Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Stworzenie chirurgicznie indukowanego modelu u myszy w celu zbadania ochronnej roli progranuliny w chorobie zwyrodnieniowej stawów

28.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50924

⸱

25 lutego 2014

 ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, NYU Hospital for Joint Diseases, 2Department of Orthopaedic Surgery, New York University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy protokół destabilizacji modelu łąkotki przyśrodkowej (DMM) u myszy, skuteczne narzędzie do badań nad chorobą zwyrodnieniową stawów (OA). Ponadto wykazaliśmy, że niedobór progranuliny może nasilać rozwój i progresję choroby zwyrodnieniowej stawów przy użyciu tego modelu, co wskazuje, że progranulina odgrywa ochronną rolę w patogenezie choroby zwyrodnieniowej stawów.

Streszczenie

Model destabilizacji łąkotki przyśrodkowej (DMM) jest ważnym narzędziem do badania patofizjologicznych ról licznych cząsteczek związanych z zapaleniem stawów w patogenezie choroby zwyrodnieniowej stawów (OA) in vivo. Jednak szczegółowy, zwłaszcza wizualizowany protokół ustanawiania tego skomplikowanego modelu u myszy, nie jest dostępny. W tym artykule wykorzystaliśmy myszy typu dzikiego i progranuliny (PGRN)-/- jako przykłady, aby wprowadzić protokół indukcji modelu DMM u myszy i porównaliśmy początek choroby zwyrodnieniowej stawów po ustaleniu tego chirurgicznie indukowanego modelu. Operacje wykonywane na myszach były albo operacją pozorowaną, która właśnie otwierała torebkę stawową, albo operacją DMM, która przecinała więzadło łąkotkowo-piszczelowe i powodowała destabilizację łąkotki przyśrodkowej. Nasilenie choroby zwyrodnieniowej stawów oceniano za pomocą testu histologicznego (np. barwienie Safraniną O), ekspresji genów związanych z chorobą zwyrodnieniową stawów, degradacji cząsteczek macierzy zewnątrzkomórkowej chrząstki i tworzenia osteofitów. Operacja DMM z powodzeniem indukowała inicjację i progresję choroby zwyrodnieniowej stawów zarówno u myszy typu dzikiego, jak i PGRN-/-, a utrata czynnika wzrostu PGNR doprowadziła do poważniejszego fenotypu choroby zwyrodnieniowej stawów w tym chirurgicznie indukowanym modelu.

Wprowadzenie

Choroba zwyrodnieniowa stawów (OA), znana również jako zwyrodnieniowe zapalenie stawów, dotyka 15% światowej populacji i ponad 46 milionów ludzi w Stanach Zjednoczonych i charakteryzuje się zapaleniem błony maziowej, zwyrodnieniem chrząstki i tworzeniem osteofitów1. Może to być wynikiem złożonej interakcji czynników genetycznych, metabolicznych, biomechanicznych i biochemicznych. Mechanizmy leżące u podstaw otwartego dostępu nadal umykają środowisku naukowemu. Obecnie istnieje wiele modeli zwierzęcych, które mogą naśladować patogenezę choroby zwyrodnieniowej stawów2,3. Ważne jest, aby stworzyć modele zwierzęce na myszach zarówno ze względu na dostępność różnych genetycznie zmodyfikowanych myszy, jak i opłacalność eksperymentów. Wśród różnych rodzajów eksperymentalnych modeli choroby zwyrodnieniowej stawów, chirurgicznie indukowany model destabilizacji łąkotki przyśrodkowej (DMM) jest dobrze akceptowanym modelem OA ze względu na jego dobrą odtwarzalność i stosunkowo wolniejszą progresję podczas rozwoju choroby zwyrodnieniowej stawów. Oba te atrybuty były kluczowe dla oceny progresji choroby zwyrodnieniowej stawów w różnych terapiach lub transgenach3-8. Jednak na spójność chirurgicznego modelu choroby zwyrodnieniowej stawów wpływają różne czynniki podczas operacji, w wyniku czego zastosowanie chirurgicznego modelu mysiego jest ograniczone.

