Używanie skanerów płaskich do zbierania poklatkowych obrazów o wysokiej rozdzielczości odpowiedzi grawitropowej korzenia rzodkiewnika

Podsumowanie

Ten protokół opisuje proces szybkiego zbierania obrazów sadzonek rzodkiewnika reagujących na bodziec grawitacyjny za pomocą dostępnych na rynku skanerów płaskich. Metoda ta pozwala na niedrogie, wysokonakładowe przechwytywanie obrazów o wysokiej rozdzielczości, które można poddać dalszym algorytmom analizy.

Streszczenie

Badania w dziedzinie biologii coraz częściej wymagają stosowania metodologii, które umożliwiają gromadzenie dużych ilości danych o wysokiej rozdzielczości. Wyzwaniem, przed którym mogą stanąć laboratoria, jest opracowanie i osiągnięcie tych metod. Obserwacja fenotypów w interesującym nas procesie jest typowym celem laboratoriów badawczych zajmujących się funkcją genów i często osiąga się to poprzez przechwytywanie obrazu. Szczególnym procesem, który można obserwować przy użyciu metod obrazowania, jest korekcyjny wzrost korzenia siewki, który został przemieszczony z wyrównania z wektorem grawitacji. Platformy obrazowania używane do pomiaru odpowiedzi grawitropowej korzeni mogą być drogie, stosunkowo niskie pod względem przepustowości i/lub pracochłonne. Problemy te zostały rozwiązane przez opracowanie metody przechwytywania obrazów o wysokiej przepustowości przy użyciu niedrogich, ale płaskich skanerów o wysokiej rozdzielczości. Dzięki tej metodzie obrazy mogą być rejestrowane co kilka minut w rozdzielczości 4 800 dpi. Obecna konfiguracja umożliwia zebranie 216 indywidualnych odpowiedzi dziennie. Zebrane dane obrazowe są wystarczająco wysokiej jakości, aby można je było wykorzystać w aplikacjach do analizy obrazu.

Wprowadzenie

Zbiór danych fenotypowych o wysokiej rozdzielczości jest przydatny w badaniach, które mają na celu zrozumienie wzajemnych zależności między genetyką a środowiskiem w pośredniczeniu w funkcjonowaniu organizmu^1,2. Badania tego rodzaju są również z natury duże pod względem skali, co dodatkowo wymaga, aby metody stosowane do pomiaru fenotypów w tym kontekście były wysokoprzepustowe^3,4. Przy ustalaniu metod badań na skalę fenomiczną w grę wchodzą kompromisy między przepustowością a rozdzielczością. Metody, które mają wyższą przepustowość, mają również zwykle niższą rozdzielczość, co utrudnia wykrycie niewielkich efektów genetyki lub środowiska⁵. Alternatywnie, metody, które dokładniej mierzą pożądany fenotyp, są również zwykle mniej wydajne, co utrudnia szerokie badanie skutków genetycznych i środowiskowych. Ponadto ręczne metody ilościowego określania fenotypów, w tym oględziny, mogą ulegać zmianom ze względu na różnice w ludzkiej percepcji⁶.

Technologie obrazowania mogą stanowić użyteczny pomost między przepustowością a rozdzielczością w uzyskiwaniu obserwacji fenotypowych^7-9. Ogólnie rzecz biorąc, obraz jest stosunkowo łatwy do uchwycenia, co ułatwia przepustowość, a gdy jest wykonany w wystarczającej rozdzielczości, można wykryć subtelne fenotypy^1,2,7. Technologie obrazowania są zwykle modyfikowalne w celu dopasowania do systemu lub procesu będącego przedmiotem zainteresowania i są na ogół skalowalne^{w zakresie 10-12}. Z tego powodu technologie obrazowania są idealne do opracowywania badań nad funkcjonowaniem organizmu na dużą skalę.

