Trzy testy, w tym test oparty na działaniu cytopatycznym (CPE), test dawka-odpowiedź i test czasu dodania (ToA) zostały opracowane, zoptymalizowane, zatwierdzone i wykorzystane do identyfikacji nowych leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi choroby niebieskiego języka (BTV), a także do określenia możliwego mechanizmu działania (MoA) dla nowo zidentyfikowanych leków przeciwwirusowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Testy do identyfikacji nowych leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi choroby niebieskiego języka
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Aby zidentyfikować potencjalne leki przeciwwirusowe przeciwko BTV, opracowaliśmy, zoptymalizowaliśmy i zwalidowaliśmy trzy przedstawione tutaj testy. Test oparty na CPE był pierwszym testem opracowanym w celu oceny, czy związek wykazał jakąkolwiek skuteczność przeciwwirusową i został wykorzystany do badań przesiewowych dużej biblioteki związków. Tymczasem cytotoksyczność leków przeciwwirusowych można również ocenić za pomocą testu opartego na CPE. Test dawka-odpowiedź został zaprojektowany w celu określenia zakresu skuteczności wybranego leku przeciwwirusowego, tj. 50% stężenia hamującego (IC50) lub stężenia skutecznego (EC50), a także zakresu jego cytotoksyczności (CC50). Test ToA został wykorzystany we wstępnym badaniu MoA w celu określenia mechanizmu leżącego u podstaw nowych leków przeciwwirusowych podczas cyklu życia wirusa BTV lub możliwego wpływu na maszynerię komórkową gospodarza. Testy te mają zasadnicze znaczenie dla oceny skuteczności przeciwwirusowej w systemie hodowli komórkowej i zostały wykorzystane w naszych ostatnich badaniach, które doprowadziły do identyfikacji wielu nowych leków przeciwwirusowych przeciwko BTV.
Wprowadzenie
BTV to prototyp dwuniciowego wirusa RNA z rodzaju Orbivirus, rodziny Reoviridae. BTV jest jedną z najważniejszych chorób zwierząt gospodarskich, w tym owiec, kóz, bydła i innych zwierząt domowych, powodującą straty w wysokości 3 miliardów dolarów rocznie na całym świecie1,2. Egzotyczny serotyp BTV jest ważnym patogenem zwierzęcym wymienionym w raporcie USDA "Patogeny zwierząt gospodarskich o wysokiej konsekwencji". Ostatnio ponowne pojawienie się BTV spowodowało poważny wybuch epidemii choroby u bydła i owiec w kilku krajach Europy Północnej3,4. Ze względu na swoje znaczenie gospodarcze i jako system modelowy, wirus BTV stał się....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Komórki, wirus i związki przeciwwirusowe
- Utrzymuj komórki BSR, pochodną komórek nerki chomika (BHK)10, w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 5% płodowej surowicy cielęcej (FCS), 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.
- Dla wszystkich trzech testów, komórki płytki w DMEM z 1% FCS, 100U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny, jak zoptymalizowano wcześniej5. To podłoże jest określane jako pożywka testowa dla wszystkich trzech testów.
- Inkubować wszystkie komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i wilgotności 80-95%.
- Oczyszczanie płytki n....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
1. Skuteczność przeciwwirusowa związku
Test CPE oparty na komórkach został opracowany, zoptymalizowany i zwalidowany in vitro przy użyciu zestawu KTG opartego na luminescencji do identyfikacji nowych leków przeciwwirusowych przeciwko BTV, jak opisano wcześniej2,5. Test odpowiedzi na dziesięć dawek zastosowano w celu odzwierciedlenia skuteczności przeciwwirusowej i cytotoksyczności zidentyfikowanego związku wiodącego poprzez pomiar liczby metabolicznie żywotnych komórek w hodow.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Jednym z kluczowych etapów odkrywania i opracowywania leków przeciwwirusowych jest opracowanie solidnych testów, które obejmują wybór mierzalnego markera, opracowanie prostego protokołu, uzyskanie wystarczającej liczby sygnałów i mniej niż 10% CV. Większość badań przesiewowych biochemicznych lub komórkowych jest zaprojektowana tak, aby zapewnić chemiczny punkt wyjścia oparty na najbardziej solidnym, prostym i niedrogim teście, ze względu na wymaganą odtwarzalność w procesie przesiewowym i potencjalnie dużą liczbę cząstec.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ten projekt był wspierany przez granty 1R03MH08127-01 i 7R03MH08127-02 od NIH dla Q. Li, oraz przez fundusze IMPACT z Wydziału Medycyny UAB dla Q. Li. Wsparcie z Molette Fund i Auburn University jest mile widziane. Dziękujemy również za pomoc techniczną ze strony Pani Pulin Che i Pana Wołodymyra Musiienko w trakcie prac.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pożywka DMEM | Gibco | 1134218 | Do hodowli komórkowych |
| FBS | Gibco | 16000044 | Do hodowli komórkowych |
| 0,05% Trypsyna-EDTA | Gibco | 1000185 | Do hodowli komórkowych |
| DPBS | Gbico | 1049769 | Do hodowli komórkowych |
| Zestaw CellTiter-Glo (KTG) | Promega | TB288 | Do pomiaru żywotności komórek |
| 70% etanol | Fisher | S25309B | Rozcieńczony od 95% |
| Przeciwwirusowe związki huashil | NIH MLSMR i synteza | ||
| BTV-10 | ATCC | VR-187 | |
| BSR Opracowany | we własnym zakresie | ||
| wielomodowy czytnik mikropłytek Synergy-II | BioTek | Do odczytu sygnału luminescencyjnego | |
| Dozownik | MicroFlo selectBioTek | Dodawanie komórek, wirusów i odczynników | |
| 384-dołkowa mikropłytka płaskodenna | CORNING | 28908031 | Do hodowli komórkowych |
| Gen. 5 oprogramowanie | BioTek | Do analizy wyników odczytu z wielomodowego czytnika mikropłytek Synergy-II | |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | Version 5 | Do analizy biostatycznej i wykresu |
Bibliografia
- Hemati, B., et al. Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph. J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).
- Gu, L., et al. Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus. PLoS ONE. 7, e43341(2012).
- Meiswinkel, R., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
