Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In situ TEM zespołów biologicznych w cieczy

9.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50936

⸱

30 grudnia 2013

 ,  ,  ,  , 
1Applications Science, Protochips, Inc., 2Virginia Tech Carilion Research Institute

* These authors contributed equally

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Tutaj opisujemy procedurę obrazowania kompleksów wirusowych w cieczy w rozdzielczości nanometrowej za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego.

Streszczenie

Badacze regularnie używają transmisyjnych mikroskopów elektronowych (TEM) do badania jednostek biologicznych i oceny nowych materiałów. W tym miejscu opisujemy dodatkowe zastosowanie tych instrumentów - oglądanie zespołów wirusowych w płynnym środowisku. Ta ekscytująca i nowatorska metoda wizualizacji struktur biologicznych wykorzystuje niedawno opracowany uchwyt na próbki na bazie mikroprzepływów. Nasz artykuł wideo pokazuje, jak zmontować i użyć uchwytu mikroprzepływowego do obrazowania próbek cieczy w TEM. W szczególności używamy dwuwarstwowych cząstek rotawirusa małpiego (DLP) jako naszego systemu modelowego. Opisujemy również kroki mające na celu pokrycie powierzchni komory cieczowej biofilmami powinowactwa, które wiążą DLP z okienkiem podglądu. Dzięki temu możemy obrazować zespoły w sposób odpowiedni do określania struktury 3D. W ten sposób przedstawiamy pierwsze spojrzenie na cząstki subwirusowe w natywnym środowisku ciekłym.

Wprowadzenie

Wspólnym celem biologów i inżynierów jest zrozumienie wewnętrznego działania maszyn molekularnych. Transmisyjne mikroskopy elektronowe (TEM) są idealnymi instrumentami do wizualizacji tych skomplikowanych szczegółów w rozdzielczości bliskiej atomowi1-2. W celu podtrzymania systemu wysokiej próżni TEM, próbki biologiczne są zwykle zatopione w cienkich warstwach szklistego lodu3, cukrów4, soli metali ciężkich5 lub pewnej ich kombinacji6. W rezultacie, obrazy osadzonych próbek mogą ujawnić tylko ograniczone migawki dynamicznych procesów.

Wczesne próby utrzymania próbek biologicznych w stanie nawodnienia w środowiskowych komorach płynnych zostały podjęte przez Parsonsa i współpracowników przy użyciu różnicowych etapów pompowania. Wzorce dyfrakcji elektronów niebarwionych kryształów katalazy udało się zarejestrować z rozdzielczością 3 A w stanie uwodnionym7-8. Ponadto oddzielone fazowo domeny lipidowe można badać w uwodnionych błonach ludzkich erytrocytów9-10. Jednak ruch spowodowany dyfuzją cieczy i jej interferencją z wiązką elektronów, spowodował poważną utratę rozdzielczości i do niedawna nie podejmowano dalszych eksperymentów z wykorzystaniem próbek biologicznych.

Wprowadzono nowo opracowane mikroprzepływowe uchwyty na próbki, które wykorzystują mikroprocesory półprzewodnikowe do tworzenia mikroskalowej komory środowiskowej. Urządzenia te mogą utrzymywać próbki w cieczy, gdy są one umieszczone w kolumnie TEM11-12. Ten przełom techniczny w obrazowaniu TEM pozwolił naukowcom po raz pierwszy zaobserwować postępujące zdarzenia na poziomie molekularnym13. Tę nową modalność nazywamy "mikroskopią molekularną in situ", ponieważ eksperymenty można teraz przeprowadzać "wewnątrz" kolumnyEM 14-15. Ogólnym celem tej metody jest zobrazowanie zespołów biologicznych w cieczy w celu obserwacji ich dynamicznych zachowań w rozdzielczości nanometrowej. Przesłanką stojącą za opracowaną techniką jest rejestrowanie obserwacji w czasie rzeczywistym i badanie nowych właściwości maszynerii biologicznej w roztworze. Metodologia ta rozszerza zastosowanie TEM do szerszych celów w biologii komórkowej i molekularnej12-16.

