Artykuł metodologiczny

Odpowiedź optokinetyczna jako ilościowa miara ostrości wzroku u danio pręgowanego

22.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50832

⸱

9 października 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Optometry, Western University of Health Sciences, 2Molecular Neurobiology Group, Western University of Health Sciences, 3Graduate College of Biomedical Sciences, Western University of Health Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Danio pręgowany były cennym narzędziem w wielu obszarach badawczych. Tutaj demonstrujemy metodę wywoływania reakcji wzrokowej i obliczania funkcjonalnej ostrości wzroku u dorosłego danio pręgowanego.

Streszczenie

Danio pręgowany to sprawdzony model do badań nad wzrokiem, jednak wiele wcześniejszych metod skupiało się na larwach ryb lub wykazywało prostą odpowiedź. Ostatnio zainteresowanie wzbudziły zachowania wzrokowe dorosłych ryb danio pręgowanego, ale nowe są metody pomiaru konkretnych reakcji. Aby wypełnić tę lukę, postanowiliśmy opracować metodologię wielokrotnego i dokładnego wykorzystania odpowiedzi optokinetycznej (OKR) do pomiaru ostrości wzroku u dorosłych danio pręgowanych. Tutaj pokazujemy, że ostrość wzroku dorosłego danio pręgowanego można zmierzyć, w tym zarówno ostrość lornetkową, jak i jednooczną. Ponieważ ryba nie jest uszkadzona podczas zabiegu, ostrość wzroku może być mierzona i porównywana w krótkich lub długich okresach czasu. Opisane tutaj pomiary ostrości wzroku można również wykonać szybko, co pozwala na uzyskanie dużej przepustowości i w razie potrzeby na dodatkowe zabiegi wzrokowe. Ten rodzaj analizy sprzyja badaniom interwencji lekowej lub badaniom progresji choroby.

Wprowadzenie

Chociaż OKR okazał się dość przydatny w badaniach nad larwami danio pręgowanego, inne metody zachowania wizualnego były stosowane u dorosłych danio pręgowanych z różnym skutkiem. Test reakcji ucieczki wykazał, że danio pręgowany albinos i rubinowy, oba mutanty pigmentacyjne, mają zmniejszone reakcje wzrokowe w warunkach jasnego światła11,12. Ten sam test reakcji ucieczki z powodzeniem zidentyfikował również mutantów ślepoty nocnej, choć w wieku 2 lat13. Jednak test reakcji ucieczki nie jest pozbawiony wad. Trudno jest przypisać dokładną funkcję wzrokową i jest to tylko przybliżenie zmian wizualnych - co oznacza, że potrzeba dużej zmiany, zanim zmiana zostanie zidentyfikowana.

Inną metodą, która została opracowana do identyfikacji dorosłych ryb pręgowanych z wadami wzroku, jest reakcja optomotoryczna (OMR)11. W tym teście ryby umieszcza się w okrągłym zbiorniku z nieprzezroczystą kolumną pośrodku. Czarno-białe paski obracają się wokół zbiornika, a ryba ma za zadanie pływać w kierunku ruchu pasków. Podobnie jak reakcja ucieczki, OMR koncentruje się na zdolnościach wzrokowo-motorycznych dorosłego danio pręgowanego. Jest jednak z powodzeniem stosowany do identyfikacji ryb z wadami wzroku, takich jak mutanty lrp2/bugeye 14. Danio pręgowany lrp2/bugeye wykazuje buphthalmos, podwyższone ciśnienie wewnątrzgałkowe, zmniejszone OMR i postępujące zwyrodnienie siatkówki14,15.

Wiele badań wykorzystywało zdolności wzrokowo-motoryczne u dorosłych ryb pręgowanych, które często są subiektywne i nie mogą być analizowane ilościowo. Korzystając z OKR, można bardziej obiektywnie badać ostrość wzroku dorosłych ryb. Zbudowaliśmy własne urządzenie OKR, wzorowane na tym, które początkowo służyło do badań larwalnych1. W tym badaniu pokazujemy, że OKR można wykorzystać do obliczenia ostrości wzroku zarówno monocznej, jak i obuocznej u danio pręgowanego.

Protokół

Wszystkie procedury hodowli zwierząt oraz eksperymenty powinny zostać zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi określonymi przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) odpowiedniej instytucji lub innymi wymogami prawnymi.

