Method Article

Systematyczna analiza walcowania komórek in vitro przy użyciu systemu mikroprzepływowego z wielodołkową płytką

DOI:

10.3791/50866

⸱

October 16th, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Division of Biomedical Engineering, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, 2Center for Regenerative Therapeutics, Brigham and Women's Hospital, 3Harvard Medical School, Harvard University, 4Harvard Stem Cell Institute, Harvard University, 5Harvard-MIT Division of Health Sciences and Technology, 6Department of Mechanical Engineering, Massachusetts Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie wykorzystało wielodołkowy system mikroprzepływowy, znacznie zwiększając przepustowość badań toczenia komórek pod fizjologicznie istotnym przepływem ścinającym. Biorąc pod uwagę znaczenie zwijania komórek w wieloetapowej kaskadzie naprowadzania komórek oraz znaczenie naprowadzania komórek po ogólnoustrojowym dostarczeniu egzogennych populacji komórek u pacjentów, system ten oferuje potencjał jako platforma przesiewowa w celu ulepszenia terapii opartej na komórkach.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Głównym wyzwaniem dla terapii opartej na komórkach jest niemożność systemowego ukierunkowania dużej ilości żywotnych komórek z wysoką skutecznością do tkanek będących przedmiotem zainteresowania po infuzji dożylnej lub dotętniczej. W związku z tym zwiększenie naprowadzania komórek jest obecnie badane jako strategia poprawy terapii komórkowej. Zwijanie się komórek po śródbłonku naczyń krwionośnych jest ważnym krokiem w procesie naprowadzania komórek i może być badane in vitro przy użyciu komory z przepływem równoległym (PPFC). Jest to jednak niezwykle żmudny, niskoprzepustowy test, ze słabo kontrolowanymi warunkami przepływu. Zamiast tego zastosowaliśmy wielodołkowy system mikroprzepływowy płytkowy, który umożliwia badanie właściwości walcowania komórkowego przy wyższej przepustowości przy precyzyjnie kontrolowanym, fizjologicznie istotnym przepływie ścinającym1,2. W tym artykule pokazujemy, w jaki sposób można łatwo zbadać właściwości toczenia komórek HL-60 (ludzka białaczka promielocytowa) na powierzchniach pokrytych selektyną P i E, a także na powierzchniach pokrytych jednowarstwą komórek. Aby lepiej symulować stany zapalne, powierzchnię kanału mikroprzepływowego pokryto komórkami śródbłonka (EC), które następnie aktywowano czynnikiem martwicy nowotworu-α (TNF-α), znacznie zwiększając interakcje z komórkami HL-60 w warunkach dynamicznych. Zwiększona przepustowość i zintegrowana wieloparametrowa platforma analizy oprogramowania, która umożliwia szybką analizę parametrów, takich jak prędkość toczenia i ścieżka walcowania, są ważnymi zaletami w ocenie właściwości walcowania komórek in vitro. Umożliwiając szybką i dokładną analizę podejść inżynieryjnych zaprojektowanych w celu wpływu na zwijanie i naprowadzanie komórek, platforma ta może pomóc w rozwoju terapii opartej na komórkach egzogennych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z głównych wyzwań w udanym klinicznym translacji terapii komórkowej jest nieefektywne dostarczanie lub kierowanie komórek podawanych systemowo do pożądanych miejsc3,4. W związku z tym nieustannie poszukuje się podejść do poprawy naprowadzania komórek, a w szczególności rolowania komórek, jako strategii poprawy terapii komórkowej. Zwijanie się komórek na naczyniach krwionośnych jest kluczowym krokiem w kaskadzie naprowadzania komórek, klasycznie zdefiniowanej dla leukocytów, które są rekrutowane do miejsc chorobowych5. Etap ten jest regulowany przez specyficzne oddziaływania między selektorynami śródbłonka, tj. selektyną P i E (P- i E-sel) a ich przeciwligandami na powierzchni leukocytów5,6. Lepsze zrozumienie i poprawa skuteczności naprowadzania komórek, a w szczególności etapu kroczącego, mają ogromne znaczenie w poszukiwaniu nowych platform do ulepszania terapii opartej na komórkach. Do tej pory osiągano to poprzez stosowanie równoległych płytowych komór przepływowych (PPFC), składających się z dwóch płaskich płyt z uszczelką między nimi, z portem dolotowym i odpływowym umieszczonym na górnej płycie, przez który zawiesina komórek jest perfektywna za pomocą pompy strzykawkowej7,8,9. Powierzchnia dolnej płyty może być pokryta odpowiednią monowarstwą/substratami komórkowymi, a następnie badana jest interakcja między perfundowanymi komórkami a powierzchnią pod wpływem przepływu ścinającego7. Jednak PPFC jest metodą o niskiej przepustowości, zużywającą odczynniki i dość żmudną, z tworzeniem się pęcherzyków, wyciekiem i słabo kontrolowanym przepływem, co stanowi poważne wady.

