Wspomagana mikrofalami funkcjonalizacja peptydów poli(glikolu etylenowego) i żywicy do stosowania w polimeryzacji łańcuchowej i tworzeniu hydrożelu

Podsumowanie

Ten film zilustruje szybką, efektywną metodę metakrylanowania poli(glikolu etylenowego), umożliwiając polimeryzację łańcuchową i syntezę hydrożelu. Pokaże, w jaki sposób w podobny sposób wprowadzić funkcje metakryloamidu do peptydów, szczegółowo omówi typowe metody analityczne do oceny wydajności funkcjonalizacji, przedstawi sugestie dotyczące rozwiązywania problemów i zaawansowanych modyfikacji oraz zademonstruje typowe techniki charakteryzacji hydrożelu.

Streszczenie

Jedną z głównych zalet stosowania makromerów poli(glikolu etylenowego) (PEG) w tworzeniu hydrożeli jest uniwersalność syntezy. Możliwość czerpania z szerokiej gamy mas molekularnych i konfiguracji PEG (liczba ramion, długość ramienia i wzór rozgałęzień) zapewnia naukowcom ścisłą kontrolę nad uzyskanymi strukturami i właściwościami hydrożelu, w tym modułem Younga i rozmiarem oczek. Ten film zilustruje szybką, wydajną, bezrozpuszczalnikową, wspomaganą mikrofalami metodę metakrylanowania prekursorów PEG do dimetakrylanu poli(glikolu etylenowego) (PEGDM). Ta syntetyczna metoda zapewnia bardzo potrzebne materiały wyjściowe do zastosowań w dostarczaniu leków i medycynie regeneracyjnej. Przedstawiona metoda jest lepsza od tradycyjnych metod metakrylacji, ponieważ jest znacznie szybsza i prostsza, a także bardziej ekonomiczna i przyjazna dla środowiska, przy użyciu mniejszych ilości odczynników i rozpuszczalników. Zademonstrujemy również adaptację tej techniki do funkcjonalizacji peptydów metakrylamidem na żywicy. Ta metoda na żywicy pozwala na funkcjonalizację N-końca peptydów grupami metakrylamidowymi przed deprotekcją i rozszczepieniem z żywicy. Pozwala to na selektywne dodawanie grup metakryloamidowych do N-końców peptydów, podczas gdy aminokwasy z reaktywnymi grupami bocznymi (np. pierwszorzędowa amina lizyny, pierwszorzędowy alkohol seryny, drugorzędowe alkohole treoniny i fenol tyrozyny) pozostają chronione, zapobiegając funkcjonalizacji w wielu miejscach. W tym artykule szczegółowo omówiono popularne metody analityczne (spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego protonów (^;H-NMR) i spektrometria mas czasu przelotu z desorpcją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-ToF)) w celu oceny efektywności funkcjonalizacji. Omówione zostaną typowe pułapki i sugerowane metody rozwiązywania problemów, a także modyfikacje techniki, które można wykorzystać do dalszego dostrajania funkcjonalności makromerów oraz wynikających z nich właściwości fizycznych i chemicznych hydrożelu. Zademonstrowane zostanie zastosowanie syntetyzowanych produktów do tworzenia hydrożeli do dostarczania leków i badań interakcji komórka-materiał, ze szczególnym uwzględnieniem modyfikacji składu hydrożelu w celu wpływu na rozmiar siatki, kontrolowania sztywności hydrożelu i uwalniania leku.

Wprowadzenie

Hydrożele z poli(glikolu etylenowego) (PEG) są powszechnie stosowanymi biomateriałami w medycynie regeneracyjnej i dostarczaniu leków^1-3. Te hydrożele mają znaczące zalety w porównaniu z innymi biomateriałami. Hydrożele PEG są syntetyczne, oferując wysoki stopień kontroli nad właściwościami inżynieryjnymi, takimi jak moduł sprężystości i szybkość degradacji, w porównaniu z ich naturalnymi odpowiednikami z biomateriałów¹. Ponieważ są one pozyskiwane syntetycznie, PEG ma znacznie mniejszą zmienność między partiami w porównaniu z materiałami pochodzenia naturalnego⁴. Ze względu na skład chemiczny PEG, hydrożele te są wysoce hydrofilowe, odporne na adsorpcję białek i biokompatybilne³. Ta odporność na adsorpcję białek pozwala hydrożelom PEG działać jak "czysta tablica", umożliwiając naukowcom badanie i badanie określonych czynników biologicznych lub chemicznych (leków, biomolekuł, peptydów adhezyjnych komórek itp.) oraz konkretnych ról, jakie te czynniki odgrywają w kontrolowaniu zachowania komórek i/lub tkanek.

Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 1: Przykłady architektur poli(glikolu etylenowego) (PEG). A) Liniowy PEG. B) 4-ramienny PEG z rdzeniem pentaerytrytolem. C) 8-ramienny PEG z rdzeniem heksaglicerynowy. D) 8-ramienny PEG z rdzeniem z trójentaerytrytolem. n to liczba powtórzeń PEG na każdym ramieniu. Każde powtórzenie ma masę cząsteczkową 44 g/mol, dlatego n można obliczyć na podstawie całkowitej masy cząsteczkowej i struktury/ramienia #.

Prekursory PEG są dostępne w różnych architekturach i masach cząsteczkowych (Rysunek 1). Różnicowanie architektury (ramię #) i powtórzeń glikolu etylenowego (n) PEG może być wykorzystane do kontrolowania właściwości sieci hydrożelowych utworzonych z tych makromerów. Niezmodyfikowany PEG zawiera końcowe grupy hydroksylowe, które muszą zostać zastąpione alternatywną funkcją, aby ułatwić kowalencyjne sieciowanie poprzez polimeryzację, najczęściej stosowaną strategię sieciowania dla hydrożeli PEG, przed utworzeniem sieci hydrożelowych. Istnieje wiele grup chemicznych, które można włączyć do makromerów PEG w celu ułatwienia polimeryzacji i sieciowania sieciowego (akryl, metakrylan, eter winylowy, norbornen itp.). Pomimo różnorodności funkcji końcowych dostępnych w celu ułatwienia sieciowania, istnieją tylko dwa mechanizmy, za pomocą których może zachodzić polimeryzacja: wzrost krokowy i łańcuchowy (lub mieszanina tych dwóch, tryb mieszany).

Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 2: Teoretyczny schemat sieci hydrożelowej. A) Tradycyjna polimeryzacja łańcuchowa powoduje powstanie heterogenicznych sieci zawierających gęste regiony sieciowania z poli(metakrylanu) i zwiększone niedoskonałości sieci, takie jak pętle, nieprzereagowane prekursory i trwałe splątania. B) Polimeryzacja krokowa powoduje znacznie bardziej jednorodne struktury sieciowe (nie na skalę).

Funkcjonalności, które sieciują poprzez polimeryzację opartą na wzroście łańcucha, nie wymagają obecności dodatkowego środka sieciującego. Jednak hydrożele polimeryzowane łańcuchowo wytwarzają niejednorodne struktury sieciowe zawierające gęste regiony sieciowania (ryc. 2A)¹. Natomiast polimeryzacja krokowa wymaga użycia środka sieciującego lub komonomeru, który jest reaktywny z końcowymi grupami funkcyjnymi makromerów PEG. Ponieważ końcowe grupy funkcyjne na PEG mogą reagować tylko z sieciującym, a sieciujący może reagować tylko z końcowymi grupami funkcyjnymi na PEG, skutkuje to większą jednorodnością struktury sieci (rysunek 2B)¹. Polimeryzacja przyrostowa zazwyczaj prowadzi również do większej konwersji grup funkcyjnych, zmniejszając ilość nieprzereagowanych prekursorów i potencjał odpowiedzi immunologicznej/zapalnej z powodu rozpuszczalnych, niewłączonych makromerów¹. Opracowano również metody polimeryzacji w trybie mieszanym, które łączą polimeryzację krokową i łańcuchową poprzez zastosowanie makromerów, które mogą zarówno reagować samodzielnie (wzrost łańcucha), jak i reagować z sieciownikiem (wzrost krokowy). W ten sposób powstają hydrożele o charakterystyce każdego mechanizmu polimeryzacji i mogą być wykorzystywane do wytwarzania bardziej złożonych, zróżnicowanych struktur sieciowych niż same sieci o wzroście krokowym^lub łańcuchowym 1.

