Artykuł metodologiczny

Pikoiniekcja kropli mikroprzepływowych bez elektrod metalowych

10.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50913

⸱

18 kwietnia 2014

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, Unversity of California, San Francisco

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowaliśmy technikę pikoiniekcji kropli mikroprzepływowych, która nie wymaga metalowych elektrod. W związku z tym urządzenia wykorzystujące naszą technikę są prostsze w produkcji i obsłudze.

Streszczenie

Istniejące metody wstrzykiwania odczynników pikometrycznych do kropli mikroprzepływowych wymagają metalowych elektrod zintegrowanych z chipem mikroprzepływowym. Integracja tych elektrod dodaje uciążliwe i podatne na błędy etapy procesu produkcji urządzenia. Opracowaliśmy technikę, która eliminuje potrzebę stosowania metalowych elektrod podczas pikoiniekcji. Zamiast tego wykorzystuje sam płyn iniekcyjny jako elektrodę, ponieważ większość odczynników biologicznych zawiera rozpuszczone elektrolity i przewodzi prąd. Eliminując elektrody, skracamy czas i złożoność produkcji urządzeń oraz zwiększamy ich wytrzymałość. Ponadto, przy naszym podejściu, objętość wtrysku zależy od napięcia przyłożonego do roztworu pikoiniekcyjnego; Dzięki temu możemy szybko dostosować wstrzykiwaną głośność poprzez modulację przyłożonego napięcia. Wykazujemy, że nasza technika jest kompatybilna z odczynnikami zawierającymi popularne związki biologiczne, w tym, enzymy i kwasy nukleinowe.

Wprowadzenie

W mikrofluidyce opartej na kropelkach, kropelki wodne w skali mikronowej są używane jako "probówki" do reakcji biologicznych. Zaletą przeprowadzania reakcji w maleńkich kropelkach jest to, że każda kropla zużywa tylko kilka pl odczynnika, a dzięki mikrofluidyce krople mogą być formowane i przetwarzane z szybkością kiloherców1. W połączeniu właściwości te pozwalają na przeprowadzenie milionów reakcji z pojedynczymi komórkami, cząsteczkami kwasu nukleinowego lub związkami w ciągu minuty z μl całkowitego materiału.

Aby używać kropli do takich zastosowań, potrzebne są techniki dodawania kontrolowanych ilości odczynników do kropli; takie operacje są analogiczne do pipetowania do probówek. Jedną z metod osiągnięcia tego celu jest elektrokoalescencja, w której kropla odczynnika łączy się z kroplą docelową poprzez zastosowanie pola elektrycznego. Pole elektryczne zaburza ułożenie cząsteczek środków powierzchniowo czynnych na granicy faz kropli, wywołując niestabilność cienkiej warstwy i wywołując koalescencję w emulsjach, które poza tym są stabilne2. Elektrycznie indukowane łączenie jest również wykorzystywane w konstrukcji pikowtryskiwacza, urządzenia, które wstrzykuje odczynniki do kropli, gdy przepływają one przez kanał3 pod ciśnieniem. Aby zastosować pole elektryczne, urządzenia pikowtryskowe wykorzystują elektrody metalowe, ale integracja elektrod metalowych z chipami mikroprzepływowymi jest często złożonym i podatnym na błędy procesem, ponieważ druty lutownicze w cieczy są łatwo naruszane przez pęcherzyki powietrza lub kurz i inne zanieczyszczenia w kanale, a także pęknięcia spowodowane naprężeniami lub zginaniem podczas konfiguracji urządzenia.

