Wizualizacja przepływu cytoplazmatycznego podczas gojenia się ran jednokomórkowych w stentorze sinawym

Podsumowanie

Gigantyczny orzęsek Stentor coeruleus to klasyczny system do badania regeneracji i gojenia się ran w pojedynczych komórkach. Poprzez obrazowanie komórek Stentora jednocześnie przy małym i dużym powiększeniu, można mierzyć przepływy cytoplazmatyczne przed, w trakcie i po zranieniu.

Streszczenie

Chociaż gojenie ran jest często omawiane na poziomie całych tkanek, w wielu przypadkach pojedyncze komórki są w stanie leczyć rany w sobie, naprawiając uszkodzoną błonę komórkową zanim zawartość komórkowa wycieknie. Gigantyczny jednokomórkowy organizm Stentor coeruleus, w którym komórki mogą mieć wielkość większą niż jeden milimetr, był klasycznym organizmem modelowym do badania gojenia się ran w pojedynczych komórkach. Komórki stentorowe można przeciąć na pół bez utraty żywotności, a nawet można je ciąć i szczepić razem. Ale ta wysoka tolerancja na cięcie rodzi pytanie, dlaczego cytoplazma nie wypływa po prostu z rozmiaru cięcia. W tym miejscu przedstawiamy metodę cięcia komórek Stentor przy jednoczesnym obrazowaniu ruchu cytoplazmy w pobliżu cięcia w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej. Kluczem do naszej metody jest użycie konfiguracji mikroskopu "dwupoziomowego", w której operacja jest wykonywana pod mikroskopem preparacyjnym skoncentrowanym na komorze, która jest jednocześnie oglądana od dołu w wysokiej rozdzielczości za pomocą mikroskopu odwróconego z soczewką o wysokim NA. Taka konfiguracja pozwala na wysoki poziom kontroli nad procedurą chirurgiczną, jednocześnie umożliwiając śledzenie cytoplazmy w wysokiej rozdzielczości.

Wprowadzenie

Regeneracja i gojenie się ran są ważnymi procesami biologicznymi, których mechanizmy pozostają obszarami aktywnych badań. Rzeczywiście, zdolność do leczenia ran i regeneracji uszkodzonych części jest jedną z cech, która odróżnia żywe istoty od obiektów nieożywionych. Zwykle uważa się, że regeneracja odbywa się za pośrednictwem różnicowania komórek macierzystych w różne typy komórek potrzebnych do odbudowy uszkodzonej lub odciętej części zwierzęcia, podczas gdy gojenie się ran jest postrzegane w kategoriach nowych komórek atakujących ranę w celu odbudowy nienaruszonego nabłonka. Tak więc oba procesy wydają się być zapośredniczone przez kolektywy pojedynczych komórek, a zatem wydają się być kwintesencją procesów wielokomórkowych. Jest zatem potencjalnie zaskakujące, że pojedyncze komórki są w niektórych przypadkach zdolne do naprawy ran i regeneracji utraconych składników¹. Gojenie się ran w pojedynczych komórkach może obejmować wiele ścieżek, w tym skurcz sznurka torebki aktynowo-miozynowej wokół rany i łatanie błony przez szybkie połączenie pęcherzyków egzocytotycznych^1-3. Chociaż wiele typów komórek jest zdolnych do pewnego stopnia gojenia się ran^4-6, być może najbardziej dramatycznym przykładem jest gigantyczny orzęsek Stentor coeruelus⁷, pokazany na rycinie 1. Poszczególne komórki Stentora mają długość 1 mm i są pokryte rzędami rzęsek. Komórki stentorowe mają kształt stożka z aparatem ustnym, składającym się z tysięcy rzęsek na jednym końcu i wąskiej struktury mocnej na drugim końcu. Stentor był klasycznym organizmem modelowym do badania regeneracji, ponieważ jeśli jakakolwiek część komórki została odcięta, mogła się^{zregenerować7}. Na przykład, w klasycznej serii eksperymentów, Thomas Hunt Morgan⁸ wykazał, że komórka Stentora może zostać przecięta na pół, a każda połówka zregeneruje komórkę o normalnych proporcjach w^{ciągu kilku godzin}. Szlaki molekularne odpowiedzialne za regenerację w Stetorze pozostają całkowicie nieznane.