Chociaż istnieje mnóstwo grup funkcyjnych, które mogą być używane do funkcjonalizacji PEG i ułatwiania tworzenia hydrożelu, metakrylany i norborneny są jednymi z najczęstszych grup polimeryzacji łańcuchowej i krokowej. Obie te funkcje zapewniają doskonałą czasoprzestrzenną kontrolę nad polimeryzacją sieci, a gdy są używane do enkapsulacji komórek, sieci te zapewniają wysoką ogólną przeżywalność komórek^5-7. Funkcjonalizowany dimetakrylanem PEG (PEGDM) sieciowany poprzez polimeryzację łańcuchową i umożliwia włączenie biomolekuł lub innych czynników poprzez kopolimeryzację z biomolekułami akrylanowymi, metakrylanowymi lub podobnie funkcjonalizowanymi^5,6. Hydrożele PEGDM mają znaczące zalety w porównaniu z alternatywnymi systemami polimeryzacji o wzroście łańcucha, takimi jak PEG funkcjonalizowany akrylanem (PEGDA). Stosując tradycyjne metody, PEGDA może być syntetyzowana szybciej niż PEGDM; jednak dzięki zastosowaniu syntezy wspomaganej mikrofalami, synteza PEGDM jest jeszcze bardziej wydajna. PEGDA jest często syntetyzowana w nocnych reakcjach⁸ lub 24-godzinnych⁹, ale może być również syntetyzowana w ciągu czterech godzin w podwyższonych temperaturach¹⁰. PEGDM jest również tradycyjnie syntetyzowany w reakcji przez noc¹¹ lub przez 24 godziny⁵, przy czym niektóre metody wydłużają czas reakcji do 4 dni¹². Korzystając z zademonstrowanej tutaj metody wspomagania mikrofalowego, PEGDM można wytworzyć w 5-minutowej reakcji. Podczas gdy PEGDM ma wolniejszą kinetykę reakcji niż PEGDA¹³, reakcja sieciowania dla PEGDM jest nadal szybka, zachodzi w ciągu kilku minut i osiąga większą konwersję makromerów niż PEGDA, ponieważ zwiększona hydrofobowość grupy metakrylanowej zwiększa agregację grup funkcyjnych w roztworze, zwiększając w ten sposób prawdopodobieństwo transferu rodników i konwersji metakrylanu¹⁴. Hydrożele PEGDM są również związane ze zwiększoną żywotnością i wzrostem komórek w porównaniu z hydrożelami PEGDA, prawdopodobnie ze względu na zmniejszenie szybkości reakcji w danym momencie, co zmniejsza stężenie rodników i obecnych nieprzereagowanych makromerów¹⁴. Polimeryzacja tiolowo-enowa, taka jak ta wykorzystująca PEG funkcjonalizowany norbornenem (PEGN), tworzy hydrożele poprzez polimeryzację krokową i wymaga użycia PEGN i środka sieciującego, które zawierają średnio więcej niż dwie grupy funkcyjne. Ponieważ rodniki tiylowe reagują z podwójnymi wiązaniami węgiel-węgiel norbornenu, do sieciowania hydrożeli PEGN powszechnie stosuje się środki sieciujące zawierające wiele tioli, co pozwala na łatwe włączenie peptydów o funkcjach aminokwasów cysteiny⁷. Chociaż istnieje wiele innych substancji chemicznych, które reagują poprzez polimeryzację krokową (reakcje addycji Michaela, takie jak akrylan^{tiolu 15} i sulfon tiolowo-winylowy¹⁶, reakcje "kliknięcia", takie jak azydek alkinowy¹⁷ itp.), hydrożele tiolowo-norbornenowe są bardzo powszechne, ponieważ szczep z pierścienia norbornenu znacznie zwiększa szybkość reakcji i zmniejsza szansę na polimeryzację łańcuchową podwójnego wiązania norbornenu⁷.

Wybór między metakrylanem, norbornenem lub alternatywną funkcjonalizacją ułatwiającą tworzenie hydrożelu jest w dużej mierze oparty na podejściu. Na przykład wykazano, że spolimeryzowane sieci PEGDM o wzroście łańcucha dobrze nadają się do kontrolowania lokalizacji komórek w rozwoju okostnej inżynierii tkankowej^18,19. Spolimeryzowane sieci PEG o skokowym wzroście lepiej nadają się do włączania sekwencji peptydowych w celu ułatwienia enzymatycznie reagującej degradacji hydrożelu, ze względu na łatwość wprowadzania sekwencji substratów enzymatycznych przy użyciu peptydów zawierających tiol (cysteinę) i makromerów funkcjonalizowanych norbornenem²⁰. Jeśli pytanie badawcze będzie najlepszym rozwiązaniem poprzez zastosowanie hydrożeli o skokowym wzroście, Fairbanks i wsp. przedstawiają szczegółowy opis strategii funkcjonalizacji norbornenu dla PEG⁷. W tym artykule szczegółowo opisano, w jaki sposób sekwencje PEG i peptydowe mogą być funkcjonalizowane (za pomocą metakrylanu dla PEG i metakryloamidu dla peptydów) w reakcjach polimeryzacji łańcuchowej.

Tradycyjnie, PEGDM jest wytwarzany przez reakcję PEG z chlorkiem metakryloylu i trietyloaminą w dichlorometanie. Reakcję pozostawia się do przechodzenia w temperaturze pokojowej przez noc¹¹ lub przez 24 godziny⁵, przy czym niektóre metody wydłużają czas reakcji do 4 dni¹² przed filtracją, wytrąceniem w eterze dietylowym i zbieraniem. Chociaż istnieje wiele wariantów tego podejścia, wszystkie są czasochłonne, wymagają dużego zestawu urządzeń do syntezy chemicznej i nie są przyjazne dla środowiska, ponieważ wiążą się z użyciem stosunkowo dużych ilości odczynników o wysokiej czystości i rozpuszczalników. Aby obejść te ograniczenia, Lin-Gibson i in. opracowali wspomaganą mikrofalami, bezrozpuszczalnikową metodę funkcjonalizacji PEG z końcowymi grupami metakrylanowymi (Rysunek 3A)¹². W tej reakcji końcowe grupy alkoholowe PEG reagują z jednym z atomów karbonylu bezwodnika metakrylu, tworząc karboksyl. W ten sposób powstaje produkt PEGDM, którego produktem ubocznym jest kwas metakrylowy. Synteza ta ma wiele charakterystycznych zalet syntezy mikrofalowej, w tym skrócony czas reakcji i metody syntezy bezrozpuszczalnikowej²¹. Synteza mikrofalowa jest lepsza od wcześniej omówionych metod, ponieważ jest znacznie szybsza, wymaga mniej rozbudowanego sprzętu do syntezy (np. szkła, płytek reakcyjnych) i zużywa mniej ogólnych ilości odczynników i rozpuszczalników, ponieważ rozpuszczalniki są wymagane tylko do oczyszczania/zbierania produktu, a nie do syntezy, dzięki czemu jest bardziej ekonomiczna i przyjazna dla środowiska.

Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 3: Schematy funkcjonalizacji. A) Poli(glikol etylenowy) reaguje z 10-krotnym nadmiarem bezwodnika metakrylowego w celu wytworzenia metakrylanu poli(glikolu etylenowego). B) Ta sama metoda może być użyta do funkcjonalizacji N-końca sekwencji peptydowych, tworząc peptyd funkcjonalizowany metakrylamidem. Wykonując tę procedurę przed rozszczepieniem peptydu z żywicy, można przeprowadzić selektywną funkcjonalizację N-końca, ponieważ grupy boczne aminokwasów pozostają chronione. n: liczba powtórzeń PEG w makromerze (n=45,5, 227 i 455, odpowiednio, dla zastosowanego liniowego PEG 2, 10 i 20 kDa). R1 do RN: łańcuchy boczne aminokwasów. PG1 do PGN: grupy zabezpieczające łańcuch boczny. TFA: kwas trifluorooctowy. WSKAZÓWKI: triizopropylosilan. DODT: 3,6-dioksa-1,8-oktaneditiol. H₂O: woda.

Metoda metakrylacji wspomagana mikrofalami została ostatnio zaadaptowana przez naszą grupę do funkcjonalizacji N-końca peptydów grupami metakrylamidowymi (Rysunek 3B), aby ułatwić wprowadzanie peptydów do różnych polimerów i sieci polimerowych. W tej reakcji pierwszorzędowa amina N-końca peptydu reaguje z atomem karbonylu na bezwodniku metakrylowym, tworząc amid. W ten sposób powstaje peptyd funkcjonalizowany metakrylamidem, którego produktem ubocznym jest kwas metakrylowy. Podczas stosowania tej procedury do funkcjonalizacji N-końca sekwencji peptydowych ważne jest, aby aminokwasy zawierające reaktywne łańcuchy boczne (aminy pierwszorzędowe (lizyna), alkohole (seryna, treonina) i fenole (tyrozyna)) były chronione podczas funkcjonalizacji, a grupy ochronne są rozszczepiane dopiero po włączeniu metakryloamidu.

