Obrazowanie potencjału błonowego barwnika brzuszno-przyśrodkowego neuronów podwzgórza od dorosłych myszy w celu zbadania wykrywania glukozy

Podsumowanie

Aktywność pojedynczych neuronów u myszy w wieku dorosłym może być badana poprzez dysocjację neuronów z określonych regionów mózgu i użycie obrazowania barwnika potencjału błony fluorescencyjnej. Testując reakcje na zmiany poziomu glukozy, technika ta może być wykorzystana do badania wrażliwości na glukozę dorosłych brzuszno-przyśrodkowych neuronów podwzgórza.

Streszczenie

Badania aktywności neuronalnej są często wykonywane przy użyciu neuronów od gryzoni w wieku poniżej 2 miesięcy, ze względu na trudności techniczne związane ze wzrostem tkanki łącznej i zmniejszoną żywotnością neuronów, które występują wraz z wiekiem. W tym miejscu opisujemy metodologię dysocjacji zdrowych neuronów podwzgórza od myszy w wieku dorosłym. Możliwość badania neuronów u myszy w wieku dorosłym pozwala na wykorzystanie modeli chorób, które ujawniają się w późniejszym wieku i mogą być bardziej dokładne rozwojowo w przypadku niektórych badań. Obrazowanie fluorescencyjne zdysocjowanych neuronów może być wykorzystane do badania aktywności populacji neuronów, w przeciwieństwie do wykorzystania elektrofizjologii do badania pojedynczego neuronu. Jest to szczególnie przydatne podczas badania heterogenicznej populacji neuronów, w której pożądany typ neuronów jest rzadki, na przykład w przypadku neuronów wykrywających glukozę w podwzgórzu. Wykorzystaliśmy obrazowanie barwnika potencjału błonowego dorosłych brzuszno-przyśrodkowych neuronów podwzgórza, aby zbadać ich reakcje na zmiany glukozy zewnątrzkomórkowej. Uważa się, że neurony wyczuwające glukozę odgrywają rolę w centralnej regulacji bilansu energetycznego. Możliwość badania wyczuwania glukozy u dorosłych gryzoni jest szczególnie przydatna, ponieważ przewaga chorób związanych z dysfunkcyjnym bilansem energetycznym (np. otyłość) wzrasta wraz z wiekiem.

Wprowadzenie

Mózg reguluje homeostazę energetyczną poprzez neuroendokrynny i autonomiczny układ nerwowy. Podwzgórze brzuszno-przyśrodkowe (VMH), składające się z jądra brzuszno-przyśrodkowego (VMN) i jądra łukowatego (ARC), jest ważne dla centralnej regulacji homeostazy energetycznej. Wyspecjalizowane neurony wykrywające glukozę w obrębie VMH łączą aktywność neuronalną i homeostazę glukozy obwodowej¹. Istnieją dwa rodzaje neuronów wyczuwających glukozę; neurony wzbudzone glukozą (GE) zwiększają się, podczas gdy neurony hamowane glukozą (GI) zmniejszają swoją aktywność wraz ze wzrostem glukozy zewnątrzkomórkowej. Neurony wykrywające glukozę VMH są zwykle badane za pomocą elektrofizjologii lub obrazowania barwnika wrażliwego na wapń/potencjał błonowy.

Technika elektrofizjologicznego zaciskania kropek jest uważana za złoty standard w badaniu aktywności neuronalnej ex vivo. W tej technice szklana elektroda do mikropipety jest przymocowana do błony komórkowej za pomocą uszczelki o wysokiej rezystancji (GΩ). Elektrody krosowe umożliwiają rejestrację w czasie rzeczywistym zmian częstotliwości potencjału czynnościowego (cęgi prądowe) lub przewodnictwa jonów (cęgi napięciowe) w obrębie pojedynczego neuronu. Podczas gdy technika patch clamp dostarcza szczegółowych informacji na temat zmian w określonych przewodnictwie kanałów jonowych, główną wadą jest to, że tylko jeden neuron może być obserwowany w tym samym czasie. Potrzeba około 30-45 minut zapisu, aby sprawdzić, czy nagrywa się z neuronu wykrywającego glukozę, zanim jeszcze rozpocznie się określone eksperymentalne leczenie. Co więcej, neurony GI i GE stanowią <20% całkowitej populacji neuronów VMH. Problem ten komplikuje brak, w wielu przypadkach, identyfikującego markera komórkowego dla tych neuronów. Oczywiste jest zatem, że pomimo dostarczania cennych informacji elektrycznych, których nie mogą dostarczyć inne techniki, analiza zacisków krosowych jest pracochłonna, czasochłonna i ma niską wydajność.