Reakcja pierwotnego korzenia na bodziec grawitacyjny to skomplikowany proces fizjologiczny, który zachodzi w morfologicznie prostym organie. Odpowiedź polega na aktywacji szlaków sygnałowych, które rozchodzą się przez narząd korzeniowy, a jej postęp jest determinowany przez czynniki środowiskowe i genetyczne, w tym czynniki genetyczne pod wpływem środowiska^12-14. Reakcja pierwotnego korzenia na bodziec grawitacyjny była badana co najmniej od czasów Darwina, jednak jest wiele do nauczenia się o tym, jak to działa, szczególnie we wczesnych zdarzeniach sygnalizacyjnych i w czynnikach pośredniczących w plastyczności odpowiedzi^12,14,15. Uzyskanie szczegółowego zrozumienia dynamiki tej reakcji jest ważne dla znalezienia sposobów na poprawę zdolności siewek do pomyślnego zadomowienia się w danym środowisku¹⁶. Ponadto kształt korzenia sprawia, że nadaje się do zastosowań związanych z przetwarzaniem obrazu^8,12,17. Reasumując, odpowiedź grawitropowa korzeni jest idealnym systemem do rozwoju wysokoprzepustowej technologii obrazowania w celu prowadzenia badań funkcji organizmu na poziomie genomiki.

W tym raporcie przedstawiono metodę przechwytywania obrazu o wysokiej rozdzielczości odpowiedzi grawitropowej korzenia za pomocą niedrogich, dostępnych na rynku skanerów płaskich. Przegląd protokołu przedstawiono na rysunku 1. Sadzonki posadzone na płytkach agarowych umieszczono na pionowo zorientowanych skanerach płaskich wyposażonych w niestandardowe uchwyty na płytki z pleksiglasu. Obrazy były zbierane co kilka minut w rozdzielczości 4 800 dpi i zapisywane na dysku lokalnym lub serwerze danych. Metadane skojarzone z każdą serią obrazów są przechowywane w bazie danych, a przechowywane obrazy są przetwarzane. Podejście to wykorzystuje oprogramowanie VueScan do przechwytywania obrazów. VueScan może być używany do uruchamiania ponad 2,100 różnych skanerów w systemach operacyjnych Windows, Mac lub Linux (patrz tabela materiałów). W tej aplikacji zastosowano rozdzielczość skanera 4 800 dpi, aby dopasować ją do rozdzielczości osiągniętej w poprzednich badaniach przy użyciu stałopozycyjnych kamer CCD^1,8,12. Elastyczność oprogramowania VueScan wraz ze wspólnym interfejsem, którego używa dla każdego uruchamianego skanera, pozwala użytkownikom na łatwe dostosowanie praktycznie każdego sprzętu skanera o wystarczającej rozdzielczości do protokołu przedstawionego w tym artykule. Aktualna przepustowość pozwala na zebranie 216 indywidualnych odpowiedzi dziennie. Technologia jest elastyczna i skalowalna do użytku w różnych instytucjach, od szkół średnich po uniwersytety badawcze. Co więcej, zebrane obrazy są wystarczającej jakości, aby można je było wykorzystać do analizy obrazu.

Protokół

1. Protokół pozyskiwania obrazów

Uwagi:

Ten protokół jest najefektywniej wykonywany z dwiema osobami, chociaż możliwe jest, aby jedna z nich pracowała samodzielnie. Układ, który najlepiej sprawdzał się w tym laboratorium, polegał na tym, że jedna osoba przygotowywała płytki do skanowania, podczas gdy inna pracowała nad ustawieniem skanera, a następnie obie pracowały razem, aby umieścić płytki w skanerach i rozpocząć proces skanowania.

Ważne jest również, aby zauważyć, że skanery w tym projekcie są zorientowane pionowo, a pokrywy skanera spoczywają z tyłu skanera. Wykonano niestandardową podpórkę do trzymania naczyń w tej pozycji pionowej i przymocowano ją do powierzchni stołu płaskiego za pomocą pasków sterujących 3M (ilustracja 2). Zdejmowana okładka dokumentów, która jest dołączona do skanera używanego w tym protokole (Epson V700) została wyłożona z jednej strony czarnym filcem. Okładka dokumentów została przytwierdzona do stołu płaskiego za pomocą linki bungee, aby utrzymać płyty na miejscu i zapewnić kontrast obrazu (ilustracja 3).