W obecnym artykule wideo prezentujemy obszerny protokół do montażu i użycia dostępnego na rynku uchwytu na próbki mikroprzepływowe. Te wyspecjalizowane uchwyty wykorzystują mikroczipy z azotku krzemu wykonane ze zintegrowanymi przekładkami, tworząc komorę cieczy, która zawiera niewielkie objętości roztworu. Cienkie, przezroczyste okienka są wytrawiane w mikroczipach do celów obrazowania12. Demonstrujemy prawidłowe użycie uchwytu mikroprzepływowego do badania dwuwarstwowych cząstek (DLP) małpiego rotawirusa w cieczy za pomocą TEM. Aby zapewnić, że zespoły biologiczne, takie jak DLP, nie ulegną gwałtownej dyfuzji na duże odległości podczas obrazowania, stosujemy metodę Affinity Capture, aby przywiązać je do powierzchni komory mikroprzepływowej16. Ten etap wychwytywania molekularnego ma dużą przewagę nad alternatywnymi technikami obrazowania próbek biologicznych w cieczy, ponieważ pozwala na pozyskiwanie obrazów, które zostaną wykorzystane do dalszych procedur przetwarzania. Ten etap wychwytywania stosowany w połączeniu z obrazowaniem mikroprzepływowym jest unikalny dla naszych procedur17. Czytelnicy korzystający z aplikacji biologii strukturalnej wykorzystujących TEM lub komory obrazowania mikroprzepływowego mogą rozważyć zastosowanie technik wychwytywania powinowactwa, gdy celem końcowym są dynamiczne obserwacje na poziomie molekularnym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotuj urządzenia do przechwytywania biegłości16

  1. Oczyść chipy elektroniczne z azotku krzemu, inkubując je w 15 ml acetonu przez 2 minuty, a następnie w 15 ml metanolu przez 2 minuty (rysunek 1A). Pozostaw wióry do wyschnięcia pod laminarnym przepływem powietrza.
  2. Inkubować suszone frytki na rozgrzanej płytce mieszającej (bez mieszania) przez 1,5 godziny w temperaturze 150 °C, a następnie pozostawić je do ostygnięcia do temperatury pokojowej przed użyciem.
  3. Za pomocą strzykawek Hamilton skomponować mieszaniny lipidów w małych szklanych probówkach zawierających 25% chloroformu, 55% DLPC (1,2-dilauroilofosfocholiny) w chloroformie (1 mg/ml) i 20% lipidów Ni-NTA (sól kwasu 1,2-dioleoilo-iminodiacetycznego-sukcynylo-niklowego) w chloroformie (1 mg/ml) o całkowitej objętości 40 μl.
  4. Nałożyć 1 μl podwielokrotności mieszaniny na każde 15 μl kropli wody Milli-Q na kawałek Parafilmu na wilgotnej szalce Petriego (Rysunek 1B). Próbki należy inkubować na lodzie przez co najmniej 60 minut.

2. Wychwytywanie makrocząsteczek17

  1. Umieść E-chip ze zintegrowanym przekładką 150 nm na wierzchu próbki jednowarstwowej i inkubuj przez 1 minutę (rysunek 1C).
  2. Delikatnie zdjąć wiór z próbki i dodać 3 μl porcji białka A znakowanego przez Hisa. Inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (ryc. 1D).
  3. Zetrzyj nadmiar kropli za pomocą bibuły filtracyjnej Whatman #1 i natychmiast dodaj 3 μl porcji roztworu przeciwciała. Inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
  4. Usunąć nadmiar roztworu za pomocą strzykawki Hamiltona i natychmiast dodać 1 μl porcji rotavirus DLPs (0,1 mg/ml) w roztworze buforowym zawierającym 50 mM HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2 i 10 mM CaCl2. Inkubować przez co najmniej 2 minuty w temperaturze pokojowej. Przygotowanie DLP zostało opisane wcześniej18.

3. Złóż komorę mikroprzepływową i załaduj uchwyt na próbki in situ

  1. Załaduj mokry E-chip zawierający próbkę wirusa do końcówki uchwytu próbki mikroprzepływowej. Rozładować jarzeniowo drugi płaski chip E przez 1 minutę, a następnie załadować go na wierzch chipa dystansowego (rysunek 2, panele 1-5).
  2. Alternatywnie, aby zwiększyć kontrast makrocząsteczek biologicznych, barwnik z metali ciężkich (np. 0,2% mrówczanu uranylu) można dodać do mokrych próbek przed umieszczeniem drugiego E-chipa na mokrej próbce. Jednak E-chip zawierający próbkę będzie musiał zostać umyty wodą Milli-Q przed dodaniem odczynnika kontrastowego.
  3. Ułóż cały zespół razem, aby utworzyć szczelną obudowę, przytrzymywaną mechanicznie w uchwycie za pomocą 3 mosiężnych (Rysunek 2, panele 6-8).
  4. Po zamontowaniu końcówka uchwytu jest pompowana do 10-6 Torr za pomocą turbopompowanej suchej przepompowni przed umieszczeniem uchwytu w TEM.