Wykorzystanie obrazowania fluorescencyjnego zdysocjowanych neuronów VMH pozwala na badanie setek neuronów jednocześnie. Barwniki wrażliwe na wapń mogą być używane do pomiaru wewnątrzkomórkowych zmian wapnia, które pośrednio korelują ze zmianami w aktywności neuronów. Barwniki wrażliwe na potencjał błonowy są używane do monitorowania zmian potencjału błonowego. Pomiar potencjału błony komórkowej jest bardziej bezpośrednim wskaźnikiem aktywności neuronalnej w porównaniu ze zmianami wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia. Co więcej, obrazowanie barwnika potencjału błonowego (MPD) potencjalnie wykrywa mniejsze zmiany w potencjale błonowym, w których wypalanie potencjału czynnościowego nie jest zmieniane, a wewnątrzkomórkowy poziom wapnia może się nie zmieniać. Obie te techniki obrazowania fluorescencyjnego zostały wykorzystane do badania neuronów wykrywających glukozę VMH u młodych myszy^2-7. Chociaż wyniki są mniej szczegółowe niż te uzyskane za pomocą elektrofizjologii z klamrą łatkową, siła eksperymentów obrazowych polega na tym, że jednocześnie oceniają one dużą populację komórek, które nieuchronnie obejmują znaczną liczbę neuronów wykrywających glukozę. Obrazowanie MPD jest szczególnie przydatne do badania neuronów przewodu pokarmowego, które są bardziej jednolicie zlokalizowane w całym VMH; zapewniając w ten sposób odpowiednią populację do badań w zdysocjowanym VMH (~15% GI). W przeciwieństwie do tego, podczas gdy neurony GE są gęsto zlokalizowane w brzuszno-bocznym regionie VMN i ubogim w komórkę między ARC i VMN, nie reprezentują one znaczącej liczby neuronów w obrębie VMH (<1% GE). Co więcej, dzięki badaniu izolowanych neuronów eliminowane są efekty astrocytarne i presynaptyczne. Może to być zaletą w badaniu efektów neuronów pierwszego rzędu, a także wadą, ponieważ utracone są fizjologiczne połączenia i procesy.

Czynnikiem ograniczającym zarówno w elektrofizjologii klamer plastrowych, jak i obrazowaniu MPD/barwnika wapniowego jest konieczność wykorzystania młodszych zwierząt (np. myszy lub szczurów w wieku <8 tygodni). Wynika to głównie ze zwiększonej tkanki łącznej w połączeniu ze zmniejszoną żywotnością neuronów, która występuje wraz z wiekiem. W badaniach elektrofizjologii wycinków mózgu zwiększona tkanka łączna utrudnia wizualizację neuronów. Zwiększona tkanka łączna utrudnia również dysocjację dużej liczby zdrowych neuronów w badaniach obrazowych. Co więcej, neurony pochodzące od młodszych zwierząt przeżywają dłużej zarówno podczas rejestrowania klamry, jak i obrazowania. Jednak wykorzystanie młodych myszy może być poważnym ograniczeniem. Aktywność neuronalna i/lub reakcje na neuroprzekaźniki lub krążące składniki odżywcze zmieniają się wraz z wiekiem. Na przykład, ponieważ bilans energetyczny jest ściśle związany ze statusem reprodukcyjnym, neurony podwzgórza regulujące bilans energetyczny mogą reagować inaczej u zwierząt przed i po okresie dojrzewania. Dodatkowo wiele chorób wymaga długotrwałego leczenia lub nie ujawnia się aż do wieku dorosłego. Najlepszymi przykładami takich chorób są otyłość dietetyczna lub cukrzyca typu 2. Ponieważ uważa się, że neurony wykrywające glukozę odgrywają rolę w tych chorobach, opracowaliśmy metodologię skutecznego hodowania zdrowych dorosłych neuronów VMH do wykorzystania w eksperymentach obrazowania MPD.

