Fotostymulacja optogenetycznie ukierunkowana obwodów przodomózgowia ze skaningiem laserowym

Podsumowanie

Opisujemy metodę charakteryzowania funkcjonalnej topografii i właściwości synaptycznych obwodów przodomózgowia za pomocą podejścia optogenetycznego do fotostymulacji populacji neuronów in vitro.

Streszczenie

Czuciowe przodomózgowie składa się z misternie połączonych typów komórek, których właściwości funkcjonalne nie zostały jeszcze w pełni wyjaśnione. Zrozumienie interakcji między tymi obwodami przodomózgowia zostało ostatnio pomocne dzięki rozwojowi metod optogenetycznych do modulacji aktywności neuronalnej za pośrednictwem światła. W tym miejscu opisujemy protokół badania funkcjonalnej organizacji obwodów przodomózgowia in vitro przy użyciu fotostymulacji metodą laserową rodopsyny kanałowej, wyrażanej optogenetycznie przez transfekcję za pośrednictwem wirusa. Podejście to wykorzystuje również użyteczność rekombinacji cre-lox u myszy transgenicznych do ukierunkowanej ekspresji w określonych typach komórek neuronalnych. Po transfekcji neurony są fizjologicznie rejestrowane w preparatach plasterkowych za pomocą klamry z łatą na całe komórki, aby zmierzyć ich wywołane reakcje na fotostymulację włókien ekspresji rodopsyny kanałowej skaningiem laserowym. Takie podejście umożliwia ocenę topografii funkcjonalnej i właściwości synaptycznych. Korelaty morfologiczne można uzyskać, obrazując neuroanatomiczną ekspresję włókien ekspresji rodopsyny kanałowej za pomocą mikroskopii konfokalnej żywego wycinka lub tkanki po utrwaleniu. Metody te umożliwiają funkcjonalne badania obwodów przodomózgowia, które rozszerzają się na bardziej konwencjonalne podejścia.

Wprowadzenie

Skomplikowane obwody przodomózgowia ssaków stanowią eksperymentalne wyzwanie dla zbadania funkcjonalnych ról jego splecionych komponentów. Rozwikłanie tych zależności zostało ostatnio pomocne dzięki rozwojowi metod optogenetycznych dla specyficznie pobudzających i hamujących populacji neuronów i ich projekcji^1-3. Podejścia te wykorzystują genetycznie kontrolowaną ekspresję kanałów błonowych reagujących na światło^4-6. Na szczególną uwagę zasługuje rodopsyna kanałowa, kanał jonowy bramkowany światłem, depolaryzuje błony neuronalne po stymulacji optycznej, prowadząc do pobudzenia neuronu wyrażającego ekspresję i jego projekcji^4,7. I odwrotnie, halorhodopina, pompa chlorkowa bramkowana światłem, hiperpolaryzuje błonę, hamując w ten sposób ukierunkowaną projekcję^6,8,9. Zmodyfikowano kilka wariantów tych opsyn, wyprodukowano wiele wektorów do transfekcji i ekspresji w populacjach neuronów będących przedmiotem zainteresowania, a także zaprojektowano transgeniczne linie myszy, które konstytutywnie wyrażają te opsyny lub umożliwiają kontrolę ich ekspresji za pośrednictwem cre-lox^1,2,10,11.

Użyteczność tych metod i materiałów optogenetycznych zrewolucjonizowała współczesną neurobiologię eksperymentalną, umożliwiając analizę roli określonych obwodów nerwowych w fizjologii i zachowaniu organizmu^12-15. W szczególności metody te mogą być skutecznie stosowane do funkcjonalnego rozwarstwiania obwodów mózgowych przy użyciu preparatów in vitro ^{Slice 16-20}. W tym kontekście jedną z głównych zalet tej metody jest możliwość scharakteryzowania fizjologii projekcji dalekiego zasięgu, które są trudne, jeśli nie niemożliwe, do zachowania w grubym warstwie, takich jak połączenia spoidłowe między półkulami kory mózgowej¹⁶. Co więcej, technologia ta umożliwia manipulacje, które nie są możliwe w przypadku innych metod, takich jak selektywne hamowanie projekcji z precyzją czasową za pomocą halorodopsyny^6,8,9. Co więcej, specyficzna dla typu komórki ekspresja tych opsyn pozwala na selektywne stymulowanie lub hamowanie izolowanych składników w obwodzie neuronalnym^1,2,11,15,21. W związku z tym te nowatorskie narzędzia optogenetyczne umożliwiają bezprecedensową analizę wkładu neuronów w fizjologię i zachowanie.