1. Opieka nad danio-ostrobramkowym

  1. Utrzymywać danio pręgowane w standardowych warunkach w temperaturze 28.5 °C przy cyklu 10 h ciemności i 14 h światła16.
  2. Przechowywać dorosłe danio pręgowane przy zagęszczeniu około 3 ryb/L.

2. Odpowiedź optokinetyczna (OKR)

  1. Zbuduj niestandardowe urządzenie do rejestracji OKR, wykorzystując obracający się bęben o średnicy 14,5 cm, stereomikroskop z regulacją natężenia światła (300-8 000 luksów) oraz komputer (Rysunek 1a).
    1. Do mikroskopu podłącz kamerę, która zapewni podgląd na żywo na sąsiednim monitorze oraz umożliwi przechwytywanie i nagrywanie obrazu.
    2. Steruj obracającym się bębnem za pomocą mikrokontrolera połączonego z komputerem, co pozwoli na wybór różnych prędkości i kierunków obrotu.
  2. Zanurz rybę w 0,016% roztworze tricainy na 2-3 min w celu znieczulenia, a następnie umieść ją na małej platformie tak, aby oczy i skrzela wystawały poza krawędź.
  3. Połóż cienką gąbkę lub ręcznik na ciele ryby i przymocuj nad nią 2-3 kawałki pianki, ukształtowane tak, aby dopasować się do ryby i unieruchomić ją. Ograniczenie ruchu ogona okazało się kluczowym aspektem unieruchomienia bez powodowania obrażeń ryby, co najlepiej osiągnięto za pomocą płaskiego kawałka pianki. (Rysunek 1b)
  4. Umieść rybę w cylindrycznym zbiorniku wypełnionym wodą, który mieści się wewnątrz obracającego się bębna urządzenia do rejestracji OKR. Użyj magnesów na platformie, aby ustawić rybę pionowo, tak aby oczy znajdowały się w odległości ok. 7,3 cm od krawędzi bębna. Ryba powinna dojść do siebie po znieczuleniu w ciągu kilku minut – odnowi się prawidłowy oddech i powinny pojawić się przypadkowe ruchy gałek ocznych.
  5. Włóż do obracającego się bębna kratkę bazową o częstotliwości 0,07 cykli na stopień (cpd) i uruchom sterowanie komputerowe, aby rozpocząć obrót i przechwytywanie wideo (w niniejszej pracy zastosowano prędkość 12 rpm, jednak prędkości od 8-16 rpm powinny dać podobne wyniki).
  6. Po wywołaniu początkowego OKR przez kratkę bazową, krótko zatrzymaj obrót i zastąp kratkę mniejszą (o wyższej częstotliwości przestrzennej).
  7. Powtarzaj ten proces, aż OKR nie będzie już możliwy do wywołania. Przeprowadź ponowny test z najmniejszą kratką, która wywołała OKR, stosując zmodyfikowaną metodę schodkową, a następnie powtórz próbę z kratką, która nie wywołała reakcji, aby zweryfikować utratę OKR. Proces ten można powtórzyć w celu potwierdzenia rzeczywistej odpowiedzi na najmniejszą wykrywalną kratkę, jeśli końcowa kratka różniła się od tej z pierwszego zdarzenia wygaszenia odpowiedzi.
  8. Wykonaj pomiary ostrości widzenia monokularnego, umieszczając czarny plastikowy przesłoniacz nad paskami sąsiadującymi z przeciwnym okiem. Powtórz powyższą procedurę (kroki 2.6-2.7).
  9. Wyznacz ostrość widzenia przeciwnego oka, zmieniając położenie przesłoniacza i ponownie powtarzając kroki 2.6-2.7.
  10. Zapisz odległość każdego oka od pasków podczas procedury testowej, korzystając z referencyjnej taśmy pomiarowej znajdującej się pod zbiornikiem z rybą, aby w kolejnych krokach można było obliczyć dokładne wartości ostrości widzenia.

3. Obliczanie ostrości wzroku

  1. Wyznacz ostrość wzroku poprzez obliczenie cpd: Równanie matematyczne dla optyki, formuła: 1/2tan⁻¹(h/2a), schemat koncepcyjny. gdzie a to odległość od środka soczewki do siatki, a h to długość jednego cyklu najmniejszej siatki, przy której zaobserwowano OKR (Rysunek 1c).
  2. W przypadku połączonych pomiarów ostrości wzroku stosuje się średnią wartość a dla oka lewego i prawego.