Ten artykuł zademonstruje obie te wspomagane mikrofalami metody syntezy PEGDM i funkcjonalizacji sekwencji peptydów na żywicy, podkreślając typowe pułapki i sugerując metody rozwiązywania problemów. W tym artykule szczegółowo omówione zostaną metody wykonywania analitycznych technik chemicznych powszechnie stosowanych do oceny funkcjonalności produktu, a także podane zostaną sugestie i zasoby dotyczące wykonywania bardziej zaawansowanych modyfikacji. Zademonstrowane zostaną typowe wyniki, które obejmują wykorzystanie zsyntetyzowanego PEGDM do tworzenia sieci hydrożelowych, wykorzystanie utworzonych hydrożeli do kontrolowania uwalniania modelowego leku oraz zastosowanie funkcjonalizowanych peptydów w celu ułatwienia interakcji komórka-hydrożel. Szczególna uwaga zostanie zwrócona na scharakteryzowanie rozmiaru siatki hydrożelowej i omówienie, w jaki sposób można dostroić skład hydrożelu, aby wpłynąć na tę podstawową właściwość fizyczną, która z kolei kontroluje właściwości materiału sypkiego, takie jak sztywność i profil uwalniania leku.

Protokół

1. Synteza PEGDM wspomagana mikrofalami

1. Aby zapobiec zanieczyszczeniu wodą, wszystkie używane naczynia szklane należy wstępnie wysuszyć w piekarniku (>60 ºC) przez 1 godzinę.
   Uwaga: Wymagane szkło to: dwie zlewki o pojemności 100 ml, zlewka o pojemności 250 ml, 3 szpatułki, kolba Büchnera o pojemności 250 ml, lejek Büchnera o średnicy 7 cm, szkiełko zegarkowe o średnicy 10 cm.
2. Wstępnie schłodzić 100-150 ml bezwodnego eteru dietylowego (74,12 g/mol) w celu wytrącenia, a następnie przeprowadzić na etapie 1.6, przelewając go do zlewki, przykrywając zlewkę szkiełkiem zegarkowym i umieszczając zlewkę w naczyniu do rekrystalizacji wypełnionym lodem. Przenieś kuchenkę mikrofalową i wirownik do dygestoria chemicznego.
   Uwaga: Eter dietylowy można również wstępnie schłodzić, umieszczając zlewkę w zamrażarce chemicznej. Niższa temperatura eteru dietylowego osiągnięta przez schłodzenie w zamrażarce zwiększy szybkość i wydajność wytrącania.
3. W małej łódce wagowej odważ 5 g poli(glikolu etylenowego) (PEG) o wybranej masie cząsteczkowej (1 000-100 000 Da).
   1. Jeśli jest obecny, wyjmij plastikowy kawałek z wieczka fiolki scyntylacyjnej. Wytarować fiolkę i dozować 10 molowych nadmiaru bezwodnika metakrylowego do fiolki (MA, 154,16 g/mol) zgodnie z równaniem 1 w kapturze. Dodać PEG do fiolki scyntylacyjnej.
      (1)
      gdzie to masa PEG w g, to masa cząsteczkowa PEG w g/mol, to liczba grup OH na PEG, oraz to masa cząsteczkowa MA w g/mol.
4. Luźno przekręcić nakrętkę na fiolkę scyntylacyjną. Ustaw kuchenkę mikrofalową na 5 minut na maksymalną moc. Zakładając rękawice żaroodporne, wyjmuj fiolkę z kuchenki mikrofalowej co 30 sekund.
   1. Całkowicie dokręć nakrętkę i wiruj przez 30 sekund. Powtarzaj, aż roztwór zostanie podgrzany w kuchence mikrofalowej przez pełne 5 minut. Nasadka może wymagać wymiany podczas zabiegu z powodu pęknięć.
5. Po poluzowaniu nasadki pozwól PEGDM ostygnąć do temperatury pokojowej. Rozpuścić PEGDM w niewielkiej ilości (10-15 ml) dichlorometanu (DCM, 84,93 g/mol).
   Uwaga: Zaleca się, aby PEGDM pozostawił PEGDM do znacznego ostygnięcia (~5 min) przed dodaniem DCM, aby zapobiec wrzeniu DCM (podejrzewanego czynnika rakotwórczego) z powodu ciepła resztkowego. PEGDM można rozbić na małe kawałki za pomocą szpatułki i zawirować, aby pomóc w rozpuszczeniu.
6. Wytrącić PEGDM w 10-krotnym nadmiarze lodowatego eteru dietylowego przez 20 min.
   Uwaga: Może być konieczne zadrapanie strony zlewki szpatułką, aby zainicjować tworzenie się kryształów w celu wytrącenia PEG o niższej masie cząsteczkowej (2,500 Da); jednak PEG o masie cząsteczkowej poniżej 1,000 Da nie wytrąci się pomimo zarysowania.
7. Za pomocą lejka i kolby Büchnera zebrać PEGDM przez filtrację próżniową. Nie filtrować do całkowitego wyschnięcia, ponieważ sprzyja to adsorpcji wody przez PEGDM.
   Uwaga: Jeśli jest to konieczne dla konkretnego używanego systemu próżniowego, między zestawem filtracji a źródłem podciśnienia można umieścić odwadniacz, aby chronić pompę próżniową przed uszkodzeniem przez opary rozpuszczalnika.
8. Przefiltrowany PEGDM przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z igłą o dużej średnicy przebitą przez nasadkę w celu wentylacji. Przechowywać przez noc w komorze próżniowej do wyschnięcia.
9. Ponownie rozpuścić PEGDM w DCM i ponownie strącić (jak w krokach 1.5-1.7) jako ostatni krok w celu usunięcia nieprzereagowanego MA. Ponownie wysuszyć, jak w kroku 1.8.

2. Charakterystyka funkcjonalizacji PEGDM

1. Używając deuterowanego chloroformu (120,38 g/mol) jako rozpuszczalnika, przygotuj próbki do ¹H-NMR. Umieścić małą próbkę PEGDM (≈10 mg) w fiolce scyntylacyjnej z niewielką ilością rozpuszczalnika (≈1,0 ml). Stężenie docelowe wynosi 10 mg/ml.
   1. Po rozpuszczeniu próbki przenieś ją do czystej probówki NMR. Próbka powinna wypełnić dno 4-5 cm probówki NMR.
2. Zbierz widma protonu, NMR. Nasze dane zbierane są za pomocą spektrometru 400 MHz. Uruchom próbki w temperaturze pokojowej przez co najmniej 64 skany, aby uzyskać wystarczającą rozdzielczość danych.
3. Jeśli analiza NMR (ryc. 4) wskazuje, że funkcjonalizacja PEGDM jest mniejsza niż 90%, procedurę metakrylacji należy powtórzyć. Dostosuj masę używanej MA, aby uwzględnić zmniejszoną ilość niefunkcjonalizowanego PEG.

Uwaga: Procent PEG funkcjonalizowanego w PEGDM można obliczyć na podstawie obserwowanego: teoretycznego stosunku końcowych protonów metakrylanu (a, b i c) do centralnych protonów PEG (d) (Rysunek 4). Dla liniowego PEG teoretyczną liczbę centralnych protonów PEG oblicza się za pomocą równania 2:

(2)
gdzie to masa cząsteczkowa PEG w g/mol i to masa cząsteczkowa pojedynczego powtórzenia PEG (44 g/mol). W przypadku nieliniowego PEG równanie to należy zmodyfikować, aby odzwierciedlić specyficzną strukturę rozgałęzień (rysunek 1). Procentową funkcjonalizację można następnie obliczyć za pomocą równania 3:
(3)
gdzie to obserwowany obszar poniżej piku d (δ=6.63 ppm), to obserwowany obszar pod pikami protonów metakrylanu (a, δ=1.94 ppm; b i c, δ=5.57 i 6.12 ppm), oraz to teoretyczna liczba protonów metakrylanu (a=3* , b=1* i c=1* - odpowiednio 6, 2 i 2 dla liniowego PEG). Obliczanie procentowej funkcjonalizacji powinno być wykonywane oddzielnie przy użyciu pików a, b i c, a następnie uśredniane w celu uzyskania ogólnej funkcjonalizacji procentowej.

Uwaga: Wystarczająco funkcjonalizowany PEGDM można następnie dializować (w wodzie, przeciwko wodzie) i zbierać przez liofilizację w celu usunięcia pozostałości bezwodnika metakrylowego i kwasu metakrylowego. Produkt końcowy należy wymieszać z niewielką ilością (0,01% wag.) inhibitora, takiego jak kwas cytrynowy lub witamina C, i przechowywać ze środkiem osuszającym w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Końcowy produkt PEGDM może być używany do produkcji hydrożeli, jak szczegółowo opisano w artykule JoVE autorstwa Khetana i Burdicka²².