Do przechwytywania obrazów można użyć dowolnego skanera o wystarczającej rozdzielczości. Epson Perfection V700 został wybrany ze względu na jego kwadratowy profil (ułatwiający ustawienie w pionie), wysoką rozdzielczość oraz dodatkowe opcje skanowania zarówno z łóżka, jak i pokrywy oraz korzystania z kanału podczerwieni. Te dodatkowe opcje nie zostały wykorzystane w tym protokole.

Po wyjęciu płytek z komory wzrostu, konieczne jest, aby protokół był kontynuowany do końca.

Przygotowanie talerza

Użyto standardowych szalek Petriego zawierających 10 ml przezroczystego podłoża i 9 nasion umieszczonych na środku każdej płytki. Procedury etykietowania płytek, przygotowania podłoża i sadzenia można znaleźć pod adresem: http://www.doane.edu/doane-phytomorph

1. Pobrać pierwszą płytkę agarową i wchłonąć zebraną kondensację na pokrywie i brzegu pokrywki płytki agarowej za pomocą chusteczki Kimwipe.
2. Nałóż Triton X-100 (detergent) na pokrywkę za pomocą Kimwipe - bądź hojny.
   (Należy pamiętać, że Triton X-100 pomaga zapobiegać gromadzeniu się kondensatu na pokrywie podczas skanowania płytki. Obfita aplikacja (wystarczająca do utworzenia filmu na powierzchni pokrywy) pomoże upewnić się, że pokrywa pozostanie przezroczysta przez cały przebieg skanera.)
3. Owiń płytkę taśmą z mikroporami, aby zabezpieczyć pokrywkę i umożliwić wentylację.

Ustawienia skanera i kolekcja obrazów

Ten protokół zakłada, że używany jest więcej niż 1 skaner i dostarcza instrukcje uruchamiania wielu skanerów z jednego komputera.

