Artykuł metodologiczny

Wzorcowanie komórek na zdefiniowanych fotolitograficznie Parylene-C: Substraty SiO2

DOI:

10.3791/50929

⸱

7 marca 2014

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Integrative Physiology, School of Biomedical Sciences, The University of Edinburgh, 2Edinburgh Cancer Research Centre, Institute of Genetics and Molecular Medicine, Western General Hospital, 3School of Engineering, Institute for Integrated Micro and Nano Systems, The University of Edinburgh

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje metodę tworzenia wzorów komórkowych na SiO2 kompatybilną z mikrofabrykacją. Predefiniowany wzór parylenu-C jest drukowany fotolitograficznie na płytkach SiO2. Po inkubacji z surowicą (lub innym roztworem aktywacyjnym) komórki przylegają specyficznie (i rosną zgodnie z zgodnością) leżącego poniżej parylenu-C, będąc jednocześnie odpychane przez regiony SiO2.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Platformy do tworzenia wzorców komórkowych wspierają szerokie cele badawcze, takie jak budowa predefiniowanych sieci neuronalnych in vitro i eksploracja pewnych centralnych aspektów fizjologii komórek. Aby łatwo połączyć modelowanie komórek z matrycami wieloelektrodowymi (MEA) i technologiami "lab on a chip" opartymi na krzemie, wymagany jest protokół kompatybilny z mikrofabrykacją. Opisujemy metodę wykorzystującą osadzanie polimeru parylenu-C na płytkach SiO2. Fotolitografia umożliwia dokładne i niezawodne modelowanie parylenu-C w rozdzielczości na poziomie mikronów. Późniejsza aktywacja przez zanurzenie w płodowej surowicy bydlęcej (lub innym specyficznym roztworze aktywacyjnym) powoduje powstanie substratu, w którym hodowane komórki przylegają lub są odpychane odpowiednio przez regiony parylenu lub SiO2. Technika ta pozwoliła na modelowanie szerokiego zakresu typów komórek (w tym pierwotnych mysich komórek hipokampa, linii komórkowej HEK 293, ludzkiej linii komórkowej teratoraka podobnej do neuronów, pierwotnych mysich komórek ziarnistych móżdżku i pierwotnych ludzkich komórek macierzystych pochodzących z glejaka). Co jednak ciekawe, platforma nie jest uniwersalna; odzwierciedlające znaczenie specyficznych dla komórek cząsteczek adhezyjnych. Ten proces modelowania komórek jest opłacalny, niezawodny i, co ważne, może być włączony do standardowych protokołów mikrofabrykacji (produkcji chipów), torując drogę do integracji technologii mikroelektronicznej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie mechanizmów, które decydują o adhezji komórek i tworzeniu wzorów na syntetycznych materiałach, jest ważne dla zastosowań takich jak inżynieria tkankowa, odkrywanie leków i produkcja biosensorów1-3. Dostępnych i rozwijających się technik jest wiele technik, z których każda wykorzystuje niezliczone czynniki biologiczne, chemiczne i fizyczne, które wpływają na adhezję komórek.

Tutaj opisujemy technikę tworzenia wzorów komórkowych, która wykorzystuje procesy początkowo opracowane do celów produkcji mikroelektroniki. W związku z tym platforma jest dobrze przygotowana do umożliwienia dalszej integracji technologii mikroelektronicznych, takich jak MEA, z platformą modelowania.

Interfejs między błoną komórkową a sąsiednim materiałem jest dwukierunkowy i złożony. In vivo białka macierzy zewnątrzkomórkowej zapewniają strukturę i siłę oraz wpływają na zachowanie komórek poprzez interakcje z receptorami adhezyjnymi komórek. Podobnie, komórki in vitro oddziałują z syntetycznymi substratami poprzez wchłonięte warstwy białek4, podczas gdy wpływy fizykochemiczne również modulują adhezję. Na przykład powierzchnia polimeru może być bardziej "zwilżalna" (hydrofilowa) przez naświetlanie jonami lub światłem ultrafioletowym lub trawienie przez traktowanie kwasem lub wodorotlenkiem5. Uznane metody tworzenia wzorców komórkowych wykorzystują te i inne mediatory adhezji komórek. Przykłady obejmują druk atramentowy6, tłoczenie mikrokontaktowe7, unieruchomienie fizyczne8, mikrofluidykę9, manipulację w czasie rzeczywistym10 i selektywne wzorcowanie składania molekularnego (SMAP)11. Każdy z nich ma określone zalety i ograniczenia. Kluczowym czynnikiem napędzającym naszą pracę jest jednak integracja modelowania komórek z systemami mikroelektromechanicznymi (MEMS).

