Ekstrakcja i analiza kortyzolu z włosów ludzkich i małpich

Podsumowanie

Kortyzol (CORT) gromadzi się w rosnących łodygach włosów ludzi i naczelnych. Opisujemy metody ekstrakcji i analizy włosów CORT z dużą precyzją i czułością. Pomiar CORT włosów jest szczególnie dobrze przystosowany do oceny przewlekłego stresu w okresach od tygodni do miesięcy.

Streszczenie

Hormon stresu kortyzol (CORT) jest powoli wprowadzany do rosnących łodyg włosów u ludzi, naczelnych i innych ssaków. Opracowaliśmy i zwalidowaliśmy metodę ekstrakcji i analizy CORT z włosów małp rezusów, a następnie dostosowaliśmy tę metodę do stosowania z ludzkimi włosami na skórze głowy. W przeciwieństwie do "próbek punktowych" CORT pobieranych z osocza lub śliny, CORT włosów zapewnia zintegrowany pomiar aktywności układu podwzgórze-przysadka-kory nadnerczy (HPA), a tym samym stresu fizjologicznego, w okresie włączenia hormonów. Ponieważ włosy na ludzkiej skórze głowy rosną średnio w tempie 1 cm/miesiąc, poziomy CORT uzyskane z segmentów włosów o długości kilku cm mogą potencjalnie służyć jako biomarker stresu doświadczanego przez wiele miesięcy.

W naszej metodzie, każda próbka włosów jest najpierw dwukrotnie myta w izopropanolu, aby usunąć z zewnętrznej części łodygi włosa resztki materiału, które zostały naniesione przez pot lub sebum. Po wysuszeniu próbka jest mielona na drobny proszek w celu rozbicia macierzy białkowej włosa i zwiększenia powierzchni do ekstrakcji. CORT z wnętrza łodygi włosa jest ekstrahowany do metanolu, metanol jest odparowywany, a ekstrakt jest odtwarzany w buforze testowym. Wyekstrahowany CORT, wraz z wzorcami i kontrolami jakości, jest następnie analizowany za pomocą czułego i specyficznego dostępnego na rynku zestawu do testów immunoenzymatycznych (EIA). Odczyt z EIA jest przeliczany na pg CORT na mg masy sproszkowanych włosów. Metoda ta została zastosowana w naszym laboratorium do analizy CORT włosów u ludzi, kilku gatunków makaków, marmozet, psów i niedźwiedzi polarnych. Wiele badań, zarówno przeprowadzonych w naszym laboratorium, jak i w innych grupach badawczych, wykazało szerokie zastosowanie CORT włosów do oceny narażenia na przewlekły stres zarówno w warunkach naturalnych, jak i laboratoryjnych.

Wprowadzenie

Pomiar CORT w osoczu, ślinie, a czasami w moczu lub kale, jest używany jako wskaźnik stresu fizjologicznego od czasu odkrycia przez Selye roli osi HPA w stresie¹. Chociaż opublikowano wiele prac dotyczących aktywności HPA w sytuacjach ostrego stresu, dziedzina ta jest utrudniona przez brak prostego i wiarygodnego wskaźnika przewlekłego stresu fizjologicznego. Problem ten pojawia się, ponieważ zarówno osocze, jak i ślina dają "punktowe" oszacowania aktywności HPA, które podlegają zmianom okołodobowym i mogą być zakłócone przez zakłócenia środowiskowe. Próbki moczu i kału dają pomiary CORT i/lub wydalania metabolitów, które w niektórych przypadkach obejmują kilka godzin, a w niektórych przypadkach nawet cały dzień. Pobranie wielu próbek przy użyciu którejkolwiek z tych matryc może zapewnić przybliżony złożony wskaźnik poziomów CORT w czasie; jednak żadne z tych podejść nie zapewnia prawdziwie długoterminowego wskaźnika aktywności HPA i reakcji tego systemu na przewlekłe czynniki stresogenne.