3. Wspomagana mikrofalami funkcjonalizacja peptydów na żywicy

Uwaga: Nasze peptydy są syntetyzowane przy użyciu żywicy Fmoc-Gly-Wang, przy użyciu automatycznego syntezatora peptydów z monitorowaniem UV, oraz 0,2 M roztworów aminokwasów w N-metylopirolidonie (NMP, 99,1 g/mol). 5% piperazyny (86,1 g/mol) w dimetyloformamidzie (DMF, 73,1 g/mol) jest używane do deprotekcji, 0,5 M O-benzotriazol-N,N,N',N'-tetrametylo-urono-heksafluoro-fosforan (HBTU, 379,3 g/mol) w DMF jest używany jako aktywator, i 2 M diizopropyloetyloamina (DIEA, 129,3 g/mol) w NMP jest stosowana jako baza aktywująca. Peptydy można również uzyskać od komercyjnego dostawcy peptydów. W przypadku korzystania ze źródeł komercyjnych bardzo ważne jest, aby peptydy były pozyskiwane na żywicy z nienaruszonymi grupami chroniącymi łańcuch boczny aminokwasów, a nie w pełni rozszczepione, jak to jest standardem.

Uwaga: Ważne jest, aby wszystkie aminokwasy z reaktywnymi łańcuchami bocznymi były chronione, aby zapewnić, że funkcjonalizacja metakryloamidu zachodzi tylko na pierwszej aminie N-końca sekwencji. W Tabeli 1 przedstawiono aminokwasy z reaktywnymi grupami bocznymi i typowymi grupami ochronnymi. Aminokwasy z grupami ochronnymi są włączane do sekwencji podczas syntezy peptydów w taki sam sposób, jak aminokwasy niechronione i często są dostępne u tych samych dostawców aminokwasów.

Aminokwas	Grupa reaktywna	Grupa chroniąca
Lizyna	Amina pierwotna	tert-butyloksykarbonyl (Boc)
Serine	Alkohol podstawowy	tert-butyl (tBu)
Treonina	Alkohol wtórny	tBu
Tyrozyna	Fenol	tBu

Tabela 1: Aminokwasy reaktywne i typowe grupy ochronne.

1. Zsyntetyzuj peptydy przy użyciu standardowej syntezy peptydów w fazie stałej i przechowuj na żywicy w temperaturze 4 °C w DMF, aż będą gotowe do użycia.
2. Za pomocą lejka Büchnera o średnicy 7 cm z bibułą filtracyjną i kolbą o pojemności 250 ml zebrać żywicę peptydową z DKZ poprzez filtrację.
3. Jeśli jest obecny, wyjmij plastikowy kawałek z wieczka fiolki scyntylacyjnej. Przenieść żywicę do fiolki scyntylacyjnej. Używając jednorazowej pipety, dodaj tylko tyle MA, aby pokryć żywicę w fiolce scyntylacyjnej.
4. Luźno umieścić nasadkę na fiolce scyntylacyjnej. Ustaw kuchenkę mikrofalową na 3 minuty na maksymalną moc. Zakładając rękawice żaroodporne, wyjmuj fiolkę z kuchenki mikrofalowej co 15-20 sekund.
   1. Całkowicie dokręć nakrętkę i wiruj przez 15 sekund. Powtarzaj, aż roztwór zostanie podgrzany w kuchence mikrofalowej przez pełne 3 minuty.
5. Po poluzowaniu nakrętki pozwól roztworowi peptydu ostygnąć do temperatury pokojowej. Używając niewielkiej ilości DMF i lejka Büchnera z bibułą filtracyjną i kolbą, zebrać żywicę peptydową z fiolki.
6. Przenieś żywicę peptydową do świeżej fiolki scyntylacyjnej, a następnie rozszczep i zdechlepcuj peptyd.
   1. Na 0,25 mmol żywicy stosujemy 2-godzinną reakcję w temperaturze pokojowej z rotacją, używając koktajlu rozszczepienia 18,5 ml kwasu trifluorooctowego (TFA, 114,02 g/mol) z 0,5 ml triizopropylosilanu (TIPS, 158,36 g/mol), 3,6-dioksa-1,8-oktaneditiolu (DODT, 182,30 g/mol) i wody dejonizowanej (18,02 g/mol).
      Uwaga: Ten koktajl jest wystarczający dla większości peptydów, ale nie chroni aminokwasów chronionych 2,2,4,6,7-pentametylo-dihydrobenzofuran-5-sulfonylem (Pbf) (powszechnie stosowanych do ochrony łańcuchów bocznych argininy). Jeśli sekwencja zawiera jakiekolwiek grupy chronione przed Pbf, 0,5 ml TFA należy zastąpić 0,5 ml tioanizolu (124,20 g/mol), a czas rozszczepienia wydłużyć do 4 godz.
      Uwaga: Jeśli w koktajlu rozszczepienia tworzy się mętna, krystaliczna substancja, peptyd prawdopodobnie rozpada się z roztworu, a objętość koktajlu rozszczepienia powinna zostać podwojona.
7. Schłodzić 400 ml bezwodnego eteru dietylowego na lodzie w zlewce pokrytej szkiełkiem zegarkowym.
8. Wytrącić peptyd w 10-krotnym nadmiarze eteru dietylowego i równomiernie podzielić roztwór na cztery stożkowe probówki o pojemności 50 ml. Wirować przy 3 200 x g przez 10 minut w celu zebrania peptydu.
   1. Zdekantować eter i ponownie zawiesić peptyd w 100 ml świeżego eteru dietylowego podzielonego między dwie stożkowe rurki o długości 50 m. Powtórzyć proces wirowania, dwukrotnie wprowadzając ponownie 50 ml świeżego eteru, co daje w sumie 4 płuczki eterowe.
      Uwaga: Powoduje to usunięcie substancji chemicznych użytych w koktajlu rozszczepienia i rozszczepionych grup ochronnych ze stałego peptydu.
9. Po ostatnim etapie wirowania zdekantować eter odpadowy i wysuszyć peptyd przez noc w próżni.

4. Charakterystyka funkcjonalizacji peptydów

1. Stosować 50:50 H₂O:Acetonitryl (41,05 g/mol) + 0,1% TFA jako rozpuszczalnik do analizy MALDI-ToF próbek peptydów. Umieścić małą próbkę (1 - 2 mg) peptydu w probówce Eppendorfa o pojemności 1,5 ml i rozpuścić próbkę w 1 ml rozpuszczalnika MALDI.
2. Przygotuj roztwór macierzy. Powszechnie stosowaną matrycą jest kwas α-cyjano-4-hydroksycynamonowy (CHCA, 189,2 g/mol) jako matryca. Rozpuścić matrycę 10 mg/ml w rozpuszczalniku MALDI, tworząc podstawowy roztwór matrycowy.
   Uwaga: Roztwór podstawowy matrycy można przechowywać w temperaturze pokojowej przez okres do jednego tygodnia w celu przeprowadzenia dodatkowych analiz.
3. Połącz roztwór peptydu i matrycy w stosunku 1:1. Umieścić ten połączony roztwór w trzech oddzielnych miejscach na płytce próbki MALDI, dodając 1 μl/plamkę.
   1. Osusz plamy, susząc na powietrzu lub używając opalarki. Ponownie umieścić i wysuszyć każdą próbkę.
      Uwaga: Respotting daje bardziej jednolitą próbkę peptydu/matrycy i pomaga w uzyskaniu wyraźnego sygnału. Standardową mieszaninę peptydów należy również połączyć z roztworem matrycy w stosunku 1:1 i nakrapić (tylko raz) na płytkę MALDI.
4. Zbierz dane MALDI-ToF. Ze względu na dodanie grupy metakryloamidowej do N-końca peptydu, powinien nastąpić wzrost masy cząsteczkowej o 68 g/mol powyżej masy cząsteczkowej samego peptydu.
   Uwaga: W przeciwieństwie do syntezy PEGDM, peptydy nie mogą być refunkcjonalizowane, ponieważ po rozszczepieniu grupy ochronne na aminokwasach z reaktywnymi łańcuchami bocznymi są usuwane, a selektywna funkcjonalizacja N-końców nie może być już zapewniona.
   1. Jeśli analiza MALDI (ryc. 5) wykaże, że peptyd został prawidłowo sfunkcjonalizowany, a wszystkie grupy ochronne odpowiednio rozszczepione, peptyd może być dializowany (w wodzie, przeciwko wodzie) i zbierany przez liofilizację w celu usunięcia pozostałości zanieczyszczeń (koktajl rozszczepienia, eter, rozszczepione grupy ochronne itp.). Stały peptyd należy przenieść do małej probówki Eppendorfa i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.