Alternatywną techniką dla tradycyjnego PPFC jest wielodołkowy system mikroprzepływowy, pozwalający na wyższą przepustowość testów komórkowych (do 10 razy wyższą niż PPFC) przy dokładnym, sterowanym komputerowo przepływie ścinającym, przy niskim zużyciu odczynników1,10. Eksperymenty z walcowaniem komórek są przeprowadzane wewnątrz kanałów mikroprzepływowych, które mogą być pokryte monowarstwami komórek lub zmodyfikowanymi podłożami i obrazowane za pomocą mikroskopu, a właściwości walcowania można łatwo przeanalizować za pomocą odpowiedniego oprogramowania. W tym badaniu demonstrujemy możliwości tego wielodołkowego systemu mikroprzepływowego z płytką, badając właściwości toczenia komórek ludzkiej białaczki promielocytowej (HL-60) na różnych powierzchniach. Przeanalizowano toczenie HL-60 na podłożach takich jak P-i E-sel, a także na monowarstwach komórkowych wyrażających różne receptory toczenia. Ponadto zastosowano blokowanie przeciwciał (Ab) w celu wykazania bezpośredniego udziału określonych selektyn w pośredniczeniu w ruchu toczenia HL-60 na tych powierzchniach. Eksperymenty walcowania przeprowadzono ze zwiększoną przepustowością, przy stabilnym przepływie ścinającym, przy minimalnym zużyciu odczynników/komórek, co pozwoliło na efektywną analizę kluczowych parametrów walcowania, takich jak prędkość walcowania, liczba komórek walcowania i właściwości ścieżki walcowania.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórkowa

  1. Ludzkie komórki białaczki promielocytowej (HL-60)
    1. Hodowla komórek HL-60 w 75 cm2 kolbach z 15 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco firmy Iscove (IMDM), uzupełnionego 20% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% (v/v) L-glutaminy i 1% (v/v) penicyliny-streptomycyny.
    2. Zmieniaj pożywkę co 3 dni, odsysając połowę objętości zawiesiny ogniw i zastępując ją kompletnymi pożywkami IMDM.
    3. Do barwienia dioctanem karboksyfluoresceiny, estrem sukcynimidylu (CFSE) odwirować zawiesinę komórek HL-60 (400 x g, 5 min), zawiesić w 1 μM roztworze CFSE (przygotowanym we wstępnie podgrzanym PBS) i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Następnie odwirować komórki, odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w świeżym, podgrzanym podłożu przez 30 minut. Umyj komórki w PBS, a następnie użyj do eksperymentów walcowania (patrz rysunek 1B dla reprezentatywnego obrazu komórek HL-60 barwionych CFSE na powierzchni pokrytej P-sel).

Uwaga: barwienie CFSE jest opcjonalne i jest tutaj przedstawione w celu zademonstrowania zjawiska toczenia w kanale mikroprzepływowym. Analizę parametrów walcowania przedstawionych w tym artykule przeprowadzono na niebarwionych komórkach przy użyciu standardowego obrazowania w jasnym polu.