Pomiar CORT we włosach zaczął zaspokajać tę ważną potrzebę w literaturze dotyczącej stresu. Wstępne badania przeprowadzone przez kilka laboratoriów wykazały obecność CORT w ludzkich włosach, ale nie badano, czy poziom CORT we włosach zmienił się w funkcji stresu². Ponieważ nasze laboratorium od wielu lat interesuje się regulacją osi HPA małpy rezusów przez różne czynniki społeczne i behawioralne³, postanowiliśmy ustalić i zwalidować metody ekstrakcji i analizy włosów małp rezusów⁴. Opierając się na założeniu, że CORT przenoszony przez krew jest powoli i stale wprowadzany do rosnących włosów, celem tej nowej metody było wykorzystanie poziomów CORT pochodzących z włosów jako zintegrowanego wskaźnika aktywności HPA w okresach od tygodni do miesięcy.

Podczas opracowywania obecnego protokołu napotkano kilka wyzwań metodologicznych. Po pierwsze, wcześniejsze badania wykazały, że niewielkie ilości krążącego CORT są wydalane z potem i sebum, a zatem mogą pokrywać zewnętrzną stronę łodygi włosa². Aby wyeliminować ten potencjalny błąd, opracowaliśmy łagodną procedurę mycia, która wydaje się usuwać zewnętrzny CORANT, jednocześnie wywierając minimalny wpływ na CORT obecny w rosnącej łodydze włosa. Tak więc małpie włosy poddane tej procedurze (tj. dwóm 3-minutowym myciom izopropanolem) straciły około 7-8% całkowitej zawartości CORT włosów, a trzecie mycie usunęło mniej niż 1% więcej sterydów z próbki⁴. Wydaje się, że w ludzkich włosach jest więcej zewnętrznego CORT, ponieważ ta sama procedura usunęła średnio 27% całkowitej zawartości CORT z próbek (K. Rosenberg i J. Meyer, niepublikowane). Jednak podobnie jak w przypadku sierści małpy, dodatkowe mycie zawierało znacznie mniej CORT (około 7%) niż pierwsze dwa mycia. Dlatego wyniki zarówno z włosów małpich, jak i ludzkich wspierają twierdzenie, że większość (jeśli nie wszystkie) zewnętrznych CORT można usunąć przy zachowaniu głównej frakcji CORT w wewnętrznej macierzy włosa. Po drugie, nasze badania pilotażowe wykazały również, że mielenie włosów przed ekstrakcją znacznie zwiększyło odzysk CORT z próbki, prawdopodobnie poprzez rozbicie złożonej macierzy białkowej łodygi włosa, a także zwiększenie powierzchni dostępnej dla penetracji rozpuszczalnika. Opracowano dwie różne metody mielenia, z których każda ma zalety i wady. Metoda 1, która wykorzystuje młyn kulowy, ma tę zaletę, że wytwarza najdrobniejszy proszek. Jednak młyn kulowy jest stosunkowo drogim elementem wyposażenia, a jeśli jest używany ze standardowymi naczyniami i kulami do mielenia, jest w stanie zmielić tylko dwie próbki na raz. Małe próbki są również trudne do przetworzenia za pomocą młyna kulowego ze standardowymi naczyniami mielącymi. Metoda 2, która wykorzystuje ubijak do koralików, jest mniej skuteczna pod względem zdolności mielenia. W rezultacie, średni odzysk CORT jest o około 10% niższy przy zastosowaniu tej metody w porównaniu z młynem kulowym (dane niepublikowane). Z drugiej strony ubijak do koralików jest znacznie tańszy niż młyn kulowy, w zależności od modelu można zmielić jednorazowo 16-24 próbki, a metoda dobrze nadaje się do małych próbek. Ze względu na wyżej wspomniany odzysk różnicowy zaleca się stosowanie tej samej metody mielenia dla wszystkich próbek w ramach danego badania.

Po przetworzeniu próbek włosów, są one ekstrahowane metanolem, a CORT w ekstraktach jest analizowany za pomocą czułego i specyficznego komercyjnego zestawu EIA, pierwotnie zaprojektowanego do pomiaru CORT w ślinie. Procedury ekstrakcji i testów zostały częściowo zweryfikowane poprzez wykazanie, że seryjne rozcieńczenia ekstraktów z próbek włosów małp dały odczyty EIA, które były bardzo podobne do odczytów uzyskanych z autentycznych wzorców CORET. Następnie wykazaliśmy, że CORT włosów (oprócz CORT w osoczu i ślinie) był wrażliwy na główny stresor życiowy, jakim było administracyjnie nakazane przeniesienie małp do nowych kwater mieszkalnych^4,5. Niniejsza praca zawiera szczegółowy opis metod stosowanych rutynowo w naszym laboratorium do przetwarzania próbek włosów ludzkich i małpich oraz do ekstrakcji i analizy CORT z takich próbek.

