Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Testy do identyfikacji nowych leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi choroby niebieskiego języka

13.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50820

⸱

11 października 2013

 ,  , 
1Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 2Molette Laboratory for Drug Discovery, Department of Chemistry and Biochemistry, Auburn University

W tym artykule

Podsumowanie

Trzy testy, w tym test oparty na działaniu cytopatycznym (CPE), test dawka-odpowiedź i test czasu dodania (ToA) zostały opracowane, zoptymalizowane, zatwierdzone i wykorzystane do identyfikacji nowych leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi choroby niebieskiego języka (BTV), a także do określenia możliwego mechanizmu działania (MoA) dla nowo zidentyfikowanych leków przeciwwirusowych.

Streszczenie

Aby zidentyfikować potencjalne leki przeciwwirusowe przeciwko BTV, opracowaliśmy, zoptymalizowaliśmy i zwalidowaliśmy trzy przedstawione tutaj testy. Test oparty na CPE był pierwszym testem opracowanym w celu oceny, czy związek wykazał jakąkolwiek skuteczność przeciwwirusową i został wykorzystany do badań przesiewowych dużej biblioteki związków. Tymczasem cytotoksyczność leków przeciwwirusowych można również ocenić za pomocą testu opartego na CPE. Test dawka-odpowiedź został zaprojektowany w celu określenia zakresu skuteczności wybranego leku przeciwwirusowego, tj. 50% stężenia hamującego (IC50) lub stężenia skutecznego (EC50), a także zakresu jego cytotoksyczności (CC50). Test ToA został wykorzystany we wstępnym badaniu MoA w celu określenia mechanizmu leżącego u podstaw nowych leków przeciwwirusowych podczas cyklu życia wirusa BTV lub możliwego wpływu na maszynerię komórkową gospodarza. Testy te mają zasadnicze znaczenie dla oceny skuteczności przeciwwirusowej w systemie hodowli komórkowej i zostały wykorzystane w naszych ostatnich badaniach, które doprowadziły do identyfikacji wielu nowych leków przeciwwirusowych przeciwko BTV.

Wprowadzenie

BTV to prototyp dwuniciowego wirusa RNA z rodzaju Orbivirus, rodziny Reoviridae. BTV jest jedną z najważniejszych chorób zwierząt gospodarskich, w tym owiec, kóz, bydła i innych zwierząt domowych, powodującą straty w wysokości 3 miliardów dolarów rocznie na całym świecie1,2. Egzotyczny serotyp BTV jest ważnym patogenem zwierzęcym wymienionym w raporcie USDA "Patogeny zwierząt gospodarskich o wysokiej konsekwencji". Ostatnio ponowne pojawienie się BTV spowodowało poważny wybuch epidemii choroby u bydła i owiec w kilku krajach Europy Północnej3,4. Ze względu na swoje znaczenie gospodarcze i jako system modelowy, wirus BTV stał się przedmiotem szeroko zakrojonych badań molekularnych, genetycznych i strukturalnych, w wyniku których opracowano kilka szczepionek. Jednak ze względu na brak odpowiednich testów do odkrywania leków przeciwwirusowych, nie ma dostępnych leków przeciwwirusowych przeciwko BTV.

