Artykuł metodologiczny

Fotostymulacja optogenetycznie ukierunkowana obwodów przodomózgowia ze skaningiem laserowym

9.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50915

⸱

27 grudnia 2013

 ,  ,  , 
1Department of Comparative Biomedical Sciences, School of Veterinary Medicine, Louisiana State University, 2Department of Neurobiology, University of Chicago

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy metodę charakteryzowania funkcjonalnej topografii i właściwości synaptycznych obwodów przodomózgowia za pomocą podejścia optogenetycznego do fotostymulacji populacji neuronów in vitro.

Streszczenie

Czuciowe przodomózgowie składa się z misternie połączonych typów komórek, których właściwości funkcjonalne nie zostały jeszcze w pełni wyjaśnione. Zrozumienie interakcji między tymi obwodami przodomózgowia zostało ostatnio pomocne dzięki rozwojowi metod optogenetycznych do modulacji aktywności neuronalnej za pośrednictwem światła. W tym miejscu opisujemy protokół badania funkcjonalnej organizacji obwodów przodomózgowia in vitro przy użyciu fotostymulacji metodą laserową rodopsyny kanałowej, wyrażanej optogenetycznie przez transfekcję za pośrednictwem wirusa. Podejście to wykorzystuje również użyteczność rekombinacji cre-lox u myszy transgenicznych do ukierunkowanej ekspresji w określonych typach komórek neuronalnych. Po transfekcji neurony są fizjologicznie rejestrowane w preparatach plasterkowych za pomocą klamry z łatą na całe komórki, aby zmierzyć ich wywołane reakcje na fotostymulację włókien ekspresji rodopsyny kanałowej skaningiem laserowym. Takie podejście umożliwia ocenę topografii funkcjonalnej i właściwości synaptycznych. Korelaty morfologiczne można uzyskać, obrazując neuroanatomiczną ekspresję włókien ekspresji rodopsyny kanałowej za pomocą mikroskopii konfokalnej żywego wycinka lub tkanki po utrwaleniu. Metody te umożliwiają funkcjonalne badania obwodów przodomózgowia, które rozszerzają się na bardziej konwencjonalne podejścia.

Wprowadzenie

Skomplikowane obwody przodomózgowia ssaków stanowią eksperymentalne wyzwanie dla zbadania funkcjonalnych ról jego splecionych komponentów. Rozwikłanie tych zależności zostało ostatnio pomocne dzięki rozwojowi metod optogenetycznych dla specyficznie pobudzających i hamujących populacji neuronów i ich projekcji1-3. Podejścia te wykorzystują genetycznie kontrolowaną ekspresję kanałów błonowych reagujących na światło4-6. Na szczególną uwagę zasługuje rodopsyna kanałowa, kanał jonowy bramkowany światłem, depolaryzuje błony neuronalne po stymulacji optycznej, prowadząc do pobudzenia neuronu wyrażającego ekspresję i jego projekcji4,7. I odwrotnie, halorhodopina, pompa chlorkowa bramkowana światłem, hiperpolaryzuje błonę, hamując w ten sposób ukierunkowaną projekcję6,8,9. Zmodyfikowano kilka wariantów tych opsyn, wyprodukowano wiele wektorów do transfekcji i ekspresji w populacjach neuronów będących przedmiotem zainteresowania, a także zaprojektowano transgeniczne linie myszy, które konstytutywnie wyrażają te opsyny lub umożliwiają kontrolę ich ekspresji za pośrednictwem cre-lox1,2,10,11.

Użyteczność tych metod i materiałów optogenetycznych zrewolucjonizowała współczesną neurobiologię eksperymentalną, umożliwiając analizę roli określonych obwodów nerwowych w fizjologii i zachowaniu organizmu12-15. W szczególności metody te mogą być skutecznie stosowane do funkcjonalnego rozwarstwiania obwodów mózgowych przy użyciu preparatów in vitro Slice 16-20. W tym kontekście jedną z głównych zalet tej metody jest możliwość scharakteryzowania fizjologii projekcji dalekiego zasięgu, które są trudne, jeśli nie niemożliwe, do zachowania w grubym warstwie, takich jak połączenia spoidłowe między półkulami kory mózgowej16. Co więcej, technologia ta umożliwia manipulacje, które nie są możliwe w przypadku innych metod, takich jak selektywne hamowanie projekcji z precyzją czasową za pomocą halorodopsyny6,8,9. Co więcej, specyficzna dla typu komórki ekspresja tych opsyn pozwala na selektywne stymulowanie lub hamowanie izolowanych składników w obwodzie neuronalnym1,2,11,15,21. W związku z tym te nowatorskie narzędzia optogenetyczne umożliwiają bezprecedensową analizę wkładu neuronów w fizjologię i zachowanie.

