Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Projektowanie materiałów ze stopów białek jedwabiu i jedwabiu do zastosowań biomedycznych

17.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50891

⸱

13 sierpnia 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics and Astronomy, Rowan University, 2Department of Biomedical and Translational Sciences, Rowan University, 3Department of Biomedical Sciences, Cooper Medical School of Rowan University, 4Department of Chemistry and Biochemistry, Rowan University

W tym artykule

Podsumowanie

Mieszanie to efektywne podejście do generowania biomateriałów o szerokim zakresie właściwości i połączonych cechach. Przewidując interakcje molekularne między różnymi naturalnymi białkami jedwabiu, można zaprojektować nowe platformy ze stopów białek jedwabiu i jedwabiu o regulowanej odporności mechanicznej, reakcji elektrycznej, przezroczystości optycznej, przetwarzalności chemicznej, biodegradowalności lub stabilności termicznej.

Streszczenie

Białka włókniste mają różne sekwencje i struktury, które były wykorzystywane do różnych zastosowań w dziedzinach biomedycznych, takich jak biosensory, nanomedycyna, regeneracja tkanek i dostarczanie leków. Projektowanie materiałów w oparciu o interakcje między tymi białkami w skali molekularnej pomoże w stworzeniu nowych wielofunkcyjnych biomateriałów ze stopów białek o regulowanych właściwościach. Takie systemy materiałów stopowych zapewniają również zalety w porównaniu z tradycyjnymi polimerami syntetycznymi ze względu na biodegradowalność materiałów, biokompatybilność i trwałość w organizmie. W artykule wykorzystano mieszanki białkowe dzikiego jedwabiu tussah (Antheraea pernyi) i jedwabiu morwy domowej (Bombyx mori) jako przykład, aby dostarczyć użytecznych protokołów dotyczących tych tematów, w tym sposobu przewidywania interakcji białko-białko za pomocą metod obliczeniowych, jak wytwarzać roztwory stopów białkowych, jak weryfikować systemy stopowe za pomocą analizy termicznej oraz jak wytwarzać zmienne materiały stopowe, w tym materiały optyczne z siatkami dyfrakcyjnymi, materiały elektryczne z powłokami obwodów oraz materiały farmaceutyczne do uwalniania i dostarczania leków. Metody te mogą dostarczyć ważnych informacji do projektowania wielofunkcyjnych biomateriałów nowej generacji opartych na różnych stopach białek.

Wprowadzenie

Natura wypracowała strategie generowania regulowanych i wielofunkcyjnych macierzy biologicznych przy użyciu ograniczonej liczby białek strukturalnych. Na przykład elastyny i kolageny są zawsze stosowane razem in vivo, aby zapewnić regulowaną wytrzymałość i funkcje wymagane dla konkretnych tkanek1,2. Kluczem do tej strategii jest mieszanie (blending). Mieszanie polega na łączeniu białek w określonych proporcjach i jest podejściem technologicznym pozwalającym na tworzenie prostych systemów materiałowych o regulowanych i zróżnicowanych właściwościach3-5. W porównaniu ze strategiami inżynierii syntetycznej6,7, mieszanie może również poprawić jednorodność materiału oraz łatwość jego przetwarzania dzięki prostocie operacyjnej8-16. W związku z tym projektowanie wielofunkcyjnych, biokompatybilnych materiałów z „stopów białkowych” jest rozwijającą się dziedziną badań medycznych. Technologia ta dostarczy również systematycznej wiedzy na temat wpływu naturalnych macierzy białkowych na funkcje komórek i tkanek zarówno in vitro, jak i in vivo10,17. Poprzez optymalizację interfejsów molekularnych między różnymi białkami, materiały oparte na stopach białkowych mogą obejmować szereg funkcji fizycznych, takich jak stabilność termiczna w różnych temperaturach, elastyczność wspierająca różnorodne tkanki, czułość elektryczna w zmiennych organach oraz właściwości optyczne dla regeneracji tkanki rogówki3,18-27. Wyniki tych badań dostarczą nowej platformy materiałów białkowych w dziedzinie nauk biomedycznych, mającej bezpośrednie znaczenie dla regulowanych napraw tkanek i leczenia chorób, co w dalszej kolejności doprowadzi do stworzenia biodegradowalnych implantów o nowatorskich funkcjach terapeutycznych i diagnostycznych3.

Wiele naturalnych białek strukturalnych posiada krytyczne właściwości fizyczne i bioaktywne, które mogą być wykorzystane jako kandydaci na macierze biomateriałowe. Jedwabie z różnych gatunków jedwabników, keratyny z włosów i wełny, elastyny i kolageny z różnych tkanek oraz różnorodne białka roślinne należą do najczęściej stosowanych białek strukturalnych w projektowaniu zróżnicowanych materiałów na bazie białek (Rysunek 1)18-27. Ogólnie białka te mogą tworzyć różne drugorzędowe struktury molekularne (np. harmonijki beta w przypadku jedwabi lub sploty w przypadku keratyn) dzięki ich unikalnym, powtarzalnym pierwotnym sekwencjom aminokwasowym3,28-35. Cechy te sprzyjają tworzeniu samorzutnie organizowanych struktur makroskopowych o unikalnych funkcjach na granicach biologicznych, co czyni je cennym zasobem materiałów biopolimerowych. W niniejszej pracy zastosowano dwa rodzaje białek strukturalnych (jako przykład białko A z dzikiego jedwabiu tussah oraz białko B z udomowionego jedwabiu morwowego), aby zaprezentować ogólne protokoły wytwarzania różnych biomateriałów w formie stopów białkowych. Zaprezentowane protokoły obejmują część 1: przewidywania i symulacje oddziaływań białek, część 2: otrzymywanie roztworów stopów białkowych oraz część 3: wytwarzanie systemów stopów białkowych do zastosowań optycznych, elektrycznych i farmaceutycznych.