W niedawnej kampanii wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS) z wykorzystaniem BTV jako systemu modelowego, opracowaliśmy, zoptymalizowaliśmy i zwalidowaliśmy test oparty na CPE, aby zidentyfikować potencjalne leki przeciwwirusowe o szerokim spektrum działania przeciwko arbowirusom5. Test oparty na CPE jest dobrze uznanym testem, który został wykorzystany do odkrywania leków przeciwwirusowych przeciwko wielu wirusom, które wywołały szybką i obserwowalną CPE / apoptozę5-7. W naszym systemie, po zakażeniu BTV, CPE jest widoczne w komórkach kręgowców, w tym HeLa, BSR i HEK 293T8. CPE wywołane przez BTV można monitorować i oznaczać ilościowo za pomocą różnych metod wykrywania żywotności komórek, w tym zestawu odczynników żywotności komórek CellTiter Glo (zestaw KTG)9. Zestaw ten określa liczbę żywotnych komórek w hodowli na podstawie ilościowego oznaczenia przedstawionego komórkowego ATP, który sygnalizuje obecność metabolicznie aktywnych żywych komórek. W zoptymalizowanych warunkach, zaprezentowany tutaj test oparty na CPE wykazał swoją wykonalność dzięki jednoetapowemu protokołowi "mix and measure" oraz elastyczność dzięki stabilnym sygnałom luminescencyjnym. Tymczasem toksyczne związki zmniejszające żywotność komórek zostaną wykluczone w tym teście opartym na CPE. Test oparty na CPE wykazał swoją solidność i niezawodność w odkrywaniu leków przeciwwirusowych przeciwko BTV i został wykorzystany do badań przesiewowych NIH Molecular Libraries Small Molecule Repository (MLSMR), co prowadzi do identyfikacji sześciu nowych klastrów potencjalnych przeciwwirusowych związków ołowiowych5.

Gdy potencjalny związek przeciwwirusowy zostanie zidentyfikowany za pomocą testu opartego na CPE, będzie musiał zostać poddany testowi dawka-odpowiedź o dziesięciu stężeniach, aby określić zakres skuteczności przeciwwirusowej i cytotoksyczności2. Skuteczność przeciwwirusowa, reprezentowana jako 50% stężenie hamujące (IC50) lub 50% stężenie skuteczne (EC50), to stężenie leku, który hamuje CPE wywołane przez wirusa w połowie drogi między wartością wyjściową a maksymalną. Cytotoksyczność leków przeciwwirusowych, tj. 50% stężenie cytotoksyczności (CC50), to stężenie leku wywołujące 50% cytotoksyczności między wartością wyjściową a maksymalną. Wskaźnik selektywności (SI), oznaczany jako 50% SI (SI50) jest obliczany na podstawie CC50/IC50, który określa swoistość leku przeciwwirusowego wobec CPE wywołanego przez wirusa. Wartości IC50 (lub EC50), CC50 i SI50 są krytycznymi miarami pozwalającymi określić, czy związek przeciwwirusowy jest silny i selektywny do dalszego opracowywania leków.

Gdy lek przeciwwirusowy nie wykazywał jawnej toksyczności in vitro, a jednocześnie zapobiegał indukowanemu przez wirusa CPE i produktywnemu cyklowi życia wirusa, ważne jest scharakteryzowanie jego MoA2. Rozpoczęliśmy taką charakterystykę, przeprowadzając test ToA w celu określenia możliwych etapów cyklu życiowego wirusa, na który ma wpływ lek przeciwwirusowy. Ogólnie rzecz biorąc, związki przeciwwirusowe dodawano do komórek w różnym czasie przed lub po infekcji wirusowej. Gdyby leki przeciwwirusowe zostały dodane do zakażonych komórek po ich docelowym etapie w trakcie infekcji, skutkowałoby to niższą aktywnością w porównaniu z tym, który został dodany przed etapem. W związku z tym badanie ToA ma kluczowe znaczenie dla określenia skuteczności przeciwwirusowej związku i jego potencjalnego celu, zarówno w cyklu życiowym wirusa, jak i w maszynerii gospodarza zaangażowanej w cykl życia wirusa.