Tutaj opisujemy protokół ekspresji rodopsyny kanałowej w mózgu myszy za pomocą wektorów wirusowych związanych z adenowirusem (AAV)1,2. Specyficzna transfekcja docelowych populacji neuronów może być zrealizowana przy użyciu tego protokołu, z odpowiednim wyborem konstruktów promotorowych lub myszy transgenicznych, które wyrażają rekombinazę Cre w docelowych neuronach będących przedmiotem zainteresowania i "floxowanym" konstruktem wirusowym1,11,15,21 (Figura 1). Jako przykłady badamy tutaj projekcje korowo-korowe między pierwszorzędową korą wzrokową (V1) a drugorzędową korą wzrokową (V2), a także badamy projekcję korowo-wzgórzową warstwy 6 od pierwotnej kory czuciowej somatora (S1) do brzuszno-tylnego jądra przyśrodkowego (VPm). Łączymy tę specyficzną ekspresję z fotostymulacją metodą skaningu laserowego in vitro w celu oceny fizjologii synaptycznej i topografii funkcjonalnej. Przedstawiona konfiguracja umożliwia precyzyjne pozycjonowanie przestrzenne i kontrolę loci fotostymulacji. Na koniec opisujemy wizualizację wzorców ekspresji za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Protokół

1. Chirurgia i zastrzyki

  1. Znieczulenie myszy za pomocą iniekcji dootrzewnowej (zalecana igła 22-25 G) ketaminy (100-120 mg / kg) i ksylazyny (7,5-16 mg / kg).
    1. Oceń sedację za pomocą silnych szczypania palców u nóg, aż nie zostaną wywołane żadne odpowiedzi. W przypadku wszystkich opisanych procedur na zwierzętach należy je w razie potrzeby zmodyfikować tak, aby były zgodne z lokalnymi wytycznymi IACUC.
  2. Umieść uspokojone myszy w urządzeniu stereotaktycznym, zabezpieczając głowę i uszy w odpowiednich uchwytach.
    1. Przed umieszczeniem zwierzęcia w urządzeniu stereotaktycznym należy nasmarować je sterylną maścią okulistyczną.
  3. Ogol skórę głowy brzytwą i wysterylizuj obszar wacikami Betadine.
  4. Za pomocą skalpela wyciąć nacięcie w linii środkowej i odbić skórę i mięśnie leżące pod nią powyżej obszaru, który ma być wstrzyknięty.
  5. Obróć ostrze skalpela jako trepanację, aby wykonać kraniotomię powyżej obszaru, który ma być odsłonięty. Alternatywnie, użyj małego wiertła dołączonego do Dremel do wykonania kraniotomii.
    1. Aby wykonać kraniotomię, umieść ostrze skalpela lub wiertło na powierzchni czaszki i powoli obracaj, aż zostanie wykopana wystarczająca ilość kości, aby odsłonić pia mater pod spodem.
    2. Po wykonaniu wstępnego wykopu należy powiększyć kraniotomię za pomocą drobnych kleszczy, aby ostrożnie usunąć kość z krawędzi.
  6. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 μl roztworem wirusa, który ma być wstrzyknięty (UNC Vector Core).
    1. Aby zwiększyć skuteczność transfekcji, należy przygotować roztwór wirusowy o stężeniu 4 μg/ml polibrenu.
  7. Opuścić igłę w miejscu, w które ma być wstrzyknięte i zainparować pod ciśnieniem 200 nl roztworu zawierającego wirusa za pomocą pompki strzykawkowej.
    1. Pozostawić strzykawkę na 10 minut przed wyjęciem igły.
  8. Zszyj skórę niewchłanialnym nylonem monofilamentowym i przykryj nacięcie maścią z antybiotykiem.
    1. Szwy należy usunąć po 7-10 dniach.
  9. Wstrzyknąć buprenorfinę (0,05-0,1 mg/kg) w celu znieczulenia pooperacyjnego.
  10. Pozwól zwierzętom na pooperacyjną rekonwalescencję przez 14-21 dni, aby umożliwić odpowiednią ekspresję rodopsyny kanałowej.

