Method Article

Systematyczna analiza walcowania komórek in vitro przy użyciu systemu mikroprzepływowego z wielodołkową płytką

DOI:

10.3791/50866

⸱

October 16th, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Division of Biomedical Engineering, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, 2Center for Regenerative Therapeutics, Brigham and Women's Hospital, 3Harvard Medical School, Harvard University, 4Harvard Stem Cell Institute, Harvard University, 5Harvard-MIT Division of Health Sciences and Technology, 6Department of Mechanical Engineering, Massachusetts Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie wykorzystało wielodołkowy system mikroprzepływowy, znacznie zwiększając przepustowość badań toczenia komórek pod fizjologicznie istotnym przepływem ścinającym. Biorąc pod uwagę znaczenie zwijania komórek w wieloetapowej kaskadzie naprowadzania komórek oraz znaczenie naprowadzania komórek po ogólnoustrojowym dostarczeniu egzogennych populacji komórek u pacjentów, system ten oferuje potencjał jako platforma przesiewowa w celu ulepszenia terapii opartej na komórkach.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Głównym wyzwaniem dla terapii opartej na komórkach jest niemożność systemowego ukierunkowania dużej ilości żywotnych komórek z wysoką skutecznością do tkanek będących przedmiotem zainteresowania po infuzji dożylnej lub dotętniczej. W związku z tym zwiększenie naprowadzania komórek jest obecnie badane jako strategia poprawy terapii komórkowej. Zwijanie się komórek po śródbłonku naczyń krwionośnych jest ważnym krokiem w procesie naprowadzania komórek i może być badane in vitro przy użyciu komory z przepływem równoległym (PPFC). Jest to jednak niezwykle żmudny, niskoprzepustowy test, ze słabo kontrolowanymi warunkami przepływu. Zamiast tego zastosowaliśmy wielodołkowy system mikroprzepływowy płytkowy, który umożliwia badanie właściwości walcowania komórkowego przy wyższej przepustowości przy precyzyjnie kontrolowanym, fizjologicznie istotnym przepływie ścinającym1,2. W tym artykule pokazujemy, w jaki sposób można łatwo zbadać właściwości toczenia komórek HL-60 (ludzka białaczka promielocytowa) na powierzchniach pokrytych selektyną P i E, a także na powierzchniach pokrytych jednowarstwą komórek. Aby lepiej symulować stany zapalne, powierzchnię kanału mikroprzepływowego pokryto komórkami śródbłonka (EC), które następnie aktywowano czynnikiem martwicy nowotworu-α (TNF-α), znacznie zwiększając interakcje z komórkami HL-60 w warunkach dynamicznych. Zwiększona przepustowość i zintegrowana wieloparametrowa platforma analizy oprogramowania, która umożliwia szybką analizę parametrów, takich jak prędkość toczenia i ścieżka walcowania, są ważnymi zaletami w ocenie właściwości walcowania komórek in vitro. Umożliwiając szybką i dokładną analizę podejść inżynieryjnych zaprojektowanych w celu wpływu na zwijanie i naprowadzanie komórek, platforma ta może pomóc w rozwoju terapii opartej na komórkach egzogennych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z głównych wyzwań w udanym klinicznym translacji terapii komórkowej jest nieefektywne dostarczanie lub kierowanie komórek podawanych systemowo do pożądanych miejsc3,4. W związku z tym nieustannie poszukuje się podejść do poprawy naprowadzania komórek, a w szczególności rolowania komórek, jako strategii poprawy terapii komórkowej. Zwijanie się komórek na naczyniach krwionośnych jest kluczowym krokiem w kaskadzie naprowadzania komórek, klasycznie zdefiniowanej dla leukocytów, które są rekrutowane do miejsc chorobowych5. Etap ten jest regulowany przez specyficzne oddziaływania między selektorynami śródbłonka, tj. selektyną P i E (P- ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórkowa

  1. Ludzkie komórki białaczki promielocytowej (HL-60)
    1. Hodowla komórek HL-60 w 75 cm2 kolbach z 15 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco firmy Iscove (IMDM), uzupełnionego 20% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% (v/v) L-glutaminy i 1% (v/v) penicyliny-streptomycyny.
    2. Zmieniaj pożywkę co 3 dni, odsysając połowę objętości zawiesiny ogniw i zastępując ją kompletnymi pożywkami IMDM.
    3. Do barwienia dioctanem karboksyfluoresceiny, estrem sukcynimidylu (CFSE) odwirować zawiesinę komórek HL-60 (400 x g, 5 min), zawiesić w 1 μM roztworze CFSE (przygotowanym we wstępnie podgrzanym PBS) i inkubować przez ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki HL-60 toczą się po powierzchniach P- i E-selektyny, ale nie po fibronektynie

