Artykuł metodologiczny

Odtwarzalna paraplegia przez niedrożność aorty piersiowej w mysim modelu niedokrwienia rdzenia kręgowego

11.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50910

⸱

3 marca 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Division of Cardiothoracic Surgery, University of Colorado, 2Department of Anesthesiology, University of Colorado

W tym artykule

Podsumowanie

Brak mechanistycznego zrozumienia uszkodzenia niedokrwienia rdzenia kręgowego i reperfuzji utrudnił dalsze działania wspomagające zapobieganie paraplegii po operacjach aorty wysokiego ryzyka. W związku z tym konieczny jest rozwój modeli zwierzęcych. Manuskrypt ten przedstawia powtarzalne porażenie kończyn dolnych po niedrożności aorty piersiowej w modelu mysim.

Streszczenie

Tło
Paraliż kończyn dolnych nadal komplikuje interwencje aorty. Brak zrozumienia podstawowej patologii utrudnił postępy w celu zmniejszenia występowania tego urazu. Obecny model pokazuje powtarzalne porażenie kończyn dolnych po niedrożności aorty piersiowej.

Metody
Dorosłe samce myszy C57BL6 znieczulono izofluranem. Przez nacięcie szyjno-mostkowe aorta została odsłonięta. Zstępująca aorta piersiowa i lewe tętnice podobojczykowe zostały zidentyfikowane bez wejścia do przestrzeni opłucnej. Po szkieletacji tych tętnic następowało natychmiastowe zamknięcie (Sham) lub zamknięcie na 4 minuty (umiarkowane niedokrwienie) lub 8 minut (przedłużone niedokrwienie). Sternotomię i skórę zamknięto, a mysz przeniesiono do łóżka rozgrzewającego w celu rekonwalescencji. Po wyzdrowieniu analizę funkcjonalną przeprowadzano w odstępach 12-godzinnych do 48.

Wyniki
Myszy, które przeszły pozorowaną operację, nie wykazywały zauważalnego deficytu kończyn tylnych. Myszy poddane umiarkowanemu niedokrwieniu przez 4 minuty miały minimalny deficyt funkcjonalny po 12 godzinach, a następnie progresję do całkowitego paraliżu po 48 godzinach. Myszy poddane długotrwałemu niedokrwieniu miały natychmiastowy paraliż bez zauważalnych ruchów kończyn tylnych w żadnym momencie okresu pooperacyjnego. Nie zaobserwowano śmiertelności śródoperacyjnej ani pooperacyjnej.

Wniosek
Powtarzalny paraliż kończyn dolnych, natychmiastowy lub opóźniony, można osiągnąć w modelu mysim. Dodatkowo, stosując sternotomię pośrodkową i staranną sekcję, można osiągnąć wysokie wskaźniki przeżycia i odtwarzalność.

Wprowadzenie

Paraliż kończyn dolnych nadal komplikuje interwencje w obrębie klatki piersiowej i brzucha. Uraz, znany jako uraz niedokrwienno-reperfuzyjny rdzenia kręgowego (SCIR), powoduje paraliż nawet u 20% pacjentów wysokiego ryzyka1. Zabiegi chirurgiczne, takie jak pomostowanie lewego serca, drenaż płynu lędźwiowego odcinka szyjno-rdzeniowego, hipotermiczne zatrzymanie krążenia i reimplantacja tętnicy międzyżebrowej, zmniejszyły częstość występowania tego powikłania2; Jednak nadal zbyt wielu pacjentów jest dotkniętych chorobą.

Klinicznie, niedokrwienie rdzenia kręgowego i uszkodzenie reperfuzyjne jest postrzegane jako natychmiastowy lub opóźniony paraliż po interwencji3. Jednak nasze zrozumienie tego uszkodzenia zostało stłumione przez brak szczegółów mechanistycznych. W rezultacie, dostępnych jest niewiele opcji, aby złagodzić uraz po jego wystąpieniu.

Pozyskaliśmy więc mały zwierz, mysi model niedokrwienia rdzenia kręgowego i uszkodzenia reperfuzyjnego, aby lepiej scharakteryzować jego patogenezę. Większość dotychczasowych badań używała większych modeli zwierzęcych do scharakteryzowania tego urazu, a mianowicie modeli szczura4, królika5 i świni6. Są one jednak ograniczone przez ich koszt, złożoność, zmienną odtwarzalność, I, co najważniejsze, brak dostępnych technik manipulacji genetycznych. Najbardziej wiarygodny z opublikowanych modeli zwierzęcych dotyczy krzyżowego zaciskania aorty brzusznej przez podnerkę u królików. Jednak ludzkie neurony rdzenia kręgowego przedniego najczęściej czerpią zaopatrzenie naczyniowe z bardziej proksymalnych gałęzi7. Zmienna anatomia naczyniowa rdzenia kręgowego w tych modelach utrudnia przeniesienie ich wyników do użytku klinicznego.