Tutaj prezentujemy metodę wykonywania picoiniekcji bez użycia metalowych elektrod, dzięki czemu produkcja jest prostsza i bardziej solidna. Aby wywołać picoiniekcję, zamiast tego używamy samego płynu iniekcyjnego jako elektrody, ponieważ większość odczynników biologicznych zawiera rozpuszczone elektrolity i przewodzi prąd. Dodajemy również "fosę Faradaya", aby chronić wrażliwe obszary urządzenia i działać jako uniwersalne podłoże (ilustracja 1). Fosa elektrycznie izoluje kropelki przed miejscem iniekcji pikoinicji, zapewniając uziemienie, zapobiegając niezamierzonemu łączeniu się kropel. Dodatkową zaletą naszej techniki jest to, że objętość wstrzykiwana do kropli zależy od wielkości przyłożonego napięcia, co pozwala na jego regulację poprzez dostrojenie zastosowanego sygnału.

Produkujemy nasze urządzenia z poli(dimetylosiloksanu) (PDMS) przy użyciu miękkich technik fotolitograficznych4,5. Nasze podejście jest kompatybilne z urządzeniami wykonanymi z innych materiałów, takich jak żywice, tworzywa sztuczne i żywice epoksydowe. Kanały mają wysokość i szerokość 30 μm, które są optymalne do pracy z kroplami o średnicy 50 μm (65 pl). Odczynniki wprowadzamy za pomocą rurki polietylenowej (średnica wewnętrzna/zewnętrzna 0,3/1,09 mm) wprowadzane do portów utworzonych podczas produkcji urządzenia za pomocą stempli biopsyjnych 0,50 mm, podobnie jak w metodach opisanych wcześniej5. Dokładny skład płynu iniekcyjnego zależy od konkretnego zastosowania. Płyn musi zawierać tylko rozpuszczone elektrolity w stężeniach wystarczająco wysokich, aby zapewnić wystarczającą przewodność, aby sygnał elektryczny mógł zostać przesłany do pikowtryskiwacza. W testach laboratoryjnych stwierdziliśmy, że stężenia jonów większe niż 10 mM powinnywystarczyć 6, chociaż ta wartość i przewodność płynu zależą od konkretnych wymiarów urządzenia i wielkości przyłożonego napięcia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Projektowanie wymiarów i topologii urządzeń w oparciu o potrzeby eksperymentalne za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD)

Uwaga: Wybierz średnice kanałów emulsji mniejsze niż średnice sferycznych kropel. Zmusza to kropelki do uzyskania cylindrycznego lub "kiełbasianego" kształtu i pozwala na bardziej efektywną pikoiniekcję. Na nasze potrzeby zaprojektowaliśmy kanały 30 x 30 μm dla kropel o średnicy 50 μm.

  1. Modelowe miejsce (miejsca) iniekcji pikoiniekcyjnej na wzór opisanych przez Abate i wsp. 3 z wyjątkiem tego, że kanały dla elektrod metalowych są usuwane, ponieważ są one niepotrzebne.
  2. Dodaj kanały, które będą służyć jako fosa Faradaya (rysunek 1), które biegną między miejscem (miejscami) pikoiniekcji a emulsją przed nim, tak aby osłaniały kropelki przed polem elektrycznym.
    Uwaga: Zapobiega to niezamierzonemu scalaniu.

2. Wytwarzanie urządzeń przy użyciu miękkich technik fotolitograficznych

  1. Wygeneruj przezroczystą maskę fotolitograficzną na podstawie pliku CAD, korzystając z istniejących usług komercyjnych.
  2. Za pomocą fotomaski utwardź fotorezystor na płytkach krzemowych, aby uzyskać mistrza urządzenia, jak opisano wcześniej4.
  3. Mieszaninę PDMS z utwardzaczem (w proporcji 11:1) zalać wzorcem urządzenia znajdującym się w 5 cm polistyrenowej szalce Petriego.
  4. Umieść urządzenie wzorcowe z PDMS w eksykatorze próżniowym na około 15 minut, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.
  5. Utwardź urządzenie PDMS, umieszczając je w piekarniku o temperaturze 95 °C na 1 godzinę. Alternatywnie, PDMS utwardza się w temperaturze pokojowej po 24 godzinach.
  6. Usuń urządzenie, przecinając obwód ostrzem chirurgicznym i ostrożnie odrywając urządzenie od mistrza.
  7. Przebić otwory wlotowe i wylotowe w PDMS za pomocą dziurkacza biopsyjnego 0,5 mm.
  8. Przymocuj urządzenie do szklanego szkiełka mikroskopowego za pomocą spawarki plazmowej4.