4. Utwórz foldery do przechowywania obrazów z każdego skanera. Każdy skaner będzie mieścił dwie płyty, więc należy o tym pamiętać podczas tworzenia folderów. Można zdecydować się na użycie metadanych jako składników nazwy pliku, takich jak unikalne identyfikatory dla każdej płytki, wiek siewek, rozmiar nasion i identyfikatory posadzonych stad. Przykładem nazwy folderu używanej w zbieraniu danych zawierających te metadane jest "1652-2-sm-9-92-17-1653-2-lg-88-79-161".
5. Ustaw timery wylotowe na wyznaczony czas zbierania (w tym laboratorium zastosowano 9 godzin). Upewnij się, że ustawiłeś dodatkowy czas (około godziny) na przygotowanie.
   (Należy pamiętać, że skanery powinny być podłączone do timerów gniazdek, aby ustawić czas akwizycji. Chociaż oprogramowanie VueScan pozwala użytkownikowi na wielokrotne zbieranie obrazów, nie pozwala użytkownikowi wskazać, ile obrazów ma być zbieranych lub jak długo ma być zbierane obrazy.)
6. Włącz pierwszy skaner i poczekaj około 10 sekund, aż skaner przejdzie wstępne rozgrzanie.
7. Otwórz raz program VueScan. W tym protokole użyto VueScan w wersji 9.0.20 (patrz Tabela materiałów), chociaż nowsze wersje mogą być używane z niewielkimi modyfikacjami. Upewnij się, że przycisk "Więcej" został naciśnięty w dolnym panelu interfejsu użytkownika, aby wyświetlić opcje menu opisane poniżej.
8. Ustaw pole rozwijane Automatyczne powtarzanie: na brak na karcie Dane wejściowe, a na karcie Kadrowanie ustaw opcję Obszar podglądu: na wartość Maksimum (Rysunek 4). Naciśnij "Podgląd".
9. Utwórz pole kadrowania, które uchwyci obszar zainteresowania, klikając i przeciągając myszą przez obszar zainteresowania na obrazie podglądu. Ustawienia mogą zostać zmienione dla obszaru zainteresowania na karcie Kadrowanie. Typowe ustawienia używane dla pola kadrowania to: przesunięcie x 0,675; Przesunięcie Y 1,924 cala, choć zostało to dostosowane, aby uchwycić obszar siewki dla każdego skanera. Użyty rozmiar pudełka uprawowego wynosił 7,246 cala szerokości i 1,1 cala wysokości (ryc. 5).
10. Aby przesunąć pole przycinania, przytrzymaj Shift podczas przeciągania myszą. Upewnij się, że pudełko z uprawą zawiera wszystkie sadzonki do zeskanowania oraz wszelkie pożądane metadane, które mogą być zawarte na etykiecie (Rysunek 5).
11. Na karcie Przycinanie ustaw obszar podglądu: na Pole przycinania i naciśnij "Podgląd".
12. Przejdź do karty Output (Wyjście) i wybierz odpowiedni plik dla skanera (Rysunek 5).
13. Powtórz kroki 1.7-1.12 na wszystkich skanerach dla jednego komputera. Wybierz opcję "tak", gdy zostaniesz zapytany, czy otworzyć więcej niż jedną instancję VueScan.
14. Przejrzyj każdą kartę i sprawdź, czy ustawienia są poprawne. (Należy pamiętać, że wszystkie specyfikacje mogą być zmieniane w celu dopasowania do potrzeb indywidualnego laboratorium, w tym kolor obrazu, rozdzielczość itp. Jednak ustawienia używane w tym protokole mogą być bezpośrednio stosowane do konkretnego sprzętu skanującego danego laboratorium ze względu na wspólny interfejs oprogramowania VueScan. Zapoznaj się z załączoną listą specyfikacji, aby view parametry używane w tym projekcie, przy użyciu VueScan w wersji 9.0.20).
15. Na karcie Wejście wybierz opcję Ciągły w polu Automatyczne powtarzanie: lub w razie potrzeby wybierz dłuższy odstęp czasu między obrazami. Przedział czasu to czas, w którym skaner zatrzymuje się po zapisaniu ostatniego obrazu i rozpoczęciu zbierania następnego obrazu. W trybie ciągłym można uzyskać rozdzielczość 3-4 min przy rozdzielczości 4 800 dpi.
16. Powtórz kroki 1.14-1.15 dla pozostałych skanerów podłączonych do jednego komputera.
17. Przygotowane płytki umieścić w odpowiednich skanerach z siewkami zorientowanymi poziomo (nie gravistimulować).
18. Tymczasowo przyłóż czarne, filcowe tło do płyt, aby nie spadły z szablonu z pleksiglasu. Powtórz te czynności dla wszystkich skanerów.
    (Uwaga: W tym projekcie czarne kawałki filcu zostały przymocowane do okładek dokumentów dostarczonych ze sprzętem, aby zapobiec odblaskom i zapewnić kontrast z tkanką korzeniową. Konkretny użyty kolor tła będzie zależał od koloru obrazowanej tkanki).
19. Niech jedna osoba obróci talerze o 90° (w tym protokole talerze zostały obrócone w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara) i natychmiast wymieni filcowe tło.
20. Druga osoba powinna stać przy komputerze, aby mogła natychmiast nacisnąć przycisk "Skanuj".
21. Przymocuj tło do skanera za pomocą linki bungee (Rysunek 3). Niech jedna osoba przytrzyma tło na miejscu, podczas gdy druga ustawi linkę bungee.
    (Uwaga: Bezpośrednio po stymulacji grawificznej (obróceniu płytek o 90°) i umieszczeniu filcowego tła należy nacisnąć przycisk "Scan").
22. Powtórz kroki 1.17-1.21 dla pozostałych skanerów na jednym komputerze.
23. Powtórz kroki 1.6-1.22 dla następnego zestawu skanerów, jeśli ma to zastosowanie.
24. Nie zostawiaj skanerów, dopóki nie zostanie zebranych kilka obrazów, aby upewnić się, że są poprawnie zapisywane.
25. Idealnie jest przechowywać skanery w miejscu, które będzie wolne od zakłóceń przez wyznaczony czas skanowania. Rozsądne jest również uwzględnienie warunków środowiskowych w obszarze skanowania, aby zapewnić idealne odpowiedzi fenotypowe.
26. Po zakończeniu zbierania danych naciśnij zielony przycisk przerwania w każdym oknie VueScan, które pokrywa się z każdym skanerem.
27. Zamknij wszystkie programy na komputerze.
28. Uruchom ponownie komputer i wyłącz wszystkie skanery przed rozpoczęciem kolejnej rundy zbierania obrazów.