  1. Komórki śródbłonka mikronaczyniowego płuc (LMVEC)
    1. Pokryć szalki Petriego o średnicy 100 mm 0,1% roztworem żelatyny (v/v w PBS) i inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut.
    2. Hodowla LMVEC na pokrytych żelatyną 100 mm szalkach Petriego w kompletnym podłożu do wzrostu śródbłonka (śródbłonkowe podłoże podstawowe-2 (EBM-2)), uzupełnione specjalnym zestawem suplementów wzrostu, patrz ODCZYNNIKI). Zmieniaj pożywkę co drugi dzień i komórki subkultury po osiągnięciu 80-90% konfluencji.
    3. W przypadku subhodowli przemyć komórki PBS, a następnie odłączyć komórki 4 ml 1x Trypsin-EDTA na 3 minuty w temperaturze 37 °C i zneutralizować w równej objętości kompletnej pożywki EBM-2. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i odwirować (400 x g, 5 min). Po odwirowaniu ponownie zawiesić osad w 1 ml kompletnego podłoża śródbłonkowego i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Nie należy nadmiernie pasżować komórek, ponieważ wpływa to na ich morfologię i funkcję - do wszystkich eksperymentów należy używać tylko komórek w pasażu 7.
  1. Komórki selektyny P jajnika chomika chińskiego (CHO-P)
    1. Komórki CHO-P, które są komórkami CHO stabilnie transfekowanymi w celu ekspresji ludzkiego P-sel, zostały dostarczone przez współpracowników (Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School)11,12.
    2. Hodowla komórek CHO-P w kolbach T175 cm2 w 25 ml pożywki F-12.
    3. W celu pasażowania przemyć komórki 10 ml PBS przez 4-5 sekund, a następnie trypsynizować w 10 ml 1x Trypsin-EDTA przez 3 minuty w temperaturze 37 °C, a następnie zneutralizować w pełnym pożywce.
    4. Odwirować zawiesinę komórkową (400 x g, 5 min), ostrożnie odessać supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pełnej pożywki i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.

2. Działanie zintegrowanego systemu mikroprzepływowego z płytką wielodołkową

  1. Upewnij się, że wszystkie urządzenia są prawidłowo podłączone i włącz różne moduły: komputer, kontroler, odwrócony mikroskop i kamerę CCD.
  2. Otwórz oprogramowanie do obrazowania i upewnij się, że moduł płytki wielodołkowej i moduł obrazowania są prawidłowo wyświetlane na ekranie.
  3. Podłącz rurki do odwadniacza oparów (podłączonego do sterownika), a także podłącz je do interfejsu ciśnieniowego.
  4. Umieść płytkę wielodołkową w grzałce/adapterze płytkowym. Dodaj odczynniki do studzienek (opisanych poniżej) i przymocuj interfejs na górze płytki. Umieść płytkę do obrazowania na zautomatyzowanym stoliku.
  5. Interfejs mocuje się do górnej części płyty i wywiera ciśnienie pneumatyczne ze sterownika na górę studzienek, kierując płyn przez kanały mikroprzepływowe z określonym natężeniem przepływu, łatwo kontrolowanym za pomocą ekranu modułu płyty wielodołkowej w trybie ręcznym.
  6. Odczynniki w kanale przepływają przez obszar obserwacyjny, znajdujący się między studzienkami. Wymiary kanału mikroprzepływowego to 350 μm szerokości x 70 μm wysokości. Długość kanału liniowego wynosi 1 mm, a dolna część kanałów składa się ze szkła nakrywkowego o grubości 180 μm, które jest kompatybilne z mikroskopią jasnego pola, fazową, fluorescencyjną i konfokalną.
  7. Nagrywaj filmy za pomocą kamery CCD (akwizycja strumienia, 11 klatek/s) i analizuj je za pomocą kompatybilnego oprogramowania.