3. Przygotuj pompę do kontroli ciśnienia powietrza do zwiększania ciśnienia w zbiorniku zawierającym płyn

  1. Zmodyfikuj wydajność pompy w taki sposób, aby sprężone powietrze wydostawało się przez rurkę polietylenową o średnicy wewnętrznej 2.7 mm.
  2. Skonstruuj go w taki sposób, aby rurka kończyła się na końcówce strzykawki typu luer-lock, umieszczając światło nad smoczkiem z tyłu luer-locka.
  3. Uszczelnić, wypełniając przestrzeń między gwintami luer-lock a rurką epoksydową.
  4. Założyć igłę o masie 27,5 g.

4. Przygotuj monodyspersyjną emulsję kropelek wodnych (woda w oleju) zawieszonych w obojętnym fluorowanym oleju nośnikowym z 2% (wagowo) rozpuszczonym biokompatybilnym środkiem powierzchniowo czynnym7

Konkretne odczynniki zawarte w tych kropelkach zależą od zastosowania

  1. Przygotowując się do ponownego wstrzyknięcia, należy umieścić emulsję w strzykawce o pojemności 1 ml z igłą o sile 27,5 g.
  2. Zabezpiecz strzykawkę w pompce strzykawkowej i ustaw pompę pionowo (igła do góry).
    Uwaga: Ta orientacja powoduje, że kropelki pakują się w warstwę nad olejem nośnikowym. Po uruchomieniu pompy kropelki zostaną wypchnięte ze strzykawki przy dużej frakcji objętościowej przez warstwę oleju pod nimi.

5. Przygotuj odczynniki do wprowadzenia do chipa mikroprzepływowego

  1. Wbij trzy otwory 0,5 mm w nasadce probówki wirówkowej o pojemności 15 ml (wystarczy dowolny pojemnik z zakrętką) za pomocą dziurkacza do biopsji, igły lub wiertła.
  2. Przełóż drut elektrodowy o średnicy 0,5 mm i rurkę PE-2 o długości ~20 cm przez dwa otwory tak, aby dotarły do dna rurki.
  3. W pozostałym otworze nawlecz rurkę PE o długości ~2,5 cm tak, aby spoczywała powyżej poziomu płynu.
  4. Uszczelnij wszelkie szczeliny w górnej części nasadki żywicą epoksydową utwardzaną promieniami UV.
  5. Napełnić rurkę płynem do wstrzykiwań pikoiniekcyjnych i zakręcić nakrętkę.
  6. Podłącz wyjście z pompy sterującej ciśnieniem powietrza do krótszej długości rurki, wkładając igłę do światła. Igła powinna ściśle przylegać.
  7. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml 1 M NaCl, aby służyła jako fosa Faradaya.
  8. Podłączyć igłę 27,5 G i zamocować strzykawkę w pompie strzykawkowej.
  9. Napełnij kolejną strzykawkę o pojemności 1 ml olejem do przenoszenia/przekładki, podłącz igłę 27,5 G i zabezpiecz ją w pompce strzykawkowej.

