Artykuł metodologiczny

Odpowiedź optokinetyczna jako ilościowa miara ostrości wzroku u danio pręgowanego

DOI:

10.3791/50832

⸱

9 października 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Optometry, Western University of Health Sciences, 2Molecular Neurobiology Group, Western University of Health Sciences, 3Graduate College of Biomedical Sciences, Western University of Health Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Danio pręgowany były cennym narzędziem w wielu obszarach badawczych. Tutaj demonstrujemy metodę wywoływania reakcji wzrokowej i obliczania funkcjonalnej ostrości wzroku u dorosłego danio pręgowanego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Danio pręgowany to sprawdzony model do badań nad wzrokiem, jednak wiele wcześniejszych metod skupiało się na larwach ryb lub wykazywało prostą odpowiedź. Ostatnio zainteresowanie wzbudziły zachowania wzrokowe dorosłych ryb danio pręgowanego, ale nowe są metody pomiaru konkretnych reakcji. Aby wypełnić tę lukę, postanowiliśmy opracować metodologię wielokrotnego i dokładnego wykorzystania odpowiedzi optokinetycznej (OKR) do pomiaru ostrości wzroku u dorosłych danio pręgowanych. Tutaj pokazujemy, że ostrość wzroku dorosłego danio pręgowanego można zmierzyć, w tym zarówno ostrość lornetkową, jak i jednooczną. Ponieważ ryba nie jest uszkadzona podczas zabiegu, ostrość wzroku może być mierzona i porównywana w krótkich lub długich okresach czasu. Opisane tutaj pomiary ostrości wzroku można również wykonać szybko, co pozwala na uzyskanie dużej przepustowości i w razie potrzeby na dodatkowe zabiegi wzrokowe. Ten rodzaj analizy sprzyja badaniom interwencji lekowej lub badaniom progresji choroby.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż OKR okazał się dość przydatny w badaniach nad larwami danio pręgowanego, inne metody zachowania wizualnego były stosowane u dorosłych danio pręgowanych z różnym skutkiem. Test reakcji ucieczki wykazał, że danio pręgowany albinos i rubinowy, oba mutanty pigmentacyjne, mają zmniejszone reakcje wzrokowe w warunkach jasnego światła11,12. Ten sam test reakcji ucieczki z powodzeniem zidentyfikował również mutantów ślepoty nocnej, choć w wieku 2 lat13. Jednak test reakcji ucieczki nie jest pozbawiony wad. Trudno jest przypisać dokładną funkcję wzrokową i jest to tylko przybliżenie zmian wizualnych - co oznacza, że potrzeba dużej zmiany, zanim zmiana zostanie zidentyfikowana.

Inną metodą, która została opracowana do identyfikacji dorosłych ryb pręgowanych z wadami wzroku, jest reakcja optomotoryczna (OMR)11. W tym teście ryby umieszcza się w okrągłym zbiorniku z nieprzezroczystą kolumną pośrodku. Czarno-białe paski obracają się wokół zbiornika, a ryba ma za zadanie pływać w kierunku ruchu pasków. Podobnie jak reakcja ucieczki, OMR koncentruje się na zdolnościach wzrokowo-motorycznych dorosłego danio pręgowanego. Jest jednak z powodzeniem stosowany do identyfikacji ryb z wadami wzroku, takich jak mutanty lrp2/bugeye 14. Danio pręgowany lrp2/bugeye wykazuje buphthalmos, podwyższone ciśnienie wewnątrzgałkowe, zmniejszone OMR i postępujące zwyrodnienie siatkówki14,15.

Wiele badań wykorzystywało zdolności wzrokowo-motoryczne u dorosłych ryb pręgowanych, które często są subiektywne i nie mogą być analizowane ilościowo. Korzystając z OKR, można bardziej obiektywnie badać ostrość wzroku dorosłych ryb. Zbudowaliśmy własne urządzenie OKR, wzorowane na tym, które początkowo służyło do badań larwalnych1. W tym badaniu pokazujemy, że OKR można wykorzystać do obliczenia ostrości wzroku zarówno monocznej, jak i obuocznej u danio pręgowanego.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty i hodowla zwierząt powinny być zatwierdzone i prowadzone zgodnie z wytycznymi określonymi przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt odpowiedniej instytucji lub innymi wymogami prawnymi.