Ten manuskrypt przedstawia model natychmiastowej lub opóźnionej paraplegii po okluzji aorty piersiowej, który jest klinicznie istotny i łatwy do zastosowania. Odsłonięcie łuku aorty za pomocą mini sternotomii jest mniej inwazyjne i może wywołać wysoce powtarzalne wyniki przy minimalnej zachorowalności i śmiertelności. Chociaż model ten nie jest pozbawiony wyzwań i niuansów technicznych, można je przezwyciężyć dzięki starannemu rozwarstwieniu i obchodzeniu się z tkankami, aby uzyskać model paraliżu kończyn tylnych, który można łatwo wdrożyć.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie przedoperacyjne i znieczulenie

  1. Pamiętaj, aby przestrzegać sterylnej techniki przez cały czas trwania zabiegu. Rozłóż wszystkie instrumenty.
  2. Przed indukcją znieczulenia włączyć łóżko do regulacji temperatury, aby mogło się ogrzać do odpowiedniej temperatury (36.5 °C). Włącz laserowy monitor perfuzji dopplerowskiej, aby mógł się uruchomić podczas indukcji.
  3. Umieść mysz w komorze indukcyjnej.
    1. Uważnie monitoruj częstość oddechów myszy podczas indukcji.
    2. Gdy tylko częstość oddechów wizualnie zwolni, wyjmij mysz z komory indukcyjnej.
    3. Wykonaj uszczypnięcie palca u nogi, aby ocenić adekwatność środka znieczulającego.
  4. Gdy mysz jest odpowiednio znieczulona, ułóż ją w pozycji leżącej.
  5. Włóż twarz do stożka nosowego i przymocuj wszystkie kończyny do stołu grzewczego.
    1. Zwróć szczególną uwagę, aby upewnić się, że kończyny są zabezpieczone w pozycji anatomicznej, bez odchyleń w jedną stronę. Jeśli mysz jest nieprawidłowo ustawiona, trudno jest uniknąć przecięcia tętnicy piersiowej wewnętrznej podczas sternotomii.
  6. Za pomocą maszynki do strzyżenia lub dostępnego w handlu kremu do depilacji usuń włosy z linii środkowej klatki piersiowej i lewej powierzchni brzusznej kończyny dolnej.
    1. Jeśli używasz kremu do depilacji, unikaj pozostawiania kremu na miejscu na dłużej niż 30 sekund, ponieważ może dojść do oparzeń alkalicznych.
  7. Miareczkować stężenie lotnego parownika środka znieczulającego, aby utrzymać odpowiednie znieczulenie.
    1. Oczekiwane frakcje waporyzatora wynoszą od 1 do 5% przy użyciu izofluranu o wysokim przepływie O2 .
    2. Stężenie lotnego parownika środka znieczulającego powinno być miareczkowane w celu utrzymania znieczulenia podczas stymulacji chirurgicznej przy jednoczesnym utrzymaniu spontanicznych oddechów.

2. Laserowe umiejscowienie dopplera sondą doodbytniczą

  1. Włóż nasmarowaną sondę doodbytniczą do odbytnicy myszy. Przymocuj do łóżka operacyjnego.
  2. Dostosuj łóżko grzewcze do docelowej temperatury w odbycie 36.5 °C.
  3. Wykonaj małe nacięcie nad tętnicą udową myszy i wypreparuj skórę z tkanki podskórnej.
  4. Włóż laserową sondę dopplerowską do tętnicy udowej.
  5. Dostosuj pozycje sondy, aż monitor perfuzji zarejestruje więcej niż 800 jednostek perfuzji.
    1. Mocno zamocowana sonda na miejscu. Niewłaściwie zabezpieczone sondy mogą mieć fałszywie niskie pomiary perfuzji.