Protokół

1. Zwierzęta

1. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Medycyny i Stomatologii w New Jersey.
2. Grupowy dom samców myszy C57BL / 6 w harmonogramie 12 godzin światła / 12 godzin ciemności i umożliwia ad libitum dostęp do wody i pożywienia. Ofiara w wieku 4-5 miesięcy. Eutanazja myszy została przeprowadzona przy użyciu znieczulenia chirurgicznego i wtórnej formy eutanazji (tj. penetracji nacięcia do jamy klatki piersiowej przez przeponę). Jest to zgodne z wytycznymi AVMA dotyczącymi eutanazji.

2. Przygotowanie roztworu perfuzyjnego, szkiełek nakrywkowych, szklanych pipet i pożywek

1. Przygotować 1 l roztworu perfuzyjnego składającego się z 2,5 mM KCl, 7 mM MgCl₂, 1,25 mM NaH₂PO₄, 28 mM NaHCO₃, 0,5 mM CaCl₂, 7 mM glukozy, 1 mM askorbinianu i 3 mM pirogronianu w destylowanym dH₂O. Dostosuj osmolarność do ~300 mOsm używając około 80 g/l sacharozy. Natlenić przez bulgotanie 95%_O2 /5% CO₂ i dostosować pH do 7,4. Każdy eksperyment będzie wymagał około 200 ml roztworu perfuzyjnego. Podwielokrotności można przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 2 miesięcy.
2. Przygotować 250 ml bulionu Neurobasel zawierającego pożywkę Neurobasel bez glukozy, 2,5 mM glukozy i 100 j./ml penicyliny streptomycyny. Dostosuj osmolarność stada Neurobasel do 280 mOsm za pomocą sacharozy. Przygotuj 500 ml hibernacji zapasu zawierającego pożywkę Hibernate-A bez glukozy, 2,5 mM glukozy i 100 U/ml penicyliny streptomycyny.
3. Dobrze wymieszaj oba buliony i sterylizuj filtrem za pomocą filtrów próżniowych Stericum. Uważaj, aby nie wprowadzać glukozy ani innych zanieczyszczeń przez szklane naczynia lub mieszadła. Zawiń butelki w folię w celu ochrony podłoża przed światłem i przechowuj w temperaturze 4 °C przez okres do 2 miesięcy.
4. Podpal końcówki 4 autoklawowanych pipet szklanych (9 cali), aby końcówki nie były już ostre, a średnice otworów były duże (~0,9 mm), średnio-duże (~0,7 mm), średnie (~0,5 mm) i małe (~0,3 mm). Największy powinien być ledwo wypolerowany, a najmniejszy powinien mieć około jednej trzeciej tej średnicy.
5. W dniu poprzedzającym pobranie neuronów wyczyść cztery szkiełka nakrywkowe o średnicy 25 mm przy użyciu 70% etanolu i przepuść przez płomień palnika Bunsena. Umieścić każde szkiełko nakrywkowe w sterylnym naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm i dodać 2 ml sterylnej 1% poli-D-lizyny do_dH2O. Umieścić szalki w inkubatorze (37 °C) na noc. Następnego dnia przemyć jałowym dH₂O 3x i pozostawić szkiełka nakrywkowe do całkowitego wyschnięcia.
6. Przygotować 75 μl podwielokrotności 1 M kwasu mlekowego i 200 μl podwielokrotności GlutaMAX; przechowywać w temperaturze -20 °C. Przed użyciem całkowicie rozmrozić podwielokrotności kwasu mlekowego i GlutaMAX, aby zapewnić jednorodność.
7. W dniu pobrania neuronów przygotuj 30 ml świeżej pożywki hodowlanej składającej się z Hibernate-A zawierającego 1 mM kwasu mlekowego, 0,5 mM GlutaMAX i 2% B27 bez insuliny. Wirować i dostosować pH do 7,4 za pomocą 1 N NaOH.
8. Umieścić 10 ml pożywki hodowlanej na szklanej szalce Petriego o średnicy 60 mm na lodzie, umieścić 2 ml w stożkowej probówce o pojemności 15 ml na lodzie i utrzymać pozostałą pożywkę w temperaturze pokojowej.
9. W dniu pobrania neuronów przygotuj 25 ml świeżej pożywki wzrostowej składającej się z bulionu Neurobasal zawierającego 1 mM kwasu mlekowego, 0,5 mM GlutaMAX i 2% witaminy B27 bez insuliny. Wirować i dostosować pH do 7,4 za pomocą 1 N NaOH. Pozostawić świeżą pożywkę wzrostową do zrównoważenia w inkubatorze (37 °C, 5% CO₂) przez co najmniej 30 minut.