Progranulina (PGRN) jest wielofunkcyjnym czynnikiem wzrostu wyrażającym się w różnych komórkach. Wiadomo, że PGRN odgrywa kluczową rolę w różnych procesach fizjologicznych i chorobowych, takich jak gojenie się ran 9, nowotworzenie10 i stan zapalny11-15. Badania wykazały również, że niedobór PGRN może powodować choroby zwyrodnieniowe układu nerwowego zarówno u ludzi, jak i myszy16-18. Wiadomo, że PGRN ulega ekspresji w ludzkiej chrząstce stawowej, a jego poziom jest znacznie podwyższony w chrząstce pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów i reumatoidalnym zapaleniem stawów19. Ponadto PGRN odgrywa również kluczową rolę w proliferacji chondrocytów 20, różnicowaniu i kostnieniu endochrzęstnym płytki wzrostowej podczas rozwoju 21,22. Niedawno informowaliśmy, że PGRN antagonizuje TNF-α poprzez wiązanie się z receptorami TNF i wykazuje funkcję przeciwzapalną w modelach zapalenia stawów13,14,23,24. Zagadką pozostaje jednak rola PGRN w otwartym dostępie, zwłaszcza in vivo. W niniejszym artykule przedstawiamy procedurę indukcji chirurgicznego modelu DMM i badamy rolę PGRN w rozwoju choroby zwyrodnieniowej stawów poprzez ustanowienie modelu DMM u myszy WT i PGRN-/-.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury chirurgiczne związane ze zwierzętami powinny być zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki lokalnej instytucji, z naciskiem na zminimalizowanie bólu i dyskomfortu spowodowanego operacją.

1. Przygotowanie

  1. Do operacji wybierz 8-12 tygodniowe samce myszy C57BL/6 o masie ciała około 25 g.
  2. Znieczulić zwierzęta poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie koktajlu zawierającego zarówno ksylazynę (5 mg/kg), jak i ketaminę (40 mg/kg).
  3. Ogol kolano maszynkami do golenia, a następnie chirurgicznie udrapuj zwierzę i wysterylizuj miejsce operowane betadyną i alkoholem (3x) i przykryj oczy myszy maścią.

2. Proces chirurgiczny

  1. Wykonaj 1 cm podłużne przyśrodkowe nacięcie przyrzepkowe, aby odsłonić staw kolanowy.
  2. Delikatnie otwórz staw kolanowy poprzez boczne zwichnięcie rzepki i więzadła rzepki.
    1. Przeciąć torebkę stawu kolanowego wzdłużnie przez przyśrodkowe nacięcie przyrzepkowe w kroku 2.1.
    2. Wypreparuj torebkę stawu kolanowego za pomocą kleszczy.
    3. Lewą ręką chwyć dystalną część tylnej łapy i wykonaj boczne zwichnięcie rzepki i więzadła rzepki za pomocą kleszczy. Delikatnie trzymaj tylną łapę i upewnij się, że nie doznasz urazu łapy. Im lepiej torebka stawowa zostanie wypreparowana, tym mniejsza siła będzie potrzebna do wykonania zwichnięcia.
  3. Sterylną sól fizjologiczną należy skroplić na powierzchnię chrząstki stawowej podczas operacji, aby uniknąć wysuszenia powierzchni chrząstki.
  4. Przeciąć więzadło łąkotki przyśrodkowej, które zakotwicza łąkotkę przyśrodkową do płaskowyżu piszczelowego. Unikaj uszkodzenia chrząstki pod łąkotką przyśrodkową.
    1. Zidentyfikuj łąkotkę przyśrodkową, która znajduje się między kłykciem przyśrodkowym kości udowej a przyśrodkowym płaskowyżem kości piszczelowej.
    2. Zidentyfikuj więzadło łąkotkowo-piszczelowe, które łączy boczną stronę łąkotki przyśrodkowej z wyniosłością międzykłykciową kości piszczelowej.
    3. Delikatnie chwyć tylną łapę ręką i ostrożnie przetnij więzadło łąkotkowe przyśrodkowe za pomocą ostrza chirurgicznego nr 10. Upewnij się, że nie spowoduje to uszkodzenia chrząstki stawowej i innych więzadeł. W wielu przypadkach pokrywająca poduszeczka tłuszczowa musi zostać odciągnięta na bok, ale nie może zostać usunięta w celu zidentyfikowania więzadła.
  5. Zamknij torebkę stawu kolanowego szwem wchłanialnym 6-0.
  6. Zamknij skórę jedwabnym szwem 6-0.

3. Opieka pooperacyjna

  1. Nałóż jedną kroplę 0,25% bupiwakainy w miejsce operacji każdej myszy, aby zminimalizować ból pooperacyjny.
  2. Pozostaw operowane myszy wolne, aby uzyskać dostęp do wody i jedzenia.