Zdolność komórek Stentora do pełnienia funkcji modelu regeneracji zależy od niesamowitej zdolności tych komórek do samoleczenia po przecięciu. Dlaczego cytoplazma komórki Stentor nie wycieka, gdy komórka jest cięta? Gojenie się ran nie jest spowodowane natychmiastowym skurczem kory komórkowej, ponieważ możliwe jest pobranie dwóch komórek Stentora, przecięcie ich, a następnie połączenie dwóch przeciętych komórek w różnych konfiguracjach⁷. Podczas takich eksperymentów ze szczepieniem cytoplazma dwóch komórek musi pozostać odsłonięta, ponieważ łączy się, gdy komórki są do siebie dociskane. W jakiś sposób cytoplazma jest wystarczająco wystawiona na otaczające media, aby umożliwić szczepienie, ale mimo to nie wypływa z komórki. Czy cytoplazma Stentora jest na tyle elastyczna, że po prostu nie może wypłynąć nawet wtedy, gdy w błonie plazmatycznej zostanie zrobiona duża? Czy komórki zwiększają lepkość cytoplazmy lokalnie wokół rany, aby zapobiec wypływaniu cytoplazmy? Cytoplazma jest wysoce złożonym materiałem aktywnym^9-11, a odpowiedź na gojenie się ran Stentor stanowi wyjątkową okazję do badania przepływów cytoplazmatycznych i mechaniki podczas gojenia się ran jednokomórkowych. Jednak zastosowanie metod chirurgicznych w celu wywołania zranienia u Stentora stanowi wyzwanie techniczne. Aby wyciąć komórkę o długości 1 mm za pomocą szklanych igieł, co jest konwencjonalnym paradygmatem chirurgicznym, konieczne jest działanie w małym powiększeniu przy dużej odległości roboczej. W tych warunkach obrazowania nie jest możliwe śledzenie przepływu cytoplazmy, a jedyne, co można określić, to to, czy cytoplazma pozostaje wewnątrz komórki, czy nie. Prawdziwym pytaniem, które chcielibyśmy zadać, jest to, jak ruch i lepkość cytoplazmy mogą się zmieniać podczas cięcia i gojenia. Wymaga to obrazowania w wysokiej rozdzielczości. Tutaj przedstawiamy adaptację protokołu Tatara do cięcia Stentor⁷, która pozwala na wykonanie cięcia pod optyką o mniejszym powiększeniu, aby zobaczyć całą komórkę, jednocześnie obserwując przepływ cytoplazmy w wysokiej rozdzielczości, co pozwala na wykorzystanie tego systemu jako platformy do badania mechanizmów gojenia się ran jednokomórkowych.

Protokół

1. Hodowla i kolekcja komórkowa

1. Komórki Stentor coeruleus należy pozyskać albo z naturalnych stawów, jak opisano w Tartar⁷, albo od komercyjnego dostawcy (patrz Odczynniki).
2. Utrzymuj kultury, rosnąc w ciemności w temperaturze 20 ºC w zmodyfikowanym podłożu stentorowym (MSM), które jest dostosowane do receptur opisanych przez Tartar⁷ i De Terra¹² zawierających 0,75 mM Na₂CO₃, 0,15 mM KHCO₃, 0,15 mM NaNO₃, 0,15 mM KH₂PO₄, 0,15 mM MgSO₄, 0,5 mM CaCl₂, i 1,47 mM NaCl.
3. Uzupełnij pożywkę MSM źródłem węgla, dodając do niej żywą zdobycz. Hoduj kultury pożywki Chlamydomonas reinhardtii TAP przy użyciu standardowych metod hodowli¹³. Przed karmieniem umyj komórki Chlamydomonas w MSM. Nakarm 300 ml kultur Stentor ~ 3 x 10⁷ komórek Chlamydomonas 2-3 razy w tygodniu.
4. Zbierz komórki Stentora do operacji za pomocą pipety. Stentor ma tendencję do zakotwiczania się na dnie i bokach naczynia hodowlanego, a więc, aby zebrać komórki, mieszaj kulturę, bulgocząc powietrzem przez końcówkę pipety, aż komórki zaczną się odłączać i swobodnie pływać.
5. Chwyć pływające komórki za pomocą pipety wyposażonej w końcówkę o szerokim otworze, aby uniknąć ścinania komórek.
6. Umyj zebrane komórki w świeżym MSM.