1. Pielęgnacja danio pręgowanego

  1. Trzymaj danio pręgowanego w standardowych warunkach w temperaturze 28,5 °C w 10-godzinnym cyklu ciemności- 14-godzinnym cyklu świetlnym 16.
  2. Trzymaj dorosłego danio pręgowanego w zbiorniku o gęstości około 3 ryb/l.

2. Odpowiedź optokinekińska (OKR)

  1. Zbuduj niestandardowe urządzenie rejestrujące OKR, korzystając z obracającego się bębna o średnicy 14,5 cm, mikroskopu stereoskopowego z regulowanymi ustawieniami natężenia światła (300-8 000 luksów) i komputera (ilustracja 1a).
    1. Podłącz kamerę do mikroskopu, która zapewni transmisję na żywo na sąsiednim monitorze i umożliwi przechwytywanie i nagrywanie obrazu.
    2. Steruj obracającym się bębnem za pomocą mikrokontrolera połączonego z komputerem, który będzie dostosowywał się do różnych wyborów prędkości i kierunku.
  2. Znieczulij rybę 0,016% tricainą przez 2-3 minuty, a następnie umieść rybę na małej platformie z oczami i skrzelami zawieszonymi nad krawędzią.
  3. Umieść cienką gąbkę/ręcznik na ciele ryby i przypnij 2-3 kawałki pianki, ukształtowane tak, aby pomieścić rybę, nad rybą, aby ją unieruchomić. Stwierdzono, że ograniczenie ruchu ogona ryby jest kluczowym aspektem unieruchomienia bez powodowania obrażeń ryby, a najlepiej osiągnąć je za pomocą płaskiego kawałka pianki. (Rysunek 1b)
  4. Umieść rybę w cylindrycznym zbiorniku wypełnionym wodą, który mieści się w obracającym się bębnie urządzenia rejestrującego OKR. Użyj magnesów na platformie, aby ustawić rybę w pozycji pionowej, tak aby oczy znajdowały się w odległości około 7.3 cm od krawędzi bębna. Ryba powinna obudzić się ze znieczulenia w ciągu kilku minut - wznowi się normalne oddychanie i należy obserwować przypadkowe ruchy gałek ocznych.
  5. Umieść siatkę bazową o prędkości 0,07 cykli na stopień (cpd) w obracającym się bębnie i włącz elementy sterujące komputera, aby rozpocząć obracanie i przechwytywanie wideo (w przypadku tego papieru użyto prędkości 12 obr./min, ale prędkości 8-16 obr./min powinny dać podobne wyniki).
  6. Po wywołaniu początkowego OKR przez kratę podstawy, należy na chwilę wstrzymać obrót i zastąpić kratę mniejszą kratą (wyższa częstotliwość przestrzenna).
  7. Powtarzaj ten proces tak długo, aż nie będzie można uzyskać OKR-u. Przetestuj ponownie z najmniejszą kratą, która spowodowała OKR, po zmodyfikowanym podejściu do klatki schodowej, a następnie powtórz przy użyciu siatki, która nie wywołała odpowiedzi, aby zweryfikować utratę OKR. Proces ten można powtórzyć w celu sprawdzenia prawdziwej odpowiedzi na najmniejszą wykrywalną siatkę, jeśli końcowa siatka zmieniła się w stosunku do pierwszego zdarzenia wygaszania.
  8. Uzyskaj pomiary ostrości monokularu, umieszczając plastikowy okluder na paskach przylegających do przeciwległego oka. Powtórz powyższą procedurę (kroki 2.6-2.7).
  9. Uzyskaj ostrość przeciwnego oka, zmieniając położenie okludera i ponownie powtarzając kroki 2.6-2.7.
  10. Zwróć uwagę na odległość, w jakiej każde oko znajduje się od pasków podczas procedury testowej, używając referencyjnego paska pomiarowego pod zbiornikiem, aby można było obliczyć dokładne pomiary ostrości w kolejnych krokach.