Dla wszystkich trzech testów, żywotność komórek została określona za pomocą zestawu KTG zgodnie z instrukcją producenta5. Ten system detekcji generuje odpowiednie sygnały luminescencyjne, które mogą być analizowane za pomocą różnych wewnętrznych programów. Każdy test został zwalidowany i przeprowadzony co najmniej w trzech egzemplarzach z ośmioma replikami. Dla wszystkich uzyskanych danych przeanalizowano trzy parametry, w tym wartość średnią (AVE), odchylenie standardowe (STDEV) i zmienność współczynnika (CV) w celu określenia wiarygodności testu. Po określeniu solidności testu, dane będą dalej analizowane i wykreślane przy użyciu różnych narzędzi biostatycznych i graficznych2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Komórki, wirus i związki przeciwwirusowe

  1. Utrzymuj komórki BSR, pochodną komórek nerki chomika (BHK)10, w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 5% płodowej surowicy cielęcej (FCS), 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.
  2. Dla wszystkich trzech testów, komórki płytki w DMEM z 1% FCS, 100U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny, jak zoptymalizowano wcześniej5. To podłoże jest określane jako pożywka testowa dla wszystkich trzech testów.
  3. Inkubować wszystkie komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i wilgotności 80-95%.
  4. Oczyszczanie płytki nazębnej i rozmnażanie BTV typu 10 (BTV-10), jak opisano wcześniej8. Rozcieńczyć BTV-10 w pożywce testowej dla każdego wyznaczonego testu.
  5. Rozpuścić wszystkie badane związki w DMSO, aby utworzyć materiał podstawowy o stężeniu 10 mM. Przechowywać zapasy w temperaturze -20 °C.
  6. Rozcieńczyć związki do pożądanych stężeń przy użyciu pożywki do oznaczania dla wyznaczonych testów2.

2. Test oparty na CPE przy użyciu zestawu KTG

  1. Wysiewaj komórki BSR na 384-dołkową mikropłytkę (; format 16 x 24) za pomocą dozownika MicroFlo select. Gęstość wysiewu wynosi 5,000 komórek/dołek, a objętość wysiewu wynosi 20 μl do analizy skuteczności przeciwwirusowej.
  2. Inkubuj komórki przez 2-3 godziny, aż komórki dokładnie przylgną do płytki.
  3. Do każdego dołka dodać związek przeciwwirusowy o końcowym stężeniu 10 μM. Całkowicie wymieszaj.
  4. Rozcieńczyć BTV do pożądanego miana i dodać 5 μl BTV z oznaczonym MOI do każdego dołka. Do studzienki kontrolnej dodać 5 μl pożywki do oznaczania. Inkubować zakażone komórki przez 72 godziny w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i wilgotności 80-95%.
  5. W temperaturze 72 h.p.i. rozmrozić i zrównoważyć bufor CTG i liofilizowany substrat CTG do temperatury pokojowej przed użyciem. Rozpuść jednorodny roztwór odczynnika KTG, mieszając liofilizowany enzym/substrat i odczynnik buforowy zgodnie z instrukcjami producenta.
  6. Wyrównać płytki testowe do temperatury pokojowej przez 15 minut.
  7. Dodać równą objętość (25 μl) odczynników KTG do każdej studzienki za pomocą dozownika. Po inkubacji przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności zmierz sygnały luminescencji za pomocą czytnika wielomodowego o czasie integracji 0,1 sek.