2. Przygotowanie narzędzi do mikrochirurgii

1. Trzymaj dwa szklane pręty mieszające nad palnikiem Bunsena lub innym płomieniem, aż końce zaczną się topić.
2. Zetknij ze sobą końce dwóch prętów, aby stopione szkło się połączyło.
3. Po utworzeniu małej kropelki stopionego szkła między dwoma prętami, usuń je z płomienia, pozostaw do ostygnięcia na 1-2 sekundy, a następnie rozsuń je, aby uzyskać czystą przerwę. Idealnie byłoby, gdyby szkło wyciągało się w cienkie sznurki i gładko pękało, gdy szkło ostygnie, w wyniku czego powstanie igła o długości około 1-2 cm z cienkim końcem na końcu (ryc. 2).
4. Jeśli uzyskana igła nie jest optymalna, końcówki mogą zostać rozbite na odpady szklane, a pręty mogą być ponownie użyte.

3. Montaż komórek do mikrochirurgii i obserwacji (normalna chirurgia)

1. Przygotuj kwadratową komorę o ściankach wazeliny za pomocą kwadratowego stempla gumowego pokrytego wazeliną i dociśniętego do szklanego szkiełka nakrywkowego.
2. Dodaj MSM zawierający 2% metylocelulozy do kwadratu wazeliny.
3. Umieść szkiełko nakrywkowe w plastikowym adapterze, który umożliwia umieszczenie szkiełka nakrywkowego na mikroskopie ze standardowym uchwytem do szkiełek podstawowych (Rysunek 3).
4. Dodaj umyte komórki z kroku 1.6 do MSM wraz z metylocelulozą, aby utrudnić ruchliwość komórek Stentora, tak aby pozostały na miejscu podczas operacji.
5. Ułóż komórki w metylocelulozie tak, aby były równomiernie rozmieszczone i były dociśnięte wystarczająco blisko powierzchni szkiełka nakrywkowego, aby były ostre podczas obrazowania.

4. Obrazowanie gojenia się ran w wysokiej rozdzielczości w żywym stentorze

Aby jednocześnie zobrazować komórkę Stentora w wysokiej rozdzielczości, jednocześnie wycinając ją chirurgicznie pod małym powiększeniem, zbuduj mikroskop "dwupokładowy" z lunetą sekcyjną przymocowaną do głowicy okularu odwróconej lunety, tak aby była skupiona na górze szkiełka, podczas gdy odwrócona luneta jest skupiona od spodu szkiełka.