Protokół

1. Pobieranie i przechowywanie próbek

1. Włosy ludzkie
   1. Zabezpiecz całą długość włosów, z których chcesz pobrać próbkę (do średnicy ołówka) za pomocą gumki lub klipsa. Przytnij włosy jak najbliżej skóry głowy (uważając, aby nie naciąć skóry) czystymi nożyczkami. Uwaga: Standardowym obszarem pobierania próbek jest tylny wierzchołek czaszki.
   2. Niektórzy badacze donosili o spadku poziomu CORT ludzkich włosów wraz z odległością od skóry głowy⁶, co może być spowodowane wypłukiwaniem z powodu wielokrotnej ekspozycji na wodę i szampon⁷ (chociaż patrz Manenschijn i wsp.⁸ oraz Thomson i wsp. ⁹ dla przeciwnych wyników, w których nie zaobserwowano spadku segmentów) Aby zminimalizować wpływ tego potencjalnego "efektu wypłukiwania", zalecamy pobranie segmentów włosów proksymalnie do skóry głowy o długości nie większej niż 3 cm (zakładając średnie tempo wzrostu 1 cm/miesiąc¹⁰, segment o długości 3 cm zawiera CORT, który został zdeponowany w ciągu około ostatnich 3 miesięcy). Aby to osiągnąć, użyj linijki, aby zmierzyć 3 cm od pierwszego cięcia i potnij ponownie, aby uzyskać 3 cm próbkę. Uwaga: Po przycięciu włosów na długość nie jest już konieczne utrzymywanie pasm w jednej linii, chyba że badanie obejmuje cięcie próbki na oddzielne segmenty o długości 1 cm w celu ustalenia retrospektywnego kalendarza osadzania CORT w okresie poprzedzającym pobranie^{próbki 6}.
   3. Umieść próbkę włosów w woreczku wykonanym z folii aluminiowej, czystej papierowej kopercie lub 15 ml zakręcanej polipropylenowej probówce wirówkowej, typu używanego do mycia próbek. Ponieważ CORT jest wyjątkowo stabilny we włosach², próbki mogą być przechowywane przez czas nieokreślony w temperaturze -20 °C i, jeśli to konieczne, wysyłane przez noc w temperaturze otoczenia.
   4. Procedura pobierania włosów powinna być przećwiczona na ochotnikach, a próbki do ćwiczeń powinny zostać zważone przed rozpoczęciem pełnego badania. Uwaga: Próbki włosów o wielkości zaledwie 5-10 mg można analizować przy użyciu opisanych tutaj metod, chociaż pożądane jest pobieranie próbek >10 mg, aby zminimalizować prawdopodobieństwo uzyskania odczytów EIA poniżej najniższego standardu CORT.
2. Sierść małpy
   1. Ogolić włosy (100-250 mg) od karku za pomocą standardowej maszynki do strzyżenia zwierząt. Gol się jak najbliżej skóry, uważając, aby nie zranić skóry i nie spowodować krwawienia, ponieważ poziom CORT we krwi jest bardzo wysoki w porównaniu z tymi, które znajdują się we włosach. Uwaga: Obszar szyi został wybrany do rutynowego pobierania próbek, ponieważ jest to na ogół dobre źródło włosów i można go łatwo zaobserwować pod kątem odrastania włosów przed ponownym pobraniem próbki.
   2. Umieść próbkę włosów w woreczku wykonanym z folii aluminiowej lub w polipropylenowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml z zakrętką. Próbki włosów małp powinny być przechowywane i wysyłane w taki sam sposób, jak opisano powyżej w odniesieniu do próbek włosów ludzkich.
   3. Ponieważ włosy małpy, w przeciwieństwie do włosów na ludzkiej skórze głowy, rosną do pewnej długości, a następnie przestają rosnąć¹¹, w tym przypadku generalnie nie jest możliwe wykorzystanie odległości od skóry jako kalendarza do odkładania się CORT. Jeżeli jednak od zwierzęcia można pobrać więcej niż jeden raz (na przykład podczas okresowych rutynowych badań lekarskich), pożądane jest wykonanie wstępnego golenia w celu ustalenia punktu czasowego linii bazowej, a następnie ponowne golenie tego samego obszaru po upływie pożądanego czasu. CORT w drugiej próbce został zdeponowany w okresie między goleniem a ponownym goleniem, co pozwala na precyzyjne przypisanie zawartości CORT w próbce do aktywności HPA w tym przedziale⁵.