2. Przygotowanie plastra

  1. Po okresie rekonwalescencji należy głęboko znieczulić zwierzę znieczuleniem izofluranowym, co potwierdza brak odruchu odstawienia, gdy tylna stopa i/lub palce są mocno ściśnięte.
  2. Wypreparuj mózg przez dekapitację, a następnie cięcia w linii środkowej i czołowej czaszki.
  3. Oderwij czaszkę od linii środkowej, aby odsłonić mózg.
  4. Ostrożnie usuń mózg za pomocą cienkiej szpatułki, aby oddzielić nerwy czaszkowe od podstawy mózgu.
  5. Szybko umieść wypreparowany mózg w małej 100 ml zlewce zawierającej schłodzony, lodowaty sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF; w mM: 125 NaCl, 3 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 25 NaHCO3, 25 glukozy).
  6. Wyjmij mózg z ACSF i umieść go na szkiełku mikroskopowym pokrytym bibułą filtracyjną wstępnie zwilżoną ACSF.
  7. Wykonaj blokujące cięcie mózgu w pożądanej orientacji za pomocą czystej żyletki.
  8. Przymocuj zablokowaną powierzchnię mózgu do etapu cięcia za pomocą kleju błyskawicznego.
  9. Przenieś etap do komory cięcia wibratomu (przechowuj w zamrażarce, aż będzie gotowy do cięcia).
  10. Wlej lodowaty ACSF do komory tnącej.
  11. Cięcie skrawków mózgu pod kątem 400-500 μm za pomocą wibrującej krajalnicy do tkanek.
  12. Przenieść wycinki mózgu do komory przetrzymywania zawierającej natleniony ACSF i inkubować w temperaturze 30 °C przez co najmniej 1 godzinę przed eksperymentem.

3. Zapis fizjologiczny

  1. Po okresie inkubacji przenieść wycinek do komory rejestracyjnej na zmodyfikowanym stoliku mikroskopu.
  2. Zabezpiecz plasterek w kąpieli podczas eksperymentu za pomocą kilku nitek nylonowych włókien przymocowanych do uchwytu na plastry z platynowego drutu.
  3. Stale perfuzuj wycinek za pomocą ACSF.
  4. Pociągnąć pipety rejestrujące do rezystancji końcówki 3-6 MΩ po napełnieniu roztworem wewnątrzkomórkowym zawierającym następujące (w mM): 127 K-glukonian, 3 KCl, 1 MgCl2, 0,07 CaCl2, 10 HEPES, 2 Na 2-ATP, 0,3 Na-GTP, 0,1 EGTA. Roztwór wewnątrzkomórkowy powinien mieć pH 7,3, dostosowane KOH lub kwasem glukonowym i osmolalność 280-290 mOsm.
  5. Korzystając ze standardowej wizualizowanej konfiguracji zapisu całej komórki, umieść pipetę rejestrującą w pobliżu neuronu, który ma być rejestrowany, stosując nadciśnienie22,23.
  6. Zwolnij nadciśnienie, jednocześnie stosując ssanie, aby utworzyć uszczelkę Gigaohm.
  7. Zastosuj krótkie ssanie, aby przerwać membranę i utworzyć zapis konfiguracji całej komórki.
  8. Rejestruj odpowiedzi neuronów w cęgach napięciowych lub prądowych.

4. Fotostymulacja skaningowa laserowa

  1. Uruchom oprogramowanie i sprzęt do akwizycji danych, opisane w poprzednich raportach23-29.
    Uwaga: Wykorzystaliśmy zarówno programy akwizycyjne Tidelwave25, jak i ostatnio Ephus26, napisane w Matlabie i opracowane przez laboratorium Karela Svbody w Janelia Farms30. Pełny opis fotostymulacji skaningowej laserowej u Ephus znajduje się w Suter et al.26 i przewodnik krok po kroku30.
    Uwaga: Konfiguracja opisana w tym artykule pochodzi z konfiguracji opisanej przez Shepherda (2012)23. Wiązka laserowa jest kierowana przez otwarty system wiązek luster do górnego portu mikroskopu przez soczewkę obiektywu na plasterek (ryc. 2).
  2. Przekieruj niewielką część lasera na fotodiodę za pomocą szkiełka nakrywkowego mikroskopu umieszczonego na ścieżce lasera i wykorzystaj prąd wyjściowy z tej fotodiody do monitorowania intensywności lasera podczas eksperymentów.
    1. Skalibruj wyjściowy prąd wyjściowy fotodiody zapisany w oprogramowaniu do zmierzonej mocy lasera w tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu za pomocą miernika mocy podczas konfiguracji sprzętu23.
  3. Kontroluj moc lasera, obracając koło o zmiennej neutralnej gęstości. Moc lasera wykorzystywana w naszych eksperymentach wahała się w granicach 25-70 mW (w tylnej płaszczyźnie ogniskowej).
  4. Ustaw długość i czas stymulacji laserowej, modyfikując parametry impulsu dla lasera i migawki. Stymulacja laserowa trwa zazwyczaj 2 ms.
  5. Uchwyć obraz obszaru, który ma być stymulowany, za pomocą funkcji "Chwyć wideo".
  6. Wybierz siatkę stymulacji zgodnie z żądanymi wymiarami. Zazwyczaj używamy matrycy stymulacyjnej 16 x 16 z odstępami 80 μm między sąsiednimi rzędami i kolumnami.
  7. Nałóż siatkę odwzorowania na uzyskany obraz i dostosuj przesunięcie x, y i stopnia do żądanego położenia i orientacji.
  8. Aktywuj funkcję "Mapa", aby rozpocząć stymulację i akwizycję danych.
  9. Po uzyskaniu odpowiedzi wywołanych fotostymulacją, przeprowadź analizę zmapowanych danych za pomocą programu do analizy map offline w Tidelwave25 lub programu "MapAnalysis" w Ephus26.