MEMS odnoszą się do ekstremalnie małych urządzeń mechanicznych napędzanych elektrycznością. Pokrywa się to z odpowiednikami systemów nanoelektromechanicznych w skali nano. Koncepcja ta stała się praktyczna dopiero wtedy, gdy strategie półprzewodnikowe umożliwiły produkcję w mikroskali. Techniki mikrowytwarzania opracowane pierwotnie dla elektroniki półprzewodnikowej zostały przypadkowo uznane za przydatne w innych zastosowaniach, takich jak na przykład elektrofizjologia komórkowa. Kluczowym celem dalszych etapów jest połączenie takich technologii mikroelektronicznych z procesem modelowania komórek o wysokiej wierności (tworząc urządzenie bioMEMS). Kilka istniejących, skądinąd niezawodnych i praktycznych technik tworzenia wzorów komórkowych jest niekompatybilnych z tą ideą. Na przykład dokładne wyrównanie wbudowanych mikroelektroniki lub bioczujników ma zasadnicze znaczenie dla ich skuteczności, ale jest niezwykle trudne do osiągnięcia przy użyciu techniki takiej jak tłoczenie mikrokontaktowe.

Aby obejść ten problem, pracujemy nad platformą do tworzenia wzorów opartą na SiO2, która wykorzystuje fotolitograficznie drukowany parylen-C. Fotolitografia polega na przeniesieniu cech geometrycznych z maski na podłoże za pomocą oświetlenia UV. Maska jest projektowana przy użyciu odpowiedniego programu do projektowania wspomaganego komputerowo. Na szklanej płytce cienka warstwa nieprzezroczystego chromu reprezentuje pożądany wzór geometryczny (możliwa jest rozdzielczość elementu 1-2 mm). Podłoże, które ma być wzorzyste, jest pokryte cienką warstwą fotorezystu (polimeru wrażliwego na promieniowanie UV). Powlekany polimer jest następnie wyrównywany i doprowadzany do bliskiego kontaktu z maską. Źródło promieniowania UV jest stosowane w taki sposób, że niezabezpieczone obszary są napromieniowywane, a zatem stają się rozpuszczalne i usuwalne w następnym etapie rozwoju, pozostawiając reprezentację parylenu-C wzoru maski. Proces ten rozpoczął się podczas opracowywania urządzeń półprzewodnikowych. W związku z tym wafle krzemowe są często używane jako podłoże. Fotolitograficzne osadzanie parylenu-C na SiO2 jest zatem prostym i niezawodnym procesem, który rutynowo odbywa się w mikroelektronicznych pomieszczeniach czystych.

Podczas gdy parylen ma kilka pożądanych cech bioinżynieryjnych (chemicznie obojętny, niebiodegradowalny), czynnikiem ograniczającym jego bezpośrednie zastosowanie w modelowaniu komórek jest jego wrodzona słaba adhezja, przypisywana częściowo jego ekstremalnej hydrofobowości. Niemniej jednak parylen-C był wcześniej używany pośrednio do modelowania komórek, na przykład jako odklejana matryca komórkowa12,13. Takie podejście jest ograniczone przez słabą rozdzielczość i wymaga wielu kroków. Opisany tutaj proces wykorzystuje etap trawienia kwasem, po którym następuje inkubacja surowicy, aby zapewnić, że regiony parylenu-C stają się adhezyjne komórkowo, poprzez połączenie zmniejszenia hydrofobowości i wiązania białek surowicy.

Końcowym rezultatem jest konstrukt złożony z dwóch różnych substratów, które po aktywacji biologicznej wykazują odpowiednie cechy cytoadhezyjne lub cyto-odpychające i w ten sposób stanowią efektywną platformę do modelowania komórek. Co ważne, nie ma potrzeby wprowadzania czynników biologicznych do pomieszczenia czystego, ponieważ wzorzyste podłoża mogą być przechowywane w nieskończoność przed użyciem (po czym są aktywowane za pomocą płodowej surowicy bydlęcej lub innego roztworu aktywacyjnego).