Tutaj opisujemy protokół ekspresji rodopsyny kanałowej w mózgu myszy za pomocą wektorów wirusowych związanych z adenowirusem (AAV)^1,2. Specyficzna transfekcja docelowych populacji neuronów może być zrealizowana przy użyciu tego protokołu, z odpowiednim wyborem konstruktów promotorowych lub myszy transgenicznych, które wyrażają rekombinazę Cre w docelowych neuronach będących przedmiotem zainteresowania i "floxowanym" konstruktem wirusowym^1,11,15,21 (Figura 1). Jako przykłady badamy tutaj projekcje korowo-korowe między pierwszorzędową korą wzrokową (V1) a drugorzędową korą wzrokową (V2), a także badamy projekcję korowo-wzgórzową warstwy 6 od pierwotnej kory czuciowej somatora (S1) do brzuszno-tylnego jądra przyśrodkowego (VPm). Łączymy tę specyficzną ekspresję z fotostymulacją metodą skaningu laserowego in vitro w celu oceny fizjologii synaptycznej i topografii funkcjonalnej. Przedstawiona konfiguracja umożliwia precyzyjne pozycjonowanie przestrzenne i kontrolę loci fotostymulacji. Na koniec opisujemy wizualizację wzorców ekspresji za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Protokół

1. Chirurgia i zastrzyki

1. Znieczulenie myszy za pomocą iniekcji dootrzewnowej (zalecana igła 22-25 G) ketaminy (100-120 mg / kg) i ksylazyny (7,5-16 mg / kg).
   1. Oceń sedację za pomocą silnych szczypania palców u nóg, aż nie zostaną wywołane żadne odpowiedzi. W przypadku wszystkich opisanych procedur na zwierzętach należy je w razie potrzeby zmodyfikować tak, aby były zgodne z lokalnymi wytycznymi IACUC.
2. Umieść uspokojone myszy w urządzeniu stereotaktycznym, zabezpieczając głowę i uszy w odpowiednich uchwytach.
   1. Przed umieszczeniem zwierzęcia w urządzeniu stereotaktycznym należy nasmarować je sterylną maścią okulistyczną.
3. Ogol skórę głowy brzytwą i wysterylizuj obszar wacikami Betadine.
4. Za pomocą skalpela wyciąć nacięcie w linii środkowej i odbić skórę i mięśnie leżące pod nią powyżej obszaru, który ma być wstrzyknięty.
5. Obróć ostrze skalpela jako trepanację, aby wykonać kraniotomię powyżej obszaru, który ma być odsłonięty. Alternatywnie, użyj małego wiertła dołączonego do Dremel do wykonania kraniotomii.
   1. Aby wykonać kraniotomię, umieść ostrze skalpela lub wiertło na powierzchni czaszki i powoli obracaj, aż zostanie wykopana wystarczająca ilość kości, aby odsłonić pia mater pod spodem.
   2. Po wykonaniu wstępnego wykopu należy powiększyć kraniotomię za pomocą drobnych kleszczy, aby ostrożnie usunąć kość z krawędzi.
6. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 μl roztworem wirusa, który ma być wstrzyknięty (UNC Vector Core).
   1. Aby zwiększyć skuteczność transfekcji, należy przygotować roztwór wirusowy o stężeniu 4 μg/ml polibrenu.
7. Opuścić igłę w miejscu, w które ma być wstrzyknięte i zainparować pod ciśnieniem 200 nl roztworu zawierającego wirusa za pomocą pompki strzykawkowej.
   1. Pozostawić strzykawkę na 10 minut przed wyjęciem igły.
8. Zszyj skórę niewchłanialnym nylonem monofilamentowym i przykryj nacięcie maścią z antybiotykiem.
   1. Szwy należy usunąć po 7-10 dniach.
9. Wstrzyknąć buprenorfinę (0,05-0,1 mg/kg) w celu znieczulenia pooperacyjnego.
10. Pozwól zwierzętom na pooperacyjną rekonwalescencję przez 14-21 dni, aby umożliwić odpowiednią ekspresję rodopsyny kanałowej.