6. Przygotowanie urządzenia mikroprzepływowego do iniekcji pikowtrysku

  1. Podłącz rurkę wyjściową (o większej długości) od pojemnika płynu iniekcyjnego do portu wlotowego płynu do iniekcji pikoiniekcyjnej na chipie mikroprzepływowym.
  2. Podłączyć strzykawkę zawierającą 1 M NaCl do portu wlotowego fosy Faradaya na chipie mikroprzepływowym z rurką PE o długości
  3. Podłączyć strzykawkę zawierającą olej nośnikowy do portu wlotowego chipa mikroprzepływowego za pomocą rurki PE.
  4. Włóż rurkę PE do portu wylotowego emulsji w chipie mikroprzepływowym. Rurka powinna kończyć się w naczyniu na emulsję, zwykle w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  5. Włóż rurkę PE do portu wylotowego fosy Faradaya na chipie mikroprzepływowym. Rurka powinna być zakończona w nieprzewodzącym i elektrycznie izolowanym pojemniku, aby zapobiec zwarciu.
  6. Podłącz wyjście wzmacniacza wysokiego napięcia (HV) za pomocą zacisku krokodylkowego do metalowej elektrody zanurzonej w płynie pikoiniekcyjnym.
  7. Podłączyć elektrodę masową wzmacniacza wysokiego napięcia za pomocą zacisku krokodylkowego do metalu igły strzykawki zawierającej 1 M NaCl.

7. Wprowadź odczynniki do chipa mikroprzepływowego

  1. Wprowadzić 1 M NaCl (fosa Faradaya) do urządzenia z szybkością 100 μl/h.
  2. Wprowadzić emulsję kropelkową i olej nośnikowy w ilościach odpowiednich do wymiarów urządzenia. W naszym urządzeniu demonstracyjnym wprowadzamy krople i olej w dawkach odpowiednio 200 i 400 μl/h. Natężenia przepływu powinny umożliwiać kropelkom przechodzenie przez pikowtryskiwacz w regularnych odstępach czasu, oddzielonych szczeliną oleju nośnikowego.
  3. Wyregulować ciśnienie przyłożone do płynu do iniekcji pikoiniekcyjnej w taki sposób, aby ciśnienie płynu w kryzie pikoiniekcyjnej było w równowadze mechanicznej z kanałem kroplowym.
    Uwaga: Przy tym ciśnieniu (ciśnieniu Laplace'a) płyn do wstrzykiwań powinien wybrzuszać się w kanale kropelkowym, nie pączkując i nie tworząc własnych kropel (rysunek 2). Przy tych opisanych powyżej natężeniach przepływu przykładamy ciśnienie ~13 psi do płynu iniekcyjnego, aby osiągnąć równowagę w miejscu wstrzyknięcia.

8. Rozpocznij wstrzykiwanie pikowtrysku

  1. Gdy kropelki przechodzą przez otwór iniekcyjny, należy zastosować sygnał prądu przemiennego 0-10 V, 10 kHz wzmocniony 1000 razy przez wzmacniacz wysokiego napięcia (ilustracja 3).
  2. Moduluj objętość wtrysku, zmieniając amplitudę przyłożonego napięcia.
    Uwaga: Wyższe napięcia powinny pozwolić na wprowadzenie większej ilości płynu do kropel. W naszych testach obserwujemy stabilne i spójne wstrzykiwanie przy napięciach od 100 do 3 000 V przy użyciu roztworów iniekcyjnych NaCl w zakresie od 10 do 500 mM (ilustracja 4).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Obrazy mikroskopowe wykonane w miejscu piko-iniekcji pokazują, że elektryfikacja płynu do piko-iniekcji jest wystarczająca, aby wywołać iniekcję (Rysunek 2)). Objętość wstrzykiwaną można kontrolować poprzez modulowanie amplitudy przyłożonego napięcia, przy czym wyższe napięcia pozwalają na wstrzykiwanie większych objętości. Na (Rysunku 3)) przedstawiono zależność objętości iniekcji od wartości przyłożonego napięcia dla trzech reprezentatywnych stężeń molowych płynu do iniekcji. Aby zadem...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zależność między objętością wtrysku a przyłożonym napięciem zależy od wielu czynników, w tym wymiarów urządzenia, długości rurki transportującej płyn pikoiniekcyjny do urządzenia, molowości płynu pikoiniekcyjnego oraz prędkości kropelek przepływających przez wtryskiwacz. Z tego powodu zalecamy, aby przed każdym uruchomieniem pikoiniekcji scharakteryzować stosunek objętości do napięcia poprzez pomiar objętości wtrysku na krawędziach roboczych zakresów napięcia i molowości. Dodatkowo przy wyższych napięciach i molowcach pł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie do końca rozumiemy dokładny mechanizm fizyczny stojący za związkiem między przyłożonym napięciem a objętością wtrysku obserwowany w naszych eksperymentach. Zainteresowania laboratorium i odpowiednie obszary wiedzy specjalistycznej nie są dobrze przystosowane do zajmowania się tym wciąż utrzymującym się pytaniem. Zachęcamy osoby z większą wiedzą fizyczną i inżynierską do zbadania tego zjawiska.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Wydział Bioinżynierii i Nauk Terapeutycznych UCSF, Kalifornijski Instytut Nauk Ilościowych (QB3) oraz Bridging the Gap Award od Rogers Family Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawki 1 ml Luer-Lok™ BDMedical309628
LocTite Klej utwardzany promieniami UVHenkel35241
Rurki PE-2Towary naukoweBB31695-PE/2
Novec HFE-75003M98-0212-2928-5
NaClSigma AldrichS9888
1,5 ml probówkiwirówkoweEppendorf22363531
BD Falcon 15 ml tubkaBD Biosciences352097
Pompa kontroli ciśnienia powietrzaControl Air Inc.Polecamy jeden pod kontrolą DAQ i oprogramowania sterującego
Pompy strzykawkoweNew EraMuszą być w stanie pomieścić strzykawki o pojemności 1 ml i płynąć z prędkością tak niską, jak 100 μ l/hr
WzmacniaczMusi być zdolny do 1,000-krotnego wzmocnienia sygnałów od 0,01 do 10 V
Spajacz/czyścik plazmowyHarrick Plasma
3" wafle krzemoweSigma Aldrich647535
PDMSDow CorningSylgard 184 ze środkiem utwardzającym powinny być dołączone
SU-8 fotorezystorMicroChemLepkość zależy od wymiarów urządzenia
HV