Ta platforma wzorcowa parylene-C/SiO2 jest zatem dobrym kandydatem do koalicji z komponentami MEMS, ponieważ procesy produkcyjne tak bardzo przypominają te używane do produkcji mikroelektroniki.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wytwarzanie wzorów parylenu na SiO2: Przebieg procesu (patrz rysunek 1)

  1. Zaprojektuj żądaną konfigurację parylene-C za pomocą pakietu oprogramowania do edycji układu, zdolnego do odczytu/zapisu plików CIF (Caltech Intermediate Form) lub GDS-II (Graphic Database System-II). CIF i GDS-II to standardowe formaty plików do układów scalonych.
  2. Zleć produkcję masek fotograficznych odpowiedniemu zakładowi mikroelektronicznemu lub wyprodukuj we własnym zakresie, jeśli takie istnieją.
  3. Tlenić płytkę krzemową w atmosferycznym piecu poziomym (H2 1,88 SLM i O2 1,25 SLM) w temperaturze 950 °C przez 40 minut, aby uzyskać warstwę SiO2 o długości 200 nm (potwierdzić grubość za pomocą reflektometru spektroskopowego o małej plamce).
  4. Zagruntować utlenioną płytkę promotorem przyczepności silanów. Teraz nanieść parylen-C w temperaturze 22 °C z szybkością 1,298 nm/mg dimeru za pomocą systemu osadzania próżniowego specjalnie zaprojektowanego do osadzania parylenu. Powłoka parylenu-C o grubości 100 nm została użyta do wszystkich pokazanych poniżej przykładów.
  5. Promotor adhezji heksametyldisilazanu (HMDS) z następnym złożeniem na płytce pokrytej parylenem za pomocą odpowiedniego systemu powlekania fotorezystancyjnego.
  6. Teraz obracaj płytkę z prędkością 4 000 obr./min przez 30 sekund, nakładając dodatni fotorezystor (co daje teoretyczną grubość 1 μm), używając tego samego systemu powłok fotorezystowych, co powyżej.
  7. Wafelek pieczemy na miękko przez 60 sekund w temperaturze 90°C.
  8. Włóż zarówno wafel, jak i wstępnie wyprodukowaną maskę fotograficzną do nakładki maski.
  9. Naświetlić płytkę pokrytą fotorezystem z negatywem UV przedstawiającym pożądaną konfigurację parylenu-C.
  10. Piecz odsłonięty wafel przez 60 sekund w temperaturze 110 °C.
  11. Usuń cały odsłonięty fotorezystor z płytki, opracowując odpowiednie rozwiązanie wywoływacza.
  12. Wytrawić niezabezpieczony parylen. Użyj systemu wytrawiania plazmą tlenową (przy ciśnieniu w komorze 50 mTorr, 49 sccm O2, mocy RF 100 W przy 13,56 MHz i szybkości wytrawiania 100 nm / min), aby ujawnić leżący pod spodem SiO2.
  13. Wafel pokroić w kostkę za pomocą odpowiedniej piły do krojenia w kostkę (prędkość obrotowa wrzeciona 30 000 obr/min, prędkość posuwu 7 mm/s).
  14. Opłucz wióry w dejonizowanymH2Oi wysusz suszarką azotem.
  15. Przechowuj chipsy (na czas nieokreślony) w pojemnikach wolnych od kurzu, aż będą potrzebne.