Wyniki

Funkcjonalność urządzenia OKR

Urządzenie OKR, opisane powyżej i przedstawione na Rysunku 1, funkcjonuje przy minimalnej konserwacji. Jak zaznaczono w kroku 2.3, unieruchomienie ogona jest kluczowe dla utrzymania ryby w pozycji ograniczonej podczas rejestracji. Po odpowiednim unieruchomieniu ryba może pozostać w urządzeniu OKR przez dłuższy czas. W związku z tym należy zachować szczególną staranność podczas wstępnych etapów unieruchamiania, aby umożliwić zebranie większej ilości danych dla każdej poszczególnej ryby.

Pomiary ostrości wzroku

Binokularna OKR jest łatwo wywoływana u zdrowych dorosłych ryb. Postępując zgodnie z powyższą procedurą, można określić ostrość wzroku u danio pręgowanych w różnym wieku (Rycina 2). Najlepsza zarejestrowana przez nas binokularna ostrość przestrzenna wyniosła 0,74 cpd. Jak zaznaczono na Rycynie 2, binokularna ostrość wzroku zazwyczaj wzrasta wraz z wiekiem (n=46; p = 0,002 ANOVA przy użyciu SPSS v14), ale stabilizuje się po około 12 miesiącach życia. Porównując zmierzoną ostrość wzroku u 5-miesięcznych ryb typu dzikiego z rybami lrp2/bugeye w tym samym wieku, stwierdzono, że ryby lrp2/bugeye wykazywały znacznie niższą ostrość wzroku (p < 0,001; typ dziki: 0,49±0,05 cpd; n=8; lrp2/bugeye: 0,35±0,06; n=10; test t Studenta przy użyciu Excela).

Poprzez zasłonięcie prawego oka można określić ostrość widzenia lewego oka i na odwrót. W porównaniu z ostrością widzenia binokularnego, obserwuje się sumację binokularną podobną do tej występującej u ludzi17 (Rysunek 3). Ostrość widzenia binokularnego była zazwyczaj o 5-10% lepsza niż ostrość widzenia zmierzona niezależnie dla oka prawego (OD) lub lewego (OS). U niektórych osobników różnica ta wynosiła 25% poprawy.

Układ mikroskopowy z kratką częstotliwości przestrzennej; schemat przedstawia obrotowy bęben, kontrolę światła.
Rysunek 1. Rejestracja OKR. A>) Urządzenie OKR składa się z obrotowego bębna o średnicy 14,5 cm oraz mikroskopu z regulowanymi ustawieniami natężenia światła (300-8 000 lux). Kamera zapewnia podgląd na żywo na sąsiednim monitorze. Obrotowy bęben posiada różne ustawienia prędkości w obu kierunkach (zgodnie i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara), a wymienne kratki częstotliwości przestrzennej są wkładane i wyjmowane w zależności od potrzeb. B>) Ryby są unieruchamiane i umieszczane w centrum obrotowego bębna. C>) Liczbę cykli na stopień (cpd) oblicza się, stosując wzór cpd=Wzór równowagi statycznej, 1/(2 tan⁻¹(h/2a)), równanie matematyczne do badań fizycznych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Wykres rozrzutu ostrości wzroku w zależności od wieku, pokazujący zmiany cykli/stopnia w zależności od miesięcy u niemowląt, wykres.
Rycina 2. Zmiany ostrości wzroku wraz z wiekiem. Wykres przedstawia niezależne pomiary ostrości wzroku dokonane w wieku od 5 do 15 miesięcy. Ostrość wzroku zazwyczaj wzrasta w ciągu pierwszego roku rozwoju, a następnie nieco spada w 15. miesiącu życia (p = 0.002 ANOVA przy użyciu SPSS v14). Każdy punkt może reprezentować jedną lub kilka ryb. Ostrość wzroku jest mierzona w cyklach/stopień (cpd). (n = 46 łącznie; 8 w 5. miesiącu; 4 w 6. miesiącu; 7 w 8. miesiącu; 6 w 9. miesiącu; 11 w 10. miesiącu; 2 w 11. miesiącu; 2 w 12. miesiącu oraz 6 w 15. miesiącu). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Sumowanie ostrości wzroku obuocznego, wykres słupkowy, przedstawiający porównanie cykli na stopień, OU, OD, OS.
Rycina 3. Efekt sumowania ostrości wzroku obuocznego. Ostrość wzroku obuoczna (OU) jest zazwyczaj wyższa w porównaniu do ostrości wzroku oka prawego (OD) lub lewego (OS). W tej konkretnej grupie ostrość wzroku OS była znacząco niższa. (* p=0.006, N=8) Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Dyskusja