3. Perfuzja serca

1. Całkowicie rozmrozić 200 ml roztworu perfuzyjnego i natlenić 95%_O2/5% CO₂ na lodzie przez co najmniej 15 minut.
2. Umyj ostrze wibratomu acetonem, 70% etanolem i dH₂O. Umieść ostrze w wibratomie.
3. Przepłukać komorę chłodzącą wibratomu i rurkę perfuzyjną_dH2O. Napełnić komorę chłodzącą (4 °C) roztworem perfuzyjnym i kontynuować natlenianie.
4. Znieczulić mysz pentobarbitalem sodu 50 mg/ml, rozcieńczonym w stosunku 1:1 sterylną wodą, wstrzykniętym dootrzewnowo. Sprawdź, czy mysz jest w pełni znieczulona, szczypiąc ogon i obserwując brak reakcji.
5. Wlej zimny roztwór perfuzyjny do zbiornika perfuzyjnego i rurki tuż przed rozwarstwieniem. Zachowaj 20-30 ml na wypreparowanie mózgu i kontynuuj dotlenianie na lodzie. Przepływ grawitacyjny z podwyższonej strzykawki o pojemności 60 ml przez rurkę i igłę 20 G zapewnia wystarczający przepływ. Pozostawić roztwór do spłynięcia, aż pęcherzyki powietrza zostaną wypłukane. Kontynuuj dotlenianie.
6. Odetnij skórę powyżej klatki piersiowej myszy. Podnieś klatkę piersiową i ostrożnie wykonaj poziome cięcie przez membranę. Wykonaj dwa boczne nacięcia przez klatkę piersiową w kierunku ramion, aby odsłonić serce. Użyj kleszczy, aby przytrzymać klatkę piersiową.
7. Wykonaj małe nacięcie o średnicy 2 mm w prawym przedsionku, aby zapewnić punkt wyjścia dla krwi, która ma zostać wypłukana z układu naczyniowego.
8. Nakłuć lewą komorę igłą perfuzyjną, tylko na tyle, aby wprowadzić otwór igły. Jedną ręką przytrzymać igłę na miejscu, a drugą uruchomić przepływ roztworu perfuzyjnego. Po 10-15 ml roztworu perfuzyjnego krew należy wypłukać, a ścieki się oczyszczą.

4. Cięcie i sekcja mózgu

1. Po perfuzji serca przenieś natleniony zimny roztwór perfuzyjny na szalkę Petriego na lodzie tuż przed użyciem.
2. Szybko odetnij głowę, usuń mózg z czaszki i umieść mózg w roztworze perfuzyjnym. Aby usunąć mózg: pociągnij skórę do przodu, wykonaj nacięcie w linii środkowej czaszki w kierunku oczodołów, wykonaj 2 boczne nacięcia w kierunku każdego oka, użyj kleszczy, aby odciągnąć każdą stronę czaszki, wykonaj nacięcie koronalne między oczodołami i użyj szpatułki, aby delikatnie nakłonić mózg do roztworu perfuzyjnego. W razie potrzeby użyj nożyczek, aby przeciąć drogi wzrokowe. Nie dotykaj obszaru podwzgórza i nie ciągnij za drogi wzrokowe, ponieważ wywiera to zbyt duży nacisk na środkową wyniosłość i leżącą poniżej tkankę podwzgórza.
3. Użyj żyletki i igły, aby bocznie przyciąć tkankę mózgową około 3 mm z tyłu i z przodu podwzgórza, gdy tkanka jest zanurzona (bregma -3,52 mm). Szczególnie ważne jest, aby przednia strona cięcia była wypoziomowana, aby mózg siedział prosto na uchwycie wibratomowym.
4. Usuń pozostałą tkankę mózgową z roztworu i użyj bibuły filtracyjnej, aby usunąć roztwór z zamontowanej części mózgu.
5. Umieść odrobinę super kleju na wibratomie i rozprowadź klej do wielkości mózgu. Połóż tkankę mózgową na kleju przednią stroną skierowaną w dół, a podwzgórze skierowanym w stronę ostrza. Usuń nadmiar kleju i umieść uchwyt w komorze chłodzącej wibratomu. Należy zachować ostrożność, aby nie pozostawić dużo kleju, ponieważ po umieszczeniu w roztworze będzie on bulgotał wokół mózgu.
6. Przy wibratomie ustawionym na niską prędkość (poziom 2) i wysoką amplitudę (poziom 9) wykonaj plastry 300-500 μm, aż dotrzesz do obszaru podwzgórza. Teraz wykonaj cienkie plastry 100 μm, tnąc od tyłu do przodu. Wskazówki wizualne są następujące. Za podwzgórzem trzecia komora będzie bardzo mała (bregma -2,70 do -2,30 mm). Przy bregmie -2,30 mm trzecia komora jest podzielona na odcinki grzbietowe i brzuszne na przekroju koronalnym.
7. Gdy odcinki trzeciej komory połączą się, wykonaj dwie plastry o grubości 500 μm, które będą zawierały właściwy obszar VMH (bregma -2,18 do -1,22 mm). Trzecia komora, znajdująca się przed VMH, nie rozciąga się już do brzusznego dna mózgu (bregma -1,06 do -0,82)⁸.
8. Przenieść te plastry na szalkę Petriego na pożywce zawierającej lód. Przeanalizuj VMH (VMN + ARC), jak pokazano na rysunku 1. Za pomocą pipety delikatnie przenieś kawałki VMH do 2 ml pożywki hodowlanej na lodzie.