2. Czyszczenie i aktywacja chipów: Protokół

  1. Usuń resztki fotorezystu z wiórów, myjąc w acetonie przez 10 sekund.
  2. Płukać w dejonizowanym destylowanym H2O 3x.
  3. Uzupełnić świeży kwas piraniowy (proporcja 5:3 30% nadtlenku wodoru i 98% kwasu siarkowego).
    UWAGA: Kwas piraniowy należy przygotowywać z dużą starannością. Jest niezwykle silnym utleniaczem, jest silnie kwaśny, a mieszanie nadtlenku wodoru z kwasem siarkowym jest reakcją egzotermiczną. Wykonaj ten etap w okapie oparowym z kwasem. Odczekaj 2 minuty po wymieszaniu kwasu piranii, ale zużyj w ciągu 20 minut.
  4. Oczyść i wytraw wióry przez zanurzenie w kwasie piraniowym na 10 minut.
  5. Opłucz wiórki 3x w dejonizowanymH2Oi przenieś do sterylnego naczynia hodowlanego.
  6. Teraz aktywuj żetony do tworzenia wzorów komórek. Na przykład dodaj dwa chipsy na studzienkę do płytki 6-dołkowej, a następnie dodaj 2 ml płodowej surowicy bydlęcej, aby całkowicie zanurzyć wszystkie wióry. Wykonaj ten i wszystkie kolejne etapy hodowli komórkowej w sterylnych warunkach w kapturze do hodowli tkankowej z przepływem laminarnym.
  7. Inkubować chipsy w surowicy przez 3-12 godzin w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Kroki 2.4-2.7 należy wykonywać sekwencyjnie i bez opóźnień między krokami. Jeśli aktywacja surowicy jest opóźniona o ≥24 godziny po leczeniu piranią, wzorzec komórek jest upośledzony z powodu zmniejszonego odpychania komórek z regionów SiO2.
    Alternatywne roztwory aktywacyjne zawierające specyficzne białka adhezyjne komórek mogą być stosowane zamiast płodowej surowicy bydlęcej. Takie roztwory zmieniają charakterystykę adhezji komórkowej dwóch kontrastujących substratów (patrz reprezentatywne wyniki dla przykładu).

3. Powlekanie linii komórkowych na chipie: Protokół

  1. Usuń wiórki z roztworu aktywacyjnego i umyj raz przez 10 sekund w zrównoważonym roztworze soli Hanka.
  2. Umieść chip w dołku hodowlanym i umieść wybrany typ komórki jako zawiesinę w zwykłym pożywce wzrostowej. Optymalna gęstość posiewu komórek zależy zarówno od typu ogniwa, jak i wzoru geometrycznego parylenu-C na chipie. Gęstość 5 x 104 komórek/ml jest rozsądnym punktem wyjścia.
  3. Obrazowanie jest dostosowane do podstawowej motywacji do tworzenia wzorców komórkowych, ale zachowanie żywych komórek można łatwo ocenić za pomocą mikroskopu preparacyjnego i kamery cyfrowej z odpowiednią soczewką przekaźnikową.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fotolitograficzny proces wzorowania SiO2 za pomocą parylenu-C jest zilustrowany na rysunku 1. Po przygotowaniu, aktywacja chipów w płodowej surowicy bydlęcej umożliwia modelowanie w hodowli szerokiego zakresu typów komórek. Nasza grupa z powodzeniem stworzyła wzór pierwotnych mysich komórek hipokampa14-16, linii komórkowej HEK 29317, linii komórkowej18 ludzkiego neuronopodobnego teratocarcinoma (hNT), pierwotnych mysich komórek ziarnistych móżdżku i pierwotnych ludzkich komórek macierzystych pochodzących z glejaka.

Rysunek 3 ilustruje solidny wzór komórek HEK 293 na wzorze parylenu składającym się z okrągłych węzłów z przedłużeniami 'krzyżyka'. Aktywacja chipa w tym przykładzie miała miejsce za pomocą płodowej surowicy bydlęcej. Z kolei na rysunku 4 przedstawiono potencjał rozszerzenia platformy wzorców poprzez zastosowanie alternatywnych rozwiązań aktywacyjnych. Stosując roztwór albuminy surowicy bydlęcej (3 mg/ml) i fibronektyny (1 μg/ml) w HBSS, poprzednia zasada wzorca została odwrócona.

Rysunek 5 ilustruje inny typ komórki (pierwotna linia komórek macierzystych pochodzenia ludzkiego, pochodząca z glejaka wysokiego stopnia). W tym przypadku geometria podstawowego wzorca wpływa na zachowanie komórki, przy czym wzór pokazany na rysunku 4A promuje wzrost procesu komórkowego wzdłuż cienkich ścieżek parylenu-C, jak pokazano na rysunkach 4B i 4C.

Niektóre typy komórek nie występują podczas korzystania z ustalonego protokołu aktywacji płodowej surowicy bydlęcej. Rycina 6 ilustruje komórki 3T3 L1 rosnące do konfluencji bez dostrzegalnej cyto-odpychającej lub cytoadhezyjnej różnicy między regionami parylenu-C i SiO2.

figure-results-1
Rysunek 1. Schemat przepływu ilustrujący proces wytwarzania wzorów parylenu-C na SiO2.

figure-results-2
Rysunek 2.Diagram przepływu ilustrujący zmiany kąta zwilżania dla wzorzystych domen parylenu-C i SiO2 podczas etapów aktywacji chipa.