3. Rozwarstwienie łuku aorty/tętnicy podobojczykowej

  1. Wykonaj 2 cm nacięcie skóry powyżej wcięcia mostka i delikatnie odetnij skórę od tkanki podskórnej.
  2. Wypreparuj gruczoł podżuchwowy wolny.
    1. Jeśli wystąpi krwawienie, można delikatnie uciskać bawełnianym wacikiem.
    2. Podziel gruczoł podżuchwowy przez linię środkową w płaszczyźnie beznaczyniowej.
  3. Delikatnie unieś mostek za pomocą kleszczy i za pomocą nożyczek wykonaj 1 cm sternotomię w linii środkowej mostka. Każde odchylenie od linii środkowej może spowodować krwotok z tętnicy sutkowej wewnętrznej, który będzie trudny do opanowania.
  4. Umieść 5-0 szwów retrakcyjnych z każdej strony na krawędzi mostka i wsuń mostek bocznie, mocując szwy do łóżka operacyjnego. Unikaj umieszczania szwów retrakcyjnych zbyt bokiem, aby zapobiec odmie opłucnowej.
  5. Za pomocą mięśni pasków bez preparacji wzdłuż tchawicy. Mięsień lewego paska można podzielić nożyczkami, aby poprawić ekspozycję.
  6. Wypreparuj grasicę z otaczającej tkanki. Kontynuuj rozwarstwienie, aż zostaną uwidocznione wielkie naczynia. Zachowaj szczególną ostrożność, aby zapobiec przedostaniu się do jamy opłucnej.
  7. Umieść zaciski naczyniowe na łuku aorty i lewej tętnicy podobojczykowej.
  8. Sprawdź, czy przepływ dystalny został odpowiednio zakłócony. Będzie to postrzegane jako zmniejszenie liczby jednostek perfuzji o >90%.
    1. Kontynuuj okluzję przez 4-8 minut.
  9. Usuń zacisk naczyniowy i sprawdź hemostazę przed zamknięciem klatki piersiowej.

4. Zamknięcie sternotomii i skóry

  1. Usuń szew retrakcyjny po lewej stronie myszy.
  2. Zamknij sternotomię prawym szwem retrakcyjnym.
    1. Pojedynczy szew mostkowy (przy użyciu wcześniej założonego ściegu retrakcyjnego) jest wystarczający do zamknięcia mostka. Założenie kolejnego szwu jest zbędne i zwiększa ryzyko wystąpienia odmy opłucnowej i krwotoku.
  3. Zamknij skórę ściegiem 5-0.

5. Rekonwalescencja i ocena pooperacyjna

  1. Przenieś mysz do klatki odzyskiwania. Klatkę należy umieścić na poduszce grzewczej, aby podnieść temperaturę otoczenia komory odzysku i zmniejszyć straty ciepła do otoczenia.
  2. Uważnie monitoruj mysz pod kątem objawów niewydolności oddechowej lub napadów padaczkowych. Podawaj środek przeciwbólowy zgodnie z wytycznymi instytucji. Myszy należy natychmiast poddać eutanazji, jeśli zaobserwuje się drgawki lub niewydolność oddechową.
    1. Eutanazja w komorze CO2 jest naszą preferowaną metodą. Zwichnięcie szyjki macicy jest inną opcją, jeśli CO2 nie jest dostępne.
    2. Całkowitego wyzdrowienia można spodziewać się w ciągu 1-2 godzin, w zależności od długości zastosowanego lotnego środka znieczulającego i stężenia.
  3. Przywróć mysz do normalnej klatki. Umieść jedzenie i wodę na podłodze klatki.
  4. Oceń stan neurologiczny w odstępach 12-godzinnych za pomocą skali Basso Mouse Scale for Locomotion8.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Myszom przeprowadzono operację pozorowaną (n=3) lub zamknięcie aorty na okres od 4 min (n=3) do 8 min (n=3). Po operacji stan myszy oceniano w skali Basso Mouse Score (Rysunek 1). U myszy, którym wykonano operację pozorowaną, nie zaobserwowano żadnych deficytów funkcjonalnych w żadnym punkcie po operacji. Myszy poddane umiarkowanemu niedokrwieniu (4 min) wykazywały niemal prawidłową funkcję kończyn tylnych po 12 h, z postępującym pogorszeniem funkcji aż do całkowitego paraliżu w 48 h. Myszy w grupie z pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Paraplegia wtórna do reperfuzji niedokrwiennej rdzenia kręgowego jest wynikiem kompleksu słabo poznanych patologii9. Chociaż jest to najczęściej obserwowane po operacji aorty piersiowo-brzusznej, wiele innych urazów, takich jak rozwarstwienie aorty, uraz, zjawiska zatorowe, zapalenie naczyń i niedociśnienie ogólnoustrojowe10 może prowadzić do paraplegii. Aby uzyskać dalsze zrozumienie tego urazu i określić przyszłe cele w celu wyeliminowania tego urazu, modele zwierzęce stały się koniecznością.