Przegląd włókien naturalnych: keratyna włosa, bambus, keratyna wełny, elastyna, jedwab morwowy, jedwab tusah.
Rycina 1. Surowce białek strukturalnych powszechnie stosowane w naszym laboratorium do projektowania materiałów opartych na białkach, w tym jedwabie od różnych gatunków jedwabników, keratyny z włosów i wełny, elastyny z różnych tkanek oraz różnorodne białka roślinne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przewidywanie interakcji białek

  1. Analiza bioinfomatyczna cząsteczek białek
    1. Odwiedź stronę internetową National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/) i wyszukaj nazwy białek, które zostaną użyte do badania stopu. Uwaga: W tym przykładzie użyto dwóch białek: białka A, które jest fibroiną jedwabiu z dzikiego tussah, oraz białka B, które jest fibroiną z jedwabiu morwy domowej. W przypadku białka A sekwencje aminokwasów można znaleźć w "fibroinie [Antheraea pernyi] GenBank: AAC32606.1" (Antheraea pernyi to chińska (dębowa) Tussah). W przypadku białka B sekwencje aminokwasów można znaleźć razem w "prekursorze łańcucha ciężkiego fibroiny [Bombyx mori] NCBI Reference Sequence: NP_001106733.1" i "prekursorze łańcucha lekkiego fibroiny [Bombyx mori] NCBI Reference Sequence: NP_001037488.1" (Bombyx mori to udomowiony jedwabnik z drzewa morwowego).
    2. Wybierz i zapisz sekwencje aminokwasowe białka A i białka B z bazy danych.
    3. Odwiedź stronę internetową ExPASy (SIB Bioinformatics Resource Portal) (www.expasy.org) lub użyj innego komercyjnego oprogramowania, aby obliczyć podstawowe dane bioinfomatyczne białek na podstawie ich sekwencji, w tym między innymi całkowitego ładunku na cząsteczkę, indeks hydrofobowości cząsteczki, krzywą miareczkowania cząsteczek przy różnych wartościach pH itp. Informacje te zostaną wykorzystane jako podstawowe elementy do obliczeniowej symulacji oddziaływań białek i pomogą zrozumieć, czy te dwa białka mają silne oddziaływania. [Uwaga: Ten krok nie służy do precyzyjnego przewidywania każdego szczegółu interakcji białkowej, jak te używane w małych peptydach lub nauce o białkach funkcjonalnych. Celem tej sekcji jest jedynie uniknięcie wytwarzania mieszaniny białek z oczywistymi separacjami makrofaz, której nie można nazwać materiałem "stopowym". W związku z tym oszacowanie może być przybliżone, ale system stopu białka można zweryfikować za pomocą metody eksperymentalnej opisanej w kroku 3.1 przy użyciu precyzyjnej analizy termicznej].
  2. Symulacja obliczeniowa systemu stopów białkowych
    Poniżej opisano procedurę symulacji układu stopu białek. Program symulacyjny jest napisany w języku programowania C, który może być używany w jedno- lub wieloprocesorowym systemie komputerowym. Do symulacji białek stopowych36-39 wykorzystano model sieci i masy sprężyny (LSM). Model LSM daje prosty opis siły wypadkowej działającej na masę po przymocowaniu do sprężyny i można rozwiązać równanie siły, aby zrozumieć ruch każdej masy. Prosty algorytm programu do modelowania tego systemu stopów białek przy użyciu modelu LSM jest podany w następujący sposób:
    1. Reprezentują pojedyncze białko jako gruboziarnistą cząstkę o masie m.
    2. Użyj sprężyny Hooke'a lub neo-Hooke'a, aby przedstawić wiązanie38,39. Łącząc skończoną liczbę cząstek ze sprężynami, można utworzyć domenę podstopu, która reprezentuje stabilny blok budulcowy białek stopowych. Aby przedstawić różne typy wiązań w łączniku wewnętrznym, należy użyć różnych stałych/sztywności sprężystości.
    3. Modeluj system stopów białkowych jako materiał składający się z tępo usieciowanych podstopów. Również w tym przypadku użyto różnych sztywności do przedstawienia różnych wiązań między wzajemnymi połączeniami podstopów.
    4. Modeluj proces zrywania i przekształcania wiązań za pomocą Modelu Bella40,41, dzięki któremu słabe wiązania mogą zostać zreformowane, ale silne więzi nie mogą się zreformować, gdy zostaną zerwane. Gdy system jest wystarczająco obciążony (zarówno na wiązaniach wewnątrzstopowych, jak i międzystopowych), wiązania mogą zostać zerwane i zreformowane.
    5. W celu zbadania wpływu odkształceń na białka stopowe pod wpływem naprężeń, należy przyłożyć do układu siły zewnętrzne. Rozłóż te siły równomiernie na każdą cząstkę podczas rozwiązywania równania siły (prawa Newtona).
    6. Aby modelować interakcje między roztworem (takim jak cząsteczki wody) a białkami, należy przyłożyć dodatkową siłę oporu lub siłę tarcia do każdej cząstki.
    7. Rozwiąż równanie siły dla każdej cząstki za pomocą działań każdej siły (siły sprężyny z wiązania, siły zewnętrznej i siły tarcia).
    8. Oblicz i wyodrębnij pozycje cząstek białka w funkcji czasu.
    9. Obliczyć wielkości fizyczne, które charakteryzują białka stopowe na podstawie położenia cząstek.
    10. Zmień sztywność wiązania w programie, aby zrozumieć interakcje między różnymi białkami. (Średnia sztywność wiązania jest obliczana na podstawie modułu Younga materiałów białkowych. Moduł Younga różnych włóknistych materiałów białkowych można uzyskać za pomocą uniwersalnej próby rozciągania18 lub bezpośrednio z wcześniejszej literatury2-4,18).