Czasami ryby mogą uciec do zbiornika wodnego. Bardzo ważne jest unieruchomienie ogona. Ponadto stwierdzono również, że użycie cienkiej gąbki/ręcznika na ciele ryby jest nieocenione w utrzymywaniu ryby w zawieszeniu przez dłuższy czas. Dzięki tej procedurze byliśmy w stanie utrzymać ryby w stanie unieruchomienia przez ponad 30 minut bez szkody dla ryb. Taka ilość czasu jest więcej niż wystarczająca do wykonania lornetki i obu ostrości monokularowych.

Prezentacja kraty może być wykonana zgodnie z opisem tutaj i gdzie indziej za pomocą fizycznie obracającego się bębna lub poprzez przedstawienie wyświetlacza cyfrowego18-22. Oba typy mają określone zalety i wady. Zdecydowaliśmy się na fizyczną rotację zarówno ze względu na koszty, jak i specyfikację techniczną. Wyłączając komputer i sprzęt do obrazowania, opisane tutaj urządzenie OKR można zbudować za około 150 USD.

OKR jest obiektywnym sposobem określania ostrości wzroku u dorosłych danio pręgowanego. Podczas gdy kilka innych testów wzrokowo-motorycznych wzroku zostało wykorzystanych w poprzednich eksperymentach, a nawet elektroretinogram został z powodzeniem wykonany w oczach dorosłego danio pręgowanego, chociaż nie był intensywnie wykorzystywany, OKR dorosłego danio pręgowanego otwiera drzwi do wielu nowych warunków eksperymentalnych22. Badanie to wykazało użyteczność OKR w pomiarze zmian ostrości wzroku w czasie, identyfikacji różnic w ostrości wzroku w modelach chorób oczu oraz w określaniu jednoocznej ostrości wzroku.

Co ciekawe, wzrok dorosłego danio pręgowanego w porównaniu ze wzrokiem człowieka (20/20) wynosi około 20/1,000 (gdy 0,60 cpd jest konwertowane na -0,3 logMAR). Chociaż może się to wydawać słabe, oczy danio pręgowanego są bardzo dobrze przystosowane do środowiska, w którym żyje. Pomimo wizualnego zadania polegającego na patrzeniu przez 6,5 cm wody, kilka milimetrów poliwęglanu i kolejny centymetr powietrza, ryby radzą sobie całkiem nieźle! Odkryliśmy, że ostrość dorosłego danio pręgowanego wynosi około 70% tego, co można by przewidzieć, biorąc pod uwagę odstępy między ich fotoreceptorami. 23 Porównaj to z optymalną wydajnością człowieka ~20/12, która stanowi około 80% przewidywanych 20/10, a technika OKR do pomiaru zdolności wzrokowych u dorosłych ryb pręgowanych jest imponująca24,25.

Technika pomiaru niezależnej ostrości wzroku oka pozwoliłaby na badania, w których jedno oko mogłoby być leczone, a drugie stosowane jako kontrola. Ponadto ryby z asymetrycznym rozwojem gałki ocznej, takie jak lrp2/bugeye lub ryby, u których rozwija się zaćma, mogą być dokładniej monitorowane. Należy zauważyć, że należy zachować ostrożność, aby dokładnie zmierzyć odległość od oczu do pasków i zasłonić pełne pole widzenia. Technika ta powinna otworzyć drzwi do dokładniejszych i bardziej szczegółowych pomiarów funkcji wzrokowych danio pręgowanego.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Finansowanie zapewnione DJC przez Western University of Health Sciences College of Optometry. Specjalne podziękowania dla Irisy Tam za projekt graficzny.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Super Low Light Black White Video Security CameraSuper CircuitsPC164CEX-2 Można użyć dowolnej kamery o słabym oświetleniu
Mikrokontroler Arduino DuemilanoveAdafruit Industries Arduino Uno jest również kompatybilne z oprogramowaniem do kontroli prędkości.
Metanosulfonian trikainyVWR101107-950