Bibliografia

  1. Kritikou, E. It's cheaper in the Picolab. Nat. Rev. Genet. 6 (9), (2005).
  2. Ahn, K., Agresti, J., Chong, H., Marquez, M., Weitz, D. A. Electrocoalescence of drops synchronized by size-dependent flow in microfluidic channels. Appl. Phys. Lett. 88 (26), (2006).
  3. Abate, A. R., Hung, T., Mary, P., Agresti, J. J., Weitz, D. A. High-throughput injection with microfluidics using picoinjectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 19163-19166 (2010).
  4. Harris, J., et al. Fabrication of a microfluidic device for the compartmentalization of neuron soma and axons. J. Vis. Exp. (7), (2007).
  5. Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Anal. Chem. 70 (23), 4974-4984 (1998).
  6. O'Donovan, B., Eastburn, D. J., Abate, A. R. Electrode-free picoinjection of microfluidic drops. Lab on a Chip. 12 (20), 4029-4032 (2012).
  7. Holtze, C., et al. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a Chip. 8 (10), 1632-1639 (2008).
  8. Chung, C., Lee, M., Char, K., Ahn, K., Lee, S. Droplet dynamics passing through obstructions in confined microchannel flow. Microfluid. Nanofluid. 9, 1151-1163 (2010).
  9. Herminghaus, S. Dynamical instability of thin liquid films between conducting media. Phys. Rev. Lett. 83 (12), 2359-2361 (1999).
  10. Priest, C., Herminghaus, S., Seemann, R. Controlled electrocoalescence in microfluidics: Targeting a single lamella. Appl. Phys. Lett. 89 (13), 134101-134103 (2006).
  11. Florent, M., Siva, A. V., Hao, G., Dirk, E., Frieder, M. Electrowetting-controlled droplet generation in a microfluidic flow-focusing device. J. Phys: Condens. Matter. 19 (46), (2007).
  12. Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR. PLoS ONE. 8 (4), (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

p yn wtryskowysterowanie napi ciemwykonanie urz dzeniar w Faradayakana emulsjiwysokie napi ciewtryskiwanie kropel

Powiązane artykuły