2. Produkcja roztworów stopów białkowych

Dziki jedwab tussah (białko A) i domowy jedwab morwowy (białko B) są tutaj wybrane jako przykład systemu stopów białkowych. W niniejszym protokole po raz pierwszy przedstawiono sposób uzyskania roztworu dzikiego jedwabiu tussah (białka A).

  1. Pokrój surowe kokony lub włókna z dzikiego jedwabiu tussah o masie 3 g.
  2. Odmierz 3 g dwuwęglanu sodu lub węglanu sodu (Uwaga: W przypadku użycia węglanu sodu masa cząsteczkowa łańcuchów białkowych zmniejszy się podczas procesu gotowania42).
  3. Napełnij szklaną zlewkę o pojemności 2 l wodą destylowaną (H2O). Następnie umieść szklaną zlewkę na gorącym ogniu, przykryj folią aluminiową i podgrzej do wrzenia.
  4. Zdejmij osłonę z folii aluminiowej i powoli dodaj odmierzony dwuwęglan sodu do wrzącej wody, pozwalając mu całkowicie się rozpuścić. (Uwaga: Rolą diwęglanu sodu jest "mydło" do usuwania rozpuszczalnych białek serycyny i innych zanieczyszczeń przyczepionych na powierzchni włókien dzikiego jedwabiu. W przypadku stosowania innych naturalnych włókien białkowych należy wybrać odpowiednie środki chemiczne zgodnie z literaturą).
  5. Dodaj surowe włókna białkowe (włókna dzikiego jedwabiu) do wrzącej wody i gotuj przez 2-3 godziny (Uwaga: czas gotowania ma krytyczny wpływ na masę cząsteczkową łańcuchów białkowych26,43. Należy dobrać odpowiedni czas zgodnie z literaturą lub wykonując doświadczenia kontrolne26,43. Temperaturę wrzenia można również dostosować tak, aby wpływała na masę cząsteczkową łańcuchów białkowych(26,43,44).
  6. Po ugotowaniu ostrożnie wyjmij włókna białkowe szpatułką z roztworu i ściśnij je, aby usunąć nadmiar wody. (UWAGA: Włókna są bardzo gorące!)
  7. Następnie zanurz włókna w 2-litrowej zlewce z zimną wodą destylowaną i umyj włókna dwukrotnie przez 30 minut, aby całkowicie usunąć zanieczyszczone pozostałości z powierzchni włókien. Suszyć włókna w dygestoriach przez co najmniej 12 godzin.
  8. Rozpuść 45,784 g azotanu wapnia (Ca(NO3)2) w szklanej zlewce, aby utworzyć ciecz w temperaturze 65 °C w celu rozpuszczenia włókien białkowych dzikiego jedwabiu. (Uwaga: Jeśli używasz innych naturalnych włókien białkowych, wybierz odpowiedni rozpuszczalnik do rozpuszczenia białek. Tutaj możesz również użyć 9,3 M roztworu LiSCN lub LiBr lub 85% roztworu fosforanowego do rozpuszczania różnych włókien jedwabiu.)
  9. Połączyć włókna i rozpuszczalnik w proporcji 1 g błonnika na 10 ml rozpuszczalnika. Pozostawić włókna do rozpuszczenia w temperaturze 95 °C przez 5 do 12 godzin. (Uwaga: czas rozpuszczania zależy od masy cząsteczkowej białek26,43-45)
  10. Za pomocą strzykawek wstrzyknąć roztwór dzikiego jedwabiu do kaset dializacyjnych o pojemności 12 ml (maksymalnie 1000 MW jako wielkość graniczna) lub szczelnie zamkniętych przewodów dializacyjnych (maksymalnie 1000 MW jako wielkość graniczna) i dializować w 2 litrach wody destylowanej. (Uwaga: Wstrzyknięcie jest bardziej efektywne, jeśli roztwór jest utrzymywany w temperaturze 35 °C, w przeciwnym razie lepkość roztworu białkowego dramatycznie wzrośnie w temperaturze pokojowej). Często zmieniaj wodę destylowaną, aby usunąć rozpuszczalniki Ca(NO3)2 z roztworu (po 30 minutach, 2 godzinach, 6 godzinach, a następnie co 12 godzin przez 3 dni. W sumie będzie około 8 podmian wody).
  11. Po 3 dniach zebrać roztwory białek z kaset dializacyjnych lub rurki do dializy i umieścić w probówkach o prędkości 13 000 obr./min.
  12. Odwirowywać roztwory przez 1 godzinę przy 3 500 obr./min w temperaturze 4 °C 3x w celu usunięcia osadów. Po każdym uruchomieniu wirówki szybko wciągnij supernatant do nowych probówek. Roztwory końcowe należy przechowywać w lodówce o temperaturze 4 °C.
  13. Wlać 5 ml roztworu białkowego na podłoże z polidimetylosiloksanu (PDMS) lub inne płaskie podłoże hydrofobowe i pozostawić do całkowitego wyschnięcia (zwykle trwa to dłużej niż 12 godzin). Zważyć pozostałą stałą warstwę białkową i obliczyć stężenie roztworu końcowego w procentach wagowych (w/v%) = zmierzona masa (w mg) ÷ 5 (w ml) ÷ 10.
  14. Zbierz kolejne wybrane naturalne włókno białkowe (w tym przypadku jako białko B użyto udomowionego jedwabiu morwowego) i powtórz powyższy proces z odpowiednim "mydłem" i rozpuszczalnikiem rozpuszczającym, aż do uzyskania końcowego roztworu białka wodnego o zmierzonym stężeniu. [Uwaga: Jeśli materiały białkowe są w postaci proszku, należy użyć odpowiednich porowatych rurek lub membran do przytrzymania próbek podczas procesu "mydlenia". Jeśli białko zostało już oczyszczone, przejdź bezpośrednio do kroku 2.8, aby rozpuścić proszek. Jeśli białko zostało już oczyszczone i jest rozpuszczalne w wodzie, najpierw przygotuj jego roztwór wodny o pożądanym stężeniu, a następnie przejdź do kroku 2.15 poniżej, aby przygotować mieszanki roztworów białkowych.]
  15. Powoli rozcieńczyć roztwór białka A (tutaj roztwór dzikiego jedwabiu) w wodzie destylowanej o temperaturze 4 °C, aby uzyskać 1,0% wag. Białko A roztwór wodny. Wykonaj ten sam proces dla białka B (tutaj udomowionego jedwabiu).
  16. Powoli wymieszać 1% wag. roztwór białka A z roztworem białka B w temperaturze 4 °C za pomocą pipety, aby uniknąć agregacji białek podczas mieszania. (Uwaga 1: Nie należy używać przyrządu wirowego do mieszania białek, ponieważ niektóre białka (np. jedwabie) tworzą hydrożele podczas wibracji46,47. Uwaga 2: Jeśli to możliwe, użyj dodatkowych urządzeń do kontrolowania szybkości mieszania i wielkości mieszania, upewniając się, że mieszasz je tak wolno, jak to możliwe, aby uniknąć agregacji. Nie należy szybko pipetować roztworu podczas mieszania).
  17. Końcowe roztwory do mieszania powinny mieć określony stosunek masowy lub stosunek molowy białka A:Białka B. Zazwyczaj miesza się je ze stosunkiem masowym 90:10, 75:25, 50:50, 25:75, 10:90, aby uzyskać szerokie spektrum roztworów stopowych. Stosować roztwory czystego białka A i białka B jako kontrole. Do roztworu do mieszania o stosunku molowym białka A:Białko B = R: (100-R). Obliczyć stosunek objętości mieszania (na podstawie tego samego roztworu o stężeniu 1 % wag.) według wzoru: Objętość A: Objętość B = R·(MW z A): (100-R)·(MW z B).
  18. Natychmiast odlej końcowe roztwory na podłoża PDMS, aby utworzyć folie lub inne zaprojektowane materiały. (Uwaga: Nie przechowuj roztworów stopów białek o wysokim stężeniu przez długi czas. Więcej agregatów może powstawać później ze względu na interakcje białko-białko w wodzie). W razie potrzeby rozcieńczyć roztwory mieszaniny bezjonową wodą destylowaną i przechowywać je w lodówce o temperaturze 4 °C, aby uniknąć dodatkowej agregacji białek w roztworach.