3. Test dawka-odpowiedź

  1. Umieść komórki BSR na 384-dołkowej mikropłytce (czarnej; format 16 x 24) za pomocą dozownika, o gęstości wysiewu 5 000 komórek/basenik w objętości wysiewu odpowiednio 20 μl dla testu skuteczności przeciwwirusowej i 25 μl dla testu cytotoksyczności.
  2. Inkubować komórki przez 2-3 godziny w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i wilgotności 80-95%, aż komórki będą dobrze przyczepione do płytki.
  3. Przeprowadzić test na ćwiartce obszaru płytki 384-dołkowej dla każdego związku (co odpowiada płytce 96-dołkowej), jak pokazano w tabeli 1. Przydzielić osiem powtórzeń dla każdego stężenia w jednym teście. Pierwszą kolumnę należy przypisać jako kontrolę pozytywną bez dodawania związku i wirusa, a ostatnią kolumnę (12.część) jako kontrolę ujemną poprzez dodanie samego wirusa bez związków.
  4. Rozcieńczyć związki do 50 μM w pożywce testowej i dodać do 2. kolumny w stężeniu 20 μl/basenik w celu oznaczenia skuteczności przeciwwirusowej. Wymieszaj związek pięciokrotnie za pomocą 8-kanałowej pipety półautomatycznej do stężenia 25 μM.
  5. Za pomocą 8-kanałowej pipety półautomatycznej przenieść mieszaninę 20 μl z 2. kolumny do następnej kolumny (3. kolumny), dobrze wymieszać, aby uzyskać stężenie 12,5 μM. Powtórzyć ten proces, przenosząc mieszaninę 20 μl z 3. kolumny do następnej kolumny (4. kolumny), aby utworzyć kolejne dwukrotne rozcieńczenie o stężeniu 6,25 μM. Powtórzyć to dwukrotne seryjne rozcieńczanie aż do 11. kolumny. Odessać i wyrzucić 20 μl mieszaniny do 11. kolumny po dodaniu i wymieszaniu związku.
  6. Dodać BTV-10, w oparciu o MOI 0,01, do każdego dołka od kolumny 2 do kolumny 11 o objętości 5 μl/basenik. Po dodaniu wirusa końcowe stężenie związku w każdej kolumnie powinno wynosić: 20 μM w kolumnie 2, 10 μM w kolumnie 3 i kontynuować dwukrotne rozcieńczenie do kolumny 11 o końcowym stężeniu 0,04 μM.
  7. Dodać 5 μl pożywki do kolumny 1 jako kontrolę tylko komórek (dodatnia) i 5 μl/basenik BTV do kolumny 12 jako kontrola tylko zakażenia BTV (ujemna).
  8. Rozcieńczyć związki do początkowego stężenia 200 μM do badania cytotoksyczności. Podobnie, dodać 25 μl/studzienkę związku do kolumny 2 i wymieszać 5x z 8-kanałową pipetą półautomatyczną do stężenia 100 μM. Nie dodawaj BTV.
  9. Przeprowadzić dwukrotne rozcieńczenie seryjne przez zasysanie 25 μl z kolumny 2 do sąsiedniej kolumny 3 i kontynuować do ostatniej kolumny (12μl). W kolumnie 12, po wymieszaniu, odessać i odrzucić 25 μl mieszaniny. Końcowe stężenie w kolumnie 2 powinno wynosić 100 μM, a w 12. kolumnie 0,2 μM. Kolumna 1 to formant tylko w komórce.
  10. Zarówno w przypadku testów skuteczności przeciwwirusowej, jak i cytotoksyczności, inkubować płytki w temperaturze 37 °C, z 5% CO2 i wilgotnością 80-95% przez 72 godziny po zabiegu. Zmierz żywotność komórek za pomocą zestawu KTG, jak opisano powyżej (kroki protokołu 2.5-2.7).

4. Test czasu dodania (ToA)

  1. Komórki BSR należy wysiać z kolumny 1-24 na mikropłytce 384-dołkowej (; format 16 x 24) przez dozownik przy 5 000 komórek/dołku, a objętość wysiewu wynosi 15 μl/dołek.
  2. Dla każdego związku wykorzystaj wszystkie dwadzieścia cztery kolumny z ośmioma replikami dla każdego punktu czasowego w połowie płytki 384-dołkowej (Tabela 2). Przypisz kolumnę 1 jako kontrolę tylko komórek, dodając 10 μl/dołek pożywki do oznaczania. Oznaczyć kolumnę 24 jako kontrolę tylko zakażenia wirusem BTV (kontrola ujemna) poprzez dodanie 5 μl/dostojnika i 5 μl/basenik wirusa w MOI 0,01 do końcowej objętości 25 μl/basenik.
  3. Wybierz kolumny parzyste z kolumn 2-22 jako kolumnę oceny skuteczności przeciwwirusowej w różnych godzinach po zakażeniu (hpi). W tych kolumnach należy zainfekować komórki 5 μl/dołek BTV przy MOI 0,01. Przy różnych h.p.i. dodaj również 5 μl / dobrze rozcieńczony związek do każdej studzienki, aby uzyskać końcową objętość 25 μl / studzienkę. Dla oznaczonych -2 i -1 h.p.i. dodać związek do komórek BSR przed zakażeniem BTV. Dla 0 hpi dodać związek i BTV do kultury jednocześnie.
  4. Równolegle oznacz kolumny o numerach nieparzystych z kolumny 3-23 jako kontrole tylko złożone, z których złożone zostały dodane w różnych punktach czasowych zgodnie z oznaczeniem (-2, -1, 0, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 48 hpi). W tych kolumnach dodać 5 μl/basenik pożywki do oznaczania i 5 μl/dobrze rozcieńczony związek, aby uzyskać końcową objętość 25 μl/basenik.
  5. Po zabiegu inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przy wilgotności 80-95%.
  6. Określ żywotność ogniwa przy 72 h.p.i. za pomocą zestawu CellTiter-Glo, jak opisano wcześniej (kroki protokołu 2.5-2.7).