5. Dysocjacja i kultura

1. Wyjmij VMH z lodu i umieść w temperaturze pokojowej. Dodać 20 j./ml papainy do 4 ml pożywki hodowlanej. Odwrócić do wymieszania i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 34 °C. Sprawdzaj i mieszaj przez odwrócenie co minutę, aż pożywka wytrawiająca przestanie być mętna. Przefiltrować (0,22 μm) do sterylnej kolby i przenieść tkankę do pożywki wytrawiającej.
2. Trawić tkankę przez wytrząsanie z prędkością 100 obr./min w temperaturze 34 °C przez 30 min.
3. Podczas trawienia należy przygotować 1 ml pożywki zawierającej 8% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Rozpuścić 80 mg BSA w 1 ml pożywki hodowlanej i przefiltrować (0,22 μm) do stożkowej probówki.
4. Umyj tkankę, przenosząc ją do 5 ml pożywki hodowlanej w stożkowej probówce i powoli odwracając raz.
5. Dodać 30 μl enzymu DNazy do 6 ml pożywki hodowlanej i wymieszać, aby uzyskać pożywkę do rozcierania. Odessać pożywkę płuczącą i dodać 3 ml pożywki do rozcierania.
6. Użyj szklanych pipet, aby rozcierać w kolejności od największej do najmniejszej. Delikatnie rozcieraj 10x, a następnie odczekaj 4 min, aż większe kawałki opadną. Za pomocą drugiej pipety przenieść górne 2 ml zawierające zdysocjowaną zawiesinę komórek do nowej stożkowej probówki. Dodać 2 ml pożywki do rozcierania, rozcierać 10x i odczekać 3 min. Za pomocą trzeciej pipety przenieść górne 2 ml do zawiesiny komórek. Dodać 1 ml pożywki do rozcierania, rozcierać 5x i odczekać 2 min. Użyj czwartej pipety, aby przenieść górne 2 ml do zawiesiny komórek.
7. Ułóż zdysocjowaną zawiesinę komórkową na wierzchu 8% BSA, uważając, aby się nie wymieszać. Wirować z prędkością 1 000 obr./min przez 5 min.
8. Umieścić autoklawowane cylindry klonujące 6 mm x 8 mm na środku każdego szkiełka nakrywkowego. Szkiełka nakrywkowe muszą być całkowicie suche. Odessać i ponownie zawiesić osad w ciepłym podłożu o pojemności 440 μl. Napełnij cylindry klonujące zawiesiną neuronalną i umieść w inkubatorze na 20 minut.
9. Wyjmij cylindry klonujące i bardzo delikatnie zmyj zanieczyszczenia. Napełnij każde naczynie 2 ml pożywki wzrostowej. Pozwól komórkom zregenerować się przez co najmniej 1 godzinę przed wykonaniem jakichkolwiek testów.