1. Umieść suwak na odwróconej lunecie (użyj Zeiss Axiovert 200M lub Olympus IX80).
2. Zdejmij korpus mikroskopu preparacyjnego ze stojaka i określ przybliżoną pozycję nad odwróconym okularem mikroskopu, aby umieścić lunetę sekcyjną, aby umożliwić wizualizację szkiełka w małym powiększeniu.
3. Zmodyfikuj kartonowe pudełko tak, aby miało taką samą grubość, jak pożądany odstęp między odwróconą głowicą okularu lunety a lunetą sekcyjną, a następnie przyklej do odwróconego teleskopu za pomocą taśmy laboratoryjnej, którą można łatwo usunąć po zakończeniu eksperymentu. Dostosuj grubość pudełka zgodnie z dokładną konfiguracją głowicy okularu mikroskopu odwróconego oraz wielkością mikroskopu preparacyjnego tak, aby próbka znajdowała się w polu view bez konieczności przesuwania lunety sekcyjnej po jej zamocowaniu.
4. Trzymając lunetę sekcyjną przy pudełku, przesuwaj ją, aż szkiełko będzie ostre, a następnie ponownie przyklej do pudełka za pomocą taśmy laboratoryjnej. Ostateczna konfiguracja jest pokazana na rysunku 4.
5. Obrazy komórek przez odwróconą lunetę przy użyciu optyki DIC i soczewki obiektywu pneumatycznego 20X. Użyj kondensatora DIC o dużej odległości roboczej, aby zapewnić wystarczająco dużo miejsca do wykonania mikrochirurgii od góry.
6. Rejestruj obrazy z szybkością 2 obrazów/s za pomocą kamery CCD o rozdzielczości 512 x 512.
7. Rozpocznij akwizycję przed rozpoczęciem cięcia komórek, aby uchwycić początkowy wzorzec przepływu cytoplazmatycznego i obserwować wszystkie etapy procesu zranienia i gojenia się ran.
8. Zakończ akwizycję, gdy komórka wznowi normalny wygląd i/lub aktywną ruchliwość, w celu wizualizacji i pomiaru ruchów cytoplazmatycznych w całym procesie regeneracji.

5. Analiza przepływu cytoplazmatycznego podczas gojenia się ran

Zmierz przepływ cytoplazmatyczny za pomocą prędkości obrazu cząstek (PIV). Technika ta jest rutynowa w badaniach dynamiki płynów i może generować pola przepływu przy braku indywidualnie śledzonych cząstek w płynie. PIV został wykorzystany do pomiaru przepływów cytoplazmy w oparciu o obrazowanie pęcherzyków subkomórkowych i innych cech widocznych w cytoplazmie za pomocą mikroskopii światła przechodzącego¹⁴.

1. Pobierz PIVLab, pakiet MATLAB dla PIV, ze strony internetowej http://pivlab.blogspot.com/.
2. Załaduj stos obrazów tiff dla każdej sekwencji wideo do programu PIV w programie MATLAB.
3. Ręcznie wygeneruj maskę dla każdego stosu obrazów, aby zamaskować obszary nieprzetworzonych danych poza ciałem Stentora.
4. Ustaw PIVLab tak, aby używał ustawienia szybkiej transformaty Fouriera i rozmiaru kosza 64 x 64 pikseli, co spowoduje koszowanie pikseli w każdej klatce na większe piksele kwadratowe.
5. Uruchom PIVLab, aby obliczyć korelacje krzyżowe między pikselami w każdej klatce a pobliskimi pikselami w następnej klatce, aby uzyskać zależny od czasu wektor przepływu wyśrodkowany na każdym pikselu w binacji, który ma taką samą rozdzielczość czasową jak nasze surowe dane.
6. Oblicz średnie czasowe wynikowego pola wektorowego, aby wygenerować linie strumieniowe do porównania danych pobranych za pomocą stentora przed cięciem i podczas gojenia się rany, a także oblicz histogramy prędkości przepływu (w celu zbadania siły przepływu) i zmiany prędkości w danym pikselu w czasie (w celu zbadania wahań przepływu).
7. W przypadku sekwencji obrazów z Stentorem rozszczepionym na pół i cytoplazmą widocznie przeciekającą do otaczającego bufora, oblicz całkowity strumień cytoplazmy z powrotem do ciała komórki, mnożąc średnią prędkość przepływu przez pole przekroju poprzecznego podstawy zewnątrzkomórkowego pęcherzyka cytoplazmy.

Wyniki

Korzystając z opisanych powyżej protokołów, stwierdzono, że cytoplazma Stentora jest niezwykle dynamiczna, zarówno przed, jak i po cięciu. Film 1 pokazuje rozległy przepływ cytoplazmy obecnej w nieprzeciętych komórkach. Pomimo naszych pierwotnych oczekiwań, że zdolność Stentora do przetrwania cięcia będzie wiązała się z usztywnieniem lub żelowaniem cytoplazmy, w rzeczywistości, gdy komórki Stentora są cięte z wystarczającą gwałtownością, aby wyciągnąć cytoplazmę z komórki, cytoplazma pozostaje wysoce dynamiczna i udaje jej się wrócić do komórki w wysoce ukierunkowany sposób (Wideo 2).