5. Analiza danych

  1. Najpierw przetwarzaj wszystkie dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania opartego na sygnałach luminescencyjnych uzyskanych przez czytnik wielomodowy. Określić wartość średnią (średnią), odchylenie standardowe (STDEV) dla każdego zabiegu, jak również zmiany współczynnika (CV), które wymagają wartości nie większej niż 10%.
  2. Przenieś przetworzone dane z powyższego oprogramowania do biostatycznego i graficznego narzędzia programowego. Przeprowadzić analizę regresji nieliniowej w celu wyznaczenia wartości EC50 i CC50.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

1. Skuteczność przeciwwirusowa związku

Test CPE oparty na komórkach został opracowany, zoptymalizowany i zwalidowany in vitro przy użyciu zestawu KTG opartego na luminescencji do identyfikacji nowych leków przeciwwirusowych przeciwko BTV, jak opisano wcześniej2,5. Test odpowiedzi na dziesięć dawek zastosowano w celu odzwierciedlenia skuteczności przeciwwirusowej i cytotoksyczności zidentyfikowanego związku wiodącego poprzez pomiar liczby metabolicznie żywotnych komórek w hodow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Jednym z kluczowych etapów odkrywania i opracowywania leków przeciwwirusowych jest opracowanie solidnych testów, które obejmują wybór mierzalnego markera, opracowanie prostego protokołu, uzyskanie wystarczającej liczby sygnałów i mniej niż 10% CV. Większość badań przesiewowych biochemicznych lub komórkowych jest zaprojektowana tak, aby zapewnić chemiczny punkt wyjścia oparty na najbardziej solidnym, prostym i niedrogim teście, ze względu na wymaganą odtwarzalność w procesie przesiewowym i potencjalnie dużą liczbę cząstec...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ten projekt był wspierany przez granty 1R03MH08127-01 i 7R03MH08127-02 od NIH dla Q. Li, oraz przez fundusze IMPACT z Wydziału Medycyny UAB dla Q. Li. Wsparcie z Molette Fund i Auburn University jest mile widziane. Dziękujemy również za pomoc techniczną ze strony Pani Pulin Che i Pana Wołodymyra Musiienko w trakcie prac.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pożywka DMEMGibco1134218Do hodowli komórkowych
FBSGibco16000044Do hodowli komórkowych
0,05% Trypsyna-EDTAGibco1000185Do hodowli komórkowych
DPBSGbico1049769Do hodowli komórkowych
Zestaw CellTiter-Glo (KTG)PromegaTB288Do pomiaru żywotności komórek
70% etanolFisherS25309BRozcieńczony od 95%
Przeciwwirusowe związki huashilNIH MLSMR i synteza
BTV-10ATCCVR-187
BSR Opracowanywe własnym zakresie
wielomodowy czytnik mikropłytek Synergy-IIBioTekDo odczytu sygnału luminescencyjnego
DozownikMicroFlo selectBioTekDodawanie komórek, wirusów i odczynników
384-dołkowa mikropłytka płaskodennaCORNING28908031Do hodowli komórkowych
Gen. 5 oprogramowanieBioTekDo analizy wyników odczytu z wielomodowego czytnika mikropłytek Synergy-II
GraphPad Prism 5GraphPadVersion 5Do analizy biostatycznej i wykresu
de novo