2. Mycie i suszenie próbek

1. mycie
   1. Umieść każdą próbkę włosów w polipropylenowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml z zakrętką.
   2. Dodać 5 ml izopropanolu klasy wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) do każdej probówki, a następnie powtarzać inwersję przez 3 minuty za pomocą rotatora.
   3. Zdekantować izopropanol do pojemnika na odpady, uważając, aby nie stracić żadnej cząstki próbki.
   4. Powtórz kroki 2.1.2 i 2.1.3 jeszcze raz.
2. suszenie
   1. Susz włosy przez co najmniej 2-3 dni, aby zapewnić całkowite odparowanie izopropanolu.

3. Mielenie próbek i ekstrakcja CORT - Metoda 1 dla dużych próbek

1. Mielenie próbek
   1. Umieść do 250 mg suszonych włosów w 10 ml naczyniu do mielenia ze stali nierdzewnej wraz z pojedynczą kulą mielącą ze stali nierdzewnej o średnicy 12 mm.
   2. Mielić próbkę przez 6 minut z prędkością 25 Hz za pomocą młyna kulowego.
   3. Zważyć do 50 mg sproszkowanych włosów na wadze analitycznej, a następnie przenieść je do czystej probówki mikrowirówkowej z polipropylenu o pojemności 2,0 ml w celu późniejszej ekstrakcji CORT.
2. Ekstrakcja CORT
   1. Dodać 1,0 ml metanolu klasy HPLC do probówki mikrowirówki zawierającej sproszkowaną próbkę.
   2. Zakryć probówkę i inkubować próbkę przez 18-24 godziny w temperaturze pokojowej ze stałą inwersją za pomocą rotatora.
   3. Odwiruj probówki z prędkością 14 000 obr./min przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, aby granulować sproszkowane włosy.
   4. Przenieść 0,6 ml supernatantu do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, uważając, aby nie naruszyć osadu sproszkowanych włosów.

4. Mielenie próbek i ekstrakcja CORT - Metoda 2 dla małych próbek

1. Mielenie próbek
   1. Umieść do 60 mg włosów w wstępnie zważonej probówce mikrowirówkowej o pojemności 2 ml wzmocnionej do ubijania koralików.
   2. Ponownie zważyć fiolkę w celu uzyskania masy próbki.
   3. Do każdej fiolki dodać trzy kulki ze stali chromowej o średnicy 3,2 mm, a następnie mielić próbkę przez co najmniej 2 minuty w ubijaku do kulek. Jeśli oględziny wykażą, że próbka jest niewystarczająco sproszkowana, należy przeprowadzić dodatkowe mielenie przez 0,5 lub 1 minutę. Uwaga: W tym przypadku nie jest konieczne przenoszenie zmielonych włosów, ponieważ ekstrakcja CORT jest przeprowadzana w tej samej fiolce co mielenie.
2. Ekstrakcja CORT
   1. Dodać 1,5 ml metanolu klasy HPLC do probówki mikrowirówki zawierającej sproszkowaną próbkę.
   2. Zakryć probówkę i inkubować próbkę przez 18-24 godziny w temperaturze pokojowej ze stałą inwersją za pomocą rotatora.
   3. Odwiruj probówki z prędkością 10 000 obr./min przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby granulować sproszkowane włosy. Uwaga: Koraliki ze stali chromowanej pozostają w probówce z włosami podczas etapów ekstrakcji i wirowania, co odpowiada za niższą prędkość wirowania w porównaniu z metodą 1.
   4. Przenieść 1,0 ml supernatantu do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, uważając, aby nie naruszyć osadu sproszkowanych włosów.