6. Przygotowanie do obrazowania MPD

1. Przygotuj roztwór zapisu składający się ze 121 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 0,1 mM MgCl₂, 1,2 mM MgSO₄, 0,97 mM K₂HPO₄, 0,23 mM KH₂PO₄, 5 mM NaHCO₃ i 25 mM HEPES. Dostosować pH do 7,4.
2. Dodaj glukozę, aby uzyskać pożądany roztwór testowy o niskiej stężeniu glukozy (0,1-2,0 mM glukozy). Dokładnie wymieszaj i zarezerwuj 400 ml roztworu do zapisu niskiego poziomu glukozy. Dodaj glukozę do pozostałych 600 ml, aby uzyskać 2,5 mM roztwór do zapisu glukozy i dokładnie wymieszaj.
3. Chroń barwnik przed światłem tak bardzo, jak to możliwe. Dodać 4 ml buforu o temperaturze pokojowej do niebieskiej fiolki z MPD. Dokładnie wymieszać i dodać 5 μl barwnika na ml roztworu do nagrywania. Utrzymuj jednorodny roztwór, mieszając go pipetą między roztworami. Barwnik zawiera cząsteczki fluorescencyjne, które dostają się do komórek z depolaryzacją, oraz cząsteczki gaszące, które nie mogą przejść przez błonę komórkową. Podwielokrotności mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C i zużyte w ciągu 4 dni. Nie zamrażaj i nie rozmrażaj więcej niż raz.
4. Inkubować komórki w 2 ml 2,5 mM roztworu do zapisu glukozy i barwnika w temperaturze 34 °C przez 30 minut. Można zastosować suchy blok grzewczy. Chronić przed światłem.
5. Przygotuj pompy strzykawkowe i system perfuzyjny z roztworami rejestrującymi 2,5 mM i 0,1 mM oraz barwnikiem. Rurki ze strzykawek o pojemności 60 ml należy podłączyć do kolektora.
6. Po zatrzymaniu pompy należy odczekać ~10 sekund przed zmianą roztworów na kolektorze, aby zapobiec wzrostowi ciśnienia w strzykawce. Zmiany ciśnienia wpływają na dostarczanie płynu do zamkniętej komory zawierającej neurony, powodując zmiany ostrości mikroskopu podczas eksperymentu i zniekształcenie obrazów.
7. Rurkę wyjściową kolektora należy podłączyć do grzałki liniowej, a następnie rurki polietylenowej, która łączy się z zamkniętą komorą. Pęcherzyki należy usunąć, a szybkość perfuzji ustawić na 0,5 ml/min. Chronić przed światłem.
8. Przenieść szkiełko nakrywkowe o średnicy 25 mm z przylegającymi neuronami do zamkniętej komory, uważając, aby nie dopuścić do wyschnięcia szkiełka nakrywkowego i nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Poślizg jest wyrównany w rowkach dolnej części, kilka kropli roztworu nagrywającego umieszcza się po bokach, a górna część jest delikatnie dopasowywana, aby utrzymać szkiełko nakrywkowe na miejscu.
9. Za pomocą zakraplacza napełnij komorę roztworem nagrywającym, a następnie umieść na niej szkiełko nakrywkowe o średnicy 18 mm. Delikatnie włóż biały pierścień do komory, aby utrzymać mniejsze szkiełko nakrywkowe na miejscu. Dociskaj bardzo powoli i lekko, aby zapobiec przedostawaniu się pęcherzyków powietrza do zamkniętej komory.
10. Uruchomić pompę strzykawkową dla roztworu do zapisu stężenia glukozy o stężeniu 2,5 mM, nacisnąć biały pierścień i podłączyć do zamkniętej komory. Powoli zwolnij ciśnienie z białego pierścienia i podłącz do rurki prowadzącej do pojemnika na odpady.