Oprócz wykazania wcześniej nieoczekiwanego stopnia ruchu cytoplazmatycznego podczas gojenia się ran, wysoka rozdzielczość obrazowania w teście może być wykorzystana do ilościowego określenia natężenia przepływu za pomocą prędkości obrazu cząstek. Możliwość dokonywania takich pomiarów pozwoli na rygorystyczne testowanie działania inhibitorów chemicznych.

Rysunek 1. Morfologia żywej komórki Stentora. Obraz w ciemnym polu żywej komórki Stentora, która została nakarmiona Chlamydomonas zgodnie z opisem w Procedurze 1.3, widoczna jako zielony materiał wewnątrz wakuoli pokarmowych. Aparat ustny, przez który komórka je, jest widoczny jako obrzeże rzęsek w górnej części obrazu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 2. Przygotowanie szklanej igły do zabiegu. (A) Igła jest wyciągana z końca solidnego pręta szklanego. (B) Widok końcówki igły w dużym powiększeniu, wskazujący długość i ostrość niezbędną do operacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 3. Niestandardowy uchwyt na szkiełko nakrywkowe do mikrochirurgii. Aby umożliwić otwarty dostęp do zabiegu chirurgicznego, a jednocześnie zapewnić optymalne warunki obrazowania, komórki są montowane na szkiełku nakrywkowym, a nie na grubym szkiełku podstawowym. Aby szkiełko nakrywkowe zmieściło się na stoliku mikroskopu, można wykonać plastikowy uchwyt za pomocą drukarki 3D. Uchwyt ma takie same wymiary jak standardowe szkiełko mikroskopowe, a wgłębienie pośrodku odpowiada wymiarom szkiełka nakrywkowego. Otwór w jednym z rogów umożliwia wysunięcie szkiełka nakrywkowego z uchwytu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 4. Konfiguracja mikroskopu piętrowego. Głowica mikroskopu preparacyjnego jest zamontowana na górze głowicy okularu mikroskopu odwróconego. Taśma laboratoryjna pozwala na szybki montaż i demontaż aparatury po zakończeniu eksperymentu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Wideo 1. Przykład przepływu cytoplazmatycznego obserwowanego w żywej komórce Stentora. Komórka obrazowana obiektywem 10X z optyką ciemnego pola z szybkością 2 klatek na sekundę.

Wideo 2. Wyobrażam sobie komórkę Stentora, gdy jest cięta i przerywana szklaną igłą. Po przecięciu znaczna ilość cytoplazmy została wyciągnięta z głównego korpusu komórki, ale szybko przepływa z powrotem do komórki.

Dyskusja

Najważniejszym zastosowaniem tej metody będzie wykorzystanie jej do wyznaczenia szlaków molekularnych regulujących przepływ cytoplazmatyczny podczas gojenia się ran w Stentorze. Dostępna jest szeroka gama inhibitorów chemicznych, które działają na białka motoryczne, a także składniki cytoszkieletu. Inhibitory sygnalizacji wapniowej również byłyby prawdopodobnymi kandydatami. Interesujące byłoby również usunięcie lub zmniejszenie granulek pigmentu (ekstrusomów) zawierających niebieski pigment Stentorin, którego uwalnianie z komórki jest wyzwalane pod wpływem stresu, oraz pytanie, w jaki sposób egzocytotyczne uwalnianie Stentoryny może wpływać na przepływ pobliskiej cytoplazmy. Pigment można usunąć za pomocą prostego zabiegu wybielania¹⁵ , który można wykonać tuż przed cięciem. Wydaje się, że nie ma prostego sposobu na przeprowadzenie testu gojenia się ran w sposób równoległy, ponieważ komórki muszą być cięte i obrazowane pojedynczo. W ten sposób przy użyciu jednego mikroskopu możliwe byłoby operowanie i mierzenie komórek z szybkością około 1 na 0,5 godziny, tak że w ciągu jednego dnia pracy powinno być możliwe uzyskanie wystarczającej liczby punktów danych dla pojedynczego związku, aby określić, czy ma on statystycznie istotny wpływ na proces. Chociaż metoda ta nie jest w żadnym sensie wysokoprzepustowa, absolutnie wykonalne będzie przeprowadzenie badań przesiewowych za pomocą wybranego zestawu związków kandydujących specyficznych dla kilku starannie wybranych ścieżek docelowych.

