Method Article

Mikroiniekcja jednokomórkowa do analizy komunikacji komórkowej

DOI:

10.3791/50836

⸱

February 26th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute Oswaldo Cruz, Laboratory of Cellular Communication, Oswaldo Cruz Foundation

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy tutaj, jak wykonać mikroiniekcję pojedynczej komórki Lucyfera Żółtego, aby zobrazować komunikację komórkową poprzez połączenia szczelinowe w żywych komórkach, i podajemy kilka przydatnych wskazówek. Oczekujemy, że ten artykuł pomoże każdemu ocenić stopień sprzężenia komórkowego z powodu funkcjonalnych połączeń szczelinowych. Wszystko, co tu opisano, można by w zasadzie zaadaptować do innych barwników fluorescencyjnych o masie cząsteczkowej poniżej 1000 daltonów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Połączenia szczelinowe to kanały międzykomórkowe, które umożliwiają komunikację sąsiednich komórek. Komunikacja ta zależy od udziału półkanału przez każdą sąsiednią komórkę w celu utworzenia węzła szczelinowego. W komórkach ssaków półkanał jest utworzony przez sześć połączeń, monomerów z czterema domenami transbłonowymi i zakończeniem C i N w cytoplazmie. Połączenia szczelinowe umożliwiają wymianę jonów, drugich przekaźników i małych metabolitów. Ponadto odgrywają ważną rolę w wielu formach komunikacji komórkowej w procesach fizjologicznych, takich jak przekaźnictwo synaptyczne, skurcze serca, wzrost i różnicowanie komórek. Szczegółowo opisujemy, jak wykonać mikroiniekcję pojedynczej komórki Lucyfera Żółtego, aby uwidocznić komunikację komórkową poprzez połączenia szczelinowe w żywych komórkach. Oczekuje się, że w funkcjonalnych połączeniach szczelinowych barwnik będzie dyfundował z załadowanej komórki do połączonych komórek. Jest to bardzo przydatna technika do badania połączeń szczelinowych, ponieważ można ocenić dyfuzję fluorescencji w czasie rzeczywistym. Omawiamy, jak przygotować komórki i mikropipetę, jak używać mikromanipulatora i wstrzykiwać niskocząsteczkowy barwnik fluorescencyjny do linii komórek nabłonkowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Połączenia szczelinowe to kanały międzykomórkowe, które umożliwiają komunikację między sąsiednimi komórkami1. Ta komunikacja łączy dwie lub więcej sąsiednich komórek, z których każda przyczynia się do połączenia lub półkanału, tworząc kanał międzykomórkowy. W komórkach ssaków połączenie składa się z sześciu koneksyn, monomerów z czterema domenami transbłonowymi oraz zakończeniem C i N w cytoplazmie2. Połączenia szczelinowe nie tylko umożliwiają przepływ jonów, drugich przekaźników i małych metabolitów, ale także przyczyniają się do wielu form komunikacji komórkowej w wielu procesach fizjologicznych, takich jak transmisja synaptyczna, skurcze serca, wzrost i różnicowanie komórek3,4,5,6,7,8. Ponadto połączenia szczelinowe są związane z wieloma chorobami, w tym rakiem9,10, atrofią mięśni11, niektórymi chorobami genetycznymi i chorobami demielinizacyjnymi12.

Ten typ przesłuchu międzykomórkowego może być oceniany za pomocą kilku metod13,14,15,16. W tym artykule pokazujemy, jak wykonać mikroiniekcję Lucyfera Yellow w jednej komórce, aby uwidocznić komunikację komórkową poprzez połączenia szczelinowe w żywych komórkach. Omawiamy, jak przygotować komórki i mikropipetę, użycie mikromanipulatora i wstrzyknięcie żółtego barwnika Lucyfer do linii komórek nabłonka grasicy. Zwykle ta eksperymentalna procedura może być analizowana przez średnią komórek połączonych z komórką obciążoną barwnikiem. Ponadto metoda ta może być stosowana z innymi barwnikami fluorescencyjnymi o masie cząsteczkowej poniżej granicy połączeń szczelinowych, która wynosi około 1000 daltonów.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie komórek

  1. Utrzymuj posiew linii komórek nabłonka grasicy (IT76M1) lub komórki, która ma być badana w inkubatorze (37°C/5% CO2 ).
  2. Umyj komórki PBS 1x (powtórz tę pozycję 3x).
  3. Dodaj trypsynę do komórek na 5 minut.
  4. Dodać pożywkę (dwukrotność objętości trypsyny dodanej w ppkt 1.3) z 10% FBS (płodową surowicą bydlęcą) do komórek z trypsyną i odwirować (800 x g przez 5 min).
  5. Policz komórki w hemocytometrze.
  6. Dostosuj gęstość komórek w zależności od typu ogniwa, ponieważ komórki muszą być ze sobą w bliskim kontakcie, aby umożliwić sprzężenie. Uwaga: W naszym przypadku użyliśmy 3 x 105 komórek na szalkę Petriego o średnicy 35 mm.