2. Przygotowanie plastra

1. Po okresie rekonwalescencji należy głęboko znieczulić zwierzę znieczuleniem izofluranowym, co potwierdza brak odruchu odstawienia, gdy tylna stopa i/lub palce są mocno ściśnięte.
2. Wypreparuj mózg przez dekapitację, a następnie cięcia w linii środkowej i czołowej czaszki.
3. Oderwij czaszkę od linii środkowej, aby odsłonić mózg.
4. Ostrożnie usuń mózg za pomocą cienkiej szpatułki, aby oddzielić nerwy czaszkowe od podstawy mózgu.
5. Szybko umieść wypreparowany mózg w małej 100 ml zlewce zawierającej schłodzony, lodowaty sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF; w mM: 125 NaCl, 3 KCl, 1,25 NaH₂PO₄, 1 MgCl₂, 2 CaCl₂, 25 NaHCO₃, 25 glukozy).
6. Wyjmij mózg z ACSF i umieść go na szkiełku mikroskopowym pokrytym bibułą filtracyjną wstępnie zwilżoną ACSF.
7. Wykonaj blokujące cięcie mózgu w pożądanej orientacji za pomocą czystej żyletki.
8. Przymocuj zablokowaną powierzchnię mózgu do etapu cięcia za pomocą kleju błyskawicznego.
9. Przenieś etap do komory cięcia wibratomu (przechowuj w zamrażarce, aż będzie gotowy do cięcia).
10. Wlej lodowaty ACSF do komory tnącej.
11. Cięcie skrawków mózgu pod kątem 400-500 μm za pomocą wibrującej krajalnicy do tkanek.
12. Przenieść wycinki mózgu do komory przetrzymywania zawierającej natleniony ACSF i inkubować w temperaturze 30 °C przez co najmniej 1 godzinę przed eksperymentem.

3. Zapis fizjologiczny

1. Po okresie inkubacji przenieść wycinek do komory rejestracyjnej na zmodyfikowanym stoliku mikroskopu.
2. Zabezpiecz plasterek w kąpieli podczas eksperymentu za pomocą kilku nitek nylonowych włókien przymocowanych do uchwytu na plastry z platynowego drutu.
3. Stale perfuzuj wycinek za pomocą ACSF.
4. Pociągnąć pipety rejestrujące do rezystancji końcówki 3-6 MΩ po napełnieniu roztworem wewnątrzkomórkowym zawierającym następujące (w mM): 127 K-glukonian, 3 KCl, 1 MgCl₂, 0,07 CaCl₂, 10 HEPES, 2 Na 2-ATP, 0,3 Na-GTP, 0,1 EGTA. Roztwór wewnątrzkomórkowy powinien mieć pH 7,3, dostosowane KOH lub kwasem glukonowym i osmolalność 280-290 mOsm.
5. Korzystając ze standardowej wizualizowanej konfiguracji zapisu całej komórki, umieść pipetę rejestrującą w pobliżu neuronu, który ma być rejestrowany, stosując nadciśnienie^22,23.
6. Zwolnij nadciśnienie, jednocześnie stosując ssanie, aby utworzyć uszczelkę Gigaohm.
7. Zastosuj krótkie ssanie, aby przerwać membranę i utworzyć zapis konfiguracji całej komórki.
8. Rejestruj odpowiedzi neuronów w cęgach napięciowych lub prądowych.