5. Odparowanie rozpuszczalnika i rekonstytucja próbki

1. Wysuszyć metanol za pomocą parownika próżniowego lub strumienia azotu, jeśli parownik próżniowy nie jest dostępny. W przypadku zastosowania parownika próżniowego opary metanolu mogą zostać uwięzione za pomocą wymrażarki lub pułapki chemicznej wyposażonej we wkład z węglem aktywnym.
2. Po usunięciu metanolu należy rozpuścić ekstrakt CORT w odpowiedniej objętości buforu do oznaczania OOŚ (rozcieńczalnik do oznaczania). Jeśli przewiduje się stosunkowo wysokie wartości CORT, należy użyć buforu o objętości 0,4 ml lub większej. Jeśli przewiduje się stosunkowo niskie wartości, objętość można zmniejszyć do 0,2 ml lub mniej, aby zwiększyć czułość. Uwaga: 0,2 ml to wystarczająca objętość, aby co najmniej dwukrotnie pobrać zduplikowane podwielokrotności próbki, w przypadku gdy wymagane jest ponowne przeprowadzenie próbki.
3. Odtworzoną próbkę należy natychmiast oznaczyć lub zamrozić w temperaturze -20 °C do późniejszej analizy. Uwaga: Jeśli odtworzona próbka zostanie zamrożona, ważne jest, aby unikać sublimacji w okresie zamrażania, ponieważ zmiana objętości próbki doprowadzi do fałszywej wartości CORT podczas wykonywania ostatecznych obliczeń.

6. Test CORT i konwersja danych

1. Oznacz ekstrakty z włosów pod kątem CORT za pomocą zestawu do testu immunoenzymatycznego o wysokiej czułości (EIA). Uwaga: W przypadku korzystania z komercyjnego zestawu CORT EIA do śliny, postępuj zgodnie z zaleceniami producenta określonymi w ulotce zestawu, z wyjątkiem tego, że próbki testowe będą duplikatami podwielokrotności każdego odtworzonego ekstraktu do włosów zamiast próbek śliny.
2. Przygotuj ekstrakt do włosów w ramach kontroli jakości (QC) do użycia w każdym teście.
   1. Zebrać pewną liczbę dodatkowych próbek włosów i albo przetworzyć je pojedynczo, jak w krokach 4.1 i 4.2, albo połączyć je w celu przetworzenia dużej próbki, jak w krokach 3.1 i 3.2.
   2. Odparować rozpuszczalnik i rozpuścić ekstrakty w sposób opisany w krokach 5.1 i 5.2, a następnie zebrać odtworzone ekstrakty z kilku próbek pojedynczych lub zbiorczych.
   3. Podwielokrotność odtworzonego ekstraktu (np. 0,10 ml) rozlać do pojedynczych probówek do mikrowirówek i zamrozić do późniejszego wykorzystania.
   4. Rozmrozić i uruchomić jedną podwielokrotność kontroli jakości w dwóch egzemplarzach na każdej mikropłytce testu immunologicznego, aby zapewnić referencyjną wartość CORT do sprawdzenia jakości każdej serii.
   5. Współczynnik zmienności wewnątrztestowej (CV; zdefiniowany jako odchylenie standardowe podzielone przez średnią zestawu wartości próbki) można obliczyć, analizując 10-12 studzienek QC w tej samej serii, podczas gdy CV między testami można obliczyć przy użyciu wartości QC w grupie serii. Jeśli oprogramowanie czytnika mikropłytek oblicza CV dla zduplikowanych studzienek reprezentujących każdy ekstrakt z włosów, alternatywną metodą określania CV w teście wewnętrznym jest obliczenie średniej tych indywidualnych wartości CV na całej płytce.
   6. Jeżeli którykolwiek z ekstraktów próbki daje odczyt większy niż najwyższy standard CORT w OOŚ, wówczas kolejną podwielokrotność ekstraktu rozcieńcza się odpowiednią ilością buforu do oznaczania, a następujący odczyt OOŚ koryguje się o współczynnik rozcieńczenia. Próbki są również rutynowo poddawane ponownej analizie, jeśli CV dla zduplikowanych studzienek wynosi >10%.
   7. Ponieważ zestawy CORT EIA są przeznaczone do pomiaru wartości CORT w próbkach cieczy, takich jak ślina lub osocze, dane wyjściowe oprogramowania czytnika mikropłytek muszą zostać przeliczone na ilość CORT na jednostkę masy sproszkowanych włosów. Poniższy wzór konwertuje wynik testu w μg/dl na pg CORT na mg włosów:
      (A/B) * (C/D) * E * 10 000 = F
      gdzie A = μg/dl od wyników testu; B = waga (w mg) włosów poddanych ekstrakcji; C = obj. (w ml) metanolu dodanego do sproszkowanych włosów; D = obj. (w ml) metanolu odzyskanego z ekstraktu, a następnie wysuszonego; E = obj. (w ml) buforu do oznaczania użytego do rozpuszczenia wysuszonego ekstraktu; i F = końcowa wartość stężenia CORT we włosach w pg/mg.