2. Przygotowanie mikropipet

  1. Wyciągnąć mikropipetę zgodnie z opisem ze szklanej mikropipety kapilarnej (o średnicy 1,5 mm) do końcowej średnicy 0,2 μm, aby uzyskać rezystancję końcową około 30 MΩ17,18.
    UWAGA: Alternatywnie można zakupić pipety iniekcyjne. Rezystancja zależy od wielkości komórki, na przykład mikroelektroda o wyższej rezystancji byłaby konieczna dla komórek groniastych trzustki, na przykład (100-150 MΩ)19. Częstym problemem, który może wystąpić, jest wytrącanie się roztworu Lucifer Yellow, który może następnie zatkać mikropipetę i może wymagać wcześniejszej filtracji lub odwirowania. Przed wstrzyknięciem mikropipetę należy przeanalizować pod mikroskopem w celu wykrycia, czy występuje przeszkoda lub jakiekolwiek zakłócenia13. Mikropipetę można przetestować, wstrzykując LY za pomocą końcówki mikropipety do roztworu soli fizjologicznej.

3. Testowanie mikropipety

  1. Przygotować roztwór Lucifer Yellow (5%) w 150 mmol/L LiCI i załadować mikropipetę za pomocą strzykawki lub przez zasypkę (włożyć do niej roztwór LY).
  2. Umieścić mikropipetę na szalce Petriego o średnicy 35 mm z kuwetami IT76M1 na stacji roboczej do mikroiniekcji i zanurzyć końcówkę szklanej mikropipety w pożywce komórkowej. Skoncentruj się na mikropipecie i wykonaj test płynięcia barwnika, stosując impuls.

4. Jednokomórkowy Lucyfer Żółty Mikroiniekcja

  1. Ustaw ostrość mikroskopu tuż nad warstwą komórkową przy dużym powiększeniu (40X), a następnie powoli opuść pipetę do komórek za pomocą mikromanipulatora.
  2. Nakłuj komórkę docelową, gdy końcówka jest wystarczająco blisko, aby dotknąć błony komórkowej, i zastosuj mały impuls hiperpolaryzacyjny, aby wprowadzić LY do komórki. Przyłożone napięcie będzie zależało od ładunku netto barwnika, który ma zostać wstrzyknięty. Alternatywnie, niektóre inne barwniki mogą być użyte w tej technice, jak pokazano w tabeli 1.
    Uwaga: W zasadzie można użyć dowolnego barwnika hydrofilowego o MW mniejszym niż 1KDa. Jednak szybkość przenoszenia może się różnić w zależności od wagi i hydrofilowości. Dodatkowo należy ocenić niespecyficzny transfer użytego barwnika.
  3. Uchwyć obrazy komórek 3 minuty po wstrzyknięciu barwnika lub nakręć mały film za pomocą mikroskopii poklatkowej (30 kl./s).
    UWAGA: Podobne podejście można zaobserwować w Hitomi et al (2015)20. Aby uniknąć komunikacji przez mosty międzykomórkowe (niepełna mitoza), zaleca się jednoczesne wstrzyknięcie dekstranu rodaminy (od 2 do 10 KDa), który nie przechodzi przez połączenia szczelinowe, ale przechodzi przez mosty międzykomórkowe i niektóre typy nanotubul, jak pokazano na rycinie 2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Linia komórek nabłonka grasicy IT-76MI została wykorzystana do oceny sprzężenia barwnika przez połączenia szczelinowe, ponieważ komórki te zostały opisane jako wyrażające funkcjonalne połączenia szczelinowe utworzone przez connexin 4321. Rycina 1 przedstawia wstrzyknięcie Lucifer Yellow po nałożeniu do jednej komórki poniżej końcówki pipety. Po kilku minutach połączone komórki stają się fluorescencyjne (gwiazdki) wskazujące na dyfuzję barwnika fluorescencyjnego prz...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W celu sprawdzenia obecności funkcjonalnego połączenia szczelinowego międzykomórkowego wymagane jest zastosowanie znaczników, które są nieprzepuszczalne dla błony, chociaż przepuszczalne przez kanały międzykomórkowe16. Fluoresceina, pierwszy barwnik fluorescencyjny, który zaobserwował sprzężenie komórka-komórka22, jest przepuszczalny między błonami niezłącznymi3 i dlatego został zastąpiony przez żółty barwnik Lucyfera15. Obecn...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dedykują ten artykuł na cześć prof. Gilberto Oliveira-Castro, który wprowadził badania nad komunikacją międzykomórkową za pomocą połączeń szczelinowych w Brazylii. Praca ta została sfinansowana przez Capes, CNPQ i Faperj.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Lucyfer żółtySigmaL0259
Chlorek lituSigmaL4408
PBS tabletkiSigma P4417
RPMISigmaR4130
Surowica płodowa bydlęcaCultilab
TrypsinSigmaT4799
stół z izolacją wibracyjną NewportVH3036W-OPTStół z izolacją wibracyjną jest potrzebny do ochrony eksperymentów przed wibracjami i uniknięcia uszkodzenia komórek
MikromanipulatorNarishigeMMO-203To urządzenie umożliwia precyzyjną regulację mikropipety, która jest potrzebna do mikroiniekcji komórek.
Generator prądu DigitimerDS2Aby wytworzyć przepływ barwnika przez mikropipetę, prąd poniżej jednego nanoampera był podawany za pomocą generatora prądu z elektrodą wewnątrz mikropipety lub wzmacniacza, który ma obwód kompensacji pojemności (stary elektrometr) lub funkcję wtrysku prądu nowych wzmacniaczy patch clamp, a przewód uziemiający zanurzono w czaszy płytki. Alternatywnie barwnik może być wstrzykiwany za pomocą mikrowtryskiwacza pneumatycznego, zgodnie z zaleceniami fabrycznymi.    