5. Poprawiono obrazowanie plasterków

  1. Po nagraniach przenieś wycinek mózgu do 4% paraformaldehydu (PFA) w 0,01 M PBS (pH7,4) przez noc w temperaturze 4 ºC.
  2. Przenieść plaster w 30% sacharozie w 4% PFA/0,01 M PBS przez noc w temperaturze 4 ºC.
  3. Wyciąć odcinki o wielkości 50 μm za pomocą kriostatu i zebrać w 0,01 M PBS.
  4. Wypłukać skrawki w 0,01 M PBS dwukrotnie w temperaturze pokojowej.
  5. Zamontuj sekcje i szkiełko nakrywkowe w odpowiednim podłożu zapobiegającym blaknięciu.
  6. Przenieś skrawki do mikroskopu konfokalnego.
  7. Skoncentruj się na ROI za pomocą białego światła.
  8. Wybierz długość fali, rozmiar obrazowania i powtarzalność do akwizycji obrazu. W przypadku YFP używamy 514 nm (Ex)/527 nm (Em).

Wyniki

Laserowo skanowaną fotostymulację projekcji pomiędzy pierwotnym polem wzrokowym (V1) a wtórnym polem wzrokowym (V2) u myszy przeprowadzono po wstrzyknięciu pAAV-CaMKIIa-hChR2(H134R)-EYFP do V1 myszy Balb/C (Rysunek 3). Promotor CaMKIIa w tym konstrukcie wirusowym steruje specyficzną ekspresją channelrhodopsyny-EYFP w pobudzających neuronach glutaminergicznych1,15. Po przygotowaniu skrawków do rejestracji fizjologicznej zaobserwowano włókna wykazujące ekspresję channelrhodopsyny-EYFP, t.j. epifluorescencję sprzężonego EYFP, biegnące z V1 do V2 (Rysunek 3A). Ponadto zaobserwowano również włókna korowo-wzgórzowe w bocznych ciałach kolankowatych (LGN) (Rysunek 3A). Rejestracje metodą patch clamp z całego neuronu w V2 wykazały EPSC wywołane laserowo skanowaną fotostymulacją włókien wykazujących ekspresję channelrhodopsyny-EYFP w głębszych warstwach V2 (Rysunek 3B).

W innym przykładzie, z wykorzystaniem tego protokołu, przeprowadzono fotostymulację skanującą laserem projekcji korowo-wzgórzowych z warstwy 6 pierwotnej kory somatosensorycznej (S1) do jądra brzuszno-tylnego (VP). Zastosowano podejście Cre-Lox, aby ukierunkować ekspresję channelropsyny specyficznie w neuronach warstwy 6 oraz w interesujących nas projekcjach korowo-wzgórzowych. Dokładnie mówiąc, do S1 myszy B6.Cg-Tg(Ntsr1-cre)GN220Gsat/Mmcd wstrzyknięto pAAV-Ef1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-pA (Rycina 1 i 4). Ta transgeniczna linia myszy wykazuje ekspresję rekombinazy Cre specyficznie w neuronach korowo-wzgórzowych warstwy 621, co w konsekwencji prowadzi do ekspresji ChR-YFP wyłącznie w tych neuronach po transfekcji „floxowanym” konstruktem AAV. Po przygotowaniu skrawków, włókna channelropsyny-EYFP zaobserwowano w neuronach warstwy 6 oraz we włóknach rzutujących do warstwy 4 i VP (Rycina 4A i 4B). Rejestracja fizjologiczna z neuronu VPm za pomocą techniki whole-cell patch clamp wykazała, że prądy EPSC można było wywołać po fotostymulacji skanującej laserem w pobliżu rejestrowanego neuronu (Rycina 4C i 4D).