3. Obliczanie ostrości wzroku

  1. Uzyskaj ostrość widzenia, obliczając cpd: Diagram wzoru trygonometrycznego z arctanem do obliczeń geometrycznych. gdzie a to odległość od środka soczewki do siatki, a h to długość jednego cyklu najmniejszej siatki, przy której zaobserwowano OKR (Rysunek 1c).
  2. W przypadku połączonych pomiarów ostrości wzroku stosuje się uśrednioną wartość a zarówno z lewego, jak i prawego oka.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Funkcjonalność urządzenia OKR

Urządzenie OKR, jak wyjaśniono powyżej i pokazano na rysunku 1, działa przy minimalnej konserwacji. Jak wspomniano w kroku 2.3, unieruchomienie ogona ma kluczowe znaczenie dla utrzymania ryby w ryzach podczas nagrywania. Wystarczająco unieruchomiona ryba może być trzymana w urządzeniu OKR przez dłuższy czas. W związku z tym należy zachować ostrożność podczas początkowych etapów unieruchomienia, aby można było zebrać więcej danych dla każdej pojedynczej ryby.

Pomiary ostrości wzroku

Obuoczny OKR jest łatwo wywoływany u normalnych dorosłych ryb. Postępując zgodnie z powyższą procedurą, można znaleźć ostrość wzroku u danio pręgowanego w różnym wieku (ryc. 2). Najlepsza zarejestrowana przez nas obuoczna ostrość przestrzenna wyniosła 0,74 cpd. Jak zauważono na rycinie 2, ostrość widzenia obuocznego na ogół wzrasta wraz z wiekiem (n = 46; p = 0,002 ANOVA przy użyciu SPSS v14), ale wyrównuje się po około 12 miesiącu życia. Kiedy porównaliśmy zmierzoną ostrość wzroku u 5-miesięcznych ryb typu dzikiego z rybami lrp2 / bugeye w tym samym wieku, stwierdziliśmy, że ryby lrp2 / bugeye miały znacznie obniżoną ostrość (p < 0,001; typ dziki: 0,49±0,05 cpd; n = 8; LRP2/Bugeye: 0,35±0,06; n=10; Test T Studenta z wykorzystaniem Excela).

Poprzez zasłonięcie prawego oka można określić ostrość widzenia dla lewego oka i na odwrót. W porównaniu z ostrością obuoczną, sumowanie obuoczne obserwuje się podobnie jak w przypadku ludzkiego wzroku17 (ryc. 3). Ostrość obuoczna była na ogół o 5-10% lepsza niż ostrość prawej (OD) lub lewej (OS) mierzonej niezależnie. W przypadku niektórych pojedynczych ryb różnica wynosiła 25% poprawę.

Schemat systemu mikroskopu z przestrzennymi siatkami częstotliwości, kontrolą światła i wymienną siatką.
Rysunek 1. Nagrywanie OKR. A) Urządzenie OKR składa się z obrotowego bębna o średnicy 14,5 cm i mikroskopu z regulowanymi ustawieniami natężenia światła (300-8 000 luksów). Kamera zapewnia obraz na żywo na sąsiednim monitorze. Obracający się bęben ma różne ustawienia prędkości zarówno w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara, jak i przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, a wymienne siatki częstotliwości przestrzennej są wkładane i wyjmowane w razie potrzeby. B) Ryby są zabezpieczone i umieszczone w środku obracającego się bębna. C) Liczbę cykli na stopień (cpd) oblicza się za pomocą cpd=Złożony wzór trygonometryczny do obliczania kąta; analiza równań i zastosowanie edukacyjne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Ostrość wzroku zmienia się wraz z wykresem wieku; cykle/stopień a wiek w miesiącach; badanie widzenia rozwojowego.
Rysunek 2. Ostrość wzroku zmienia się wraz z wiekiem. Wykres przedstawia niezależną ostrość wzroku mierzoną w wieku 5-15 miesięcy. Ostrość wzroku na ogół wzrasta w ciągu pierwszego roku rozwoju, a następnie nieco spada w wieku 15 miesięcy (p = 0,002 ANOVA przy użyciu SPSS v14). Każdy punkt może reprezentować 1 lub kilka ryb. Ostrość wzroku mierzy się w cyklach/stopniu (cpd). (n = 46 ogółem; 8 w wieku 5 miesięcy; 4 w wieku 6 miesięcy; 7 w wieku 8 miesięcy; 6 w wieku 9 miesięcy; 11 w wieku 10 miesięcy; 2 w wieku 11 miesięcy; 2 w wieku 12 miesięcy i 6 w wieku 15 miesięcy). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Efekt sumowania obuocznej ostrości wzroku, wykres słupkowy, cykle na stopień, porównanie OU, OD, OS.
Rysunek 3. Efekt sumowania ostrości wzroku obuocznej. Ostrość wzroku obuocznej (OU) jest na ogół wyższa w porównaniu z ostrością oka prawego (OD) lub lewego (OS). W tej konkretnej grupie ostrość OS była istotnie niższa. (* p=0,006, N=8) Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czasami ryby mogą uciec do zbiornika wodnego. Bardzo ważne jest unieruchomienie ogona. Ponadto stwierdzono również, że użycie cienkiej gąbki/ręcznika na ciele ryby jest nieocenione w utrzymywaniu ryby w zawieszeniu przez dłuższy czas. Dzięki tej procedurze byliśmy w stanie utrzymać ryby w stanie unieruchomienia przez ponad 30 minut bez szkody dla ryb. Taka ilość czasu jest więcej niż wystarczająca do wykonania lornetki i obu ostrości monokularowych.