4. Obrazowanie w cieczy za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego

  1. Załaduj uchwyt próbki in situ do transmisyjnego mikroskopu elektronowego (firma FEI) wyposażonego w żarnik LaB6 i działającego pod napięciem 120 kV.
  2. Włącz filament TEM i wyreguluj eucentryczną wysokość stolika mikroskopu w stosunku do próbki, korzystając z funkcji woblera, aby przechylić próbkę od -15° do +15° do przodu iz powrotem w kolumnie. Ta procedura dostosowuje stolik w kierunku z, aby pomóc w uwzględnieniu odpowiedniej grubości komory cieczy. Ten krok zapewnia również użycie dokładnego powiększenia podczas rejestrowania obrazów.
  3. Najpierw rejestruj obrazy wzdłuż krawędzi i w rogach komory mikroprzepływowej. Obszary te zazwyczaj zawierają najcieńszy roztwór. Rejestruj obrazy próbek w warunkach niskiej dawki (1-3 elektrony/A2) za pomocą kamery CCD. Używaj powiększeń nominalnych od 6 000X do 30 000X.
  4. Określ prawidłową wartość rozmycia, ustawiając ostrość na krawędzi komory fluidalnej. Użyj wartości -1,5 μm, aby rejestrować obrazy w powiększeniu 30 000x. W przypadku napotkania gęstego roztworu lub jeśli w przygotowaniu próbki nie zastosowano środka kontrastowego, należy zastosować wyższe wartości rozmycia w zakresie od -2 do -4 μm.
  5. Aby upewnić się, że roztwór znajduje się w komorze mikroprzepływowej przez cały czas trwania eksperymentów, należy skupić wiązkę elektronów, aż pęcherzyki utworzą się w cieczy wewnątrz urządzenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reprezentatywne obrazy DLP w cieczy z wykorzystaniem E-chipów poddanych wyładowaniom żarowym (Rysunek 3A) pokazują mniejszą liczbę DLP w danym obszarze widzenia, prawdopodobnie ze względu na dyfuzję, w porównaniu do DLP wzbogaconych na urządzeniach Affinity Capture (Rysunek 3B). Dodanie formatanu uranylu do komory obrazowania zwiększa kontrast preparatu, a tym samym widoczność poszczególnych DLP w roztworze (Rysunek 3C, górny panel). Lepszy kontrast umożliwia późniejsze ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W prezentowanej pracy zastosowaliśmy podejście oparte na wychwytywaniu powinowactwa do wiązania DLP rotawirusów z platformą mikroprzepływową. Pozwoliło to na obrazowanie in situ kompleksów wielkocząsteczkowych w ciekłym mikrośrodowisku. Podejście do przechwytywania jest istotne w odniesieniu do innych technik obrazowania mikroprzepływowego , ponieważ lokalizuje próbki biologiczne w oknie obrazowania, aby zniwelować duże problemy dyfuzyjne, które pojawiają się podczas rejestrowania obrazów w ciecz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorka, Madeline J. Dukes, jest pracownikiem firmy Protochips, Inc.

