etapy barwienia i mycia w szklanych zbiornikach.
3. Wyciąć odpowiednie pasma i przeanalizować je za pomocą LC/MS⁹ o wysokiej rozdzielczości.

Wyniki

Analiza błonowa SPINE umożliwia współoczyszczanie białek błonowych i przejściowo oddziałujących z nimi partnerów białkowych. Współoczyszczanie jest realizowane przy użyciu formaldehydu jako czynnika sieciującego. Kluczowe dla zapobiegania niespecyficznemu sieciowaniu są dwa parametry: stężenie formaldehydu oraz czas sieciowania. Odpowiednie, ale nie nadmierne zastosowanie formaldehydu można łatwo kontrolować za pomocą immunoblotingu. Kompleksy białkowe sieciowane formaldehydem można rozdzielić poprzez gotowanie, ale nie ...

Dyskusja

Analiza błony SPINE jest podejściem biochemicznym, które umożliwia potwierdzenie i zidentyfikowanie do tej pory nieznanych partnerów interakcji białek błonowych. Membrana SPINE łączy sieciowanie in vivo za pomocą formaldehydu z oczyszczaniem białka przynęty błonowej znakowanego Strep-em. Połączenie z immunoblottingiem ułatwia potwierdzenie przewidywanych partnerów interakcji (ryc. 2). Dodatkowo, połączenie z analizą MS pozwala na identyfikację nieznanych partnerów interakcji (ryc. 3

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
37% Formaldehyd	Roth	4979.1	Nie powinien być starszy niż jeden rok
DNaseI	Sigma	DN25
Zestaw do oznaczania białek BCA	Pierce	23225
Pręt mikromagnetyczny	Roth	0955.2	5 mm długości, 2 mm średnicy
Triton X-100	Roth	6683.1	standardowy detergent do solubilizacji
n-dodecyl-β-maltozyd	Glycon	D97002-C	najlepszy detergent do rozpuszczania CpxA
1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column	IBA	2-1207-050
Zestaw do oczyszczania białek Strep-tag	IBA	2-1002-001	Zawiera bufor W i bufor E
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-4	Millipore	UFC803024
SuperSignal West Pico Podłoże chemiluminescencyjne	Pierce	34080
SilverQuest Zestaw do barwienia srebra	Invitrogen	LC6070
FireSilver Zestaw do barwienia	Proteome Factory	P-S-2001
Ultrawirówka