Morfologię znakowanych włókien oceniono łatwiej po rejestracjach fizjologicznych. W tym celu ponownie pocięto (50 μm) preparaty plastrów z ekspresją channelrhodopsin-EYFP w neuronach kortykotalamicznych warstwy 6 (Rycina 5). Ujawniło to gęsty wzór znakowanych włókien biegnących z warstwy 6 do warstwy 4, gdzie kończyły one swój bieg i rozgałęziały się w sposób rozległy (Rycina 5A). Ponadto zaobserwowano włókna kortykotalamiczne wchodzące w istotę białą i biegnące w kierunku wzgórza (Ryciny 5A oraz 5B).

Schemat edycji genów z wykorzystaniem układu Cre-loxP dla ukierunkowanej ekspresji ChR-YFP w modelu mysim.
Rycina 1. Schematyczne przedstawienie ukierunkowanej ekspresji channelrhodopsyny z wykorzystaniem podejścia Cre-Lox. Myszy transgeniczne wykazujące ekspresję rekombinazy Cre w wybranych populacjach neuronalnych otrzymują wstrzykniętego wirusa z sekwencją „floxed”, kodującego channelrhodopsynę połączoną z białkiem fluorescencyjnym, takim jak YFP. Po transfekcji jedynie neurony posiadające rekombinazę Cre będą wykazywać ekspresję channelrhodopsyny-EYFP. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Schemat mikroskopii laserowej z optyką laserową, lustrem dichronicznym, kamerą CCD i układem skanującym.
Rycina 2. Schematyczny rysunek układu do fotostymulacji. (A) Schemat układu do fotostymulacji z szybkim skanowaniem laserowym. Wiązka lasera jest prowadzona kolejno przez otwarty układ wiązki do migawki oraz filtra neutralnego (N.D.). Szkiełko zakrywkowe odbija część wiązki do fotodiody połączonej ze wzmacniaczem do pomiarów mocy lasera. Galwanometry lustrzane są używane do pozycjonowania wiązki lasera poprzez soczewkę skanującą, która prowadzi wiązkę przez boczny port na górze mikroskopu. Następnie wiązka jest odbijana w dół przez obiektyw do preparatu z przekrojem tkankowym za pomocą lustra dichronicznego. Więcej szczegółów znajduje się w publikacjach Lam i Sherman23 oraz Shepherd29. (B) Przykład siatki fotostymulacji dla reprezentatywnego eksperymentu przedstawionego na Rycini 3. Siatka stymulacji 16 x 16 jest nałożona na fotomikrografię preparatu z przekrojem tkankowym. Czerwona gwiazdka wskazuje położenie neuronu rejestrowanego metodą patch clamp w konfiguracji whole-cell. Położenie wiązki lasera jest kierowane do każdego z 256 punktów w siatce stymulacji za pomocą komputerowego pozycjonowania galwanometrów lustrzanych. Na rysunku przedstawiono pozycje lasera dla pierwszych 5 punktów stymulacji. Odpowiedzi zarejestrowanego neuronu na fotostymulację w każdym z tych punktów przedstawiono na Rycini 3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Schemat mapy neuroobrazowania; analiza LGN, kory wzrokowej V1 i V2; badanie połączeń neuronalnych.
Rysunek 3. Fotostymulacja skaningowa laserem projekcji kora-kora z pierwotnej kory wzrokowej (V1) do wtórnej kory wzrokowej (V2) u myszy. (A) Obraz epifluorescencyjny preparatu skrawka przedstawiający włókna channelrhodopsin-EYFP z V1 do V2 oraz w bocznym ciele kolankowatym (LGN). Specyficzna ekspresja channelrhodopsin-EYFP w pobudzających neuronach glutaminergicznych jest sterowana przez konstrukt wirusowy zawierający promotor CaMKIIa. (B) Pobudzające prądy postsynaptyczne (EPSCs) wywołane w neuronie w V2 po fotostymulacji skaningowej laserem. Czerwona gwiazdka oznacza miejsce rejestracji. Paski skali: (A) 500 µm, (B) 200 pA, 100 msec. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Schemat warstw kory z analizą obszaru VP; mapowanie mikroaktywności elektrycznej; dane elektrofizjologiczne.
Rysunek 4. Fotostymulacja skaningowa laserem projekcji korowo-wzgórzowych z pierwotnej kory somatosensorycznej (S1) do jądra brzuszno-tylnego (VP) u myszy. (A) Obraz epifluorescencyjny preparatu skrawka wykazujący włókna channelrhodopsin-EYFP w S1. (B) Obraz epifluorescencyjny oznakowanych włókien w VP. (C) Pobudzające prądy postsynaptyczne (EPSCs) wywołane w neuronie VP po fotostymulacji skaningowej laserem. (D) Wykres średnich EPSCs. Czerwona gwiazdka oznacza miejsce rejestracji. Obramowane ślady w (C) odpowiadają obramowanym wartościom w (D). Paski skali: (A) 250 µm, (B) 250 µm, (C) 100 pA, 100 msec. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Mikroskopia fluorescencyjna ukazująca struktury neuronalne znakowane zielonymi markerami; schemat porównawczy.
Rycina 5. Obrazowanie neuronów warstwy 6 wykazujących ekspresję channelrhodopsin-EYFP w pierwotnej korze somatosensorycznej (S1) myszy. (A-B) Znakowane neurony w warstwie 6 oraz włókna rzutujące do warstwy 4 i istoty białej. Paski skali: (A) 250 µm, (B) 250 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Dyskusja