Prezentacja kraty może być wykonana zgodnie z opisem tutaj i gdzie indziej za pomocą fizycznie obracającego się bębna lub poprzez przedstawienie wyświetlacza cyfrowego18-22. Oba typy mają określone zalety i wady. Zdecydowaliśmy się na fizyczną rotację zarówno ze względu na koszty, jak i specyfikację techniczną. Wyłączając komputer i sprzęt do obrazowania, opisane tutaj urządzenie OKR można zbudować za około 150 USD.

OKR jest obiektywnym sposobem określania ostrości wzroku u dorosłych danio pręgowanego. Podczas gdy kilka innych testów wzrokowo-motorycznych wzroku zostało wykorzystanych w poprzednich eksperymentach, a nawet elektroretinogram został z powodzeniem wykonany w oczach dorosłego danio pręgowanego, chociaż nie był intensywnie wykorzystywany, OKR dorosłego danio pręgowanego otwiera drzwi do wielu nowych warunków eksperymentalnych22. Badanie to wykazało użyteczność OKR w pomiarze zmian ostrości wzroku w czasie, identyfikacji różnic w ostrości wzroku w modelach chorób oczu oraz w określaniu jednoocznej ostrości wzroku.

Co ciekawe, wzrok dorosłego danio pręgowanego w porównaniu ze wzrokiem człowieka (20/20) wynosi około 20/1,000 (gdy 0,60 cpd jest konwertowane na -0,3 logMAR). Chociaż może się to wydawać słabe, oczy danio pręgowanego są bardzo dobrze przystosowane do środowiska, w którym żyje. Pomimo wizualnego zadania polegającego na patrzeniu przez 6,5 cm wody, kilka milimetrów poliwęglanu i kolejny centymetr powietrza, ryby radzą sobie całkiem nieźle! Odkryliśmy, że ostrość dorosłego danio pręgowanego wynosi około 70% tego, co można by przewidzieć, biorąc pod uwagę odstępy między ich fotoreceptorami. 23 Porównaj to z optymalną wydajnością człowieka ~20/12, która stanowi około 80% przewidywanych 20/10, a technika OKR do pomiaru zdolności wzrokowych u dorosłych ryb pręgowanych jest imponująca24,25.

Technika pomiaru niezależnej ostrości wzroku oka pozwoliłaby na badania, w których jedno oko mogłoby być leczone, a drugie stosowane jako kontrola. Ponadto ryby z asymetrycznym rozwojem gałki ocznej, takie jak lrp2/bugeye lub ryby, u których rozwija się zaćma, mogą być dokładniej monitorowane. Należy zauważyć, że należy zachować ostrożność, aby dokładnie zmierzyć odległość od oczu do pasków i zasłonić pełne pole widzenia. Technika ta powinna otworzyć drzwi do dokładniejszych i bardziej szczegółowych pomiarów funkcji wzrokowych danio pręgowanego.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansowanie zapewnione DJC przez Western University of Health Sciences College of Optometry. Specjalne podziękowania dla Irisy Tam za projekt graficzny.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Super Low Light Black White Video Security CameraSuper CircuitsPC164CEX-2 Można użyć dowolnej kamery o słabym oświetleniu
Mikrokontroler Arduino DuemilanoveAdafruit Industries Arduino Uno jest również kompatybilne z oprogramowaniem do kontroli prędkości.
Metanosulfonian trikainyVWR101107-950