3. Powlekanie kanałów mikroprzepływowych substratem białkowym lub monowarstwą komórkową

  1. Powlekanie kanału mikroprzepływowego fibronektyną lub selektyną P/E
    1. Przygotować 1 ml roztworu fibronektyny o stężeniu 20 μg/ml w PBS. Zmieniaj objętość w zależności od liczby kanałów, które mają być pokryte (użyj 25-50 μl fibronektyny na kanał).
    2. Dodaj 25-50 μl roztworu fibronektyny do każdego dołka wlotowego. Zastosuj siłę tnącą 2 dyn/cm2 przez 5 minut, aby perfować kanał. Proszę zwrócić uwagę na kroplę płynu pojawiającą się w studzience wylotowej. Inkubować przez 30-45 minut w R.T.
    3. Zassać roztwór ze studzienek (nie zasysać bezpośrednio ze środkowego okręgu zasilającego kanał)1,13. Dodać 200-500 μl PBS do studzienki wylotowej i przepłukać kanał PBS, stosując przepływ ścinający 2 dyn/cm2 przez 5 minut. Kanał jest teraz odpowiednio pokryty fibronektyną i gotowy do użycia.
    4. W celu pokrycia P- lub E-sel należy przygotować roztwór o stężeniu 5 μg/ml pożądanego ludzkiego rekombinowanego białka w PBS i pokryć kanały zgodnie z powyższym opisem, z 1-godzinną inkubacją w temperaturze 37 °C, aby umożliwić pokrycie powierzchni.
  2. Tworzenie monowarstwy CHO-P lub LMVEC wewnątrz kanału mikroprzepływowego
    1. Delikatnie trypsynizować komórki z szalek hodowlanych przez 3 minuty, schłodzić przy użyciu 2-krotnej objętości pełnej pożywki i odwirować (5 min przy 400 x g). Zawiesić komórki w 10 ml pełnej pożywki i ponownie odwirować (5 minut przy 400 x g).
    2. Policz komórki, aby określić stężenie komórek w zawiesinie. Aby zapewnić utworzenie zlewającej się monowarstwy LMVEC wewnątrz kanału, należy doprowadzić stężenie komórek do 15-20 milionów komórek/ml. W przypadku zlewającej się monowarstwy komórek CHO-P użyj 50-60 milionów komórek/ml. Użyj 25-50 μl zawiesiny komórkowej dla każdego kanału - określ odpowiednio początkową liczbę komórek użytych w eksperymencie.
    3. Dodać 25-50 μl zawiesiny komórek w odpowiednim stężeniu do studzienki wlotowej. Umieścić płytkę na stoliku mikroskopu i wprowadzić komórki do kanału (2 dyn/cm2), aż na ekranie zostaną zaobserwowane komórki wypełniające całe kanały, a następnie zatrzymaj przepływ.
    4. Napełnij zarówno wylot, jak i wlot 200 μl pełnego podłoża LMVEC lub CHO. Pozwól komórkom osiąść i przylegać przez 3 godziny w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ).
    5. Po 3-godzinnej inkubacji przemyj kanał pełną pożywką (2 dyn/cm2, 10-15 min) w celu usunięcia nieprzyłączonych komórek. Komórki powinny teraz wydawać się całkowicie zlewające, a kanał jest teraz gotowy do użycia. W zależności od początkowej gęstości wysiewu komórek, może być wymagane dodatkowe 2-3 godziny czasu osiadania, aby zapewnić całkowite pokrycie powierzchni komórkami.

4. Aktywacja prozapalna LMVEC i blokowanie przeciwciał selektyny P/E-.

  1. Przygotować roztwór TNF-α (10 ng/ml) w podłożu podstawowym LMVEC.
  2. Aby wywołać zapalną aktywację LMVEC w kanałach, dodaj 100 μl roztworu TNF-α do studzienki wlotowej i wprowadź roztwór do kanału, stosując przepływ ścinający 2 dyn/cm2 przez 5 minut. W przypadku kanałów kontrolnych (nieaktywowane EC) dodać 100 μl podłoża podstawowego LMVEC do studzienki wlotowej i wprowadzić do kanału (2 dyn/cm2 przez 5 min). Kanał jest teraz gotowy do testu kroczącego.
  3. Aby zablokować P-sel i E-sel na komórkach LMVEC i CHO-P, należy wprowadzić do kanału przeciwciała neutralizujące P-sel (klon AK4, 5 μg/ml w pożywce podstawowej) lub E-sel (klon P2H3, 5 μg/ml w pożywce podstawowej) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Następnie przemyć kanały pożywką podstawową (2 dyn/cm2 przez 5 min). Kanały są teraz gotowe do testu kroczącego.

