Wysokoprzepustowe mikroiniekcje zygot jeżowców

Podsumowanie

Mikroiniekcja jest powszechną techniką używaną do dostarczania konstruktów DNA, mRNA, oligonukleotydów antysensownych morfolino lub innych zabiegów do jaj, embrionułów i komórek różnych gatunków.

Streszczenie

Mikroiniekcja do komórek i embrionów jest powszechną techniką, która jest używana do badania szerokiego zakresu procesów biologicznych. W tej metodzie niewielka ilość roztworu leczniczego jest umieszczana w igle do mikroiniekcji, która służy do fizycznego wstrzykiwania pojedynczych unieruchomionych komórek lub zarodków. Pomimo konieczności wstępnego szkolenia w celu wykonania tej procedury w celu uzyskania wysokiej przepustowości, mikroiniekcja oferuje maksymalną skuteczność i powtarzalne dostarczanie szerokiej gamy roztworów leczniczych (w tym złożonych mieszanin próbek) do komórek, komórek jajowych lub zarodków. Zastosowania mikroiniekcji obejmują dostarczanie konstruktów DNA, mRNA, białek rekombinowanych, odczynniki do wzmacniania funkcji i utraty funkcji. Barwnik fluorescencyjny lub kolorymetryczny jest dodawany do wstrzykiwanego roztworu, aby umożliwić natychmiastową wizualizację wydajnego dostarczania, a także narzędzie do niezawodnej normalizacji ilości dostarczonego roztworu. Opisana metoda umożliwia mikroiniekcję 100-400 zygot jeżowców w ciągu 10-15 min.

Wprowadzenie

Skuteczne i powtarzalne leczenie jest jednym z głównych wyzwań metodologicznych dla badaczy. Ustalono kilka metod przejściowego dostarczania roztworów leczniczych do komórek jajowych, zarodków i komórek. Metody te obejmują elektroporację (polegającą na generowaniu przejściowych porów w błonie za pomocą krótkich impulsów elektrycznych)^1,2, lipofekcję (dostarczanie poprzez fuzję liposomów zawierających leczenie z membraną)¹, bombardowanie mikrocząsteczkami1 (DNA wytrąca się na cząstkach metalu o wielkości mikronów, które są następnie wykorzystywane do penetracji komórek z dużą prędkością) i transdukcja (wirus jest używany jako nośnik transgenów). W tej chwili mikroiniekcja jest jedynym podejściem, które ma tę zaletę, że dostarcza dowolne rozwiązanie ze 100% wydajnością przy minimalnej ilości odczynników. Co więcej, pojedynczy roztwór do wstrzykiwań może składać się ze złożonego koktajlu zabiegów. Technika ta została wykorzystana do skutecznego mikrowstrzykiwania jaj i zarodków wielu gatunków, takich jak jeżowce^3,4, danio pręgowany⁵, mysz⁶, żaba⁷ i bydło⁸, a także pojedyncze komórki w kulturze tkankowej⁹. Przeprowadzono również pojedyncze iniekcje blastomerów w późniejszych stadiach rozwojowych^10-12.

Obecne metody mikroiniekcji opierają się na metodzie wtrysku ciśnieniowego, która została początkowo opisana przez Hiramoto¹⁰; jednak poczyniono znaczne postępy w kierunku optymalizacji tego procesu. Doskonałe techniki mikroiniekcji zostały opisane w innym miejscu¹¹, a tutaj opisujemy jedną z konkretnych metod, która jest obecnie stosowana do mikrowstrzykiwania nowo zapłodnionych jaj jeżowca (Strongylocentrotus purpuratus). Przez ponad sto lat jeżowce były cennym modelem eksperymentalnym^15,16. Jeżowce są ewolucyjnie blisko spokrewnione ze strunowcami (w tym z nami), a analiza ich genomu wykazała, że zawierają wszystkie główne rodziny genów, tak jak ludzki¹⁷. Wytwarzają dużą liczbę synchronicznie rozwijających się przezroczystych zarodków, którymi można łatwo manipulować. Wykorzystując jeżowca jako organizm modelowy, społeczność jeżowców przyczyniła się do naszego zrozumienia procesu zapłodnienia^18-21, procesów biologicznych komórek^22-24 oraz sieci regulacji genów (GRN)^25-28.