7. Obrazowanie MPD

1. Wyśrodkuj neurony za pomocą światła o niskim jasnym polu. Staraj się zminimalizować czas, w którym komórki są wystawione na działanie światła.
2. Pozwól systemowi perfuzyjnemu działać przez 10 minut, aby umożliwić stabilizację temperatury, ostrości i równowagi barwnika.
3. Podczas przygotowania otwórz program MetaMorph i zrób zdjęcie neuronów w jasnym polu (10X). Użyj funkcji automatycznego ustawiania ostrości, aby wykonać 3 stosy obrazów fluorescencyjnych (150 ms, wąski filtr Cy3, 10X) i określić ostrość w zakresie 5 μm. Pod koniec 10-minutowego okresu zalewania ponownie sprawdź ostrość.
4. Rozpocznij rejestrowanie obrazów fluorescencyjnych co 30 sekund przez 40 minut. Ustal linię bazową przy 2,5 mM glukozy przez 10 minut, następnie zmniejsz poziom glukozy przez 15 minut, a na koniec wróć do 2,5 mM glukozy przez 15 minut. Roztwory zmienia się, zatrzymując pompę strzykawkową, odczekając 10 sekund, przekręcając port na kolektorze i uruchamiając kolejną pompę strzykawkową. Zmiany powinny nastąpić przed żądanymi punktami czasowymi w oparciu o opóźnienie między kolektorem a komórkami.
5. Po zarejestrowaniu wszystkich obrazów fluorescencyjnych wykonaj obraz neuronów w jasnym polu.

8. Analiza obrazowania MPD

1. Użyj MetaMorph, aby utworzyć owalne obszary wokół każdej komórki na obrazie jasnego pola wykonanym pod koniec eksperymentu. Regiony powinny być nieco większe niż każdy neuron i mogą znajdować się 1 piksel poza ciemną krawędzią komórki. Nie wybieraj komórek, które są w złym stanie, zachodzą na siebie lub znajdują się blisko zanieczyszczeń. Niezdrowe komórki często wydają się ciemne. Na koniec utwórz 5 dużych owalnych obszarów w obszarach bez komórek lub zanieczyszczeń do pomiarów tła.
2. Przenieś obszary na wszystkie obrazy fluorescencyjne i sprawdź, czy nie nastąpił żaden ruch/przesunięcie. Użyj funkcji Miara, aby zarejestrować intensywność fluorescencji każdego regionu dla wszystkich obrazów w pliku Excel. Zaleca się korzystanie z czasopism w Metamorph.
3. W programie Excel utwórz średnią z 5 regionów tła dla każdego obrazu fluorescencyjnego. Reprezentuje to średnią wartość tła w każdym punkcie czasowym. Dla każdego obrazu/punktu czasowego odejmij tło od wszystkich pomiarów regionu. Intensywność fluorescencji odjęta w tle będzie dalej określana jako intensywność.
4. Dla każdej komórki oblicz średnią intensywność w ciągu 2–8 minut nagrywania. Reprezentuje to linię bazową komórki w 2,5 mM glukozy. W celu zminimalizowania hałasu stosuje się 2-minutowy bufor na obu końcach każdego zabiegu.
5. Dla każdej komórki oblicz procentową zmianę w stosunku do linii bazowej: (Intensywność-Linia bazowa)/Linia bazowa
6. Utwórz wykres liniowy z procentową zmianą w stosunku do punktu odniesienia w stosunku do czasu.
7. Oblicz średnią procentową zmianę w stosunku do linii bazowej w ciągu minut 18–23. Oblicz średnią procentową zmianę w stosunku do linii bazowej w ciągu 35–40 minut. Gdy przetwarzanie obrazu nie jest używane, szum jest redukowany poprzez uśrednianie intensywności w każdym obszarze komórki, odejmowanie tła i uśrednianie intensywności regionu w ciągu 5 minut lub dłużej.
8. W celu określenia progu hałasu należy przeprowadzić eksperymenty kontrolne, w których 2,5 mM roztwór do zapisu glukozy jest zamieniany na 2,5 mM roztwór do zapisu glukozy. Oblicz średnią procentową zmianę w stosunku do wartości wyjściowej w ciągu minut 18-23 dla co najmniej 6 szalek i 3 myszy. Określ średnią i odchylenie standardowe tych wartości.
9. Ustaw próg dodatniej odpowiedzi depolaryzacyjnej na średnią plus 2 odchylenia standardowe. Średnia plus 2 odchylenia standardowe odpowiada różnicy z p<0,05. Nasze eksperymenty kontrolne wykazały 10% zmianę w stosunku do wartości wyjściowej jako odpowiednią wartość progową.
10. Dla każdej komórki oceń odwracalną odpowiedź na depolaryzację na podstawie 2 kryteriów. Po pierwsze, średnia zmiana procentowa w stosunku do linii bazowej w minutach 18–23 musi być większa niż 10%, czyli próg określony w poprzednim kroku. Po drugie, średnia zmiana procentowa w stosunku do linii bazowej w minutach 35–40 musi być mniejsza niż połowa średniej zmiany procentowej w stosunku do wartości wyjściowej w minutach 18–23. Drugie kryterium zostało wybrane, ponieważ okazało się, że jest bardziej rygorystyczne niż stymulacja glutaminianem lub KCl. Niezdrowe neurony często reagują na stymulację glutaminianem lub KCl, mimo że ich reakcje na obniżony poziom glukozy nie są odwracalne.
11. Dla każdej potrawy oblicz % zdepolaryzowanych neuronów. Wartość ta służy do ilościowego określenia % neuronów przewodu pokarmowego w różnych grupach badanych.