5. Test walcowania HL-60 na kanałach mikroprzepływowych pokrytych monowarstwą substratu/komórki

  1. Dokładnie zbadaj kanały pod mikroskopem, aby upewnić się, że kanały są prawidłowo pokryte (w przypadku powlekania komórkami należy obserwować w pełni zlewającą się monowarstwę komórek).
  2. Aby przygotować zawiesinę komórek HL-60 do eksperymentów walcowych, odwirować zawiesinę komórek HL-60 (5 min przy 400 x g) i przemyć raz pożywką podstawową. Policz komórki i ponownie zawieś w IMDM (pożywka podstawowa, zawierająca Ca2+ i Mg2 +), aby utworzyć zawiesinę komórek HL-60 o stężeniu 5 milionów komórek/ml. Użyj 25-50 μl zawiesiny komórek dla każdego kanału, aby przeprowadzić test walcowania.
  3. Dodać 25-50 μl zawiesiny komórek do studzienki wylotowej, umieścić płytkę w uchwycie płytki o kontrolowanej temperaturze (37 °C) i umieścić na stoliku mikroskopu. Następnie wprowadź komórki do kanału, przykładając siłę ścinającą 2 dyn/cm2 (komórki powinny być obserwowane w ciągu 10-15 sekund przepływając od wylotu do wlotu).
  4. Aby zbadać reakcję toczenia w funkcji naprężenia ścinającego, zmniejsz ścinanie do 0,25 dyn/cm2 i uzyskaj 20-30 sekund filmów (za pomocą funkcji "akwizycji strumieniowej") dla każdego żądanego ścinania (stopniowo zwiększaj ścinanie od 0,25 do 5 dyn/cm2. Możliwe jest również użycie wyższych nożyc).
  5. Nagrywaj filmy za pomocą kamery CCD (akwizycja strumienia, 11 klatek/s) i analizuj ścieżki toczenia i prędkości toczenia za pomocą kompatybilnego oprogramowania.

6. Cytometria przepływowa do wykrywania ekspresji cząsteczek powierzchniowych

  1. Po trypsynizacji należy przygotować zawiesinę komórkową (używając 1-2 x 105 komórek/próbkę) o pożądanym typie komórek (HL-60, CHO-P lub LMVECs) w PBS (-/-), uzupełnioną 2% FBS. Umyć komórki dwukrotnie i doprowadzić objętość próbki do 50 μl (przy użyciu tego samego buforu).
  2. Inkubować każdą próbkę z pożądanym sprzężonym z fluoroforem Ab (szczegółowe informacje znajdują się w załączonej tabeli) w temperaturze 4 °C przez 20 minut (przykryć folią aluminiową).
  3. Przemyć komórki dwukrotnie (ten sam bufor) i doprowadzić końcową objętość wybarwionej zawiesiny komórek do 200 μl. Analizować próbki za pomocą cytometru przepływowego w celu wykrycia ekspresji cząsteczek powierzchniowych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki HL-60 toczą się po powierzchniach P- i E-selektyny, ale nie po fibronektynie