Wyniki

Rycina 1 przedstawia wydruk z reprezentatywnego zestawu próbek ludzkich włosów (dorosłe osoby płci męskiej i żeńskiej) przetworzonych przy użyciu metody 2 – rozcierania i ekstrakcji. Do wygenerowania wyników oraz dopasowania 4-parametrycznej krzywej sigmoidalnej do wzorców CORT wykorzystano oprogramowanie komputerowe (Rycina 2). Współczynniki zmienności (CV) między dołkami na tej płytce wynosiły od 0,01 do 5,73%, przy średnim CV wewnątrz analizy wynoszącym 1,34%. CV między analizami, wyz...

Dyskusja

Opisana powyżej procedura CORT jest prosta do wykonania, stosunkowo niedroga, wykorzystuje łatwo dostępne chemikalia, odczynniki i materiały eksploatacyjne oraz wymaga sprzętu, który, z jednym wyjątkiem, prawdopodobnie jest obecny w typowym laboratorium analitycznym. Wyjątkiem jest urządzenie do mielenia, takie jak młyn kulowy lub mini-ubijak do koralików. Zauważamy, że niektóre grupy badawcze mielą próbki włosów na małe fragmenty o długości około^{12 mm 12}, ale na podstawie naszych obserwacji zalecamy mielenie ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Izopropanol klasy HPLC	Fisher	A451
Metanol klasy HPLC	Fisher	A452
Zestawy do oznaczania kortyzolu w ślinie	Salimetrics	1-3002	Informacje na temat czułości i swoistości testu można znaleźć we wlotce producenta
15 ml Probówki wirówkowe z polipropylenową nakrętką	Max Scientific	10-9151
1,5 ml Probówki do mikrowirówek Safe-Lock	Fisher	05-402-25
2,0 ml probówki do mikrowirówek Safe-Lock	Fisher	05-402-7
2,0 ml XXTuff wzmocnione mikrofiolki	BioSpec	330TX	Do stosowania z kulkami ze
stali chromowej 3,2 mm	BioSpec	11079132c	Stosować z mini-beadbeater
10 ml słoiki do mielenia ze stali nierdzewnej	Retsch	02.462.0061	Do użytku z młynkiem miksującym
12 mm kule mielące ze stali nierdzewnej	Retsch	05.368.0037	Do użytku z młynem miksującym
Wkład z węglem aktywnym Savant	DTK120R Do		użytku z pułapką chemiczną Savant
Rotator do probówek wirówkowych 15 ml	Fisher	S02135
Rotator do probówek do mikrowirówek	Fisher	NC9854190
Wirówka stołowa do probówek do mikrowirówek	Fisher	13-100-675
MM 200 młyn miksujący	Retsch	20.746.0001
Mini-Beadbeater 16	BioSpec	607
Savant DNA Speedvac	Fisher	DNA120-115
Pułapka chłodnicza	Savant Fisher	RVT400-115
Pułapka chemiczna Savant	Fisher	SCT120	Alternatywa dla pułapki parowej z chłodzeniem
Czytnik
mikropłytek Myjka
do mikropłytekMieszalnik
Pipetor
Waga analityczna

: do mikropłytekwielokanałowy