4. Fotostymulacja skaningowa laserowa

1. Uruchom oprogramowanie i sprzęt do akwizycji danych, opisane w poprzednich raportach^23-29.
   Uwaga: Wykorzystaliśmy zarówno programy akwizycyjne Tidelwave²⁵, jak i ostatnio Ephus²⁶, napisane w Matlabie i opracowane przez laboratorium Karela Svbody w Janelia Farms³⁰. Pełny opis fotostymulacji skaningowej laserowej u Ephus znajduje się w Suter et al.²⁶ i przewodnik krok po kroku³⁰.
   Uwaga: Konfiguracja opisana w tym artykule pochodzi z konfiguracji opisanej przez Shepherda (2012)²³. Wiązka laserowa jest kierowana przez otwarty system wiązek luster do górnego portu mikroskopu przez soczewkę obiektywu na plasterek (ryc. 2).
2. Przekieruj niewielką część lasera na fotodiodę za pomocą szkiełka nakrywkowego mikroskopu umieszczonego na ścieżce lasera i wykorzystaj prąd wyjściowy z tej fotodiody do monitorowania intensywności lasera podczas eksperymentów.
   1. Skalibruj wyjściowy prąd wyjściowy fotodiody zapisany w oprogramowaniu do zmierzonej mocy lasera w tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu za pomocą miernika mocy podczas konfiguracji sprzętu²³.
3. Kontroluj moc lasera, obracając koło o zmiennej neutralnej gęstości. Moc lasera wykorzystywana w naszych eksperymentach wahała się w granicach 25-70 mW (w tylnej płaszczyźnie ogniskowej).
4. Ustaw długość i czas stymulacji laserowej, modyfikując parametry impulsu dla lasera i migawki. Stymulacja laserowa trwa zazwyczaj 2 ms.
5. Uchwyć obraz obszaru, który ma być stymulowany, za pomocą funkcji "Chwyć wideo".
6. Wybierz siatkę stymulacji zgodnie z żądanymi wymiarami. Zazwyczaj używamy matrycy stymulacyjnej 16 x 16 z odstępami 80 μm między sąsiednimi rzędami i kolumnami.
7. Nałóż siatkę odwzorowania na uzyskany obraz i dostosuj przesunięcie x, y i stopnia do żądanego położenia i orientacji.
8. Aktywuj funkcję "Mapa", aby rozpocząć stymulację i akwizycję danych.
9. Po uzyskaniu odpowiedzi wywołanych fotostymulacją, przeprowadź analizę zmapowanych danych za pomocą programu do analizy map offline w Tidelwave²⁵ lub programu "MapAnalysis" w Ephus²⁶.

5. Poprawiono obrazowanie plasterków

1. Po nagraniach przenieś wycinek mózgu do 4% paraformaldehydu (PFA) w 0,01 M PBS (pH7,4) przez noc w temperaturze 4 ºC.
2. Przenieść plaster w 30% sacharozie w 4% PFA/0,01 M PBS przez noc w temperaturze 4 ºC.
3. Wyciąć odcinki o wielkości 50 μm za pomocą kriostatu i zebrać w 0,01 M PBS.
4. Wypłukać skrawki w 0,01 M PBS dwukrotnie w temperaturze pokojowej.
5. Zamontuj sekcje i szkiełko nakrywkowe w odpowiednim podłożu zapobiegającym blaknięciu.
6. Przenieś skrawki do mikroskopu konfokalnego.
7. Skoncentruj się na ROI za pomocą białego światła.
8. Wybierz długość fali, rozmiar obrazowania i powtarzalność do akwizycji obrazu. W przypadku YFP używamy 514 nm (Ex)/527 nm (Em).

Wyniki

Laserowa fotostymulacja projekcji między głównym obszarem widzenia (V1) a drugorzędnym obszarem widzenia (V2) u myszy została zrealizowana po wstrzyknięciu pAAV-CaMKIIa-hChR2(H134R)-EYFP do V1 myszy Balb/C (Rysunek 3). Promotor CaMKIIa w tym konstrukcie wirusowym napędza specyficzną ekspresję rodopsyny kanałowej-EYFP w pobudzających neuronach glutaminergicznym^1,15. Po przygotowaniu wycinków do zapisu fizjologicznego zaobserwowano ekspresję włókien rodopsyny kanałowej-EYFP, tj. epifluorescencję sprzężonego EYFP, przechodzącą od V1 do V2 (ryc. 3A). Ponadto zaobserwowano również włókna korowo-wzgórzowe w jądrze kolankowatym bocznym (LGN) (ryc. 3A). Zapisy klamry krosowej całej komórki z neuronu w V2 ujawniły EPSC wywołane po fotostymulacji skaningowej laserowej włókien ekspresyjnych rodopsyny-EYFP w dolnych warstwach V2 (Figura 3B).