Mikroiniekcja do zygot jeżowców wymaga kilku kroków. Po pierwsze, jaja muszą zostać unieruchomione przed wstrzyknięciem (opisane poniżej). Naczynia do mikroiniekcji są pokryte siarczanem protaminy (PS), który tworzy dodatnio naładowaną powierzchnię, do której mogą przylegać ujemnie naładowane jaja³. Jaja są poddawane dejelli przez inkubację w kwaśnej wodzie morskiej (pH 5,15) przez 10 minut, a następnie dwa mycia w naturalnej wodzie morskiej lub sztucznej wodzie morskiej (pH 8,0). Jaja dejelli są ostrożnie układane w linii prostej na środku naczynia pokrytego PS w obecności 1 mM 3-aminotriazolu (3-AT), który jest niezbędny do zahamowania aktywności owoperoksydazy, która jest wydzielana z ziarnistości korowych jaja w wyniku zapłodnienia²⁹. Ten krok jest ważny, aby zapobiec stwardnieniu otoczki nawozowej i ułatwić wprowadzenie igły do mikroiniekcji. Jako alternatywę dla 1 mM 3-AT, można zastosować 10 mM kwas paraminobenzoesowy (PABA). Roztwór do wstrzykiwań jest umieszczany w igle do mikroiniekcji za pomocą specjalistycznej końcówki pipety do mikroładowania i montowany na uchwycie przymocowanym do mikromanipulatora i jednostki ciśnieniowej (ryc. 1). Każda igła może być użyta do mikroiniekcji pojedynczych zygot w wielu eksperymentach w oddzielnych dniach. Mikroiniekcję można wykonywać przez 10-15 minut, aż do stwardnienia zygot. Zygoty są następnie przemywane wodą morską i hodowane w temperaturze 15 °C. Kiedy zarodki osiągają stadium wylęgu blastuli, uwalniają enzym wylęgowy, który trawi składniki otoczki zapłodnienia³⁰ i pozwala im naturalnie oderwać się od naczynia pokrytego PS. W razie potrzeby zarodki można delikatnie odłączyć od naczynia za pomocą pipety doustnej lub pipety Pasteura, delikatnie wdmuchując na zarodki wodę morską. Opisana metoda umożliwia wydajną i niezawodną mikroiniekcję 100-400 nowo zapłodnionych komórek jajowych na jednej szalce, zapewniając wysokoprzepustową metodę dalszych analiz.

Protokół

1. Przygotowanie potraw pokrytych siarczanem protaminy (PS)

1. Przygotować 1% roztwór siarczanu protaminy (PS), dodając 0,5 g PS do 50 ml dejonizowanej wody destylowanej (_ddH2O) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Dobrze wstrząsnąć z dużą prędkością na wytrząsarce stołowej w temperaturze pokojowej przez 1-2 godziny, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie PS. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 3 miesiące (przed każdym użyciem należy upewnić się, że całkowicie rozpuścił się żelowy osad)³.
2. Weź rękaw z polistyrenowych szalek Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm i rozłóż zarówno pokrywki, jak i spody na ławce.
3. Wlej 1% roztwór PS do każdego naczynia (można użyć zarówno dna, jak i pokrywek) tylko tyle, aby pokryć powierzchnię, pozostaw na co najmniej 2 minuty. Pozostały roztwór PS może być wielokrotnie używany w ciągu 3 miesięcy, jeśli jest przechowywany w temperaturze 4 °C.
4. Umieścić naczynia poddane działaniu PS w zlewce wypełnionej wodą destylowaną (dH₂O). Pozostawić zlewkę pod ciśnieniem dH₂O na co najmniej 10 minut.
5. Naczynia z powłoką PS mogą być używane natychmiast lub suche na powietrzu do przechowywania. Przykryj je, aby zapobiec gromadzeniu się kurzu. Można je przechowywać w temperaturze pokojowej przez 1 miesiąc³.