Wyniki

Magnetyczny rezonans jądrowy protonu jest jedną z najczęstszych technik analitycznych do oceny efektywności reakcji chemicznej, ponieważ obszar pod każdym pikiem widma jest proporcjonalny do względnych poziomów tego protonu w próbce, co pozwala na określenie proporcji produktu i reagenta w próbce. W przypadku tej reakcji można użyć analizy ¹H-NMR (ryc. 4) do obliczenia % funkcjonalizacji na podstawie obserwowanego: teoretycznego stosunku końcowych protonów metakrylanu (a, b i c) do centralnych protonów PEG (d). PEGDM pokazany na rysunku 4 wynosił 2,000 Da przed funkcjonalizacją; zatem n=2,000 Da/(44 Da/PEG powtórzenie) = 45,5, więc d=4*(n-1)=178, co daje stosunek jednostek proton: NMR 178/102,16=1,74. W tym przypadku pik a nie może być wykorzystany do oceny % funkcjonalizacji, ponieważ obecność wody w próbce sztucznie zwiększa obszar pod pikiem. Używając piku b, funkcjonalizacja % wynosi 1,00 * 1,74 / 2 * 100% = 87,1%; Używając piku C, funkcjonalizacja % wynosi 1,08*1,74/2*100%=94,1%. W związku z tym ogólna funkcjonalizacja % wynosi 91%, a ten PEGDM jest odpowiednio funkcjonalizowany do stosowania w syntezie hydrożelu. Zazwyczaj około 90% funkcjonalizacji osiąga się po jednej rundzie metakrylacji.

Ze względu na mnogość pików protonów, które powstają w analizie peptydów metodą ¹H-NMR, funkcjonalizacja peptydów jest łatwiejsza do zbadania za pomocą spektrometrii mas MALDI-ToF. Pokazano to na rysunku 5, gdzie zsyntetyzowano peptyd GKRGDSG i poddano go funkcjonalizacji metakryloamidu. Niewielka frakcja peptydu została rozszczepiona w celu wstępnej oceny masy cząsteczkowej (ryc. 5A), która wykazała obserwowany pik masy cząsteczkowej występujący przy 676 g / mol, oczekiwanej masie cząsteczkowej peptydu, co wskazuje na prawidłową syntezę sekwencji peptydowej. Pozostała część peptydu została poddana funkcjonalizacji metakryloamidu przed rozszczepieniem. Ponieważ peptyd ten zawiera aminokwasy R chronione przez Pbf, rozszczepienie przeprowadzono w koktajlu zawierającym tioanizol przez 4 godziny. Po funkcjonalizacji metakryloamidu obserwowany pik masy cząsteczkowej występuje przy 744 g / mol (Figura 5B), oczekiwanej masie peptydu funkcjonalizowanego metakrylamidem (676 + 68 g / mol), a nie przy oczekiwanej masie cząsteczkowej niefunkcjonalizowanego peptydu, co wskazuje na prawidłową funkcjonalizację.

Aby zademonstrować funkcjonalność zarówno PEG, jak i peptydu funkcjonalizowanego metakrylamidem, wyprodukowano hydrożele PEGDM z i bez 0,5 mM funkcjonalizowanego metakrylamidem GKRGDSG (Rysunek 6). Hydrożele wyprodukowano z 10% wag. liniowym 10 kDa PEGDM w PBS, z 0,05% wag. fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinianem litu (LAP) jako fotoinicjatorem. Roztwór prekursora hydrożelu wstrzyknięto między dwa szkiełka podstawowe oddzielone szklaną przekładką i przytrzymywane za pomocą spinaczy do segregatorów. Roztwór prekursora poddano następnie działaniu światła UV o długości fali 365 nm o sile 2 mW/^cm2 przez 10 minut w celu wywołania sieciowania, po czym za pomocą cylindrycznego stempla zebrano żele o średnicy 8 mm. Żele przepłukano w PBS i pozostawiono do pęcznienia przez 2 dni, aby zapewnić osiągnięcie warunków pęcznienia w równowadze^16,20 . Ludzkie MSCs (pasaż 3) wyhodowano do 80% konfluencji i wysiewano na hydrożelach w ilości 15 000 komórek/^cm2. Komórki pozostawiono do przylegania przez 48 godzin, a następnie przeniesiono je na świeże podłoże zawierające 0,5 μl / ml kalceiny AM i 2 μl / ml homodimeru etydyny (zestaw LIVE/DEAD Viability firmy Invitrogen) i zobrazowano pod wpływem kontrastu fazowego i fluorescencji przy 10-krotnym powiększeniu za pomocą aparatu Nikon Eclipse Ti 2000. MSC nie były w stanie przylegać do niefunkcjonalizowanych hydrożeli PEG (Figura 6A), ale po włączeniu peptydu adhezyjnego RGD były w stanie przylegać i rozprzestrzeniać się na powierzchni hydrożelu (Figura 6B). Przedstawione obrazy LIVE/DEAD nie reprezentują żywotności populacji wysiewanych MSC, ponieważ MSCs są komórkami zależnymi od adhezji, które odrywają się od powierzchni żelu po śmierci i zostaną usunięte podczas procesu przenoszenia pożywki, co powoduje sztuczną inflację żywotności wysiewanych komórek. Obrazy fluorescencyjne mają raczej na celu rozgraniczenie między przylegającymi komórkami a niewielkimi zmianami w topologii hydrożelu, co może być trudne w przypadku samego kontrastu fazowego. Co ciekawe, nierozproszone komórki wysiane na żelach zawierających tylko PEG są zabarwione pozytywnie zarówno na obecność kalceiny AM, jak i homodimera etydyny, co wskazuje, że komórki umierały w czasie obrazowania.

Jedną z wielu zalet hydrożeli PEG jest ich wysoce przestrajalna natura. Modyfikacja specyficznego składu hydrożelu PEG zapewnia naukowcom wysoki stopień kontroli nad właściwościami, takimi jak moduł sprężystości. Jak pokazano na rysunku 7, wiadomo, że zarówno masa cząsteczkowa PEG (figura 7A), jak i procent wagowy (rysunek 7B) kontrolują rozmiar siatki hydrożelu (ξ) oraz wynikającą sztywność hydrożelu i szybkość uwalniania leków w kapsułkach. Wykazano to, wytwarzając hydrożele o różnej masie cząsteczkowej PEGDM i badając wynikowy moduł hydrożelu i rozmiar oczek (ryc. 8). Wszystkie hydrożele wyprodukowano z 10% wag. liniowego PEGDM w PBS, z 0,05% wag. LAP jako fotoinicjatorem. 40 μl roztworu prekursora hydrożelu w strzykawkach o pojemności 1 ml z odciętymi końcówkami wystawiono na działanie światła UV o długości fali 365 nm o sile 2 mW/^cm2 przez 10 minut w celu utworzenia hydrożeli, tworząc cylindryczne geometrie o średnicy około 5 mm i wysokości 2 mm. Żele pozostawiono do pęcznienia w PBS przez 2 dni przed testami mechanicznymi. Moduł hydrożelowy określono za pomocą MTS QT/5 z ogniwem obciążnikowym 5 N przy ściskaniu od 5 do 10% początkowej wysokości hydrożelu z prędkością 0,1 mm/s. Po zakończeniu testów mechanicznych rozmiar oczek określono poprzez pomiar masy hydrożelu przed (M_s) i po (MD) 24 godzinach liofilizacji za pomocą równania Flory'ego-Rehnera, jak opisano w sekcji dyskusji, z obliczeniami wykonanymi w MATLAB. Zgodnie z hipotezą, zwiększenie masy cząsteczkowej makromeru PEG spowodowało wzrost rozmiaru siatki hydrożelu (ryc. 8A) i spadek sztywności hydrożelu (ryc. 8B). Rozmiar oczek hydrożelu i wynikającą z niego sztywność żelu można również kontrolować, zmieniając procentową masę PEG. Hydrożele wyprodukowano z różną % wagową liniowego 10 kDa PEGDM, a sztywność hydrożelu i rozmiar oczek określono zgodnie z wcześniejszym opisem (rysunek 9). Jak pokazano na rysunku 7B, zwiększenie % masy PEG powoduje znaczne zmniejszenie rozmiaru oczek (rysunek 9A) i wzrost sztywności hydrożelu (rysunek 9B).