Głównym ograniczeniem obecnego podejścia jest stosunkowo prymitywna metoda montażu mikroskopu piętrowego. Zakładając, że mikroskop odwrócony używany do obrazowania jest instrumentem ogólnego użytku, którego inni pracownicy muszą używać do innych celów, ważną kwestią jest łatwość, z jaką aparat można zdemontować i ponownie złożyć. O ile obecna metoda z wykorzystaniem taśmy laboratoryjnej jest rzeczywiście szybka i łatwa do zdemontowania, o tyle za każdym razem wymaga starannego wyrównania przez użytkownika podczas montażu. Istotną modyfikacją byłoby zatem skonstruowanie niestandardowego wymiennego uchwytu z otworami na głowicę okularu odwróconej lunety i korpus lunety sekcyjnej. Powinno to być łatwe do wyprodukowania przy użyciu nowoczesnej technologii drukarki 3D.

Drugim ograniczeniem tego podejścia jest poleganie na obrazowaniu DIC organelli wewnątrzkomórkowych jako markerów przepływu. Ponieważ tożsamość tych organelli obserwowanych w mikroskopie nie jest obecnie znana, nie jest możliwe poznanie ich wielkości ani potencjalnych interakcji z innymi składnikami komórkowymi. W związku z tym korzystne może być wstrzyknięcie zewnętrznych znaczników, takich jak kulki fluorescencyjne, i wykorzystanie ich do śledzenia przepływu. Wymagałoby to jednak dodatkowego etapu - mikroiniekcji - zanim eksperyment mógłby zostać przeprowadzony, co jeszcze bardziej spowolniłoby test.

Ostatnim kluczowym ograniczeniem jest poleganie na pojedynczej płaszczyźnie obrazu do pozyskiwania danych. Podstawowe znaczenie tego testu polega na tym, że wykracza on poza zwykłe pytanie, czy rana się goi, czy nie, i pozwala na uzyskanie szczegółowej analizy wzorca przepływu. W związku z tym niezwykle ważne będzie rozszerzenie obrazowania o obrazowanie trójwymiarowe. Obecna metoda obrazuje pojedynczą płaszczyznę ogniskową, a zatem po przeprowadzeniu analizy PIV wynikiem jest przekrój przez pełne trójwymiarowe pole przepływu. Jest to pouczające, ale niekompletne. Poprzez pozyskiwanie obrazów 3D na każdym kroku czasowym, powinno być możliwe uzyskanie w pełni trójwymiarowego pola przepływu. Będzie to szczególnie ważne dla dokładnej obserwacji, jak cytoplazma porusza się w bezpośrednim sąsiedztwie miejsca rany.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Stentor coeruleus żywa kultura	kultury Carolina Biological	131598
Metyloceluloza, 1,500 cP	Sigma	M0387
SPRZĘT:
Nazwa materiału	katalogowy		firmy
Mieszadło z miękkiego szkła 5 cali długości	Fisher Scientific	11-380A
Naczynie do hodowli bakterii 4,5 w 250 ml  szkło	Carolina Biological	741004
IX81 mikroskop odwrócony	Olympus
Axiovert 200M mikroskop odwrócony	Zeiss
Stemi 2000 Mikroskop stereoskopowy	Zeiss
Evolve 512 x 512 EMCCD	Fotometria
Plan Apo 20X obiektyw	Olympus	UPLSAPO