2. Zdobądź gamety jeżowca i unieruchamij jaja na naczyniu pokrytym PS do mikroiniekcji

1. Ikrę należy przeprowadzić u jeżowców poprzez potrząsanie lub docelomiczne wstrzyknięcie do 1 ml 0,5 % KCl w celu wywołania skurczu mięśni gładkich w celu uwolnienia gamet³ (ryc. 2).
2. Jeśli zwierzę jest samcem, na co wskazuje biały kolor plemników, należy zebrać nasienie suche z powierzchni zwierzęcia do probówki o pojemności 1,5 ml. Suche plemniki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez tydzień bez znaczącej utraty funkcji biologicznych.
3. Jeśli zwierzę jest samicą, na co wskazuje żółty kolor spowodowany zawartością żółtka jaja, zbierz jego gamety, zanurzając gonopory w zlewce pełnej wody morskiej. Jaja zostaną uwolnione z gonoporów i osiądą pod wpływem grawitacji.
4. Przefiltruj jaja z zanieczyszczeń, takich jak kolce zwierząt, za pomocą nylonowej siatki filtracyjnej 80 μm. Najlepsze wyniki osiąga się, jeśli ikra zostanie wykorzystana w ciągu 5-7 godzin po tarle.
5. Odjelluj jajka:
   1. Przygotuj 100 ml kwaśnej wody morskiej na około 1 ml jajka. Użyj 0,5 M kwasu cytrynowego, aby dostosować pH wody morskiej z pH 8,0 do 5,1-5,2. Zbyt niskie pH zmniejszy zapłodnienie, a zbyt wysokie pH nie pozwoli jajom przyczepić się do płytek pokrytych PS.
   2. Dodać jajka (nie więcej niż 1 ml) do kwaśnej wody morskiej i pozostawić jaja do osadzenia się na lodzie na 10 minut. Alternatywnie, usunięcie galaretki może być ułatwione poprzez delikatne obracanie jaj podczas zabiegu. W ten sposób można skutecznie usunąć jaja S. purpuratus w ciągu 3-4 minut.
   3. Ostrożnie odlej kwaśną wodę morską, dodaj świeżą wodę morską i pozwól jajkom ponownie osiąść na lodzie. Jaja odgalaretowane można przechowywać na lodzie do 6 godzin bez problemów z zapłodnieniem

3. Wiosłuj jajka

1. Przygotować 1 M roztwór podstawowy 3-aminotriazolu (3-AT, MW = 84,08) rozpuszczając 0,84 g 3-AT w 10 ml ddH₂O. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy.
2. Przygotować 1 mM roztwór roboczy 3-AT, dodając 50 μl 1 M roztworu podstawowego do 50 ml wstępnie schłodzonej wody morskiej. Utrzymuj roztwór na lodzie.
3. Przygotować pipetę doustną (ryc. 3) do delikatnego obchodzenia się z jajami:
   1. Końcówka pipety jest ręcznie pobierana ze szklanych mikropipet (100 x średnica zewnętrzna 1,09 mm). Trzymaj mikropipetę obiema rękami nad otwartym ogniem. Gdy szkło zacznie się topić, ostrożnie pociągnij końce pipety w przeciwnych kierunkach.
   2. Podłącz jedną wyciągniętą pipetę do plastikowej rurki (średnica wewnętrzna 1,14 mm), szczelnie zamknij za pomocą Parafilm. Długość rurki powinna wynosić około 50-70 cm.
   3. Włóż sterylną, filtrowaną końcówkę P20 lub P200 na końcu rurki przeciwlegle do szklanej rurki, która ma być używana jako ustnik.
   4. Przytnij koniec szklanej mikropipety nożyczkami, aby wyregulować średnicę końcówki. Optymalna średnica nieznacznie przekracza średnicę jaja (80 μm).
4. Wlej 4 ml 1 mM 3-AT wody morskiej do każdego naczynia pokrytego PS (dna lub pokrywki).
5. Weź pipetę do jamy ustnej, włóż końcówkę P20/P200 do jamy ustnej i zabezpiecz ją zębami. Aby zassać jaja, najpierw zasysaj niewielką ilość wody morskiej. Posiadając kolumnę płynu przed załadowaniem jaj, będzie się miało maksymalną kontrolę nad techniką pipetowania przez usta.
6. Umieść końcówkę mikropipety w pobliżu jaj i delikatnie zassaj kilkaset jaj w pipecie. Jaja należy umieścić w szklanej mikropipecie.
7. Ułóż jajka w dejelli w linii prostej na talerzu, delikatnie wydmuchując je z ust, pipetą, przesuwając końcówkę w linii prostej. Jaja należy wysiać tuż przed wstrzyknięciami, ponieważ mogą wystąpić problemy z zapłodnieniem z powodu długotrwałej ekspozycji na 3-AT wodę morską³. Co więcej, kleje kationowe, takie jak PS, mogą być toksyczne dla jaj i nie zaleca się wystawiania zarodków na działanie tych odczynników przez długi czas, zwłaszcza jeśli otoczki zapłodnienia zostały usunięte.
8. Zrób zadrapanie na naczyniu w pobliżu linii rzędowych jaj za pomocą szklanej pipety. To zadrapanie będzie ważne, aby złamać igłę do wstrzykiwań, aby dostosować przepływ roztworu w razie potrzeby. Alternatywnie zadrapanie można wykonać przed wlaniem wody morskiej 3-AT do naczynia.