Wyniki

Reprezentatywne obrazy

Podejście to umożliwia szybkie generowanie wysokorozdzielczych serii czasowych wzrostu siewek Arabidopsis. Pierwsze i ostatnie obrazy z przebiegu skanowania przedstawiono na Ryc. 7A i 7B. Ryc. 7C i 7D prezentują optymalne wyniki uzyskane z połowy pełnego obrazu skanera. Niektóre problemy mogące wpływać na jakość obrazu pokazano na Ryc. 7A i 7B. Problemy te obejmują zmienność w kiełkowaniu, różnice w trajektorii wzrostu siewek na początku przebiegu oraz gromadzenie się kondensacji podczas skanowania. Kondensację można w dużej mierze wyeliminować poprzez zwiększenie ilości Triton X-100 naniesionej na wewnętrzną stronę pokrywy płytki. Innymi czynnikami, które mogą utrudniać dokładne gromadzenie obrazów, są nieprawidłowa konfiguracja ramki wycinania względem pozycji płytki oraz ustawienie płytek pod kątem względem ramki wycinania.

Zastosowanie analizy obrazu: kompresja obrazu
Po uzyskaniu sekwencji czasowej obrazów ze skanera muszą one zostać bezpiecznie zapisane w sposób dostępny sieciowo, aby ułatwić analizę obrazu. Pliki obrazów powiązane z pojedynczym skanowaniem zajmują znaczną ilość miejsca na dysku twardym. Pojedynczy plik TIFF zebrany przy rozdzielczości 4,800 dpi ma rozmiar około 220 MB, a typowe skanowanie generuje 200 plików obrazów. Zatem na jeden cykl wymagane jest około 44 GB miejsca na dysku twardym. Aby zmniejszyć koszty przechowywania i transmisji sieciowej związanej z analizą obrazu, pożądane jest ograniczenie ilości miejsca potrzebnego do przechowywania danych obrazowych przy jednoczesnym zminimalizowaniu utraty danych. Dalsza analiza będzie obejmować identyfikację każdej siewki w kolejnych plikach obrazów powiązanych z cyklem eksperymentalnym. Dlatego segmentacja pojedynczych siewek z obrazu skanera może ułatwić późniejszą analizę. Ponieważ oddzielenie siewki od reszty obrazu może również znacząco zmniejszyć zapotrzebowanie na miejsce poprzez usunięcie niepotrzebnych pikseli tła, podejście to prowadzi również do znacznej redukcji rozmiaru danych. Ponadto, jeśli dalsza analiza koncentruje się na tkance korzenia, zachowanie informacji o kolorze może być zbędne, ponieważ piksele korzenia mają stosunkowo wąską przestrzeń barwną. Opracowano protokół komputerowego przetwarzania obrazu oraz kod służący do zmniejszenia rozmiaru danych poprzez segmentację poszczególnych siewek i konwersję obrazów do skali szarości. Podejście to skutkuje 60% redukcją zapotrzebowania na miejsce do przechowywania danych.

Przebieg prac wykorzystany do osiągnięcia tej kompresji danych opisano w następujących krokach:

1. Zacznij od serii czasowej plików obrazów ze skanera zapisanych w jednym folderze.
2. Każdy obraz przekonwertuj z przestrzeni RGB na skalę szarości (Rysunek 8, góra).
3. Podziel obraz na lewą i prawą stronę.
4. Wyodrębnij każdą siewkę z obrazu do osobnego pliku (Rysunek 8). Odbywa się to poprzez zastosowanie progu w celu przekonwertowania pikseli na kolor czarny lub biały, a następnie obliczenie całkowitej intensywności pikseli w każdym wierszu obrazu. Identyfikowany jest wiersz o najwyższej intensywności, a każdy piksel jest klasyfikowany jako „roślina” lub „nie-roślina” na podstawie intensywności sąsiednich pikseli. Wyznaczany jest środek każdej „rośliny” w tym wierszu, a od tego punktu rysowany jest obszar wycinania o określonym rozmiarze (Rysunek 8, dół).
5. Utwórz oddzielny folder dla każdej strony obrazu (lewej i prawej) z osobnymi podfolderami dla każdej siewki do przechowywania poszczególnych plików obrazów z serii czasowej.
6. Zarchiwizuj powstałe foldery w skompresowanym pliku ZIP.