Komórki HL-60 są uważane za złote standardowe "rolki", ponieważ wyrażają różne samonaprowadzające się ligandy, w tym toczące się ligandy glikoproteiny P-sel ligand-1 (PSGL-1) i Sialyl-Lewis X (SLeX)5,14 (Rysunek 1A). Białko powierzchniowe PSGL-1 działa jak rusztowanie dla tetrasacharydu SLeX, pośrednicząc w specyficznej interakcji z P- i E-sel, które są regulowane w górę na śródbłonku ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z głównych wyzwań w skutecznej translacji terapii opartej na komórkach egzogennych jest niezdolność do skutecznego dostarczania komórek do miejsc urazów i stanów zapalnych z wysoką skutecznością wszczepienia3. Walcowanie komórek stanowi krytyczny krok w procesie naprowadzania komórek, ułatwiając spowalnianie komórek na ścianach naczyń krwionośnych, ostatecznie prowadząc do ich mocnego przylegania i transmigracji przez śródbłonek do tkanki5. Lepsze zrozumienie procesu walcowania dla typów komó...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki CHO-P były miłym prezentem od dr Barbary Furie (Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School). Praca ta była wspierana przez grant Narodowego Instytutu Zdrowia HL095722 dla J.M.K. Praca ta została również częściowo wsparta nagrodą Movember-Prostate Cancer Foundation Challenge Award dla J.M.K.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ludzkie mikronaczyniowe komórki śródbłonka płucLonzaCC-2527
Komórki jajnika chomika chińskiego z ekspresją selektyny P (CHO-P)Uprzejmy prezent od dr Barbary Furie11,12
HL-60 CellsATCCCCL-240
Cell Culture Reagents
Endothelial Basal MediumLonzaCC-3156
EBM-2 MediaLonzaCC-3156
Śródbłonkowe suplementy podłoża podstawowegoLonzaCC-4147
EGM-2 MV SingleQuotsLonzaCC-4147
IMDM - Zmodyfikowany Dulbecco's Medium firmy Iscove 1xGibco12440
F-12 (1x) Mieszanka składników odżywczych (szynka)Gibco11765-054
Penicylina Streptomycyna (P / S)Gibco15140
L-glutamina (L / G) 200 mMGibco25030
Surowica bydlęca płodu (FBS)Atlanta BiologicalsSa550
Szalki PetriegoBD FalconBD-353003
100 mm Naczynie do hodowli komórkowych, polistyren
poddany kulturze tkankowejProbówki wirówkowe (15 ml polipropylenowe probówki stożkowe)Kolby MedSupply PartnersTC1500
T75BD Falcon353136
Roztwór żelatyny (2%)SigmaG1393
dPBS (bez chlorku wapnia i chlorku magnezu)SigmaD8537
Roztwór trypsyny-EDTA (10x)SigmaT4174
Przeciwciała
Anti-hE-Selectin/CD62ER& D SystemsBBA21
FITC Sprzężona mysz IgG1R& D SystemsBBA21
Anty-hP-SelectinR& D SystemsBBA34
FITC Sprzężona mysz IgG1R& D SystemsBBA34
FITC Mysz IgG­ 1 κ Kontrola izotypuBD Bioscience555748
Anti-SLeX / CD15s Ab, klon: 5F18Santa CruzSC70545
FITC SprzężonySanta CruzSC70545
Normalna kontrola izotypu myszy IgM-FITCCruzSC2859
PE Mysz Anti-Human CD162, klon: KPL-1BD Pharmingen556055
PE Mouse IgG1 k Kontrola izotypuBD Pharmingen550617
Anti-P-Selectin Ab (AK4)Santa CruzSC19996
Anti-E-Selectin Ab, klon P2H3MilliporeMAB2150
Mouse IgG1 Isotype ControlSanta CruzSC3877
Inne odczynniki
Rekombinowany ludzki TNF-alfaPeproTech300-01A
CFSE - do cytometrii przepływowejInvitrogenC34554
Ludzkie białko rekombinowane P-selectin-FCR& D Systems137-PS-050
Ludzkie białko rekombinowane E-selektyna-FCR& D Systems724-ES-100
Fibronectin Human, PlasmaInvitrogen33016-015
Equipment
Bioflux 1000Fluxion BiosciencesBioflux Montage było oprogramowaniem używanym do przeprowadzania eksperymentów i analizy danych
BioFlux 48-dołkowe płytkiFluxion Biosciences
BD Accuri C6 Flow CytometrBD BioscienceCFlow Plus był oprogramowaniem używanym do przeprowadzania eksperymentów i analizy danych
Nikon Eclipse Ti-SNikon
CoolSnap HQ2Fotometria
Santa Zestaw do proliferacji komórek śladowych Aparat CCD