Hydrożele zawierające kapsułkowaną albuminę surowicy bydlęcej (BSA) zostały utworzone przy użyciu PEG o różnej masie cząsteczkowej (2, 10 i 20 kDa). Wszystkie hydrożele wyprodukowano z 10% wag. PEGDM w PBS zawierającym 50 μg/ml BSA, jak opisano na rysunku 6. Żele inkubowano w 1 ml PBS w temperaturze 37 °C i przenoszono do świeżego PBS w każdym punkcie czasowym. Uwolnione BSA określono ilościowo za pomocą testu Bradforda firmy Thermo Scientific. Rozmiar oczek hydrożelu określono zgodnie z opisem na rysunku 8. Jak pokazano na rysunku 7A, uwalnianie BSA następuje szybciej z hydrożeli utworzonych przy użyciu PEGDM o większej masie cząsteczkowej, w wyniku większego rozmiaru oczek w hydrożelu (rysunek 10).

Rysunek 4. Reprezentatywny ¹H-NMR liniowego PEGDM o sile 2 kDa funkcjonalizowanego metodą wspomaganą mikrofalami.Procentową funkcjonalizację można obliczyć na podstawie obserwowanego: teoretycznego stosunku końcowych protonów metakrylanu (a, b i c) do centralnych protonów PEG (d). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 5. Reprezentatywny MALDI-ToF peptydu GKRGDSG (A) przed i (B) po funkcjonalizacji metodą wspomaganą mikrofalami. Należy zauważyć, że obserwowany pik masy cząsteczkowej po funkcjonalizacji występuje przy 744 g / mol, oczekiwanej masie peptydu funkcjonalizowanego metakrylamidem (676 + 68 g / mol), a nie przy oczekiwanej masie cząsteczkowej niefunkcjonalizowanego peptydu (676 g / mol). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 6. Reprezentatywny kontrast fazowy (po lewej) i obrazy fluorescencyjne LIVE/DEAD (zielony/czerwony) (po prawej) MSCs hodowanych na A) samych żelach PEG i B) żelach PEG zawierających 0,5 mM funkcjonalizowanego metakrylamidem GKRGDSG. MSCs nie są w stanie przylegać i rozprzestrzeniać się na samych żelach PEGDA, ale po włączeniu peptydu adhezyjnego RGD są w stanie przylegać i rozprzestrzeniać się na powierzchni hydrożelu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 7. A) Masa cząsteczkowa PEG i B) procent wagowy PEG używany do tworzenia sieci hydrożelowych wpływa na rozmiar oczek hydrożelu (ξ) oraz wynikową sztywność hydrożelu i szybkość uwalniania leków w kapsułkach. A) Zwiększenie masy cząsteczkowej PEG (od lewej do prawej) przy stałym procencie wagowym zwiększa rozmiar siatki hydrożelu, zmniejszając sztywność hydrożelu i zwiększając szybkość uwalniania leku. B) Zmniejszenie procentu wagowego PEG (od lewej do prawej) używanego do tworzenia hydrożeli zwiększa rozmiar siatki hydrożelowej, podobnie zmniejszając sztywność hydrożelu i zwiększając szybkość uwalniania leku (nie w skali). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 8. A) Zwiększa się rozmiar oczek i B) sztywność hydrożelu zmniejsza się wraz ze wzrostem masy cząsteczkowej makromeru PEG. n=10, słupki błędów = SEM, *** p<0,001 przez jednoczynnikową ANOVA z testem post-hoc HSD Tukeya. Wszystkie analizy statystyczne zostały wykonane przy użyciu Prism 5. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 9. A) Zmniejsza się rozmiar oczek i B) sztywność hydrożelu wzrasta wraz ze wzrostem % wag. PEG. n = 9-10, słupki błędów = SEM, ** p<0,01, *** p<0,001 przez jednokierunkową ANOVA z testem post-hoc HSD Tukeya. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 10. Uwalnianie kapsułkowanego modelowego albuminy surowicy bydlęcej (BSA) z hydrożeli utworzonych przy użyciu PEG o masie cząsteczkowej 2 kDa, 10 kDa, 20 kDa. Uwalnianie BSA następuje szybciej z hydrożeli utworzonych przy użyciu PEGDM o większej masie cząsteczkowej, w wyniku większego rozmiaru oczek w hydrożelu. n=6, słupki błędów = SEM. % uwolnionego BSA różni się istotnie (p<0,0001) między wszystkimi trzema grupami w każdym punkcie czasowym, z wyjątkiem t=1 i 2,5 godziny, kiedy uwalnianie z żeli 2 i 10 kDa jest równoważne, za pomocą dwukierunkowej ANOVA powtarzanej za pomocą testu post-hoc Bonferroniego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Dyskusja

Przedstawione wcześniej metody są nieocenione w syntezie funkcjonalizacji PEGDM i metakryloamidu peptydów lub innych związków zawierających aminy. Materiały te mogą być następnie wykorzystywane w medycynie regeneracyjnej i zastosowaniach związanych z dostarczaniem leków. Ze względu na hydrofilowy charakter PEG, hydrożele utworzone z makromerów PEG mają wysoką zawartość wody, podobnie jak wiele tkanek w organizmie². Ta cecha sprawia, że PEG jest bardzo odporny na adsorpcję białek, a zatem obojętny w organizmie³. Jednak higroskopijny charakter PEG może okazać się kłopotliwy podczas funkcjonalizacji. Jeśli podczas procedury metakrylacji w próbce PEG znajduje się woda, bezwodnik metakrylowy będzie reagował preferencyjnie z wodą, wytwarzając kwas metakrylowy, co spowoduje słabą funkcjonalizację PEG.

Dlatego jednym z najważniejszych kroków, które można podjąć, aby zapewnić udaną metakrylację PEG lub peptydu, jest utrzymanie warunków reakcji bezwodnej. Zalecany etap suszenia wszystkich naczyń szklanych przed użyciem ma na celu zapobieganie zanieczyszczeniu wody. Obecność wody w próbce można zaobserwować w analizie NMR, jako szeroki pik przy 1,7 ppm (ryc. 4). Jeśli zaobserwuje się słabą metakrylację nawet po wysuszeniu wszystkich wyrobów szklanych, chemikalia mogą być suszone na siarczanie sodu lub innych środkach suszących (sita molekularne itp.) przed użyciem. Destylacja może być również stosowana do usuwania wody i oczyszczania bezwodnika metakrylowego przed użyciem, a destylacja azeotropowa może być stosowana do suszenia PEG²³. W skrajnych przypadkach synteza może być przeprowadzona w komorze rękawicowej, aby dodatkowo zapewnić odpowiednie warunki bezwodne. Druga runda metakrylacji, zgodnie z tą samą procedurą, może być również wykonana w celu zwiększenia funkcjonalności. Ponieważ zawsze istnieje ryzyko, że wymagane będą dodatkowe rundy funkcjonalizacji, należy zachować ostrożność w krokach 1.7 i 1.9, aby szybko zebrać PEGDM za pomocą filtracji próżniowej. Filtracja próżniowa przez okres dłuższy niż jest to absolutnie konieczne zwiększa ekspozycję PEG na działanie powietrza, zwiększając możliwość adsorpcji wody.

Mimo że procentowy nadmiar bezwodnika metakrylowego w stosunku do hydroksylowych grup funkcyjnych pozostaje niezmieniony, zwiększenie funkcjonalizacji PEG (np. ramienia #) na prekursorze PEG jest na ogół związane ze spadkiem osiągniętego procentu funkcjonalizacji (wyniki niepublikowane, laboratorium Benoit). Aby zapobiegawczo zaradzić temu zmniejszeniu wydajności funkcjonalizacji lub w przypadku napotkania szczególnych trudności z osiągnięciem wystarczająco wysokiej funkcjonalizacji, czas trwania reakcji mikrofalowej może zostać wydłużony, pod warunkiem, że interwał mikrofalowy jest utrzymywany na poziomie 30 sekund. Podczas gdy nadmiar 10 molowych jest zwykle wystarczający, ilość bezwodnika metakrylowego użytego w reakcji można również zwiększyć, aby zwiększyć osiągnięty procent funkcjonalizacji¹².