Kod realizujący te kroki został opracowany w języku programowania Python²⁰. Algorytm pozwala na redukcję rozmiaru danych o około 60% i skutecznie identyfikuje wszystkie pojedyncze siewki w 90% analizowanych dotychczas plików obrazów ze skanera. Kody są dostępne do bezpłatnego pobrania na mocy licencji GNU General Public License Version 3 (patrz Tabela materiałów).

Rysunek 1. Procedura skanowania rozpoczyna się od wysiewu nasion (do dziewięciu nasion Arabidopsis na szalkę) i kończy na przechowywaniu danych oraz przetwarzaniu obrazów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 2. TSzablon do konstrukcji podpór pod szalki Petriego. Pleksiglas został docięty tak, aby jego szerokość odpowiadała szerokości platformy (w tym przypadku 227 mm), a długość wynosiła 128 mm. Z pozostałego fragmentu wycięto dwa koła o średnicy 88 mm w taki sposób, aby były one równomiernie rozmieszczone wzdłuż szerokości i długości podpory. Podporę przymocowano do platformy za pomocą pasków 3M Command Strips. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Rysunek 3. Konfiguracja skanera po wystawieniu siewek na stymulację grawitacyjną i umieszczeniu pokrywy dokumentu. Jest to konfiguracja skanera w kroku 1.21 procedury Konfiguracja skanera i gromadzenie obrazów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rycina 4. Zrzut ekranu ustawień wybranych dla kroku 1.8 Konfiguracji skanera i zbierania obrazów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększony obraz.

Rycina 5. Zrzut ekranu oprogramowania VueScan podczas kroków 1.9 i 1.10 sekcji Konfiguracja skanera i gromadzenie obrazów. Czerwona ramka zaznacza rozmiar kadrowania, natomiast niebieska ramka zaznacza konkretne ustawienia przesunięcia w osi x i y, użyte w celu uchwycenia siewek oraz informacji z etykiet. Obszar szyby skanera do zeskanowania jest przedstawiony jako linia przerywana w obszarze Podglądu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 6. Wybór folderu docelowego dla kroku 1.12 procedury Konfiguracji Skanera i Pozyskiwania Obrazów. Naciśnięcie przycisku @ obok okna dialogowego Folder domyślny (czerwona strzałka) umożliwia użytkownikowi wybór odpowiedniego folderu docelowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Rysunek 7 (A-D). Powyższe obrazy są przykładami danych zebranych przy użyciu metody opisanej w niniejszej pracy. Panele A, B oraz C, D przedstawiają odpowiednio pierwsze i ostatnie obrazy z jednego cyklu skanowania. Panele A i B pokazują cały zeskanowany obszar, natomiast C, D stanowią wycinek tego obszaru, przedstawiając pojedynczą płytkę. Można zaobserwować kilka niespójności. Panel A wykazuje zmienność w kiełkowaniu i trajektorii wzrostu. Panel B (te same siewki co na obrazie A; 9 h później) pokazuje, że na płytkach może gromadzić się kondensat. Panele C i D uznaje się za dobre wyniki ze względu na intensywny wzrost siewek oraz wysoką jakość obrazu przez cały czas trwania pomiaru. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększony obraz.