Podziękowania

Autorzy dziękują dr. Michaelowi J. Friedlanderowi, dyrektorowi Virginia Tech Carilion Research Institute za zachęcanie do naszych wysiłków badawczych. Projekt ten był wspierany przez fundusze rozwojowe dla S.M.M i D.F.K. oraz częściowo przez inicjatywę Nano-Bio Instytutu Technologii Krytycznej i Nauk Stosowanych w Virginia Tech.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
E-chipy, chip dystansowyProtochips, Inc.EPB-52TBD400 μ m x 50 μ m
okno E-chip, górny chipProtochips, Inc.EPT-45W400 μ m x 50 μ m okno
Lipid Ni-NTAAvanti Polar Lipids790404PForma proszku
DLPC (12:0) lipidAvanti Polar Lipids850335PForma proszku
Kolby miarowe Fisher Scientific20-812A; 20-812C1 ml; 5 ml 
Strzykawki HamiltonCo.80300, 804001-10 μ l; 1-25 μ l
Bibuła filtracyjna Whatman #1Whatman1001 090100 sztuk, 90 mm
Szklane szalki PetriegoCorning70165-101100 mm x 15 mm
Szklane pipety PasteuraVWR14673-01014673-010
Szklane rurki hodowlaneVWR47729-5666 mm x 50 mm
AcetonFisher ScientificA11-11 L
MetanolFisher ScientificA412-11 L
Chloroform Mikroskopia elektronowa12550100 ml 
Białko oznaczone przez niego AAbcam, Inc.ab52953System wodny 10 mg
Milli-QEMD Millipore Corp.Z00QSV001Woda ultraczysta
HEPES FisherScientificBP310-500500 g
Sprzęt 
Uchwyt na próbki Poseidon In situProtochips, Inc.  Kompatybilny z
FEI: FEI Spirit BioTwin TEMFEI Co.Kamera CCD 120 kV
Eagle 2k HSFEI Co.10  Å/piksel próbkowanie przy 30 000X
Stacja pomp suchych Gatan 655Gatan, Inc.Końcówka uchwytu pompy do 10-6  range
PELCO easiGlow, jednostka wyładowcza jarzeniowaTed Pella, Inc.  Tryb ujemnej polaryzacji
Podgrzewana płyta mieszająca IsotempFisher ScientificHeat do 150 º C przez 1,5 godziny

Bibliografia

  1. Zhou, Z. H. Towards atomic resolution structural determination by single-particle cryo-electron microscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 218-228 (2008).
  2. Wolf, M., Garcea, R. L., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Subunit interactions in bovine papillomavirus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6298-6303 (2010).
  3. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q. Rev. Biophys. 21, 129-228 (1988).
  4. Unwin, P. N., Henderson, R. Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens. J. Mol. Biol. 94, 425-440 (1975).
  5. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).
  6. Adrian, M., Dubochet, J., Fuller, S. D., Harris, J. R. Cryo-negative staining. Micron. 29, 145-160 (1998).
  7. Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186, 407-414 (1974).
  8. Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological objects. Adv. Biol. Med. Phys. 15, 161-270 (1974).
  9. Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184, 77-78 (1974).
  10. Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 5068-5072 (1974).
  11. Ring, E. A., de Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).
  12. Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Gray Jerome, W., de Jonge, N. Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy. J. Struct. Biol. 174, 552-562 (2011).
  13. Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336, 61-64 (2012).
  14. Peckys, D. B., de Jonge, N. Visualizing gold nanoparticle uptake in live cells with liquid scanning transmission electron microscopy. Nano Lett. 11, 1733-1738 (2011).
  15. Klein, K. L., Anderson, I. M., de Jonge, N. Transmission electron microscopy with a liquid flow cell. J. Microsc. 242, 117-123 (2011).
  16. Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices-a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc. Adv. 2, 2408-2412 (2012).
  17. Gilmore, B. L., et al. Visualizing viral assemblies in a nanoscale biosphere. Lab Chip. 13, 216-219 (2013).
  18. Bican, P., Cohen, J., Charpilienne, A., Scherrer, R. Purification and characterization of bovine rotavirus cores. J. Virol. 43, 1113-1117 (1982).
  19. Frank, J., et al. SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J. Struct. Biol. 116, 190-199 (1996).
  20. Zhang, X., et al. Near-atomic resolution using electron cryomicroscopy and single-particle reconstruction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 1867-1872 (2008).
  21. Scheres, S. H. A Bayesian view on cryo-EM structure determination. J. Mol. Biol. 415, 406-418 (2012).
  22. Kelly, D. F., Abeyrathne, P. D., Dukovski, D., Walz, T. The Affinity Grid: a pre-fabricated EM grid for monolayer purification. J. Mol. Biol. 382, 423-433 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid
Posted by JoVE Editors on 10/10/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/50936

Tagi

Środowisko ciekłeuchwyt mikrofluidycznywychwyt powinowactwacząsteczki DLPs rotawirusaobrazowanie TEMwizualizacja wirusówśledzenie nanocząstekmikroskopia elektronowa
In situ TEM zespołów biologicznych w cieczy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.