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10545-10549 (1995).
  2. Neuhauss, S. C., et al. Genetic disorders of vision revealed by a behavioral screen of 400 essential loci in zebrafish. J. Neurosci. 19, 8603-8615 (1999).
  3. Schumann, W. P. The objective determination of visual acuity on the basis of the optokinetic nystagmus. Am. J. Optom. Arch. Am. Acad. Optom. 29, 575-583 (1952).
  4. Gorman, J. J., Cogan, D. G., Gellis, S. S. An apparatus for grading the visual acuity of infants on the basis of opticokinetic nystagmus. Pediatrics. 19, 1088-1092 (1957).
  5. Fulton, A. B., Manning, K. A., Dobson, V. A behavioral method for efficient screening of visual acuity in young infants. II. Clinical application. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 17, 1151-1157 (1978).
  6. Huizinga, E., Van Der Meulen, P. Vestibular rotatory and optokinetic reactions in the pigeon. Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 60, 927-947 (1951).
  7. Tappeiner, C. Visual Acuity and Contrast Sensitivity of Adult Zebrafish. Front. Zool. 9, 10(2012).
  8. Mueller, K. P., Schnaedelbach, O. D., Russig, H. D., Neuhauss, S. C. VisioTracker, an innovative automated approach to oculomotor analysis. J. Vis. Exp. (56), e3556(2011).
  9. Zou, S. Q., et al. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J. Vis. Exp. (36), e1742(2010).
  10. Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Quantitative measurements of the optokinetic response in adult fish. J. Neurosci. Methods. 186, 29-34 (2010).
  11. Li, L., Dowling, J. E. A dominant form of inherited retinal degeneration caused by a non-photoreceptor cell-specific mutation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 11645-11650 (1997).
  12. Ren, J. Q., McCarthy, W. R., Zhang, H., Adolph, A. R., Li, L. Behavioral visual responses of wild-type and hypopigmented zebrafish. Vision Res. 42, 293-299 (2002).
  13. Maaswinkel, H., Mason, B., Li, L. ENU-induced late-onset night blindness associated with rod photoreceptor cell degeneration in zebrafish. Mech. Ageing Dev. 124, 1065-1071 (2003).
  14. Stujenske, J. M., Dowling, J. E., Emran, F. The bugeye mutant zebrafish exhibits visual deficits that arise with the onset of an enlarged eye phenotype. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 4200-4207 (2011).
  15. Veth, K. N. Mutations in zebrafish lrp2 result in adult-onset ocular pathogenesis that models myopia and other risk factors for glaucoma. PLoS Genet. 7, e1001310(2011).
  16. Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edn, University of Oregon Press. (2007).
  17. Cagenello, R., Arditi, A., Halpern, D. L. Binocular enhancement of visual acuity. J. Opt. Soc. Am. A Opt. Image Sci. Vis. 10, 1841-1848 (1993).
  18. Brockerhoff, S. E. Measuring the optokinetic response of zebrafish larvae. Nat. Protoc. 1, 2448-2451 (2006).
  19. Hodel, C., Neuhauss, S. C. Computer-based analysis of the optokinetic response in zebrafish larvae. CSH Protoc. 2008, pdb prot4961(2008).
  20. Huber-Reggi, S. P., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Analysis of optokinetic response in zebrafish by computer-based eye tracking. Methods Mol. Biol. 935, 139-160 (2013).
  21. Tappeiner, C. Visual acuity and contrast sensitivity of adult zebrafish. Front. Zool. 9, 10(2012).
  22. Saszik, S., Bilotta, J. The effects of temperature on the dark-adapted spectral sensitivity function of the adult zebrafish. Vision Res. 39, 1051-1058 (1999).
  23. Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Visual acuity in larval zebrafish: behavior and histology. Front. Zool. 7, 8(2010).
  24. Curcio, C. A., Sloan, K. R., Kalina, R. E., Hendrickson, A. E. Human photoreceptor topography. J. Comp. Neurol. 292, 497-523 (1990).
  25. Kalloniatis, M., Luu, C. Visual Acuity. , (1995).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

doros e rybki danio pr gowaneostro widzenia obuocznegoostro widzenia jednoocznegocz stotliwo przestrzennametoda schodkowaobrotowy b benpomiar stopniowania

Powiązane artykuły