Rycina 8. Opracowany algorytm kompresji obrazu konwertuje obraz ze skanera na skalę szarości (góra). Obraz zostaje podzielony na prawą i lewą połowę, a krawędzie obrazu są usuwane (niewidoczne na rysunku). Pozycje poszczególnych siewek na każdej połowie są identyfikowane poprzez znalezienie wiersza o największej całkowitej intensywności pikseli. Pozycje te służą do zdefiniowania nowego obszaru przycinania, zastosowanego do wszystkich siewek na płytce (dół). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Dyskusja

Dokładna obserwacja fenotypowa ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia przejawów funkcji genów w organizmie. Jednym ze sposobów pozyskiwania informacji fenotypowych jest przechwytywanie danych obrazowych o wysokiej rozdzielczości. Opracowana platforma oparta na skanerze umożliwiła zebranie wielu obrazów (200 obrazów/okres skanowania) w wysokiej rozdzielczości (4 800 dpi) w ciągu kilku godzin. Ponadto platformę tę można łatwo dostosować do różnych środowisk laboratoryjnych i klasowych dzięki elastyczności oprogramowania VueScan do uruchamiania tysięcy różnych skanerów za pomocą wspólnego interfejsu¹⁸.

Przedstawiona tutaj metoda wypełnia lukę w wysokoprzepustowym przechwytywaniu obrazów, która rozciąga się od dużych zakładów fenotypowania i zautomatyzowanych systemów, które można wdrożyć w jednym laboratorium. Dostępne obecnie platformy o wysokiej przepustowości zwykle wykorzystują specjalistyczny sprzęt do obrazowania, w tym kamery zamontowane na podporach robotycznych, do rejestrowania obrazów o wysokiej rozdzielczości głównie naziemnych tkanek roślinnych (np. Centre for Plant Integrative Technology i Scanalyzer HTS firmy LemnaTec)^20,21. Opracowano również specjalistyczne systemy obrazowania wykorzystujące technologie rentgenowskie i rezonansu magnetycznego do obrazowania tkanek podziemnych z niezwykłą rozdzielczością w miarę ich wzrostu w środowisku glebowym (np. Centrum Technologii Integracji Roślin) ^11,22,23. Ten rozwój bardziej wyspecjalizowanej technologii odbywa się na ogół kosztem przepustowości, co utrudnia dynamiczne badania fenotypowe. Co ważne, koszty i potrzeby infrastrukturalne tych wysokiej klasy platform sprawiają, że są one w większości niewykonalne do wdrożenia w mniejszych laboratoriach.

Opracowano również platformy, które wykorzystują bardziej standardową technologię przechwytywania obrazu i są dobrze przystosowane do pomiaru reakcji dynamicznych, takich jak odpowiedź korzenia na bodziec grawitacyjny. Na przykład kamery CCD zostały wykorzystane do uchwycenia indywidualnych reakcji siewek na światło i grawitację w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej^1,8,12. Opracowano inne systemy umożliwiające pomiar orientacji wierzchołków korzeni wielu korzeni na podstawie jednego obrazu (np. RootTipMulti firmy iPlant Collaborative) ^17,24. W pierwszym przypadku przepustowość jest stosunkowo niska, biorąc pod uwagę, że każda kamera obrazuje tylko jedną sadzonkę na raz, podczas gdy w drugim przypadku przepustowość jest wyższa, ale na ogół kosztem rozdzielczości.

Procedura opisana w tym artykule przedstawia platformę do przechwytywania obrazów o wysokiej rozdzielczości z dużą przepustowością za pomocą sprzętu i oprogramowania, które są łatwo dostępne i stosunkowo niedrogie. Korzystając z tej konfiguracji, można zebrać 1,080 indywidualnych odpowiedzi roota każdego tygodnia w jednym laboratorium wyposażonym w bank sześciu skanerów. W ciągu 15 miesięcy zbierania średnio 864 indywidualnych odpowiedzi tygodniowo, w sumie 41 625 sadzonek zostało zeskanowanych do badania genomicznego. Około 15% poszczególnych kolekcji nie powiodło się z powodu błędu konfiguracji, awarii sieci lub awarii sprzętu. Kolejne 22% odpowiedzi nie powiodło się z powodu braku kiełkowania lub niewystarczającego wzrostu korzeni, aby wywołać reakcję wzrostową. Ostateczny zestaw danych składa się z 27 475 indywidualnych reakcji siewek na bodziec grawitacyjny ze 163 rekombinowanych linii wsobnych oraz 99 linii prawie izogenicznych. Dane zostały zebrane w jednym laboratorium, co sprawia, że jest to podejście o bardzo wysokiej przepustowości. Nawet biorąc pod uwagę, że sprzęt używany do zakupu jest stosunkowo niedrogi, działa niezawodnie od ponad dwóch lat, nawet przy intensywnym użytkowaniu.