...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Fundacji Chirurgii Klatki Piersiowej na rzecz Badań i Edukacji za wsparcie finansowe tego projektu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
VMS Aparat anestezjologicznyMDS Matrx
IsofluraneVet One13985-528-602,0% przez stożek nosowy 
Komora indukcyjnaVet Equip941444
Łóżko grzewczeVestavia Scientific
Lazer Doppler MonitorMoor InstrumentsVMS-LDF1
5-0 Szew, poliesterSurgidacVD-551Stożkowe igły
Mikroklipsy do mikropreparacjiInstrumenty do badań biomedycznych14-1030, 14-1060
Chirurgiczne InstrumentyDrobne narzędziaKleszcze, uchwyt na igłę
chirurgiczne

Bibliografia

  1. Conrad, M. F., Ye, J. Y., Chung, T. K., Davison, J. K., Cambria, R. P. Spinal cord complications after thoracic aortic surgery: long-term survival and functional status varies with deficit severity. J. Vasc. Surg. 48, 47-53 (2008).
  2. Okita, Y. Fighting spinal cord complication during surgery for thoracoabdominal aortic disease. Gen. Thorac. Cardiovasc. Surg. 59, 79-90 (2011).
  3. Wong, D. R., et al. Delayed spinal cord deficits after thoracoabdominal aortic aneurysm repair. Ann. Thorac. Surg. 83, 1345-1355 (2007).
  4. Taira, Y., Marsala, M. Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat. Stroke. 27, 1850-1858 (1996).
  5. Naslund, T. C., Hollier, L. H., Money, S. R., Facundus, E. C., Skenderis, B. S. Protecting the ischemic spinal cord during aortic clamping. The influence of anesthetics and hypothermia. Ann. Surg. , 409-515 (1992).
  6. Qayumi, A. K., Janusz, M. T., Lyster, D. M., Gillespie, K. D. Animal model for investigation of spinal cord injury caused by aortic cross-clamping. J. Invest. Surg. 10, 47-52 (1997).
  7. Lang-Lazdunski, L., Matsushita, K., Hirt, L., Waeber, C., Vonsattel, J. P., Moskowitz, M. A., Dietrich, W. D. Spinal Cord Ischemia: Development of a model in the mouse. Stroke. 31, 208-213 (2000).
  8. Basso, D. M., Fisher, L. C., Anderson, A. J., Jakeman, L. B., McTigue, D. M., Popovich, P. G. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J. Neurotrauma. 23, 635-659 (2006).
  9. Kwon, B. K., Tetzlaff, W., Grauer, J. N., Beiner, J., Vaccaro, A. R. Pathophysiology and pharmacologic treatment of acute spinal cord injury. Spine. J. 4, 451-464 (2004).
  10. Cheshire, W. P., Santos, C. C., Massey, E. W., Howard, J. F. Spinal cord infarction: etiology and outcome. Neurology. 47, 321-330 (1996).
  11. Kakinohana, M., et al. Delayed paraplegia after spinal cord ischemic injury requires caspase-3 activation in mice. Stroke. 42 (8), 2302-2307 (2011).
  12. Wang, Z., Yang, W., Britz, G. W., Lombard, F. W., Warner, D. S., Sheng, H. Development of a simplified spinal cord ischemia model in mice. J. Neurosci. Methods. 189, 246-251 (2010).
  13. model of ischemic spinal cord injury with delayed paralysis caused by aortic cross-clamping. Anesthesiology. 113, 880-891 (2010).
  14. Kang, J., et al. The effects of systemic hypothermia on a murine model of thoracic aortic ischemia reperfusion. J. Vasc. Surg. 52, 435-443 (2010).
  15. Li, J., Benashski, S., McCullough, L. D. Post-stroke hypothermia provides neuroprotection through inhibition of AMP-activated protein kinase. J. Neurotrauma. 28 (7), 1281-1288 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model paraplegiisonda laserowego Doppleramedianowa sternotomiaskala Baso dla myszypora enie ko czyn tylnychzak adanie klamry naczyniowej

Powiązane artykuły