W innym przykładzie, laserowa fotostymulacja projekcji korowo-wzgórzowych z warstwy 6 pierwotnej kory somatosensorycznej (S1) do jądra brzuszno-tylnego (VP) została zrealizowana przy użyciu tego protokołu. W tym przypadku zastosowaliśmy podejście Cre-Lox, aby ukierunkować ekspresję rodopsyny kanałowej w neuronach warstwy 6 i projekcjach korowo-wzgórzowych, które są przedmiotem zainteresowania. Wyraźnie wstrzyknęliśmy pAAV-Ef1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-pA do S1 B6. Myszy Cg-Tg(Ntsr1-cre)GN220Gsat/Mmcd (rysunki 1 i 4). Ten transgeniczny szczep myszy ulega ekspresji Cre-rekombinazy specyficznie w neuronach korowo-wzgórzowych warstwy 6²¹, a zatem powoduje ekspresję ChR-YFP tylko w tych neuronach, które są po transfekcji przez "floksowany" konstrukt AAV. Po przygotowaniu wycinków zaobserwowano włókna rodopsyny kanałowej-EYFP w neuronach warstwy 6 i włóknach rzutujących do warstwy 4 i VP (ryc. 4A i 4B). Zapis fizjologiczny z neuronu VPm za pomocą klamry krosowej całej komórki ujawnił, że EPSC mogą być wywołane po fotostymulacji skaningowej laserowej w pobliżu zarejestrowanego neuronu (ryc. 4C i 4D).

Morfologia oznaczonych włókien była łatwiej oceniana na podstawie zapisów fizjologicznych. Tutaj wycięliśmy preparaty warstwowe (50 μm) z ekspresją rodopsyny kanałowej-EYFP w neuronach korowych warstwy 6 (ryc. 5). Ujawniło to drobny wzór oznakowanych włókien przechodzących od warstwy 6 do warstwy 4, gdzie kończyły się i intensywnie arboryzowały (ryc. 5A). Ponadto zaobserwowano włókna korowo-wzgórzowe wchodzące do istoty białej przechodzącej w kierunku wzgórza (ryc. 5A i 5B).

Rysunek 1. Schematyczna ilustracja ukierunkowanej ekspresji rodopsyny kanałowej za pomocą podejścia Cre-Lox. Transgenicznym myszom wykazującym ekspresję Cre-rekombinazy w populacjach neuronów będących przedmiotem zainteresowania wstrzykuje się "floksowany" wirus kodujący rodopsynę kanałową połączoną z białkiem fluorescencyjnym, takim jak YFP. Po transfekcji tylko neurony z rekombinazą Cre będą wyrażać rodopsynę kanałową-EYFP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 2. Schematyczna ilustracja konfiguracji fotostymulacji. (A) Schemat konfiguracji fotostymulacji ze skaningiem laserowym. Wiązka lasera jest prowadzona kolejno przez system otwartej wiązki do przesłony i filtra o neutralnej gęstości (ND). Szkiełko nakrywkowe odbija część wiązki do fotodiody podłączonej do wzmacniacza w celu pomiaru mocy lasera. Galwanometry lustrzane służą do ustawiania wiązki laserowej przez soczewkę skanującą, która prowadzi wiązkę przez boczny port w górnej części mikroskopu. Wiązka jest następnie odbijana w dół przez soczewkę obiektywu do przygotowania plastra za pomocą lustra dichroicznego. Więcej szczegółów można znaleźć w Lam i Sherman²³ oraz Shepherd²⁹. (B) Przykład wzoru siatki fotostymulacji dla reprezentatywnego eksperymentu pokazanego na rysunku 3. Siatka stymulacyjna 16 x 16 jest nałożona na mikrofotografię przygotowania plastrów. Czerwona gwiazda wskazuje lokalizację neuronu zarejestrowaną za pomocą klamry krosowej całej komórki. Pozycja wiązki laserowej jest kierowana do każdej z 256 pozycji w siatce stymulacji przez skomputeryzowane pozycjonowanie galwanometrów lustrzanych. Pozycje lasera w 1. 5 miejscach stymulacji przedstawiono na rysunku. Reakcje zarejestrowanego neuronu na fotostymulację w każdym z miejsc przedstawiono na rycinie 3. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 3. Fotostymulacja laserowo-skaningowa projekcji korowo-korowych od pierwszorzędowej kory wzrokowej (V1) do drugorzędowej kory wzrokowej (V2) u myszy. (A) Obraz epifluorescencyjny preparatu plastra pokazujący włókna rodopsyny kanałowej EYFP od V1 do V2 oraz w jądrze kolankowatym bocznym (LGN). Specyficzna ekspresja rodopsyny kanałowej-EYFP w pobudzających neuronach glutaminergicznym jest napędzana przez konstrukt wirusowy zawierający promotor CaMKIIa. (B) Pobudzające prądy postsynaptyczne (EPSC) wywołane przez neuron w V2 po fotostymulacji skaningowej laserowej. Czerwona gwiazdka oznacza miejsce nagrywania. Podziałka skali: (A) 500 μm, (B) 200 pA, 100 ms. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 4. Fotostymulacja skaningowa laserowa projekcji korowo-wzgórzowych od pierwotnej kory somatosensorycznej (S1) do jądra brzuszno-tylnego (VP) u myszy. (A) Obraz epifluorescencyjny preparatu plastra pokazujący włókna rodopsyny kanałowej-EYFP w S1. (B) Epifluorescencyjny obraz znakowanych włókien w VP. (C) Pobudzające prądy postsynaptyczne (EPSC) wywołane przez neuron VP po fotostymulacji skaningowej laserowej. (D) Wykres średnich EPSC. Czerwona gwiazdka oznacza miejsce nagrywania. Ślady w ramkach w (C) odpowiadają wartościom w ramkach w (D). Podziałka skali: (A) 250 μm, (B) 250 μm, (C) 100 pA, 100 ms. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Ryc. 5. Obrazowanie neuronów warstwy 6 wyrażających rodopsynę kanałową-EYFP w pierwszorzędowej korze somatosensorycznej (S1) myszy. Punkty A-B) Znakowane neurony w warstwie 6 i włókna wystające do warstwy 4 i istoty białej. Podziałka skali: (A) 250 μm, (B) 250 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Dyskusja