3. Wytwarzanie zmiennych materiałów ze stopów białkowych

  1. Potwierdź przewidywania dotyczące stopu za pomocą analizy termicznej3,9,31-35
    1. Przygotuj podłoża PDMS i oczyść je przez namoczenie w wodzie destylowanej.
    2. Odlewać roztwory mieszanek białkowych o różnych proporcjach mieszania na podłoża PDMS.
    3. Suszyć roztwory przez co najmniej 12 godzin w okapie chemicznym z przepływem powietrza, aż utworzą się filmy (Uwaga: Użyj tej samej objętości dla różnych roztworów, aby można było ustalić grubość folii).
    4. Usuń folie ze stopów białkowych z podłoży PDMS i umieść je na czystych naczyniach.
    5. Zważ wiele aluminiowych patelni i pokrywek kalorymetrii różnicowej ze skaningiem (DSC) do badania DSC. Dopasuj pary patelni i pokrywki tak, aby miały równą masę całkowitą (waga patelni plus waga pokrywki równa się stałej wadze). Na przykład tutaj użyto całkowitej masy pokrywki i patelni 22,50 mg i przygotowano osiem zestawów kombinacji pokrywki i patelni o tej całkowitej wadze.
    6. Kapsułkować 6 mg każdego rodzaju suszonego białka mieszanego w aluminiowych szalkach DSC i uszczelnić je dopasowanymi pokrywkami w procesie 3.1.5. Uszczelnić pustą parę szalek i pokrywek, które mają być używane z próbką jako odniesieniem, tak aby podczas analizy termicznej rejestrowana była tylko pojemność cieplna samych próbek (Uwaga: DSC porówna pojemność cieplną płytki referencyjnej + pokrywki z pojemnością cieplną próbki + szalki + pokrywki. Ze względu na równą wagę, pojemność cieplna tła z patelni i pokrywek zostanie uwzględniona przy pozostawieniu tylko pojemności cieplnej próbki w szalce).
    7. Umieścić szczelnie zamknięte roztwory referencyjne i szalki na próbki w urządzeniu DSC o przepływie suchego azotu wynoszącym 50 ml/min i wyposażonym w chłodzony układ chłodzenia. Przed pomiarami próbki przyrząd DSC należy najpierw skalibrować za pomocą szafiru i indu odpowiednio dla przepływu ciepła i temperatury.
    8. Uruchom DSC z szybkością ogrzewania 2 K/min do 150 °C, a następnie przytrzymaj w tej temperaturze przez 15 minut, aby usunąć wszelkie pozostałe cząsteczki wody z próbek (zwykle około 3-10% całkowitej masy). Szybko schłodzić (10 K/min) do 25 °C.
    9. Uruchom ponownie DSC z szybkością ogrzewania 2 K/min do 300 °C lub do momentu, gdy pojawi się szczyt degradacji mieszanek białkowych34. Zapisać pojemność cieplną próbki białka w różnych temperaturach podczas tego procesu. Schłodzić DSC i zmienić starą próbkę na nową próbkę o innym stosunku mieszania.
    10. Oblicz i wykreśl krzywe pojemności cieplnej w funkcji temperatury dla każdej próbki mieszanki białek za pomocą oprogramowania DSC31-35.
    11. Ocenić mieszalność mieszanek białkowych za pomocą następującej metody (patrz rysunek 4 termiczny i rysunek 5), a jeśli oba białka są w pełni mieszalne, można je nazwać "stopami białkowymi". W przeciwnym razie termin "kompozyt białkowy" byłby odpowiednią nazwą zgodnie z opisowymi teoriami polimerów48,49):
      1. Poszczególne białka A i B powinny mieć indywidualne temperatury zeszklenia pojedynczego, Tg (A) i Tg (B) (patrz krzywa zielona i niebieska na rysunku 5)3,48;
      2. Ta temperatura zeszklenia jest zwykle pośrednia między temperaturami dwóch poszczególnych składników białkowych, Tg (A) i Tg (B) (patrz rysunek 5)3,48;
      3. Mieszaniny do rozdzielania faz niemieszających się uzyskuje się, jeśli zarówno Tg(A), jak i Tg (B) pojawiły się w swoich pierwotnych pozycjach (ryc. 5), a przy każdej wysokości kroku Tg proporcjonalnej do składu, oba białka są całkowicie niemieszające się3,48.
      4. Częściowo mieszalna mieszanka kompozytowa będzie miała jedno bardzo szerokie zeszklenie lub może nadal mieć dwie przemiany szkliste, ale każda z nich zbliżyła się do siebie w stosunku do czystych składników białkowych, Tg (A) i Tg (B) (patrz rysunek 5). W takim przypadku między dwoma składnikami białka mogą powstać mikroheterogeniczne struktury fazowe, a skład może się różnić w zależności od lokalizacji.
    12. Jeśli (3.1.11.1) jest przypadkiem pokazanym w DSC i można potwierdzić, że białko A-B jest układem stopowym, przejdź do wytwarzania materiałów ze stopów białkowych.
  2. Wytwarzanie materiałów optycznych ze stopów białkowych
    1. Wyprodukuj (w laboratorium produkcyjnym) lub kup zaprojektowaną powierzchnię topograficzną do odlewania. W tym konkretnym przykładzie użyto szkła z czterema wzorami dyfrakcyjnymi (rysunek 4 Optyczny).
    2. Umieść szklankę z wzorami dyfrakcyjnymi w naczyniu i upewnij się, że wzorzysta powierzchnia jest skierowana do góry.
    3. Rozprowadzić roztwór PDMS równomiernie na powierzchni szkła i całkowicie pokryć wzory powierzchni (roztwór PDMS składa się z roztworu zalewowego i katalizatora w proporcji mieszania 9:1 zgodnie z instrukcją użytkownika23,44).