figure-results-3
Rycina 3. Obrazowanie żywych komórek HEK 293 hodowanych na paryleno-C/SiO2 po trzech dniach in vitro. Chipy inkubowano przez 3 godziny w płodowej surowicy bydlęcej, po czym komórki posiano w zawiesinie w stężeniu 5 x 104 komórki/ml. Parylene-C wspomaga adhezję komórek, podczas gdy goły SiO2 odpycha komórki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4. Obrazowanie żywych komórek HEK 293 hodowanych na paryleno-C/SiO2 po trzech dniach in vitro. Chipy aktywowane przez 3 godziny w różnych zracjonalizowanych roztworach aktywacyjnych: A: płodowa surowica bydlęca, B: witronektyna (1 μg/ml) w HBSS, C: albumina surowicy bydlęcej (3 mg/ml) + witronektyna (1 μg/ml) w HBSS, D: Albumina surowicy bydlęcej (3 mg/ml) + fibronektyna (1 μg/ml) w HBSS. Komórki posiane znajdowały się w zawiesinie o gęstości 5 x 104 komórek/ml. Zwróć uwagę, jak odmienne traktowanie chipa spowodowało odwrócenie poprzedniego dogmatu o wzorcach, z SiO2 teraz adhezyjnym i odpychającym parylenem-C. Średnica węzła parylenu-C 250 μm, zaadaptowana z Hughes et al.17 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rycina 5. Obrazy immunofluorescencyjne pierwotnych komórek macierzystych pochodzących z ludzkiego glejaka wyhodowanych na różnych wzorach parylenu-C na SiO2. A: schemat ilustrujący siatkowatą konstrukcję parylenu pokazaną w B i C. B: Mikrografia fluorescencyjna utrwalonych komórek (po 4 dniach in vitro) wybarwionych na obecność kwaśnego białka fibrylarnego gleju (GFAP). C: Świetlna mikrofotografia żywych komórek na tym samym chipie. D: Obraz fluorescencyjny ilustrujący komórki barwione GFAP na innym wzorze parylenu. E: Obraz odbicia węzła i konstrukcji parylenu szprychowego zobrazowany w D. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rycina 6. Obrazowanie żywych komórek 3T3 L1 hodowanych na paryleno-C/SiO2 po czterech dniach in vitro. Chipy aktywowane przez 3 godziny w płodowej surowicy bydlęcej, po czym komórki posiewano w zawiesinie (3 x 10,4 komórki/ml). W tym przypadku platforma nie umożliwia tworzenia wzorców, a komórki stają się jednakowo zlewające się w regionach parylenu-C i SiO2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zanurzenie wiórów w kwasie piraniowym służy nie tylko do usunięcia resztek materiału organicznego, ale także do wytrawienia powierzchni podłoża. Jest to klucz do umożliwienia skutecznej aktywacji płodową surowicą bydlęcą. Niezastosowanie się do tego zapobiega tworzeniu się wzorców komórkowych i głęboko zmienia zachowanie komórek w układzie scalonym. Nie ma potrzeby sterylizacji frytek po oczyszczeniu kwasem piranii. Rzeczywiście, wykazano, że sterylizacja przez ekspozycję na promieniowanie UV podważa wzorce komórek w sposób zależny od dawki13. Należy zadbać o to, aby zmyć wszystkie pozostałości fotorezystu po procesie fotolitograficznym. Utrzymujący się fotorezystu może działać jak niepożądana warstwa cytoadhezyjna, która zastępuje wzór podyktowany geometrią parylenu-C/SiO2 . Aceton jest skuteczny przy zastosowaniu opisanego powyżej procesu fotolitograficznego i przy użyciu określonych odczynników. Jednak inne rodzaje fotorezystu mogą wymagać innego rozpuszczalnika.

Aby ocenić wpływ i powodzenie różnych etapów produkcji, można zmierzyć kąt zwilżania dwóch kontrastujących ze sobą podłoży. Rysunek 2 ilustruje zmiany, które zachodzą podczas procesu aktywacji chipa. Jest jednak prawdopodobne, że specyficzne adhezyjne i odpychające składniki białkowe w surowicy ostatecznie umożliwiają chipowi o wzorze parylenu wywieranie odpowiednich cech cytoadhezyjnych lub cyto-odpychających.