Opisany protokół szczegółowo opisuje podejście do oceny in vitro funkcjonalnej topografii i fizjologii obwodów neuronalnych, które nie ogranicza się do badania obwodów przodomózgowia, tj . wzgórza i kory mózgowej. Kilka konstruktów wirusowych do transfekcji optogenetycznej zostało udostępnionych społeczności naukowej i można je łatwo uzyskać z UNC Vector Core. Opis łatwo dostępnych konstruktów wirusowych można znaleźć w UNC Vector Core³¹, stronie z zasobami optogenetycznymi w Deisseroth Lab na Uniwersytecie Stanforda³² oraz w laboratorium neurobiologii syntetycznej Boydena na MIT³³. Warianty tych opsyn zostały opracowane przez te laboratoria i umożliwiają szeroki zakres trybów kontrolowania pobudliwości neuronów^1,2. Uzyskanie tych wektorów z rdzenia wektorowego UNC wymaga zawarcia umowy o transferze materiałów z laboratoriów, z których pochodzą. W tym protokole zauważamy, że dodatek polibrenu zwiększa skuteczność transfekcji. Ponadto inną zmienną wpływającą na ekspresję jest okres rekonwalescencji po operacji, w którym zauważamy, że okres co najmniej 14 dni jest wystarczający do uzyskania silnej ekspresji w szlakach przodomózgowia myszy.

Do celowanej transfekcji określonych grup neuronów opracowano kilka linii myszy transgenicznych Cre, które mogą być stosowane w połączeniu z opracowanymi "floksowanymi" odwróconymi konstruktami wirusowymi z otwartą ramką odczytu, które zostały opracowane¹¹. Kilka szczepów związanych z badaniami neurobiologicznymi jest dostępnych w Regionalnych Centrach Zasobów Zmutowanych Myszy³⁴. Atlasy wzorców ekspresji rekombinazy Cre w tych liniach transgenicznych są oferowane za pośrednictwem bazy danych GENSAT³⁵. Ponadto Jackson Labs oferuje kilka szczepów transgenicznych Cre, a także inne, które konstytutywnie wyrażają opsyny w określonych grupach neuronów. Kluczowym krokiem do wykorzystania tych linii myszy jest uwzględnienie czasu niezbędnego do uzyskania i założenia kolonii hodowlanej, który może się różnić w zależności od konkretnego szczepu.

Do fotostymulacji wykorzystaliśmy i dostosowaliśmy konfigurację opracowaną przez Shepherd Lab na Northwestern University, opisaną w niedawnym protokole²⁹. Chociaż zoptymalizowany do odkrępowania glutaminianu, ten zestaw jest również podatny na fotostymulację rodopsyny kanałowej bez modyfikacji. Taki układ umożliwia precyzyjną kontrolę przestrzenną i pozycjonowanie loci fotostymulacji, co umożliwia ocenę funkcjonalnej topografii unerwienia rodopsyny kanałowej zarejestrowanych neuronów. Chociaż ta metoda fotostymulacji poprawia kontrolę przestrzenną, jest ona bardziej kosztowna niż metody wykorzystujące oświetlenie pola oparte na diodach LED²⁰. Ponadto niejednorodność tkanki mózgowej jest ograniczeniem optogenetyki, czyli wszelkich technik związanych z manipulacją światłem. W praktyce jednak rzadko ma to znaczenie, ponieważ wyniki są interpretowane głównie w sposób jakościowy. W przypadku, gdy potrzebne jest bardziej ilościowe porównanie między regionami mózgu, zawsze można użyć maksymalnego natężenia światła, aby uzyskać "nasycone" odpowiedzi.