4. Ocena histologiczna chirurgicznego modelu DMM

  1. Składaj myszy w ofierze we wskazanych punktach czasowych (np. 4 tygodnie, 8 tygodni i 12 tygodni. Tutaj pokazaliśmy wyniki z 8 tygodni jako reprezentatywne) po operacji.
  2. Całe stawy kolanowe są unieruchamiane, odwapniane, zatapiane przez parafinę, a następnie cięte szeregowo w odstępach co 5 μm.
    1. Odetnij całe tylne kończyny ostrzami nr 10.
    2. Dokładnie wypreparuj skórę i mięśnie kończyn tylnych i utrwal próbki za pomocą 4% PFA przez 3 dni w RT.
    3. Usuń PFA i wyczyść próbki wodą. Następnie odwapnić próbki w EDTA w temperaturze 4 °C przez 2 tygodnie.
    4. Odwodnić próbki w gradiencie etanolu. Szczegółowo rzecz biorąc, przechowuj próbki w 70% etanolu przez 1 godzinę, a następnie zmień etanol i trzymaj próbki w nowym zestawie 70% etanolu dla O/N. Następnie umieść próbki w 80% i 90% etanolu odpowiednio i przechowuj je odpowiednio przez 1 godzinę, a następnie 100% etanol dla O / N.
    5. Usuń etanol. Przechowywać próbki w oksylenie przez 1 godzinę i zmienić na nowy zestaw oksylenu. Powtórz ten krok 3 razy.
    6. Osadź próbki w formie parafinowej za pomocą centrum zatapiania Leica. Następnie próbki są cięte na sekcje z prędkością 5 μm za pomocą mikrotomu obrotowego (Leica RM2255, Niemcy), a następnie zbierane na szkiełka podstawowe.
    7. Szeregowe sekcje strzałkowe są wycinane dla każdej próbki obejmującej obszar od środka kłykcia bocznego do środka kłykcia przyśrodkowego.
  3. Przeprowadza się barwienie Safraniną O, a następnie punktację i analizę statystyczną za pomocą systemu punktacji OARSI, jak opisano wcześniej25.
    1. Najpierw odparafinowaj szkiełka w oksylenie i uwodnij je w gradiencie etanolu do wody destylowanej. Następnie szkiełka są barwione w roztworze żelaza hematoksyliny Weigerta, 0,05% roztworze Fast Green (FCF), 1% roztworze kwasu octowego i 0,1% roztworze Safraniny O. Zamontuj szkiełka za pomocą podłoża żywicznego.
    2. Oceń szkiełka barwione Safraniną O na podstawie utraty proteoglikanu (czerwonego koloru) w chrząstce i procentowego zniszczenia struktury chrząstki, wykonaj analizę statystyczną dla wyniku histologicznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Model DMM został pomyślnie ustanowiony u myszy, a niedobór PGRN nasilił rozwój OA wywołanego chirurgicznie.

Operacje pozorowane (sham) oraz DMM (Rysunek 1) przeprowadzono u myszy WT oraz PGRN-/-. 8 tygodni po operacji myszy uśmiercono, a następnie wykonano barwienie Safraniną O na skrawkach stawów kolanowych, po czym przeprowadzono analizę statystyczną stopnia zapalenia stawów na podstawie badania histologicznego. Jak pokazano na Rysunku 2A, w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Doniesiono, że szczep myszy jest bardzo ważny dla indukcji modelu DMM, ponieważ różne szczepy myszy mają różne nasilenie choroby zwyrodnieniowej stawów po DMM, z najwyższym poziomem w szczepie 129 / SvEv, następnie C57BL6, 129 / SvInJ, a następnie FVB / n26. Duża część transgenów jest tworzona u myszy C57BL6, takich jak myszy PGRN-/-, których użyliśmy w niniejszym badaniu, które są stosunkowo podatne na DMM. Jeśli jednak transgen jest oparty na niewrażliwym szczepie, takim jak myszy FVB/n, konieczne jest krzyż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Niniejszym oświadczamy, że nie mamy konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez granty badawcze NIH R01AR062207, R01AR061484, R56AI100901, K01AR053210, oraz Disease Targeted Research Grant od Rheumatology Research Foundation (dla C. J. Liu).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Nr 10 Ostrza chirurgiczneFeather25-2976#10
6-0 szewApplied DentalWG-N53133