Opisany protokół szczegółowo opisuje podejście do oceny in vitro funkcjonalnej topografii i fizjologii obwodów neuronalnych, które nie ogranicza się do badania obwodów przodomózgowia, tj . wzgórza i kory mózgowej. Kilka konstruktów wirusowych do transfekcji optogenetycznej zostało udostępnionych społeczności naukowej i można je łatwo uzyskać z UNC Vector Core. Opis łatwo dostępnych konstruktów wirusowych można znaleźć w UNC Vector Core31, stronie z zasobami optogenetycznymi w Deisseroth Lab na Uniwersytecie Stanforda32 oraz w laboratorium neurobiologii syntetycznej Boydena na MIT33. Warianty tych opsyn zostały opracowane przez te laboratoria i umożliwiają szeroki zakres trybów kontrolowania pobudliwości neuronów1,2. Uzyskanie tych wektorów z rdzenia wektorowego UNC wymaga zawarcia umowy o transferze materiałów z laboratoriów, z których pochodzą. W tym protokole zauważamy, że dodatek polibrenu zwiększa skuteczność transfekcji. Ponadto inną zmienną wpływającą na ekspresję jest okres rekonwalescencji po operacji, w którym zauważamy, że okres co najmniej 14 dni jest wystarczający do uzyskania silnej ekspresji w szlakach przodomózgowia myszy.

Do celowanej transfekcji określonych grup neuronów opracowano kilka linii myszy transgenicznych Cre, które mogą być stosowane w połączeniu z opracowanymi "floksowanymi" odwróconymi konstruktami wirusowymi z otwartą ramką odczytu, które zostały opracowane11. Kilka szczepów związanych z badaniami neurobiologicznymi jest dostępnych w Regionalnych Centrach Zasobów Zmutowanych Myszy34. Atlasy wzorców ekspresji rekombinazy Cre w tych liniach transgenicznych są oferowane za pośrednictwem bazy danych GENSAT35. Ponadto Jackson Labs oferuje kilka szczepów transgenicznych Cre, a także inne, które konstytutywnie wyrażają opsyny w określonych grupach neuronów. Kluczowym krokiem do wykorzystania tych linii myszy jest uwzględnienie czasu niezbędnego do uzyskania i założenia kolonii hodowlanej, który może się różnić w zależności od konkretnego szczepu.

Do fotostymulacji wykorzystaliśmy i dostosowaliśmy konfigurację opracowaną przez Shepherd Lab na Northwestern University, opisaną w niedawnym protokole29. Chociaż zoptymalizowany do odkrępowania glutaminianu, ten zestaw jest również podatny na fotostymulację rodopsyny kanałowej bez modyfikacji. Taki układ umożliwia precyzyjną kontrolę przestrzenną i pozycjonowanie loci fotostymulacji, co umożliwia ocenę funkcjonalnej topografii unerwienia rodopsyny kanałowej zarejestrowanych neuronów. Chociaż ta metoda fotostymulacji poprawia kontrolę przestrzenną, jest ona bardziej kosztowna niż metody wykorzystujące oświetlenie pola oparte na diodach LED20. Ponadto niejednorodność tkanki mózgowej jest ograniczeniem optogenetyki, czyli wszelkich technik związanych z manipulacją światłem. W praktyce jednak rzadko ma to znaczenie, ponieważ wyniki są interpretowane głównie w sposób jakościowy. W przypadku, gdy potrzebne jest bardziej ilościowe porównanie między regionami mózgu, zawsze można użyć maksymalnego natężenia światła, aby uzyskać "nasycone" odpowiedzi.