4. Mikroiniekcja zygot jeżowców

1. Włączyć stację mikroiniekcji. Tutaj opisujemy zastosowanie systemu wtryskowego FemtoJet.
2. Pociągnąć kapilary iniekcyjne za pomocą ściągacza igłowego. Przykład dobrej igły przedstawiono na rysunku 4. Uwaga: W przypadku wstrzyknięć RNA, naczynia włosowate do wstrzykiwań powinny być wstępnie poddane obróbce, aby uniknąć zanieczyszczenia RNAazą³¹:
   1. Umieścić kapilary iniekcyjne w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml i dodać 50 ml przefiltrowanego metanolu/HCl (9:1). Dobrze wstrząsnąć i pozostawić na noc nie dłużej niż 10 godzin.
   2. Odlej metanol/HCl i przepłucz naczynia włosowate 2x przefiltrowanym metanolem w tej samej probówce.
   3. Spuść metanol tak bardzo, jak to możliwe i liofilizuj naczynia włosowate przez noc, aby zapewnić całkowite usunięcie metanolu.
3. Ostrożnie zamontuj kapilarę igły na uchwycie do ładowania igły i naładuj ją <0,5 μl roztworu próbki za pomocą końcówek do mikroładowania. Roztwory próbek zawierają zwykle 20% glicerolu, w zależności od wstrzykiwanego materiału³.
4. Umieść naczynie z rzędowymi jajkami na stoliku mikroskopu (jajka powinny być wyrównane pionowo, gdy patrzy się na nie przez okulary) i skup się na jajkach.
5. Ostrożnie zamontuj załadowaną igłę na uchwycie do mikroiniekcji igły i wyreguluj położenie igły tak, aby końcówka była idealnie skoncentrowana na środku pola.
6. Naciśnij przycisk, aby wywrzeć maksymalny nacisk do czyszczenia igły. Roztwór powinien wychodzić z igły. W razie potrzeby wyreguluj ciśnienie: ciśnienie wtrysku powinno mieścić się w zakresie 90-360 hPa, przy czym ciśnienie kompensacyjne powinno wynosić około 1/3 ciśnienia wtrysku.
7. Dostosuj przepływ roztworu, wstrzykując go do niezapłodnionej komórki jajowej. Za pomocą mikromanipulatora joysticka skierować końcówkę igły do wstrzykiwań do niezapłodnionej komórki jajowej. Aby ułatwić wprowadzanie igły, wywołaj lekkie drżenie, delikatnie stukając w stolik twardym przedmiotem, takim jak śrubokręt. Należy zaobserwować bolus iniekcyjny tworzący się wewnątrz komórki jajowej (ryc. 5).
8. Jeśli bolus iniekcyjny nie jest widoczny, lekko unieś końcówkę igły nad jaja, zlokalizuj rysę na szalce i wyreguluj ją tak, aby znajdowała się na środku pola. Delikatnie postukać końcówką igły w miejsce zadrapania, aby złamać końcówkę igły do wstrzykiwań. Wyregulować ciśnienie iniekcji i kompensacji tak, aby bolus iniekcji nie przekraczał 1/5 średnicy jaja (1-2 pm).
9. Po skalibrowaniu bolusa iniekcyjnego należy zapłodnić komórki jajowe, dodając rozcieńczone plemniki (1:1 000) lub 1-2 μl nasienia. Dobrze dokładnie wymieszaj, aby zapobiec wysunięciu się rzędu jaj.
10. Iniekcje należy rozpocząć natychmiast po tym, jak otoczka zapłodnienia stanie się widoczna (ryc. 5). Poruszaj się wzdłuż linii rzędowych jaj za pomocą kontrolera stolika i wstrzyknij jak najwięcej zygot, kłując je igłą sterowaną mikromanipulatorem joysticka.
11. Po 10-15 minutach nowo zapłodnione jaja stwardnieją i nie będzie można ich już wstrzykiwać. Zdejmij naczynie ze sceny i ostrożnie odessaj plemniki w wodzie morskiej 3-AT za pomocą plastikowej pipety Pasteura.
12. Nie pozwól, aby zygoty wyschły. Szybko dodaj świeżą, schłodzoną wodę morską, aby przykryć danie. Inkubować zarodki w temperaturze 15 °C.