Bibliografia

  1. Herndon, J. H., Davidson, S. M., Apazidis, A. Recent socioeconomic trends in orthopaedic practice. J. Bone Joint Surg. Am. 83, 1097-1105 (2001).
  2. Johnson, K., et al. A stem cell-based approach to cartilage repair. Science. 336, 717-721 (2012).
  3. Yang, S., et al. Hypoxia-inducible factor-2alpha is a catabolic regulator of osteoarthritic cartilage destruction. Nat. Med. 16, 687-693 (2010).
  4. Glasson, S. S., et al. Deletion of active ADAMTS5 prevents cartilage degradation in a murine model of osteoarthritis. Nature. 434, 644-648 (2005).
  5. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthr. Cart. 15, 1061-1069 (2007).
  6. Chia, S. L., et al. Fibroblast growth factor 2 is an intrinsic chondroprotective agent that suppresses ADAMTS-5 and delays cartilage degradation in murine osteoarthritis. Arthritis Rheum. 60, 2019-2027 (2009).
  7. Miller, R. E., et al. CCR2 chemokine receptor signaling mediates pain in experimental osteoarthritis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20602-20607 (2012).
  8. Wang, Q., et al. Identification of a central role for complement in osteoarthritis. Nat. Med. 17, 1674-1679 (2011).
  9. He, Z., Ong, C. H., Halper, J., Bateman, A. Progranulin is a mediator of the wound response. Nat. Med. 9, 225-229 (2003).
  10. Bateman, A., Bennett, H. P. The granulin gene family: from cancer to dementia. Bioessays. 31, 1245-1254 (2009).
  11. Kessenbrock, K., et al. Proteinase 3 and neutrophil elastase enhance inflammation in mice by inactivating antiinflammatoryprogranulin. J. Clin. Invest. 118, 2438-2447 (2008).
  12. Yin, F., et al. Exaggerated inflammation, impaired host defense, and neuropathology in progranulin-deficient mice. J. Exp. Med. 207, 117-128 (2010).
  13. Liu, C. J. Progranulin: A promising therapeutic target for rheumatoid arthritis. FEBS Lett. , (2011).
  14. Tang, W., et al. The growth factor progranulin binds to TNF receptors and is therapeutic against inflammatory arthritis in mice. Science. 332, 478-484 (2011).
  15. Zhu, J., et al. Conversion of proepithelin to epithelins: roles of SLPI and elastase in host defense and wound repair. Cell. 111, 867-878 (2002).
  16. Baker, M., et al. Mutations in progranulin cause tau-negative frontotemporal dementia linked to chromosome 17. Nature. 442, 916-919 (2006).
  17. Cruts, M., et al. Null mutations in progranulin cause ubiquitin-positive frontotemporal dementia linked to chromosome 17q21. Nature. 442, 920-924 (2006).
  18. Wils, H., et al. Cellular ageing, increased mortality and FTLD-TDP-associated neuropathology in progranulin knockout mice. J. Pathol. , (2012).
  19. Guo, F., et al. Granulin-epithelin precursor binds directly to ADAMTS-7 and ADAMTS-12 and inhibits their degradation of cartilage oligomeric matrix protein. Arthritis Rheum. 62, 2023-2036 (2010).
  20. Xu, K., et al. Cartilage oligomeric matrix protein associates with granulin-epithelin precursor (GEP) and potentiates GEP-stimulated chondrocyte proliferation. J. Biol. Chem. 282, 11347-11355 (2007).
  21. Bai, X. H., et al. ADAMTS-7, a direct target of PTHrP, adversely regulates endochondral bone growth by associating with and inactivating GEP growth factor. Mol. Cell. Biol. 29, 4201-4219 (2009).
  22. Feng, J. Q., et al. Granulinepithelin precursor: a bone morphogenic protein 2-inducible growth factor that activates Erk1/2 signaling and JunB transcription factor in chondrogenesis. FASEB J. 24, 1879-1892 (2010).
  23. Liu, C. J., Bosch, X. Progranulin: A growth factor, a novel TNFR ligand and a drug target. Pharmacol. Therap. 133, 124-132 (2012).
  24. Wu, H., Siegel, R. M. Progranulin Resolves Inflammation. Science. 332, 427-428 (2011).
  25. Glasson, S. S., Chambers, M. G., Den Berg, W. B. V. an, Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthr. Cart. 18, 17-23 (2010).
  26. Glasson, S. S. In vivo osteoarthritis target validation utilizing genetically-modified mice. Curr. Drug Targets. 8, 367-376 (2007).
  27. Ma, H. L. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthr. Cart. 15, 695-700 (2007).
  28. Lin, A. C., et al. Modulating hedgehog signaling can attenuate the severity of osteoarthritis. Nat. Med. 15, 1421-1425 (2009).
  29. Malfait, A. M., et al. ADAMTS-5 deficient mice do not develop mechanical allodynia associated with osteoarthritis following medial meniscal destabilization. Osteoarthr. Cart. 18, 572-580 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Destabilizacja kotki przy rodkowejoperacja DMMmyszy z nokautem progranulinymodel choroby zwyrodnieniowej staw wanaliza histologicznabarwienie safranin Oocena wed ug skali MANKINdegradacja chrz stkitworzenie osteofit wprocedura chirurgiczna
Stworzenie chirurgicznie indukowanego modelu u myszy w celu zbadania ochronnej roli progranuliny w chorobie zwyrodnieniowej stawów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.