    4. Umieść naczynie odlewnicze w piekarniku o temperaturze 65 °C na co najmniej 2 godziny na płaskiej powierzchni. Podczas tego procesu roztwór PDMS powinien wyschnąć na stałym podłożu.
    5. Usuń podłoże PDMS ze szkła. Wzory dyfrakcyjne powinny być teraz przeniesione na powierzchnię PDMS.
    6. Wybij formy PDMS z wzorami dyfrakcyjnymi za pomocą odpowiedniego dziurkacza.
    7. Upuść roztwory stopów białkowych na powierzchnie PDMS z wzorami dyfrakcyjnymi i susz je przez co najmniej 12 godzin, aby uzyskać warstwy z wzorami dyfrakcyjnymi.
    8. Aby uzyskać nierozpuszczalne materiały stopowe białek, należy umieścić cały zestaw suchych folii, w tym formy PDMS, w piecu próżniowym o temperaturze 60 °C (25 kPa) z naczyniem na wodę na dnie komory. Wypompuj powietrze z pieca i pozwól parze wodnej wyżarzać próbki przez co najmniej 2 godziny. (Proces ten nazywa się wyżarzaniem pary wodnej w kontrolowanej temperaturze45. W porównaniu z powszechnie stosowaną metodą metanolową, może generować podobną zawartość arkusza beta w materiałach jedwabnych45). Zwolnij próżnię i oderwij nierozpuszczalną w wodzie folię z podłoża PDMS za pomocą kleszczy. W tym przykładzie stosuje się dzikie stopy jedwabiu udomowione
      9. przez jedwab.
    9. Zbadaj jakość wzorów dyfrakcyjnych na foliach, porównując je z oryginalnymi wzorami na szkle (np. zbierz obrazy SEM dla szczegółów w skali mikro; zbierz wzory dyfrakcji laserowej dla ogólnej jakości wzoru).
  3. Wytwarzanie obwodów elektrycznych na materiałach ze stopów białkowych
    1. Aby wytworzyć wzór obwodu elektrycznego na podłożu szklanym, najpierw wyczyść szkiełko za pomocą rozpuszczalnika odtłuszczającego, takiego jak Alconox w myjce ultradźwiękowej przez 5 minut, następnie 5 minut w acetonie, a następnie 5 minut w metanolu. Metanol jest używany jako ostatni, ponieważ paruje wolniej niż aceton, dzięki czemu można go zdmuchnąć z podłoża, zamiast suszyć i pozostawiać pozostałości.
    2. Przedmuchaj szkiełko do sucha za pomocą suchego azotu gazowego, który jest wytwarzany przez odparowanie ze 180 l ciekłego azotu dewara.
    3. Wprowadzić materiały podłoża do komory osadzania. (Niniejsze wytyczne dotyczą systemu rozpylania, ale można zastosować inne techniki osadzania). Jeśli komora jest zaprojektowana z blokadą obciążenia, podciśnienie w komorze osadzania nie jest znacząco zakłócone. Opróżnić blokadę ładunku do ciśnienia 30 mTorr.
    4. Otworzyć zasuwę między zamkiem a główną komorą osadzania i wprowadzić podłoże do komory.
    5. Włącz gaz Ar i regulator ciśnienia i kontroluj ciśnienie do żądanego ciśnienia osadzania. Wyższe ciśnienia dają atomy metalu o niższej energii i bardziej jednolite folie, podczas gdy niższe ciśnienia dają lepsze przyleganie szybciej osadzonych folii. Zakres ciśnień wynosi zwykle od 3 mTorr do 60 mTorr, przy czym dobrze działa 20 mTorr.
    6. Metale są następnie rzutowane na żaluzję, która chroni podłoże przed powłoką za pomocą mocy RF 100 W. Do skierowania mocy RF na metalowy cel wymagany jest obwód strojenia. Zasilanie prądem stałym może być używane zamiast RF dla metalowych celów. W celu usunięcia warstw tlenku i zanieczyszczeń z celu, należy wstępnie napylać przez kilka minut.
    7. Otwórz żaluzję i napyl metal na podłoże. Szybkość stapiania dla opisanej konfiguracji wynosi około 10 nm na minutę. Szybkość ta będzie zależeć od odległości roboczej, ciśnienia, siły magnesu w katodzie magnetronowej, grubości celu i rozpylanego metalu. Dostosuj czas osadzania, aby uzyskać żądaną grubość.
    8. Wyjmij szkiełko z powlekanego szkła z komory.
    9. Za pomocą wirówki obróć powłokę fotorezystową na powierzchnię folii. Można użyć wielu rezystorów. W tym przypadku zastosowano dodatni fotorezyst
      10. .
    10. Po odwirowaniu rezystu na folię, piecz na miękko w temperaturze 90 °C przez 5 minut, aby wysuszyć rezystor.
    11. Przyłóż maskę kontaktową z obrazem urządzenia mocno do rezystu. Do naświetlania fotorezystu wykorzystywane jest źródło światła UV. Czas naświetlania wynosi 10 sekund, ale różni się w zależności od siły źródła światła i zastosowanego rezystu.
    12. Umieść film w wywoływaczu fotorezystu, aż pojawi się wyświetlany obraz. Wywoływacz zmywa rezystancję, która została wystawiona na działanie światła UV, które powoduje zerwanie wiązań polimerowych. Natychmiast po pojawieniu się obrazu zanurz film w wodzie DI, aby uniemożliwić wywoływaczowi pracę nad nienaświetlonym fotorezystem.
    13. Przedmuchać folie do sucha suchym azotem gazowym.
    14. Umieść folie w piekarniku w temperaturze 120 °C na 15 minut, aby "upiec" fotorezystor na twardo.
    15. Po ostygnięciu folii umieść je w roztworze do wytrawiania, aż metal niechroniony przez fotorezyst oderwie się. Zanurz w wodzie, aby zatrzymać trawienie.
