Mikroiniekcja jednokomórkowa do analizy komunikacji komórkowej

Summary

Opisujemy tutaj, jak wykonać mikroiniekcję pojedynczej komórki Lucyfera Żółtego, aby zobrazować komunikację komórkową poprzez połączenia szczelinowe w żywych komórkach, i podajemy kilka przydatnych wskazówek. Oczekujemy, że ten artykuł pomoże każdemu ocenić stopień sprzężenia komórkowego z powodu funkcjonalnych połączeń szczelinowych. Wszystko, co tu opisano, można by w zasadzie zaadaptować do innych barwników fluorescencyjnych o masie cząsteczkowej poniżej 1000 daltonów.

Abstract

Połączenia szczelinowe to kanały międzykomórkowe, które umożliwiają komunikację sąsiednich komórek. Komunikacja ta zależy od udziału półkanału przez każdą sąsiednią komórkę w celu utworzenia węzła szczelinowego. W komórkach ssaków półkanał jest utworzony przez sześć połączeń, monomerów z czterema domenami transbłonowymi i zakończeniem C i N w cytoplazmie. Połączenia szczelinowe umożliwiają wymianę jonów, drugich przekaźników i małych metabolitów. Ponadto odgrywają ważną rolę w wielu formach komunikacji komórkowej w procesach fizjologicznych, takich jak przekaźnictwo synaptyczne, skurcze serca, wzrost i różnicowanie komórek. Szczegółowo opisujemy, jak wykonać mikroiniekcję pojedynczej komórki Lucyfera Żółtego, aby uwidocznić komunikację komórkową poprzez połączenia szczelinowe w żywych komórkach. Oczekuje się, że w funkcjonalnych połączeniach szczelinowych barwnik będzie dyfundował z załadowanej komórki do połączonych komórek. Jest to bardzo przydatna technika do badania połączeń szczelinowych, ponieważ można ocenić dyfuzję fluorescencji w czasie rzeczywistym. Omawiamy, jak przygotować komórki i mikropipetę, jak używać mikromanipulatora i wstrzykiwać niskocząsteczkowy barwnik fluorescencyjny do linii komórek nabłonkowych.

Introduction

Połączenia szczelinowe to kanały międzykomórkowe, które umożliwiają komunikację między sąsiednimi komórkami¹. Ta komunikacja łączy dwie lub więcej sąsiednich komórek, z których każda przyczynia się do połączenia lub półkanału, tworząc kanał międzykomórkowy. W komórkach ssaków połączenie składa się z sześciu koneksyn, monomerów z czterema domenami transbłonowymi oraz zakończeniem C i N w cytoplazmie². Połączenia szczelinowe nie tylko umożliwiają przepływ jonów, drugich przekaźników i małych metabolitów, ale także przyczyniają się do wielu form komunikacji komórkowej w wielu procesach fizjologicznych, takich jak transmisja....

Protocol

1. Przygotowanie komórek

1. Utrzymuj posiew linii komórek nabłonka grasicy (IT76M1) lub komórki, która ma być badana w inkubatorze (37°C/5% CO₂ ).
2. Umyj komórki PBS 1x (powtórz tę pozycję 3x).
3. Dodaj trypsynę do komórek na 5 minut.
4. Dodać pożywkę (dwukrotność objętości trypsyny dodanej w ppkt 1.3) z 10% FBS (płodową surowicą bydlęcą) do komórek z trypsyną i odwirować (800 x g przez 5 min).
5. Policz komórki w hemocytometrze.
6. Dostosuj gęstość komórek w zależności od typu ogniwa, ponieważ komórki muszą być ze sobą w bliskim kontakcie, aby umożliwić sprzężenie. Uwaga: W naszym przypadku użyliśmy 3 x 10^5....

Results

Linia komórek nabłonka grasicy IT-76MI została wykorzystana do oceny sprzężenia barwnika przez połączenia szczelinowe, ponieważ komórki te zostały opisane jako wyrażające funkcjonalne połączenia szczelinowe utworzone przez connexin 43²¹. Rycina 1 przedstawia wstrzyknięcie Lucifer Yellow po nałożeniu do jednej komórki poniżej końcówki pipety. Po kilku minutach połączone komórki stają się fluorescencyjne (gwiazdki) wskazujące na dyfuzję barwnika fluorescencyjnego prz.......

Discussion

W celu sprawdzenia obecności funkcjonalnego połączenia szczelinowego międzykomórkowego wymagane jest zastosowanie znaczników, które są nieprzepuszczalne dla błony, chociaż przepuszczalne przez kanały międzykomórkowe¹⁶. Fluoresceina, pierwszy barwnik fluorescencyjny, który zaobserwował sprzężenie komórka-komórka²², jest przepuszczalny między błonami niezłącznymi³ i dlatego został zastąpiony przez żółty barwnik Lucyfera¹⁵. Obecn.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lucyfer żółty	Sigma	L0259
Chlorek litu	Sigma	L4408
PBS tabletki	Sigma	P4417
RPMI	Sigma	R4130
Surowica płodowa bydlęca	Cultilab
Trypsin	Sigma	T4799
stół z izolacją wibracyjną	Newport	VH3036W-OPT	Stół z izolacją wibracyjną jest potrzebny do ochrony eksperymentów przed wibracjami i uniknięcia uszkodzenia komórek
Mikromanipulator	Narishige	MMO-203	To urządzenie umożliwia precyzyjną regulację mikropipety, która jest potrzebna do mikroiniekcji komórek.
Generator prądu	Digitimer	DS2	Aby wytworzyć przepływ barwnika przez mikropipetę, prąd poniżej jednego nanoampera był podawany za pomocą generatora prądu z elektrodą wewnątrz mikropipety lub wzmacniacza, który ma obwód kompensacji pojemności (stary elektrometr) lub funkcję wtrysku prądu nowych wzmacniaczy patch clamp, a przewód uziemiający zanurzono w czaszy płytki. Alternatywnie barwnik może być wstrzykiwany za pomocą mikrowtryskiwacza pneumatycznego, zgodnie z zaleceniami fabrycznymi.