We wszystkich reprezentatywnych wynikach użyto wiórów o grubości parylenu 100 nm, chociaż z powodzeniem wykonaliśmy wzór przy użyciu zarówno grubszych, jak i cieńszych warstw parylenu. Co ważne, ta technika trawienia fotolitograficznego pozwala na znacznie większą trójwymiarową kontrolę konfiguracji parylenu niż ta zilustrowana tutaj. Na przykład, używając kombinacji fotomasek, można tworzyć regiony parylenu o mieszanej grubości. Otwiera to drogę do tworzenia kultur komórkowych o zdefiniowanej trójwymiarowej topografii, wykraczającej poza zwykłe dyktowanie obszarów adhezji/odpychania komórek, potencjalnie oferując sposób integracji kanałów mikroprzepływowych z konstruktem.

Jak jednak pokazano, ta platforma wzorców nie jest uniwersalnie skuteczna w różnych typach komórek. Nic dziwnego, że różne linie komórkowe, z różnymi profilami cząsteczek adhezyjnych komórek, zachowują się inaczej, gdy są hodowane na tej platformie. Nie zidentyfikowaliśmy jeszcze kluczowych składników surowicy ani uzupełniających się receptorów błony komórkowej, które leżą u podstaw tej platformy wzorców komórkowych. Takie postępowanie w przyszłości obiecuje poszerzenie jego użyteczności i specyfiki. Na przykład, "niewzorcowa" linia komórkowa może być genetycznie modyfikowana w celu ekspresji wymaganej cząsteczki adhezyjnej, a tym samym promowania wzorcowania.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez stypendium Wellcome Trust Clinical PhD fellowship (ECAT).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pakiet oprogramowania do edycji układuCleWin 5.0 firmy WieWebZdolny do odczytu/zapisu plików CIF lub GDS-II. Służy do tworzenia projektu parylenu do produkcji masek fotograficznych. http://www.wieweb.com/ns6/index.html
Maska fotograficzna na zamówienieCompugraphics International Ltd, Glenrothes, SzkocjaAlbo produkuj we własnym zakresie obiekty, albo zlecasz. www.compugraphics-photomasks.com
3 w płytkach krzemowychSiltronix, Archamps, Francjahttp://www.siltronix.com
Atmosferyczny piec poziomySandvikDo utleniania wafli krzemowej. http://www.mrlind.com
Reflektometr spektroskopowy małych plamekNanometriaDo pomiaru głębokości warstwy dwutlenku krzemu. www.nanometrics.com/
Promotor adhezji silanuMerckChemicals 1076730050Wstępnie nałożony na płytkę, aby zachęcić do osadzania parylenu. www.merck-chemicals.de/
Parylene-CUltra Electronicswww.ultra-cems.com
SCS Labcoter 2 jednostka osadzania, model PDS2010SCS Equipment, Surrye, Wielka BrytaniaModel PDS2010
Promotor adhezji www.scscoatings.com/ heksametyldisilazanu (HMDS)SpiChemwww.2spi.com
Zautomatyzowany system torowy do dozowania fotorezystu na płytki; 3-calowa szyna fotorezystycznaSVG (silicon Valley Group)Zautomatyzowany system szynowy do dozowania fotorezystu na płytki. Główny piekarnik piecze wafel i dozuje promotor przyczepności, HMDS. Kombinowany błystka dozuje fotorezystor. Piekarnik do pieczenia utwardza opór.
FotorezystorRohm & HaasSPR350-1.2 dodatni fotorezystuwww.rohmhaas.com/
MA/BA8 wyrównywacz maski fotograficznejSuss Microtechwww.suss.com
Microchem MF-26A deweloperMicrochemUsuwa odsłonięte obszary fotorezystu.
www.microchem.com System wytrawiania plazmowego JLS RIE80JLS DesignsUsuwa odsłonięte obszary parylenu. www.jlsdesigns.co.uk
[nagłówek]
DISCO DAD 680 Piła do krojenia wafli w kostkęDISCO Corporation, Japoniawww.disco.co.jp
AcetonFisher ScientificA929-4Do zmywania resztek fotorezystu.
30% Nadtlenek wodoruSigma-AldrichH1009www.sigmaaldrich.com
98% Kwas siarkowySigma-Aldrich435589www.sigmaaldrich.com
Płodowa surowica bydlęcaGibco-Invitrogen10437Standardowa aktywacja chipa.  www.invitrogen.com
Zbilansowany roztwór soli HankaGibco-Invitrogen14170www.invitrogen.com