Komórki HL-60 są uważane za złote standardowe "rolki", ponieważ wyrażają różne samonaprowadzające się ligandy, w tym toczące się ligandy glikoproteiny P-sel ligand-1 (PSGL-1) i Sialyl-Lewis X (SLeX)5,14 (Rysunek 1A). Białko powierzchniowe PSGL-1 działa jak rusztowanie dla tetrasacharydu SLeX, pośrednicząc w specyficznej interakcji z P- i E-sel, które są regulowane w górę na śródbłonku .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z głównych wyzwań w skutecznej translacji terapii opartej na komórkach egzogennych jest niezdolność do skutecznego dostarczania komórek do miejsc urazów i stanów zapalnych z wysoką skutecznością wszczepienia3. Walcowanie komórek stanowi krytyczny krok w procesie naprowadzania komórek, ułatwiając spowalnianie komórek na ścianach naczyń krwionośnych, ostatecznie prowadząc do ich mocnego przylegania i transmigracji przez śródbłonek do tkanki5. Lepsze zrozumienie procesu walcowania dla typów komó.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki CHO-P były miłym prezentem od dr Barbary Furie (Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School). Praca ta była wspierana przez grant Narodowego Instytutu Zdrowia HL095722 dla J.M.K. Praca ta została również częściowo wsparta nagrodą Movember-Prostate Cancer Foundation Challenge Award dla J.M.K.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ludzkie mikronaczyniowe komórki śródbłonka płucLonzaCC-2527
Komórki jajnika chomika chińskiego z ekspresją selektyny P (CHO-P)Uprzejmy prezent od dr Barbary Furie11,12
HL-60 CellsATCCCCL-240
Cell Culture Reagents
Endothelial Basal MediumLonzaCC-3156
EBM-2 MediaLonzaCC-3156
Śródbłonkowe suplementy podłoża podstawowegoLonzaCC-4147
EGM-2 MV SingleQuotsLonzaCC-4147
IMDM - Zmodyfikowany Dulbecco's Medium firmy Iscove 1xGibco12440
F-12 (1x) Mieszanka składników odżywczych (szynka)Gibco11765-054
Penicylina Streptomycyna (P / S)Gibco15140
L-glutamina (L / G) 200 mMGibco25030
Surowica bydlęca płodu (FBS)Atlanta BiologicalsSa550
Szalki PetriegoBD FalconBD-353003
100 mm Naczynie do hodowli komórkowych, polistyren
poddany kulturze tkankowejProbówki wirówkowe (15 ml polipropylenowe probówki stożkowe)Kolby MedSupply PartnersTC1500
T75BD Falcon353136
Roztwór żelatyny (2%)SigmaG1393
dPBS (bez chlorku wapnia i chlorku magnezu)SigmaD8537
Roztwór trypsyny-EDTA (10x)SigmaT4174
Przeciwciała
Anti-hE-Selectin/CD62ER& D SystemsBBA21
FITC Sprzężona mysz IgG1R& D SystemsBBA21
Anty-hP-SelectinR& D SystemsBBA34
FITC Sprzężona mysz IgG1R& D SystemsBBA34
FITC Mysz IgG­ 1 κ Kontrola izotypuBD Bioscience555748
Anti-SLeX / CD15s Ab, klon: 5F18Santa CruzSC70545
FITC SprzężonySanta CruzSC70545
Normalna kontrola izotypu myszy IgM-FITCCruzSC2859
PE Mysz Anti-Human CD162, klon: KPL-1BD Pharmingen556055
PE Mouse IgG1 k Kontrola izotypuBD Pharmingen550617
Anti-P-Selectin Ab (AK4)Santa CruzSC19996
Anti-E-Selectin Ab, klon P2H3MilliporeMAB2150
Mouse IgG1 Isotype ControlSanta CruzSC3877
Inne odczynniki
Rekombinowany ludzki TNF-alfaPeproTech300-01A
CFSE - do cytometrii przepływowejInvitrogenC34554
Ludzkie białko rekombinowane P-selectin-FCR& D Systems137-PS-050
Ludzkie białko rekombinowane E-selektyna-FCR& D Systems724-ES-100
Fibronectin Human, PlasmaInvitrogen33016-015
Equipment
Bioflux 1000Fluxion BiosciencesBioflux Montage było oprogramowaniem używanym do przeprowadzania eksperymentów i analizy danych
BioFlux 48-dołkowe płytkiFluxion Biosciences
BD Accuri C6 Flow CytometrBD BioscienceCFlow Plus był oprogramowaniem używanym do przeprowadzania eksperymentów i analizy danych
Nikon Eclipse Ti-SNikon
CoolSnap HQ2Fotometria
Santa Zestaw do proliferacji komórek śladowych Aparat CCD

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Conant, C. G., et al. Well plate microfluidic system for investigation of dynamic platelet behavior under variable shear loads. Biotechnol. Bioeng. 108, 2978-2987 (2011).
  2. Conant, C. G., Schwartz, M. A., Ionescu-Zanetti, C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell RollingMicrofluidic SystemHL 60 CellsP SelectinE SelectinTNF AlphaEndothelial CellsShear FlowRolling VelocityParallel Plate Flow Chamber

Related Articles