Ponadto korzystaliśmy zarówno z programów Tidelwave, jak i Ephus napisanych w Matlabie do sterowania fotostymulacją skaningową laserową i akwizycją danych25,26. Zaleca się jednak, aby osoby konfigurujące podobny system korzystały z nowszego oprogramowania Ephus26, które ma wsparcie dostępne za pośrednictwem witryny rozwojowej Janelia Farms30. Kluczowym krokiem jest wybór, którego z tych pakietów oprogramowania użyć, ponieważ ich wymagania sprzętowe nieznacznie się różnią. Ponadto programy do analizy map są dostosowane do odpowiednich programów do gromadzenia danych.

Kilka z tych kroków można zmodyfikować, aby dopasować je do konkretnej konfiguracji praktyka. Iniekcje roztworów wirusowych mogą być wykonywane za pomocą mechanizmów podających oprócz strzykawki, np . dobrze sprawdzają się również szklane pipety kapilarne ciągnięte do średnicy końcówki ~40 μm. W przypadku operacji można zastąpić niestereotaktyczny uchwyt na głowę, jeśli takie współrzędne nie są wymagane do prowadzenia wstrzyknięć. Ponadto skład ACSF i roztworu wewnątrzkomórkowego może być zmieniany w zależności od szczególnych wymagań doświadczalnych, np . poprzez zastąpienie wewnątrzkomórkowego roztworu cezu lub roztworu o wysokiej zawartości chlorków w celu wyizolowania prądów hamujących. Alternatywą dla obrazowania wzorców ekspresji w ustalonych wycinkach może być również wykonanie w żywym wycinku na odpowiednim stanowisku do obrazowania z systemem perfuzji kąpielowej.

Podsumowując, protokół ten umożliwi lekarzowi scharakteryzowanie funkcjonalnej topografii i fizjologii synaptycznej projekcji in vitro, co może nie być możliwe przy użyciu standardowych metod, np. Charakteryzowanie projekcji dalekiego zasięgu, których nie można zachować w wycinku. Opisany protokół transfekcji można zastosować do eksperymentów optogenetycznych in vivo 1-3,12,14, ponieważ mechanizm dostarczania jest taki sam. Wreszcie, chociaż protokół ten opisuje transfekcję myszy, wiele dostępnych wektorów wirusowych można wykorzystać do teoretycznej transfekcji i ekspresji tych opsyn w szerokim zakresie gatunków ssaków, umożliwiając w ten sposób niezliczone badania porównawcze i specyficzne dla gatunku1-3.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie mają sprzecznych interesów. Autor (CCL) otrzymał grant na publikację od firmy Leica Microsystems, która produkuje instrument używany w tym filmie tego protokołu.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant NIH/NIDCD R03 DC 011361, grant SVM CORP LAV3202, grant NSF-LA EPSCoR PFUND86, oraz grant publikacji od Leica Microsystems (CCL) i grant NIH/NIDCD R01 DC 008794 (SMS).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PolybreneSanta Cruz BiotechSC134220
Paraformaldehyd 32% roztwórEMS15714
VECTASHIELDVector LabsH-1400
AAV konstrukty wirusoweUNC Vector CoreNA
Stereotaktyczny uchwyt głowy myszyStoelting51730
Wtryskiwacz NanocoolHarvard Aparatura703040
Laser UV: 355 nm, Nd:YVO4; 1 W;DPSS Lasers, Inc3500
GalwonometrówLustra Cambridge Scanning6210
UchwytCambridge Scanning6m2003S-A
Cambridge Scanning6102103L
SterownikCambridge Scanning6010-19-120
Sterownik/kontrolerCambridge Scanning67121-1
Migawka - powlekana ZM (kompatybilna z UV)UniblitzL23-ZM2
WzmacniaczUniblitzVMM-D1
PłytaStanford Research SystemsSR570
6713National Instruments777741-01
2110 skrzynka rozdzielczaNational Instruments777643-01
PCI-MIO-16E-4National Instruments777383-01
BNC-2090National Instruments777270-01
National Instruments184749-01
MATLABMathworks
TCS SP2Leica Microsystems
/kontroler Sterownik żaluzji prądu