Bibliografia

  1. Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10545-10549 (1995).
  2. Neuhauss, S. C., et al. Genetic disorders of vision revealed by a behavioral screen of 400 essential loci in zebrafish. J. Neurosci. 19, 8603-8615 (1999).
  3. Schumann, W. P. The objective determination of visual acuity on the basis of the optokinetic nystagmus. Am. J. Optom. Arch. Am. Acad. Optom. 29, 575-583 (1952).
  4. Gorman, J. J., Cogan, D. G., Gellis, S. S. An apparatus for grading the visual acuity of infants on the basis of opticokinetic nystagmus. Pediatrics. 19, 1088-1092 (1957).
  5. Fulton, A. B., Manning, K. A., Dobson, V. A behavioral method for efficient screening of visual acuity in young infants. II. Clinical application. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 17, 1151-1157 (1978).
  6. Huizinga, E., Van Der Meulen, P. Vestibular rotatory and optokinetic reactions in the pigeon. Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 60, 927-947 (1951).
  7. Tappeiner, C. Visual Acuity and Contrast Sensitivity of Adult Zebrafish. Front. Zool. 9, 10(2012).
  8. Mueller, K. P., Schnaedelbach, O. D., Russig, H. D., Neuhauss, S. C. VisioTracker, an innovative automated approach to oculomotor analysis. J. Vis. Exp. (56), e3556(2011).
  9. Zou, S. Q., et al. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J. Vis. Exp. (36), e1742(2010).
  10. Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Quantitative measurements of the optokinetic response in adult fish. J. Neurosci. Methods. 186, 29-34 (2010).
  11. Li, L., Dowling, J. E. A dominant form of inherited retinal degeneration caused by a non-photoreceptor cell-specific mutation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 11645-11650 (1997).
  12. Ren, J. Q., McCarthy, W. R., Zhang, H., Adolph, A. R., Li, L. Behavioral visual responses of wild-type and hypopigmented zebrafish. Vision Res. 42, 293-299 (2002).
  13. Maaswinkel, H., Mason, B., Li, L. ENU-induced late-onset night blindness associated with rod photoreceptor cell degeneration in zebrafish. Mech. Ageing Dev. 124, 1065-1071 (2003).
  14. Stujenske, J. M., Dowling, J. E., Emran, F. The bugeye mutant zebrafish exhibits visual deficits that arise with the onset of an enlarged eye phenotype. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 4200-4207 (2011).
  15. Veth, K. N. Mutations in zebrafish lrp2 result in adult-onset ocular pathogenesis that models myopia and other risk factors for glaucoma. PLoS Genet. 7, e1001310(2011).
  16. Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edn, University of Oregon Press. (2007).
  17. Cagenello, R., Arditi, A., Halpern, D. L. Binocular enhancement of visual acuity. J. Opt. Soc. Am. A Opt. Image Sci. Vis. 10, 1841-1848 (1993).
  18. Brockerhoff, S. E. Measuring the optokinetic response of zebrafish larvae. Nat. Protoc. 1, 2448-2451 (2006).
  19. Hodel, C., Neuhauss, S. C. Computer-based analysis of the optokinetic response in zebrafish larvae. CSH Protoc. 2008, pdb prot4961(2008).
  20. Huber-Reggi, S. P., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Analysis of optokinetic response in zebrafish by computer-based eye tracking. Methods Mol. Biol. 935, 139-160 (2013).
  21. Tappeiner, C. Visual acuity and contrast sensitivity of adult zebrafish. Front. Zool. 9, 10(2012).
  22. Saszik, S., Bilotta, J. The effects of temperature on the dark-adapted spectral sensitivity function of the adult zebrafish. Vision Res. 39, 1051-1058 (1999).
  23. Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Visual acuity in larval zebrafish: behavior and histology. Front. Zool. 7, 8(2010).
  24. Curcio, C. A., Sloan, K. R., Kalina, R. E., Hendrickson, A. E. Human photoreceptor topography. J. Comp. Neurol. 292, 497-523 (1990).
  25. Kalloniatis, M., Luu, C. Visual Acuity. , (1995).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

dorosłe rybki danio pręgowaneostrość widzenia obuocznegoostrość widzenia jednoocznegoczęstotliwość przestrzennametoda schodkowaobrotowy bębenpomiar stopniowania
Odpowiedź optokinetyczna jako ilościowa miara ostrości wzroku u danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.