Wyniki

Precyzyjna dyssekcja VMH w celu oddzielenia go od innych obszarów podwzgórza jest istotna dla uzyskania powtarzalnych wyników. Włączenie innych obszarów mogłoby rozcieńczyć populację neuronów VMH, co zmieniłoby obliczony procent zdepolaryzowanych neuronów. Co więcej, neurony czułe na glukozę zidentyfikowano w innych regionach podwzgórza, takich jak podwzgórze boczne, które mogą różnić się funkcjonalnie i mechanistycznie od neuronów VMH czułych na glukozę. Rycina 1 przedstawia prawidłowe lokalizacje anato...

Dyskusja

Kluczem do możliwości badania aktywności neuronów u dorosłych myszy jest zdolność do dysocjacji zdrowych neuronów. Dysocjacja neuronów podwzgórza od dorosłych myszy jest trudniejsza na kilku kluczowych etapach protokołu w porównaniu z neuronami u młodych myszy. Udało nam się przezwyciężyć ten problem na wiele sposobów. Wytwarzanie grubych plasterków mózgu o grubości 500 μm minimalizuje mechaniczne uszkodzenia neuronów w porównaniu ze zwykłymi wycinkami o grubości 250-350 μm stosowanymi w tkance mózgowej młodszych myszy. ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Neurobasal-A Medium (Custom)	Invitrogen	0050128DJ	wykonane na zamówienie bez glukozy
Hibernate-A Medium (Custom)	BrainBits		wykonane na zamówienie bez glukozy
Penicylina streptomycyna (20 000 U/ml)	Invitrogen	15140	inni dostawcy dopuszczalne
Filtry próżniowe Stericup (0,22 μ m)	Milipore		inni dostawcy dopuszczalne
25 mm Szkiełka nakrywkowe	szklane Warner	#1 25mm okrągłe
18 mm Szkiełka nakrywkowe	szklane Warner	#1 18mm okrągłe
GlutaMAX	Invitrogen	35050
B27 minus insulina (50x)	Invitrogen	0050129SA
Żyletka	VWR	55411
Wibratom i komora chłodząca	Vibratome	Series 1000 System podziału na sekcje
Ostrza wibratome	Polysciences	22370	wtryskiwacz lub ostrza dwukrawędziowe od innych dostawców dopuszczalne
Papaina, zawieszenie	Worthington	LS003124
BSA, nadaje się do hodowli komórkowej	Sigma		inny dostawca akceptowalne
DNAse, do hodowli komórkowej	Invitrogen		Dopuszczalne
cylindry klonujące innego dostawcy, 6 mm x 8 mm	Bellco Glass	2090-00608
Barwnik potencjału membranowego (niebieski)	Urządzenia molekularne	R8042
Grzałka liniowa	Warner	SF-28
Pompy strzykawkowe	WPI	sp100i	inny dostawca dopuszczalny
Zamknięta komora	Warner	RC-43C
Rurka polietylenowa	Warner	PE-90
Metamorph	Molecular Devices		alternatywne oprogramowanie do analizy obrazu dopuszczalne Mikroskop
	Olympus	BX61 WI	używany z 10X  obiektywny
Kamera	Fotometria	Cool Snap HQ
Wąski zestaw filtrów	Cy3 Chroma	41007a
System oświetlenia	Sutter Instruments	Lambda DG-4