Ważne jest, aby wykonać dodatkowy etap wytrącania (1.9) w celu uzyskania dobrych sygnałów NMR. Chociaż kuszące jest przeprowadzenie drugiego wytrącania tego samego dnia co synteza, stwierdzono, że suszenie próbki przez noc przed ponownym wytrąceniem pomaga w usuwaniu nadmiaru bezwodnika metakrylowego i kwasu metakrylowego. Przygotowanie próbki jest również ważne dla uzyskania czystych widm NMR, dlatego próbki powinny być przygotowywane w zalecanych warunkach. Rysunek 4 przedstawia reprezentatywne ^{wyniki 1}H-NMR dla prawidłowo funkcjonalizowanego PEGDM. Analizując stosunek końcowych protonów metakrylanu do centralnych protonów PEG, stwierdzono, że PEGDM jest odpowiednio funkcjonalizowany. Przygotowanie próbki MALDI jest równie ważne dla uzyskania wyraźnego odczytu. MALDI jest szczególnie wrażliwy na obecność soli i wysokie stężenia w próbkach. Jeżeli nie można uzyskać wyraźnego odczytu MALDI (natężenie powyżej 50 dowolnych jednostek (j.a.) przy wysokim stosunku sygnału do szumu), roztwór próbki należy rozcieńczyć w stosunku 1:100 w rozpuszczalniku MALDI przed połączeniem z roztworem matrycy i ponownie przeanalizować. Rysunek 5 przedstawia reprezentatywne wyniki MALDI-ToF po prawidłowej funkcjonalizacji peptydu, rozszczepieniu i przygotowaniu próbki. Rozszczepienie małej próbki żywicy przed funkcjonalizacją (ryc. 5A) wykazuje prawidłową syntezę peptydu GKRGDSG, z prawidłową funkcjonalizacją peptydu metakryloamidu pokazaną na ryc. 5B.

Podczas gdy funkcjonalizacja peptydów na żywicy jest stosunkowo solidną procedurą, warunki rozszczepienia wymagane dla każdej sekwencji często wymagają dostrojenia. W przypadku długich sekwencji, w których wiele aminokwasów ma chronione łańcuchy boczne (>30 aminokwasów lub >15 aminokwasów z grupami ochronnymi), czas rozszczepienia należy wydłużyć o jedną godzinę. Jeśli jednak czas rozszczepienia zostanie zbyt mocno wydłużony, może dojść do rozszczepienia wiązań peptydowych z powodu długotrwałej ekspozycji na kwasy. Analiza MALDI może być bardzo pomocna w ujawnieniu wszelkich błędów, które wystąpiły w syntezie lub rozszczepianiu peptydów. Zaobserwowany spadek poniżej oczekiwanej masy cząsteczkowej może wskazywać, że aminokwas (aminokwasy) nie połączyły się prawidłowo lub że nastąpiło frakcjonowanie peptydów (patrz Tabela 2 dla źródeł powszechnie obserwowanych zmian masy cząsteczkowej). Jeśli zaobserwowana masa cząsteczkowa jest wyższa niż oczekiwano w stosunku do masy użytej grupy ochronnej, jest prawdopodobne, że rozszczepienie i deprotekcja były niewystarczające i peptyd powinien zostać ponownie rozszczepiony na dodatkowy czas.

Delecja aminokwasów	Zmiana MW (g/mol)	Nieumocnione grupy ochronne	Zmiana MW (g/mol)	Powszechnie występujące jony	Zmiana MW (g/mol)
Ala	-71	Acetylo	+42	Kl-	+35
Arg	-158	Kolczyk	+40	K+	+39
Asn	-114	Podziel	+85	Mg2+	+24
Asp	-115	Boc	+100	Na+	+23
Cys powiedział:	-103	Fmoc	+223
Gln	-128	OtBu powiedział:	+56
Klej	-129	Współczynnik Pbf	+252
Gly powiedział:	-57	tBu powiedział:	+56
Jego	-137	Trt	+242
Ile	-113
Mołdawski	-113
Lys	-128
Spełnione	-131
Phe powiedział:	-147
Pro	-97
Ser	-87
Czterej	-101
Trp	-186
Tyr	-147
Val	-99

Tabela 2. Często obserwowane zmiany masy cząsteczkowej peptydu.

Makromery wytwarzane przy użyciu metod metakrylacji wspomaganej mikrofalami mogą być wykorzystywane w wielu zastosowaniach medycyny regeneracyjnej lub dostarczania leków. Zsyntetyzowane w ten sposób funkcjonalizowane peptydy i PEGDM mogą być również włączane do polimerów przy użyciu metod polimeryzacji za pośrednictwem nitrooksydów (NMP), polimeryzacji rodnikowej z przeniesieniem atomów (ATRP) lub odwracalnego transferu addycyjno-fragmentacyjnego (RAFT)²⁴. Sieci hydrożelowe mogą być również wytwarzane w obecności komórek, jak wcześniej wykazano w artykule JoVE autorstwa Khetana i Burdicka²². Często wymaga to włączenia peptydów adhezyjnych komórek, takich jak RGD lub cząsteczki macierzy zewnątrzkomórkowej, ponieważ sam PEG nie zapewnia interakcji komórka-materiał krytycznych dla przeżycia i funkcji niektórych typów komórek²⁵. Peptydy, na przykład, mogą być syntetyzowane przy użyciu tradycyjnej syntezy peptydów w fazie stałej i funkcjonalizowane zgodnie z opisem tutaj, aby umożliwić włączenie do sieci hydrożelowych. Jak widać na rycinie 6, włączenie funkcjonalizowanego metakrylamidem peptydu adhezyjnego komórek GKRGDSG w hydrożelach (0,5 mM) ułatwia adhezję ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) do powierzchni hydrożelu PEG, zwiększając liczbę przyłączonych i rozprzestrzeniających się komórek (figura 6B), w porównaniu z hydrożelami PEG bez peptydu adhezyjnego komórek (figura 6A). Jednak wcześniejsze prace wykazały, że interakcje komórka-materiał są dodatkowo wzmocnione przez włączenie 3400 przekładek PEG Da między peptydami adhezyjnymi a sieciami hydrożelowymi, w celu zmniejszenia przeszkód sterycznych peptyd-integryna. Bez włączenia przekładki komórki mogą wchodzić w interakcje z hydrożelami PEG za pośrednictwem niespecyficznych białek, które adsorbują się do peptydu, a nie poprzez interakcje za pośrednictwem integryn z peptydami²⁶. Aby włączyć ten dystans PEG i uniknąć niespecyficznych interakcji, peptydy mogą być sprzężone z monofunkcjonalizowanym PEG za pośrednictwem estrów aktywowanych N-hydroksysukcynimidylem, jak opisano przez Herna i Hubbella²⁶.

Zastosowania sieci hydrożelowych wymagają ścisłej kontroli właściwości materiału. Istotną zaletą hydrożeli PEG jest wysoki stopień kontroli nad tymi właściwościami. Na przykład masa cząsteczkowa, liczba ramion i % wagowych PEG używanych do tworzenia sieci hydrożelowych mogą być zmieniane w celu dostrojenia właściwości do określonych zastosowań. Pozwala to na ścisłą kontrolę nad rozmiarem siatki hydrożelowej (ξ), która kontroluje współczynnik pęcznienia hydrożelu (Q) i sztywność (moduł sprężystości, E). Jest to zilustrowane na rysunku 7A i określone ilościowo na rysunku 8, gdzie wzrost masy cząsteczkowej makromeru PEG powoduje wzrost rozmiaru siatki hydrożelowej (rysunek 8A) i spadek sztywności hydrożelu (rysunek 8B).

Podstawowa cecha fizyczna, która kontroluje zachowanie masy w tych sieciach hydrożelowych, rozmiar oczek, jest obliczana przy użyciu równania Flory'ego-Rehnera¹⁶. Aby wykonać to obliczenie, najpierw oblicza się współczynnik objętościowego pęcznienia (Q) z równania 4:
(4)

gdzie ρ_s to gęstość wody (1 g/ml), ρ_p to gęstość PEG (1,12 g/ml), M_s to spuchnięta masa hydrożelu, a M_D to sucha masa hydrożelu (często mierzona po zamrożeniu i liofilizacji hydrożeli). Masę cząsteczkową między sieciami poprzecznymi (M_c , w g/mol) oblicza się następnie z równania 5:
(5)

gdzie_{M N} jest średnią liczbową MW PEG (w g/mol), jest objętością właściwą polimeru , V₁ jest objętością molową wody (18 ml/mol), V₂ jest równowagowym ułamkiem objętościowym polimeru hydrożelu
(), a X₁ jest parametrem interakcji polimer-rozpuszczalnik dla PEG i wody (0,426)¹⁶. Liczba wiązań między sieciami krzyżowymi (n) jest następnie obliczana z równania 6:
(6)

gdzie N_b oznacza liczbę wiązań w powtórzeniu PEG (3), a M_r oznacza MW powtórzenia PEG (44 g/mol)²⁷. Pozwala to na obliczenie średniej kwadratowej odległości łańcucha polimerowego od końca do końca (w nm) z równania 7:
(7)

gdzie l jest średnią długością wiązania (0,146 nm, obliczoną na podstawie długości wiązań C-C i C-O), a C_n jest stosunkiem charakterystycznym polimeru (4,0 dla PEG)²⁸. Na koniec rozmiar oczek hydrożelu można obliczyć z równania 8:
(8)

Właściwości hydrożelu można w podobny sposób dostosować, dostosowując ilość PEG używanego do tworzenia hydrożeli. Zmniejszenie procentu wagowego makromeru PEG powoduje zwiększenie rozmiaru oczek hydrożelowych, co z kolei zmniejsza sztywność hydrożelu. Rysunek 7B ilustruje, a rysunek 9 określa ilościowo, w jaki sposób procent wagowy PEG używany do tworzenia hydrożelu może być wykorzystany do kontrolowania rozmiaru oczek (rysunek 9A) i wynikowej sztywności hydrożelu (rysunek 9B). Ponieważ wykazano, że sztywność podłoża wpływa na zachowania komórek, takie jak różnicowanie komórek macierzystych²⁹, zdolność do ścisłej kontroli sztywności jest ważną cechą w wytwarzaniu hydrożelu.