Wyniki

Konstrukty reporterowe GFP i mCherry poddano transkrypcji in vitro i wstrzyknięto mikrostrzykawką do nowo zapłodnionych jaj. Embriony inkubowano w temperaturze 15 °C przez 24 hr (do stadium blastuli) i obrazowano przy użyciu mikroskopu Zeiss Observer Z1. Wstrzyknięcie konstruktów reporterowych nie doprowadziło do żadnych wad rozwojowych (Rysunek 6). W celu kwantyfikacji sygnałów fluorescencyjnych akwizycję obrazów przeprowadzono przy niskim powiększeniu (100X), aby maksymalnie zarejestrować piks...

Dyskusja

Mikroiniekcja jest potężną techniką dostarczania różnych metod leczenia, takich jak DNA, mRNA, białka rekombinowane, odczynniki do utraty funkcji i wzmocnienia funkcji, barwniki i ich kombinacje do jaj, zarodków i komórek różnych organizmów^1-7. Jednak podczas projektowania eksperymentu z mikroiniekcją należy pamiętać o kilku kwestiach.

Niezwykle ważne jest, aby wziąć pod uwagę rozpuszczalność dostarczonego leku i objętość wstrzyknięcia. Jeśli roztwór z mikroiniekcją ma tendencję do ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szklane pipety Pasteura	VWR	14673-043
Mikroskop odwrócony  Aksjowert 40 ° C	iniekcyjny	Zeiss	4109431007990000
Końcówki do mikroładowarek	Eppendorf	5242 956.003	Roztwór do wstrzykiwania obciążenia
Nylonowa siatka filtracyjna 80  μ m	Amazon.com	03-80-37	Przefiltruj jaja, aby pozbyć się zanieczyszczeń
P20 lub P200 Końcówki do pipet z barierą aerozolową	Fisher Scientific	02707432 lub 02707430	Część pipety doustnej
Parafilm	Fisher Scientific	13 374 12	Część pipety do ust
Rurka polietylenowa	Intramedic	PE-160	Część pipety do ust
Siarczan protaminy	MP Biomedicals, LLC	194729	Dołącz dejellied jaja do naczyń iniekcyjnych
Jeżowce S. purpuratus	Pt. Laboratorium bezkręgowców morskich Loma	N/A
Woda morska	dowolny sklep zoologiczny	Instant Ocean
Sterylna polistyrenowa szalka Petriego 60 mm x 15 mm	Fisher Scientific	0875713A	Naczynia iniekcyjne
Trójosiowy mikromanipulator do zgrubnego pozycjonowania MMN-1	Narishige	9124	Manipuluj igłą iniekcyjną
Trójosiowy typ joysticka Olej Hydrauliczny drobny mikromanipulator MMO-202ND	Narishige	9212	Manipuluj igłą iniekcyjną
Pipety transferowe	Fisher Scientific	13-711-9RANO&	nbsp;
Pionowy  ściągacz igieł	Narishige	PC-10	Igły do wstrzykiwań ciągnionych

Mikroskop