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhi, Z. L., et al. A Versatile Gold Surface Approach for Fabrication and Interrogation of Glycoarrays. ChemBioChem. 9, 1568-1575 (2009).
  2. Michelini, E., Roda, A. Staying alive: new perspectives on cell immobilization for biosensing purposes. Anal. Bioanal. Chem. 402 (5), 1785-1797 (2012).
  3. Franks, W., Tosatti, S., Heer, F., Seif, P., Textor, M., Hierlemann, A. Patterned cell adhesion by self-assembled structures for use with a CMOS cell-based biosensor. Biosens. Bioelectron. 22 (7), 1426-1433 (2007).
  4. Bacakova, L., Filova, E., Parizek, M., Ruml, T., Svorcik, V. Modulation of cell adhesion, proliferation and differentiation on materials designed for body implants. Biotechnol. Adv. 29 (6), 739-767 (2011).
  5. Bacakova, L., Svorcik, V. Cell colonization control by physical and chemical modification of materials. In: Cell growth process: new research. Kimura, D. , Nova Science Publishers Inc. New York. 5-56 (2008).
  6. Sanjana, N. A fast flexible ink-jet printing method for patterning dissociated neurons in culture. J. Neurosci. Methods. 136, 151-163 (2004).
  7. Brittain, S., Paul, K., Zhao, X. -M., Whitesides, G. Soft lithography and micro- fabrication. Phys. World. 11, 31-36 (1998).
  8. Maher, M., Pine, J., Wright, J., Tai, Y. C. The neurochip: a new multielectrode device for stimulating and recording from cultured neurons. J. Neurosci. Methods. 87 (1), 45-56 (1999).
  9. Martinoia, S., Bove, M., Tedesco, M., Margesin, B., Grattarola, M. A simple micro- fluidic system for patterning populations of neurons on silicon micro- machined substrates. J. Neurosci. Methods. 87 (1), 35-44 (1999).
  10. Zeck, G., Fromherz, P. Noninvasive neuroelectronic interfacing with synaptically connected snail neurons immobilized on a semiconductor chip. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (18), 10457-10462 (2001).
  11. Michel, R., et al. Selective molecular assembly patterning: a new approach to micro- and nanochemical patterning of surfaces for biological applications. Langmuir. 18 (8), 3281-3287 (2002).
  12. Rajalingam, B., Selvarasah, S., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. Generation of static and dynamic patterned cocultures using microfabricated parylene-C stencils. Lab Chip. 7, 1272-1279 (2007).
  13. Reusable, reversibly sealable parylene membranes for cell and protein patterning. J. Biomed. Mater. Res. A. Wright, D., Rajalingam, B., Karp, J., Selvarah, S., Ling, Y., Yeh, J., Langer, R., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. 85 (2), 530-538 (2008).
  14. Delivopoulos, E., Murray, A. F., MacLeod, N. K., Curtis, J. C. Guided growth of neurons and glia using microfabricated patterns of parylene-C on a SiO2 background. Biomaterials. 30, 2048-2058 (2009).
  15. Delivopoulos, E., Murray, A. F., Curtis, J. C. Effects of parylene-C photooxidation on serum-assisted glial and neuronal patterning. J. Biomed. Mater. Res. A. 94, 47-58 (2010).
  16. Delivopoulos, E., Murray, A. F. Controlled adhesion and growth of long term glial and neuronal cultures on parylene-C. PLoS One. 6 (9), (2011).
  17. Hughes, M. A., Bunting, A., Cameron, K., Murray, A. F., Shipston, M. J. Modulating patterned adhesion and repulsion of HEK 293 cells on micro-engineered parylene-C/SiO2 substrates. J. Biomed. Mat. Res. Mater. A. 101 (2), 349-357 (2013).
  18. Unsworth, C. P., Graham, E. S., Delivopoulos, E., Dragunow, M., Murray, A. F. First human hNT neurons patterned on parylene-C/silicon dioxide substrates: Combining an accessible cell line and robust patterning technology for the study of the pathological adult human brain. J. Neurosci. Methods. 194, 154-157 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Osadzanie parylenu Cproces fotolitografiipod o a z dwutlenku krzemuaktywacja surowic bydl c p odutraktowanie kwasem Piranhaobrazowanie ywych kom rekkonfokalna mikroskopia fluorescencyjnamacierze wieloelektrodowekompatybilne z mikrowytwarzaniem

Powiązane artykuły