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bennett, M. V., et al. Gap junctions: new tools, new answers, new questions. Neuron. 6 (3), 305-320 (1991).
  2. Orellana, J. A., Martinez, A. D., Retamal, M. A. Gap junction channels and hemichannels in the CNS: Regulation by signaling molecules. Neuropharmacology. , (2013).
  3. Peracchia, C. Structural correlates of gap junction permeation. Int Rev Cytol. 66, 81-146 (1980).
  4. Loewenstein, W. R. Junctional intercellular communication and the control of growth. Biochim Biophys Acta. 560 (1), 1-65 (1979).
  5. Alves, L. A., et al. Functional gap junctions in thymic epithelial cells are formed by connexin 43. Eur.J Immunol. 25 (2), 431-437 (1995).
  6. Alves, L. A., et al. Are there functional gap junctions or junctional hemichannels in macrophages? Blood. 88 (1), 328-334 (1996).
  7. Fonseca, P. C., et al. Characterization of connexin 30.3 and 43 in thymocytes. Immunology letters. 94 (1-2), 65-75 (2004).
  8. Nihei, O. K., et al. Modulatory effects of cAMP and PKC activation on gap junctional intercellular communication among thymic epithelial cells. BMC Cell Biol. 11, 3(2010).
  9. Czyz, J., Szpak, K., Madeja, Z. The role of connexins in prostate cancer promotion and progression. Nat Rev Urol. 9 (5), 274-282 (2012).
  10. El-Saghir, J. A., El-Habre, E. T., El-Sabban, M. E., Talhouk, R. S. Connexins: a junctional crossroad to breast cancer. Int J Dev Biol. 55 (7-9), 773-780 (2011).
  11. Cea, L. A., et al. Connexin- and pannexin-based channels in normal skeletal muscles and their possible role in muscle atrophy. J Membr Biol. 245 (8), 423-436 (2012).
  12. Cotrina, M. L., Nedergaard, M. Brain connexins in demyelinating diseases: therapeutic potential of glial targets. Brain Res. 1487, 61-68 (2012).
  13. Park, H. an-A., R, S., Khanna, S. avita, Sen, C. handan K. Current Technologies in Single-Cell Microinjection and Application to Study Signal Transduction. Methods in Redox Signaling. , Chapter 10 (2010).
  14. Abbaci, M., Barberi-Heyob, M., Blondel, W., Guillemin, F., Didelon, J. Advantages and limitations of commonly used methods to assay the molecular permeability of gap junctional intercellular communication. Biotechniques. 45 (1), 33-52 (2008).
  15. Stewart, W. W. Functional connections between cells as revealed by dye-coupling with a highly fluorescent naphthalimide tracer. Cell. 14 (3), 741-759 (1978).
  16. Meda, P. Probing the function of connexin channels in primary tissues. Methods. 20 (2), 232-244 (2000).
  17. Klaunig, J. E., Shi, Y. Assessment of gap junctional intercellular communication. Curr Protoc Toxicol. , Chapter 2 Unit2 17 (2009).
  18. Hanani, M. Lucifer yellow - an angel rather than the devil. J Cell Mol Med. 16 (1), 22-31 (2012).
  19. Orci, L., Biochemistry, C. Blockage of Cell-to-Cell Communication within Pancreatic Acini Is Associated with Increased Basal Release of Amylase Materials and Methods Preparation of Acini. Cell. 103 (August), 475-483 (1986).
  20. Hitomi, M., et al. Differential connexin function enhances self-renewal in glioblastoma. Cell Rep. 11 (7), 1031-1042 (2015).
  21. Nihei, O. K., Campos de Carvalho,, C, A., Spray, D. C., Savino, W., Alves, L. A. A novel form of cellular communication among thymic epithelial cells: intercellular calcium wave propagation. Am J Physiol Cell Physiol. 285 (5), C1304-C1313 (2003).
  22. Kanno, Y., Loewenstein, W. R. Intercellular Diffusion. Science. 143 (3609), 959-960 (1964).
  23. Alves, L. A., Nihei, O. K., Fonseca, P. C., Carvalho, A. C., Savino, W. Gap junction modulation by extracellular signaling molecules: the thymus model. Braz J Med Biol Res. 33 (4), 457-465 (2000).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single cell MicroinjectionGap Junction AnalysisLucifer Yellow DyeFluorescence MicroscopyMicromanipulator TechniqueCellular Communication StudyEpithelial Cell LineGap Junction FunctionDye Diffusion AssayThymic Epithelial Cells

Related Articles