Bibliografia

  1. Hemati, B., et al. Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph. J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).
  2. Gu, L., et al. Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus. PLoS ONE. 7, e43341(2012).
  3. Meiswinkel, R., et al. The 2006 outbreak of bluetongue in northern Europe--the entomological perspective. Prev. Vet. Med. 87, 55-63 (2008).
  4. Szmaragd, C., et al. Mortality and case fatality during the recurrence of BTV-8 in northern Europe in 2007. Vet. Rec. 161, 571-572 (2007).
  5. Li, Q., Maddox, C., Rasmussen, L., Hobrath, J. V., White, L. E. Assay development and high throughput antiviral drug screening against Bluetongue virus. Antiviral Research. 83, 267-273 (2009).
  6. Noah, J. W., et al. A cell-based luminescence assay is effective for high-throughput screening of potential influenza antivirals. Antiviral Res. 73, 50-59 (2007).
  7. Che, P., Wang, L., Li, Q. The development, optimization and validation of an assay for high throughput antiviral drug screening against Dengue virus. Int. J. Clin. Exp. Med. 2, 363-373 (2009).
  8. Li, Q., Li, H., Blitvich, B. J., Zhang, J. The Aedes albopictus inhibitor of apoptosis 1 gene protects vertebrate cells from bluetongue virus-induced apoptosis. Insect Mol. Biol. 16, 93-105 (2007).
  9. Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell number. J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).
  10. Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
  11. Phillips, T., Jenkinson, L., McCrae, C., Thong, B., Unitt, J. Development of a high-throughput human rhinovirus infectivity cell-based assay for identifying antiviral compounds. J. Virol. Methods. 173, 182-188 (2011).
  12. Harvey, T. J., et al. Tetracycline-inducible packaging cell line for production of flavivirus replicon particles. J. Virol. 78, 531-538 (2004).
  13. Puig-Basagoiti, F., et al. High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 4980-4988 (2005).
  14. Puig-Basagoiti, F., et al. Triaryl pyrazoline compound inhibits flavivirus RNA replication. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 1320-1329 (2006).
  15. Duan, M., et al. In vitro and in vivo protection against the highly pathogenic H5N1 influenza virus by an antisense phosphorothioate oligonucleotide. Antivir. Ther. 13, 109-114 (2008).
  16. Ray, D., Shi, P. Y. Recent advances in flavivirus antiviral drug discovery and vaccine development. Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 1, 45-55 (2006).
  17. Severson, W. E., et al. High-throughput screening of a 100,000-compound library for inhibitors of influenza A virus (H3N2). J. Biomol. Screen. 13, 879-887 (2008).
  18. Severson, W. E., et al. Development and validation of a high-throughput screen for inhibitors of SARS CoV and its application in screening of a 100,000-compound library. J. Biomol. Screen. 12, 33-40 (2007).
  19. Bolken, T. C., et al. Identification and characterization of potent small molecule inhibitor of hemorrhagic fever New World arenaviruses. Antivir. Res. 69, 86-97 (2006).
  20. Van Loock, M., et al. A novel high-throughput cellular screening assay for the discovery of HIV-1 integrase inhibitors. J. Virol. Methods. 179, 396-401 (2012).
  21. Kampmann, T., et al. In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses. Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).
  22. Kirchmair, J., et al. Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques. Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test oparty na CPEtest zależności dawka-odpowiedźtest czasu dodaniaefekt cytopatycznytest żywotności komórekprzesiewy przeciwwirusowewyznaczanie EC50pomiar CC50mechanizm działania
Testy do identyfikacji nowych leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi choroby niebieskiego języka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.