Chociaż protokół ten był bardzo przydatny dla celów badawczych tej grupy, nadal istnieją pewne ograniczenia. Ze względu na przepustowość około 50 GB nieskompresowanych danych obrazowych dziennie okazało się, że do przechowywania obrazów potrzebna jest duża ilość miejsca, chyba że uda się opracować skuteczne schematy kompresji. Problem z pamięcią masową został tymczasowo rozwiązany poprzez zakup zewnętrznych dysków twardych dla każdego komputera. Ponadto zakupiono dwa urządzenia pamięci masowej o pojemności 10 TB związane z siecią. Później opracowano algorytmy kompresji, jak opisano powyżej, które mogą pomóc w zmniejszeniu rozmiaru danych nawet o 60% (ilustracja 8). Należy zauważyć, że szybkość, z jaką dane mogą być zapisywane na urządzeniu pamięci masowej powiązanej z siecią, zależy od szybkości połączenia sieciowego. Schematy kompresji zostały również ograniczone ze względu na chęć zapobieżenia utracie danych obrazu.

Rozważane są również inne ograniczenia specyficzne dla systemu obrazowania opartego na skanerze. Na przykład w podejściu opartym na skanerze siewki są wystawione na działanie światła o dużym natężeniu w kolorze białym i potencjalnie w podczerwieni podczas każdego skanowania. Prawdopodobnie wpływa to na wzrost siewek, chociaż nadal można zaobserwować, że siewki przechodzą silne reakcje na bodziec grawitacyjny (ryc. 7). Przyszłe ulepszenie może polegać na programowaniu skanerów w taki sposób, aby aktywne były tylko diody LED na podczerwień. Obszarem aktywnego rozwoju jest tworzenie algorytmów analitycznych dobrze dopasowanych do rozdzielczości i przepustowości tych danych obrazowych. Duży zestaw danych wygenerowany za pomocą tej metody opartej na skanerze okazał się idealny do opracowania solidnych narzędzi do wysokoprzepustowego fenotypowania obrazów siewek. Algorytm kompresji zastosowany na tych obrazach pokazanych na rysunku 7 potwierdza twierdzenie, że są one podatne na aplikacje do analizy obrazu. Dodatkowo wygenerowane obrazy mogą być analizowane przez wcześniej opublikowany algorytm RootTrace^17,24, jeśli są zbierane w niższej rozdzielczości (mniej niż 1 200 dpi), a poszczególne siewki są segmentowane od obrazu za pomocą opisanego powyżej algorytmu kompresji przed analizą. Dane o wzroście korzeni można uzyskać z obrazów zmniejszonych do 1,200 dpi, podczas gdy dane o kącie wierzchołka można uzyskać z obrazów zmniejszonych do 900 dpi (niepublikowana obserwacja).

Procedura opisana w tym artykule wpisuje się w swoją własną niszę w świecie obrazowania korzeniowego, ponieważ charakteryzuje się wysoką przepustowością i wysoką rozdzielczością, a jednocześnie jest stosunkowo przystępna cenowo. Dodatkową zaletą tego podejścia jest to, że można je łatwo dostosować do potrzeb obrazowania określonej grupy badawczej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Skanery fotograficzne Epson Perfection V700	Epson	B11B178011-pleksi
-			wykonany na zamówienie. Zobacz rysunek 2.
Inteligentne linki bungee	SmartStraps	Wal-Mart 1079478
Brinks Cyfrowe zegary zewnętrzne	Brinks	Wal-Mart 42-1014-2
Oprogramowanie VueScan	Hamrick Software	http://www.hamrick.com
Oprogramowanie do segmentacji	Chris Wentworth, Doane College		https://sites.google.com/a/doane.edu/compphy-doane/projects/root-gravitropism/image-segmentation
Taśma mikroporowa 3M	Fisher Scientific	19-061-655-Stojaki
na trzymanie	-		wykonane na zamówienie przez sklejenie ze sobą dwóch stojaków na ciasteczka.