    16. Spłucz acetonem, aby usunąć stwardniały fotorezystor.
    17. Spłucz metanolem i wysusz suchym azotem.
    18. Gdy powlekane szkła są gotowe, upuść różne roztwory stopów białkowych na powierzchnie szkła i susz je przez co najmniej 12 godzin, aby uzyskać warstwy stopów białkowych na szkłach. (Sugeruje się, aby najpierw skoncentrować roztwory stopów do 5% wag., aby uzyskać grube warstwy stopów białkowych).
    19. Ze względu na oddziaływania hydrofobowo-hydrofilowe cienkie warstwy metalu zostaną przeniesione z powierzchni szklanych na dołączone powierzchnie folii ze stopu białka51. Oderwij folie ze stopu białka cienkimi metalowymi wzorami od szklanych podłoży za pomocą kleszczy.
    20. Aby uzyskać nierozpuszczalne materiały ze stopów białkowych, należy umieścić suche warstwy w piecu próżniowym o temperaturze 60 °C (25 kPa) z naczyniem wodnym na dnie komory. Wypompuj powietrze z pieca i pozwól parze wodnej wyżarzać próbki przez co najmniej 2 godziny. Zwolnij próżnię i oderwij nierozpuszczalną w wodzie folię od podłoża za pomocą kleszczy.
    21. Przetestuj właściwości elektryczne wzorów metalowych na foliach ze stopów białek, takie jak opór elektryczny, i porównaj je z oryginalnymi wzorami na szkle.
  4. Wytwarzanie materiałów farmaceutycznych za pomocą stopów białkowych
    1. Aby wytworzyć folie ze stopu białkowego ze związkami farmaceutycznymi, najpierw przygotuj podłoże PDMS zgodnie z opisem w kroku 3.2. Uformowane podłoże PDMS oczyścić wodą destylowaną.
    2. Rozpuścić lub zdyspergować związki farmaceutyczne w roztworze wodnym. Użyj ultradźwięków lub wiru, aby jednorodnie wymieszać związki farmaceutyczne z wodą. Jeśli związki nie są rozpuszczalne w wodzie, zdyspergować proszki o jednorodnym rozkładzie w bezjonowej wodzie destylowanej.
    3. Obliczyć pożądany stosunek masowy związków do stopów białkowych wzoro: objętość roztworu złożonego x procent wagowy roztworu złożonego : objętość roztworu stopu białkowego x procent wagowy roztworu złożonego (tutaj użyto 1 % wag. roztworu stopu). Wybierz proporcje, aby uzyskać film o pożądanej gęstości związku w folii ze stopu białka.
    4. Powoli wymieszać roztwór złożony z roztworem stopu białkowego, postępując zgodnie z tymi samymi instrukcjami w sekcji 2 procesu 2.16. (Uwaga: Aby uniknąć żelowania, nie należy stosować ultradźwięków ani wirować roztworu podczas mieszania).
    5. Wylać obliczoną objętość mieszaniny na podłoże PDMS i wysuszyć ją przez co najmniej 12 godzin w okapie chemicznym, aby uzyskać folię ze stopu białkowego zawierającą zaprojektowany stosunek związków farmaceutycznych.
    6. Fizycznie usieciować folię zgodnie z tą samą instrukcją w sekcji 3.2 procesu 3.2.8. Przykład folii stopowych z nierozpuszczalnymi lekami modelowymi o niskiej gęstości (LD) lub wysokiej (HD) można zobaczyć na rysunku 4 Chemikalia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Typowe oddziaływania białko-białko (np. między białkiem A a białkiem B) mogą obejmować oddziaływania elektrostatyczne (ładunek-ładunek), tworzenie wiązań wodorowych, oddziaływania hydrofobowe i hydrofilowe, a także efekty dipolowe, rozpuszczalnika, przeciwjonów oraz efekty entropowe pomiędzy specyficznymi domenami dwóch białek (Rysunek 2)3. W związku z tym, w zasadzie możemy przewidzieć efekty tych oddziaływań za pomocą symulacji komputerowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Jedną z najbardziej krytycznych procedur w produkcji systemu białek "stopowych" jest weryfikacja mieszalności mieszalnych białek. W przeciwnym razie jest to tylko niemieszająca się mieszanina białkowa lub złożony system białkowy bez stabilnych i przestrajalnych właściwości. W tym celu i potwierdzić właściwości ich stopów, można zastosować eksperymentalną metodę analizy termicznej. Interakcje białko-białko można rozpatrywać zgodnie z modelem kratowym Flory'ego-Hugginsa48 jako interakcje między "rozpuszczalnikie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują Rowan University za wsparcie tych badań. XH dziękuje również dr Davidowi L. Kaplanowi z Tufts University i NIH P41 Tissue Engineering Resource Center (TERC) za wcześniejsze szkolenia techniczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Różnicowe kalorymetry skaningowe Q100 (DSC)TA Instruments, New Castle, DE, USA
n/ADo obliczenia pojemności cieplnej można użyć dowolnego typu DSC z oprogramowaniem.
System napylania próżniowego SS30T T-M Vacuum Products, Inc., Cinnaminson, NJ, USAN/ADzięki niestandardowym częściom; do powlekania można użyć dowolnego rodzaju systemu napylania.
Piec próżniowy VWR 1415M VWRInternational, Bridgeport, NJ, USAN/ADo fizycznego sieciowania próbek można użyć dowolnego typu pieca próżniowego.