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Conant, C. G., et al. Well plate microfluidic system for investigation of dynamic platelet behavior under variable shear loads. Biotechnol. Bioeng. 108, 2978-2987 (2011).
  2. Conant, C. G., Schwartz, M. A., Ionescu-Zanetti, C. Well plate-coupled microfluidic devices designed for facile image-based cell adhesion and transmigration assays. J. Biomol. Screen. 15, 102-106 (2010).
  3. Ankrum, J., Karp, J. M. Mesenchymal stem cell therapy: Two steps forward, one step back. Trends Mol. Med. 16, 203-209 (2010).
  4. Karp, J. M., Leng Teo, G. S. Mesenchymal stem cell homing: the devil is in the details. Cell Stem Cell. 4, 206-216 (2009).
  5. Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).
  6. Ley, K. The role of selectins in inflammation and disease. Trends Mol. Med. 9, 263-268 (2003).
  7. Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro. Methods Enzymol. 416 (06), 346-371 (2006).
  8. Brown, D. C., Larson, R. S. Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements. BMC Immunol. 2, 9(2001).
  9. Lawrence, M. B., McIntire, L. V., Eskin, S. G. Effect of flow on polymorphonuclear leukocyte/endothelial cell adhesion. Blood. 70, 1284-1290 (1987).
  10. Conant, C. G., Schwartz, M. A., Nevill, T., Ionescu-Zanetti, C. Platelet adhesion and aggregation under flow using microfluidic flow cells. J. Vis. Exp. (10), e1644(2009).
  11. Furie, B., Furie, B. C. Role of platelet P-selectin and microparticle PSGL-1 in thrombus formation. Trends Mol. Med. 10, 171-178 (2004).
  12. Tchernychev, B., Furie, B., Furie, B. C. Peritoneal macrophages express both P-selectin and PSGL-1. J. Cell Biol. 163, 1145-1155 (2003).
  13. Conant, C. G., et al. Using well-plate microfluidic devices to conduct shear-based thrombosis assays. J Lab Autom. 16, 148-152 (2011).
  14. Larsen, G. R., et al. P-selectin and E-selectin. Distinct but overlapping leukocyte ligand specificities. J. Biol. Chem. 267, 11104-11110 (1992).
  15. Varki, A. Selectin ligands: will the real ones please stand up. J. Clin. Invest. 100, S31-S35 (1997).
  16. Bohnsack, J. F., Chang, J. Activation of beta 1 integrin fibronectin receptors on HL60 cells after granulocytic differentiation. Blood. 83, 543-552 (1994).
  17. Lawrence, M. B., Kansas, G. S., Kunkel, E. J., Ley, K. Threshold levels of fluid shear promote leukocyte adhesion through selectins (CD62L,P,E). J. Cell Biol. 136, 717-727 (1997).
  18. Moore, K. L., et al. P-selectin glycoprotein ligand-1 mediates rolling of human neutrophils on P-selectin. J. Cell Biol. 128, 661-671 (1995).
  19. Lawrence, M. B., Springer, T. A. Neutrophils roll on E-selectin. J Immunol. 151, 6338-6346 (1993).
  20. Yao, L., et al. Divergent inducible expression of P-selectin and E-selectin in mice and primates. Blood. 94, 3820-3828 (1999).
  21. Sackstein, R. Glycoengineering of HCELL, the human bone marrow homing receptor: sweetly programming cell migration. Ann. Biomed. Eng. 40, 766-776 (2012).
  22. Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J. Vis. Exp. , e1009(2009).
  23. Muller, W. A., Luscinskas, F. W. Assays of transendothelial migration in vitro. Methods Enzymol. 443, 155-176 (2008).
  24. Bakker, D. P., vander Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., vander Mei, H. C. Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 69, 6280-6287 (2003).
  25. Benoit, M. R., Conant, C. G., Ionescu-Zanetti, C., Schwartz, M., Matin, A. New device for high-throughput viability screening of flow biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 76, 4136-4142 (2010).
  26. Varki, A. Selectin ligands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 7390-7397 (1994).
  27. Ramos, C. L., et al. Direct demonstration of P-selectin- and VCAM-1-dependent mononuclear cell rolling in early atherosclerotic lesions of apolipoprotein E-deficient mice. Circ. Res. 84, 1237-1244 (1999).
  28. Yago, T., et al. Core 1-derived O-glycans are essential E-selectin ligands on neutrophils. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (2010).
  29. Yago, T., et al. E-selectin engages PSGL-1 and CD44 through a common signaling pathway to induce integrin alphaLbeta2-mediated slow leukocyte rolling. Blood. 116, 485-494 (2010).
  30. Simone, G., et al. Cell rolling and adhesion on surfaces in shear flow. A model for an antibody-based microfluidic screening system. Microelectronic Eng. 98, 668-671 (2012).
  31. Perozziello, G., et al. Microfluidic devices modulate tumor cell line susceptibility to NK cell recognition. Small. 8, 2886-2894 (2012).
  32. Perozziello, G., et al. Microfluidic biofunctionalisation protocols to form multivalent interactions for cell rolling and phenotype modification investigations. Electrophoresis. , (2013).
  33. Simone, G., et al. A facile in situ microfluidic method for creating multivalent surfaces: toward functional glycomics. Lab Chip. 12, 1500-1507 (2012).
  34. Sarkar, D., et al. Engineered cell homing. Blood. 118, e184-e191 (2011).
  35. Cheng, Z., et al. Targeted Migration of Mesenchymal Stem Cells Modified With CXCR4 Gene to Infarcted Myocardium Improves Cardiac Performance. Mol. Ther. 16, 571-579 (2008).
  36. Enoki, C., et al. Enhanced mesenchymal cell engraftment by IGF-1 improves left ventricular function in rats undergoing myocardial infarction. Int. J. Cardiol. 138, 9-18 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell RollingMicrofluidic SystemHL 60 CellsP SelectinE SelectinTNF AlphaEndothelial CellsShear FlowRolling VelocityParallel Plate Flow Chamber

Related Articles