Ponadto korzystaliśmy zarówno z programów Tidelwave, jak i Ephus napisanych w Matlabie do sterowania fotostymulacją skaningową laserową i akwizycją danych^25,26. Zaleca się jednak, aby osoby konfigurujące podobny system korzystały z nowszego oprogramowania Ephus²⁶, które ma wsparcie dostępne za pośrednictwem witryny rozwojowej Janelia Farms³⁰. Kluczowym krokiem jest wybór, którego z tych pakietów oprogramowania użyć, ponieważ ich wymagania sprzętowe nieznacznie się różnią. Ponadto programy do analizy map są dostosowane do odpowiednich programów do gromadzenia danych.

Kilka z tych kroków można zmodyfikować, aby dopasować je do konkretnej konfiguracji praktyka. Iniekcje roztworów wirusowych mogą być wykonywane za pomocą mechanizmów podających oprócz strzykawki, np . dobrze sprawdzają się również szklane pipety kapilarne ciągnięte do średnicy końcówki ~40 μm. W przypadku operacji można zastąpić niestereotaktyczny uchwyt na głowę, jeśli takie współrzędne nie są wymagane do prowadzenia wstrzyknięć. Ponadto skład ACSF i roztworu wewnątrzkomórkowego może być zmieniany w zależności od szczególnych wymagań doświadczalnych, np . poprzez zastąpienie wewnątrzkomórkowego roztworu cezu lub roztworu o wysokiej zawartości chlorków w celu wyizolowania prądów hamujących. Alternatywą dla obrazowania wzorców ekspresji w ustalonych wycinkach może być również wykonanie w żywym wycinku na odpowiednim stanowisku do obrazowania z systemem perfuzji kąpielowej.

Podsumowując, protokół ten umożliwi lekarzowi scharakteryzowanie funkcjonalnej topografii i fizjologii synaptycznej projekcji in vitro, co może nie być możliwe przy użyciu standardowych metod, np. Charakteryzowanie projekcji dalekiego zasięgu, których nie można zachować w wycinku. Opisany protokół transfekcji można zastosować do eksperymentów optogenetycznych in vivo ^1-3,12,14, ponieważ mechanizm dostarczania jest taki sam. Wreszcie, chociaż protokół ten opisuje transfekcję myszy, wiele dostępnych wektorów wirusowych można wykorzystać do teoretycznej transfekcji i ekspresji tych opsyn w szerokim zakresie gatunków ssaków, umożliwiając w ten sposób niezliczone badania porównawcze i specyficzne dla gatunku^1-3.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Polybrene	Santa Cruz Biotech	SC134220
Paraformaldehyd 32% roztwór	EMS	15714
VECTASHIELD	Vector Labs	H-1400
AAV konstrukty wirusowe	UNC Vector Core	NA
Stereotaktyczny uchwyt głowy myszy	Stoelting	51730
Wtryskiwacz Nanocool	Harvard Aparatura	703040
Laser UV: 355 nm, Nd:YVO4; 1 W;	DPSS Lasers, Inc	3500
Galwonometrów	Lustra Cambridge Scanning	6210
Uchwyt	Cambridge Scanning	6m2003S-A
	Cambridge Scanning	6102103L
Sterownik	Cambridge Scanning	6010-19-120
Sterownik/kontroler	Cambridge Scanning	67121-1
Migawka - powlekana ZM (kompatybilna z UV)	Uniblitz	L23-ZM2
Wzmacniacz	Uniblitz	VMM-D1
Płyta	Stanford Research Systems	SR570
6713	National Instruments	777741-01
2110 skrzynka rozdzielcza	National Instruments	777643-01
PCI-MIO-16E-4	National Instruments	777383-01
BNC-2090	National Instruments	777270-01
	National Instruments	184749-01
MATLAB	Mathworks
TCS SP2	Leica Microsystems