Bibliografia

  1. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat. Rev. Neurosci. 13, 251-266 (2012).
  2. Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends Cog. Sci. 15, 592-600 (2011).
  3. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71, 9-34 (2011).
  4. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13940-13945 (2003).
  5. Zemelman, B. V., Lee, G. A., Ng, M., Miesenbock, G. Selective photostimulation of genetically ChARGed neurons. Neuron. 33, 15-22 (2001).
  6. Gradinaru, V., Thompson, K. R., Deisseroth, K. eNpHR: a Natronomonas halorhodopsin enhanced for optogenetic applications. Brain Cell Biol. 36, 129-139 (2008).
  7. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. M. illisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
  8. Lanyi, J. K. Halorhodopsin: A light-driven chloride ion pump. Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 15, 11-28 (1986).
  9. Han, X., Boyden, E. S. Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution. PLoS One. 2, (2007).
  10. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodpsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-755 (2011).
  11. Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat. Neurosci. 15, 793-802 (2012).
  12. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34, 389-412 (2011).
  13. Gradinaru, V., Mogri, M., Thompson, K. R., Henderson, J. M., Deisseroth, K. Optical deconstruction of parkinsonian neural circuit. Science. 324, 354-359 (2009).
  14. Olsen, S. R., Bortone, D. S., Adesnik, H., Scanziani, M. Gain control by layer six in cortical circuits of vision. Nature. 483, 47-52 (2012).
  15. Zhang, F., et al. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).
  16. Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Na. Neurosci. 10, 663-668 (2007).
  17. Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons. Neuron. 65, 230-245 (2010).
  18. Lee, C. C., Lam, Y. W., Sherman, S. M. Intracortical convergence of layer 6 neurons. Neuroreport. 23, 736-740 (2012).
  19. Mancuso, J. J., et al. Optogenetic probing of functional brain circuitry. Exp. Physiol. 96, 26-33 (2011).
  20. Valley, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. Using affordable LED arrays for photo-stimulation of neurons. J. Vis. Exp. (57), (2011).
  21. Gong, S., et al. Targeting Cre recombinase to specific neuron populations with bacterial artificial chromosome constructs. J. Neurosci. 27, 9817-9823 (2007).
  22. Cox, C. L., Sherman, S. M. Control of dendritic outputs of inhibitory interneurons in the lateral geniculate nucleus. Neuron. 27, 597-610 (2000).
  23. Lam, Y. W., Sherman, S. M. Mapping by laser photostimulation of connections between the thalamic reticular and ventral posterior lateral nuclei in the rat. J. Neurophysiol. 94, 2472-2483 (2005).
  24. Lam, Y. W., Sherman, S. M. Functional organization of the somatosensory cortical layer 6 feedback to the thalamus. Cereb Cortex. 20, 13-24 (2010).
  25. Shepherd, G. M., Pologruto, T. A., Svoboda, K. Circuit analysis of experience-dependent plasticity in the developing rat barrel cortex. Neuron. 38, 277-289 (2003).
  26. Suter, B. A., et al. Ephus: multipurpose data acquisition software for neuroscience experiments. Front Neural Circuits. 4, (2010).
  27. Lee, C. C., Sherman, S. M. Topography and physiology of ascending streams in the auditory tectothalamic pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 372-377 (2010).
  28. Lee, C. C., Sherman, S. M. Intrinsic modulators of auditory thalamocortical transmission. Hear Res. , 287-2843 (2012).
  29. Shepherd, G. M. Circuit mapping by ultraviolet uncaging of glutamate. , Cold Spring. 998-1004 (2012).
  30. ScanImage, Ephus, and other DAQ software [Internet]. , Janelia Farms. Ashburn (VA). Available from: http://www.ephus.org (2003).
  31. UNC Gene Therapy Center [Internet]. , University of North Carolina. Chapel Hill (NC). Available from: http://genetherapy.unc.edu/services.htm (2003).
  32. Optogenetics Resource Center [Internet]. , Stanford University. Stanford (CA). Available from: http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics (2003).
  33. Synthetic Neurobiology Group [Internet]. , MIT. Cambridge (MA). Available from: http://syntheticneurobiology.org (2003).
  34. Mutant Mouse Regional Resource Centers [Internet]. , NIH. Bethesda (MD). Available from: http://www.mmrrc.org (2003).
  35. GENSAT Brain Atlas [Internet]. , NIH. Bethesda (MD). Available from: http://www.gensat.org/cre.jsp (2003).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Celowanie optogenetyczneekspresja channelropsynypatch clamp ca okom rkowymikroskopia konfokalnatransfekcja wirusowarekombinacja Cre loxprzygotowanie skrawk wtopografia funkcjonalnaw a ciwo ci synaptyczne
Fotostymulacja optogenetycznie ukierunkowana obwodów przodomózgowia ze skaningiem laserowym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.