Bibliografia

  1. Rosenbloom, J., et al. Extracellular matrix 4: The elastic fiber. FASEB J. 7, 1208-1218 (1993).
  2. Traub, W., et al. On the molecular structure of collagen. Nature. 221, 914-917 (1969).
  3. Hu, X., et al. Protein-Based Composite Materials. Materials Today. 15, 208-215 (2012).
  4. Hardy, J. G., Scheibel, T. R. Composite materials based on silk proteins. Progress in Polymer Science. 35, 1093-1115 (2010).
  5. Kidoaki, S., et al. Mesoscopic spatial designs of nano- and microfiber meshes for tissue-engineering matrix and scaffold based on newly devised multilayering and mixing electrospinning techniques. Biomaterials. 26, 37-46 (2005).
  6. Teng, W. B., et al. Recombinant silk-elastin like protein polymer displays elasticity comparable to elastin. Biomacromolecules. 10, 3028-3036 (2009).
  7. Foo, C. W. P., Kaplan, D. L. Genetic engineering of fibrous proteins, spider dragline, silk and collagen. Adv Drug Delivery Rev. 54, 1131-1143 (2002).
  8. Hu, X., et al. Charge-Tunable Autoclaved Silk-Tropoelastin Protein Alloys That Control Neuron Cell Responses. Adv. Funct. Mater. 23, 3875-3884 (2013).
  9. Hu, X., et al. Biomaterials derived from silk-tropoelastin protein systems. Biomaterials. 31, 8121-8131 (2010).
  10. Hu, X., et al. The influence of elasticity and surface roughness on myogenic and osteogenic-differentiation of cells on silk-elastin biomaterials. Biomaterials. 32, 8979-8989 (2011).
  11. Hu, X., et al. Biomaterials from ultrasonication-induced silk fibroin-hyaluronic acid hydrogels. Biomacromolecules. 11, 3178-3188 (2010).
  12. Gil, E. S., et al. Swelling behavior and morphological evolution of mixed gelatin/silk fibroin hydrogels. Biomacromolecules. 6, 3079-3087 (2005).
  13. Lu, Q., et al. Green process to prepare silk fibroin/gelatin biomaterial scaffolds. Macromol. Biosci. 10, 289-298 (2010).
  14. Lu, S., et al. Insoluble and flexible silk films containing glycerol. Biomacromolecules. 11, 143-150 (2010).
  15. Mandal, B. B., et al. Silk fibroin/polyacrylamide semi-interpenetrating network hydrogels for controlled drug release. Biomaterials. 30, 2826-2836 (2009).
  16. Yeo, I. S., et al. Collagen-based biomimetic nanofibrous scaffolds, preparation and characterization of collagen/silk fibroin bicomponent nanofibrous structures. Biomacromolecules. 9, 1106-1116 (2008).
  17. Holst, J., et al. Substrate elasticity provides mechanical signals for the expansion of hemopoietic stem and progenitor cells. Nat. Biotechnol. 28, 1123-1128 (2010).
  18. Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. New Opportunities for an Ancient Material. Science. 329, 528-531 (2010).
  19. Qin, G., et al. Mechanism of resilin elasticity. Nature Communications. 3, 1003(2012).
  20. Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nat. Protocols. 6, 1612-1631 (2011).
  21. Wise, S. G., et al. Engineered tropoelastin and elastin-based biomaterials. Adv Protein Chem Struct Biol. 78, 1-24 (2009).
  22. Amsden, J. J., et al. Rapid nanoimprinting of silk fibroin films for biophotonic applications. Adv. Mater. 22, 1746-1749 (2010).
  23. Lawrence, B. D., et al. Silk film biomaterials for cornea tissue engineering. Biomaterials. 30, 1299-1308 (2009).
  24. Kim, D. H., et al. Dissolvable films of silk fibroin for ultrathin conformal bio-integrated electronics. Nat. Mater. 9, 511-517 (2010).
  25. Zhang, J., et al. Stabilization of vaccines and antibiotics in silk and eliminating the cold chain. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 11981-11986 (2012).
  26. Pritchard, E. M., et al. Effect of silk protein processing on drug delivery from silk films. Macromolecular Bioscience. 13, 311-320 (2013).
  27. Lammel, A. S., et al. Controlling silk fibroin particle features for drug delivery. Biomaterials. 31, 4583-4591 (2010).