Hydrożele mogą być również używane do kontrolowania dostarczania leków. Jak pokazano na rysunku 7A i pokazano na rysunku 10, zwiększenie masy cząsteczkowej makromerów PEG zwiększa rozmiar siatki sieci hydrożelowej, a następnie zwiększa uwalnianie kapsułkowanego leku modelowego, albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Podczas gdy próbki hydrożelu w tym badaniu zostały zniszczone w czasie t=195 godzin, aby umożliwić pomiar mokrej i suchej masy hydrożelu w celu obliczenia rozmiaru oczek, z naszego doświadczenia wynika, że dalsze uwalnianie BSA nastąpiłoby, gdyby próbki były inkubowane przez dłuższy czas. Niepełne uwolnienie BSA zaobserwowane na rysunku 10 nie jest nieoczekiwane, ponieważ inne grupy również zgłosiły, że BSA jest odporne na dyfuzję w sieciach hydrożelowych PEG³⁰. Niepełne uwolnienie kapsułkowanego białka może nastąpić z powodu wiązań wodorowych między białkami a makromerami PEG lub kowalencyjnego wiązania między grupą metakrylanową na PEG a pierwszorzędowymi grupami aminowymi na resztach lizyny w BSA³¹. Ponadto BSA jest podatny na agregację i tworzenie wiązań dwusiarczkowych w miarę upływu czasu, co może zwiększyć jego efektywny promień Stokesa i utrudnić jego uwalnianie z hydrożeli. Ponieważ hydrożele o wzroście łańcucha, takie jak te hydrożele PEGDM, są podatne na nieidealność sieci i niejednorodny rozmiar siatki hydrożelu (rysunek 2A), możliwe jest również, że frakcja kapsułkowanego BSA jest zawarta w regionach hydrożelu, które mają znacznie mniejszy rozmiar oczek niż ogólna średnia w żelu, co zapobiega jego uwolnieniu. Podczas gdy w tym przypadku zaobserwowano niepełne, nieFickiańskie uwalnianie (dane nie pokazano) kapsułkowanego BSA, kontrolowane uwalnianie przez Fickana wielu innych leków modelowych, w tym insuliny i albuminy jaja kurzego, wykazano przy użyciu podobnych hydrożeli PEGDM³⁰. Ponadto Watkins i Anseth wykorzystali konfokalną laserową mikroskopię skaningową, aby wykazać, że uwalnianie cząsteczek fluorescencyjnych z podobnych hydrożeli jest modelowane akceptowalnie za pomocą metod dyfuzji Fickana³².

Podczas gdy hydrożele utworzone w tym badaniu są nieulegające degradacji, degradacja sieci jest kolejnym parametrem, który można włączyć i dostroić do tych sieci. Zapewnienie kontrolowanej degradacji hydrożelu może skutkować zmianami w zachowaniu komórek³³, promowaniem wzrostu tkanki lub wrastania tkanki gospodarza lub eliminacją potrzeby eksplantacji³⁴. Degradowalne hydrożele PEG są powszechnie syntetyzowane przez otwarcie hydrolitycznie degradowalnych grup d,l-laktydu, glikolidu lub ε-kaprolaktonu na grupy hydroksylowe w PEG przed metakrylacją³⁵. Te trzy grupy ulegają degradacji w wyniku hydrolizy funkcji estrów, przy czym największą podatność na degradację mają estry glikolidowe, a następnie laktyd i ester kaprolaktonu, ze względu na ich różną hydrofobowość. Po włączeniu grup hydrolitycznie degradowalnych, PEG może być dalej funkcjonalizowany przy użyciu procedury metakrylacji opisanej w tym artykule, umożliwiając tworzenie sieci hydrożelowych poprzez późniejszą polimeryzację łańcuchową inicjowaną przez rodniki^36,37. Szybkość degradacji sieci hydrożelowych można kontrolować poprzez zmianę tożsamości grupy hydrolitycznie degradowalnej (glikolid, laktyd itp.) oraz poprzez zmianę liczby powtórzeń ulegających degradacji zawartych w strukturze^35,38.

Teoretycznie zademonstrowane tutaj metody można by zastosować do akrylacji PEG i peptydów poprzez zastąpienie bezwodnika metakrylowego bezwodnikiem akrylowym odpowiednio w krokach 1.3 i 3.3. Jednak bezwodnik akrylowy jest ponad 20 razy droższy niż bezwodnik metakrylowy^39,40, co sprawia, że akrylacja wspomagana mikrofalami jest znacznie mniej atrakcyjna niż metakrylacja wspomagana mikrofalami.

Pokazaliśmy prostą, szybką metodę funkcjonalizacji PEG i peptydów, sposób oceny skuteczności tej procedury oraz udostępniliśmy zasoby do wykorzystania zsyntetyzowanych materiałów do tworzenia sieci hydrożelowych. Te syntetyczne narzędzia są bardzo wszechstronne w swoich zastosowaniach i powinny okazać się podstawą w dowolnej liczbie laboratoriów zajmujących się dostarczaniem leków i badaniami materiałowymi.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
3,6-dioksa-1,8-oktanedithiol	Tokyo Chemical Industry Co, LTD	D2649	CAS 14970-87-7
Acetonitryl	J.T. Baker	UN1648	CAS 75-05-8
Aminokwasy	AAPPTech	Glicyna: AFG101	CAS 29022-11-5
		Arginina: AFR105	CAS 154445-77-9
		Asparagina: AFD105	CAS 71989-14-5
		Seryna: AFS105	CAS 71989-33-8
Bezwodny eter dietylowy	Fisher Scientific	UN1155	CAS 60-29-7
Kwas cytrynowy	Sigma Aldrich	C1857	CAS 77-92-9
Deuterowany chloroform	Cambridge Isotope Laboratories Inc.	DLM-7-100	CAS 865-49-6
Dichlorometan	Fisher Scientific	UN1593	CAS 75-09-2
Diizopropyloetyloamina	Alfa Aesar	A1181	CAS 7087-68-5
Dimetyloformamid	Fisher Scientific	D119-4	CAS 68-12-2
Peptydy	z żywicy Fmoc-Gly-Wang	RGF-1301-PI	100-200 rozmiar oczek
Metakryl bezwodnik	Alfa Aesar	L14357	CAS 760-93-0
N-metylopirolidon	VWR	BDH1141-4LG	CAS 872-80-4
Peptydy żywiczne	Syntetyzowane we własnym zakresie		peptydy żywiczne można również kupić w Peptides International, GenScript, AAPPTec, etc.
O-benzotriazol-N,N,N',N',N'--tetrametylo-uronowo-heksafluorofosforan	AnaSpec Inc	510/791-9560	CAS 94790-37-1
Kalibracja peptydów Standardowa	pielęgnacja	206195
Piperazyna	Alfa Aesar	A15019	CAS 11-85-0
Poli(glikol etylenowy) 2 kDa	liniowy Alfa Aesar	B22181	CAS 25322-68-3
Poli(glikol etylenowy) 10 kDa liniowy	Alfa Aesar	B21955
Poli(glikol etylenowy) 20 kDa linear	Sigma Aldrich	81300	JenKem Technologies USA jest alternatywnym dostawcą liniowego i wieloramiennego PEG
Tioanizol	Alfa Aesar	L5464	CAS 100-68-5
Kwas trifluorooctowy	Alfa	Aesar A12198	CAS 76-05-1
Triizopropylosilan	Alfa Aesar	L09585	CAS 6485-79-6
&alfa;-cyjano-4-hydroksycynamonowy kwas	Tokio Przemysł chemiczny Co, LTD	C1768	CAS 28166-41-8