  28. Urry, D. W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers. J Phys Chem B. 101, 11007-11028 (1997).
  29. Shao, Z., Vollrath, F. Materials: Surprising strength of silkworm silk. Nature. 418, 741-741 (2002).
  30. Jin, H. J., Kaplan, D. L. Mechanism of silk processing in insects and spiders. Nature. 424, 1057-1061 (2003).
  31. Hu, X., et al. Determining Beta-Sheet Crystallinity in Fibrous Proteins by Thermal Analysis and Infrared Spectroscopy. Macromolecules. 39, 6161-6170 (2006).
  32. Hu, X., et al. Dynamic Protein-Water Relationships during β-Sheet Formation. Macromolecules. 41, 3939-3948 (2008).
  33. Hu, X., et al. Microphase separation controlled beta-sheet crystallization kinetics in fibrous proteins. Macromolecules. 42, 2079-2087 (2009).
  34. Cebe, P., et al. Beating the Heat - Fast Scanning Melts Beta Sheet Crystals. Scientific Reports. 3, 1130(2013).
  35. Pyda, M., et al. Heat Capacity of Silk Fibroin Based on the Vibrational Motion of Poly(amino acid)s in the Presence and Absence of Water. Macromolecules. 41, 4786-4793 (2008).
  36. Buxton, G. A., et al. A lattice spring model of heterogeneous materials with plasticity. Model. Simul. Mater. Sci. Eng. 9, 485-497 (2001).
  37. Buxton, G. A., Balazs, A. C. Modeling the dynamic fracture of polymer blends processed under shear. Phys. Rev. B. 69, 054101(2004).
  38. Kolmakov, G. V., et al. Harnessing labile bonds between nanogel particles to create self-healing materials. ACS Nano. 3, 885-892 (2009).
  39. Duki, S. F., et al. Modeling the nanoscratching of self-healing materials. J. Chem. Phys. 134, 084901(2011).
  40. Bell, G. I. Models for the specific adhesion of cells to cells. Science. 200, 618-627 (1978).
  41. Bell, G. I., et al. Cell adhesion. Competition between nonspecific repulsion and specific bonding. Biophys. J. 45, 1051-1064 (1984).
  42. Wang, Q., et al. Effect of various dissolution systems on the molecular weight of regenerated silk fibroin. Biomacromolecules. 14, 285-289 (2013).
  43. Wray, L. S., et al. Effect of processing on silk-based biomaterials: reproducibility and biocompatibility. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 99, 89-101 (2011).
  44. Lawrence, B. D., et al. Silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design. J. Vis. Exp. (62), e3646(2012).
  45. Hu, X., et al. Regulation of Silk Material Structure by Temperature-Controlled Water Vapor Annealing. Biomacromolecules. 12, 1686-1696 (2011).
  46. Yucel, T., et al. Vortex-induced injectable silk fibroin hydrogels. Biophys J. 97, 2044-2050 (2009).
  47. Yucel, T., et al. Non-equilibrium silk fibroin adhesives. J Struct Biol. 170, 406-412 (2010).
  48. Flory, P. J. Principles of polymer chemistry. , Cornell University Press. Ithaca, N.Y.. (1953).
  49. Chen, H., et al. Thermal properties and phase transitions in blends of Nylon-6 with silk fibroin. J Therm Anal Calorim. 93, 201-206 (2008).
  50. Scabarozi, T. H., et al. Epitaxial growth and electrical-transport properties of Ti7Si2C5 thin films synthesized by reactive sputter deposition. Scripta Materialia. 65, 811-814 (2011).
  51. Tao, H., et al. Silk materials-a road to sustainable high technology. Adv Mater. 24, 2824-2837 (2012).
  52. Annabi, N., et al. Cross-linked open-pore elastic hydrogels based on tropoelastin, elastin and high pressure CO2. Biomaterials. 31, 1655-1665 (2010).
  53. Moll, R., et al. The human keratins: biology and pathology. Histochem Cell Biol. 129, 705-733 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mieszaniny białek jedwabiupowłoki obwodów elektronicznychregeneracja roztworu białkowegowytwarzanie cienkich warstwanaliza termicznamateriały optycznemateriały elektrycznemateriały farmaceutyczneoddziaływania białko-białko
Projektowanie materiałów ze stopów białek jedwabiu i jedwabiu do zastosowań biomedycznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.